Chẩn đoán phân biệt các type virus PMWS

0  Trường đại học nông lâm tp.HCM Bộ môn CNSH Tiểu luận: SV: Vũ Thị Nguyệt MSSV: 06126097 Lớp: DH06SH 1  MỤC LỤC I. Đặt vấn đề II. Tổng quan tài liệu 1. Định nghĩa bệnh PMWS 2. Tác nhân gây bệnh 3. Nguyên nhân lây nhiễm 4. Phương pháp PCR a. Định nghĩa b. Thiết kế primer cho phản ứng PCR c. Thành phần phản ứng d. Quy trình e. Đọc kết quả III. Vật liệu và phương pháp IV. Kết luận V. Tài liệu tham khảo 2  NỘI DUNG I. Đặt vấn đề Hội chứng còi cọc trên heo cai sữa được phát hiện năm 1991 ở Cananda, trên đàn heo này một số heo cai sữa có biểu hiện còi cọc và hiệu quả điều trị kém. Bệnh gây thiệt hại nhiều cho ngành chăn nuôi bắc Mỹ, nhiều nước ở châu Âu và một số nước ở châu Á. Tại Việt Nam, nghiên cứu của Lâm Thị Thu Hương và công tác viên (2004), thực hiện tại các trang trại chăn nuôi heo ở Thành phố HCM và các tỉnh phụ cận cho thấy: khảo sát 25 mẫu hạch của những heo còi cọc sau cai sữa để xét nghiệm, tỷ lệ dương tính với virus này chiếm 36% (9 mẫu). Điều này làm chúng ta cần phải quan tâm đặc biệt đến căn bệnh. Mặc dù căn bệnh diễn biến chậm nhưng tăng dần lên với mức độ nguy hại cao. Sau khi đàn heo nhiễm bệnh thì tỷ lệ chết có khi lên đến 90 %. Đây là một bệnh truyền nhiễm do virus gây ra. Virus PMWS là một DNA virus chuỗi đơn, thuộc họ Circoviridae, thường được gọi là là porcine circovirus (PCV). Khi nghiên cứu về Circovirus, người ta nhận thấy có đến 2 loại PCV: PCV1 và PCV2. Do PCV1 và PCV2 cùng có thể hiện trên một heo và giữa chúng có sự tương đồng nhất định về gen nên dịch tễ học phân tử cần phải phân biệt chúng với nhau để có những đánh giá chính xác về tình hình dịch tễ PMWS. Trong bài này đề cập đến việc sử dụng kĩ thuật PCR bằng việc sử dụng các cặp mồi đặc hiệu tương ứng ở các vùng gen bảo tồn của PCV1, PCV2. Kỹ thuật này cho phép cùng lúc phân biệt được PCV1 và PCV2. II. Tổng quan tài liệu 1. Định nghĩa bệnh PMWS Bệnh xảy ra trên heo cai sữa, heo từ 6- 14 tuần tuổi, đôi khi cũng có thể xảy ra trên heo 3 tuần tuổi. Sau thời gian cai sữa heo bị èo uột, thở khó, tiêu chảy, gầy còm, nuôi không lớn, da có màu trắng đôi khi vàng nhạt. Tử số trung bình từ 4% đến 10%, nếu xảy ra ở dạng cấp tính thì số heo chết có thể lên đến 38%. Ở dạng mãn tính xảy ra ở heo tơ vỗ béo, tử số ít nhưng heo không tăng trọng và chỉ đạt trọng lượng khoảng 30 kg, trong khi những heo bình thường có thể đạt 100kg. Người ta gọi đây là hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa (PMWS). 3  Hình ảnh heo bị mắc hội chứng PMWS 2. Tác nhân gây bệnh • Circovirus thuộc họ virus có DNA mạch vòng, không có vỏ bao và chứa một bộ gen vòng đơn. • Là loại virus nhỏ nhất được biết đến và có khả năng sống sót cao trong môi trường. • Gồm có 2 type được tìm thấy ở heo, bao gồm type 1 (PVC1) và type 2 (PVC2). • Qua nghiên cứu về gen của 2 loại virus này rất khác nhau về mặt di truyền với bộ nhiễm sắc thể chỉ tương đồng khoảng 68-76%. • PCV có cấu trúc gen đơn giản, gồm hai khung chính mở đọc, rep và cap, được nhìn thấy ở hình dưới Gen cap nằm ở sợi ngược của PCV và mã hóa các protein cấu trúc chính của vi rút trong khi gen rep chỉ đạo tổng hợp của các protein Rep. 4  a. Circovirus type 1 (PVC-1): Porcine circovirus loại 1 (PCV1) chứa 2 khung đọc mở mã hóa các protein trong quá trình phiên mã, Rep và Cap và 1 vị trí cắt tại vị trí như hình vẽ 5  • Năm 1974, các nhà khoa học đã phân lập được Circovirus type 1 từ tế bào thận heo • Hiện nay, chúng không gây bệnh cho heo b. Circovirus type 2 (PVC-2): • Được ghi nhận đầu tiên vào 1991 tại Tây Canada, phát hiện ở vết thương của heo • Bao gồm nhiều chủng khác nhau (kiểu sinh học và kiểu gen. Kháng thể trên PVC-2 đã được phát hiện ở huyết thanh heo nuôi tại Bỉ năm 1985 • Từ những kinh nghiệm nghiên cứu ban đầu cho thấy, khi gây nhiễm virus type 2 lên heo, heo sẽ biểu hiện những tổn thương đặc trưng của bệnh. Tuy nhiên, nếu một loại virus khác như Parvovirus heo (PPV) hay PRRSV được tiêm vào cùng một lúc thì heo cũng mang những biểu hiện tương tự. Những nguyên nhân gây ra bệnh thường là do nhiễm PCV type 2 hay một vài loại virus khác nhưng không phải tất cả heo bị nhiễm PCV và PPRS không có biểu hiện bệnh lý PMWS. Những nghiên cứu về huyết thanh tại Châu Âu và Bắc Mỹ cho thấy, sự lây nhiễm lan rộng trong đàn heo nhưng chỉ một phần nhỏ đàn có huyết thanh dương tính là từng biểu hiện bệnh lý. Điều này có vẻ như hầu hết những ca lây nhiễm có biểu hiện ngầm với bệnh. Heo con có thể bị nhiễm trước khi cai sữa. c. Sự nhân rộng của Circovirus • Virus xâm nhập vào tế bào chủ • Bám và phát hành gen ssDNA của virus vào hạt nhân • Các ssDNA được chuyển thành dsDNA • mRND virus được phiên mã và dịch mã để sản xuất ra protein của virus • Nhân rộng Rep và sản xuất ra vòng tròn ssDNA • Sự tổng hợp vòng tròn ssDNA có thể: 9 Được chuyển đổi sang dsDNA làm khuôn mẫu để nhân đôi 3. Nguyên nhân lây nhiễm • Nhiễm từ tinh dịch heo bệnh, phân, phương tiện, vật dụng (quần áo, xe đẩy,…) hay từ những loài khác (Chuột, Chim,…) • Tiếp xúc giữa heo bệnh với heo khỏe mạnh • Do Stress (trong quá trình vận chuyển, thay đổi môi trường, thay đổi chuồng trại,… 6  • Do nhập nhiều heo với các độ tuổi khác nhau và chăn nuôi với mật độ dày đặc • Do thú sản xuất liên tục • Khi heo mẹ bị nhiễm virus PCV2, chúng sẽ truyền sang heo con và gây ra hội chứng còi sau cai sữa(PMWS). Bên cạnh hội chứng PMWS, heo còn mắc thêm một số bệnh khác như nhiễm trung đường hô hấp (PRRV)... 4. Phương pháp PCR a. Định nghĩa PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction, được dịch ở một vài sách là Phản ứng chuỗi trùng hợpcũng có sách gọi là "phản ứng khuếch đại gen". PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo 7  ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E. coli hay nấm men. PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác định huyết thống. b. Thiết kế primer cho phản ứng PCR Đoạn DNA cần khuếch đại được xác định bằng primer chọn lọc. Primer là những đoạn ngắn, sợi DNA nhân tạo – không quá 50 (thường 18-25) nucleotides (vì DNA thường là sợi đôi, chiều dài của nó được xác định bằng số lượng cặp base (bp); chiều dài của sợi đơn DNA được đo bằng base hay nucleotides) phù hợp một cách chính xác ở điểm bắt đầu và kết thúc của DNA cần khuếch đại. Nó gắn chặt với DNA mẫu ở những điểm khởi đầu và kết thúc, nơi mà DNA-polymerase nối và bắt đầu quá trình tổng hợp của sợi DNA mới. Sự lựa chọn về chiều dài của primer và nhiệt độ biến tính của nó, nhiệt độ biến tính của primer được định nghĩa là nhiệt độ dưới lúc mồi bám vào DNA mẫu và nhiệt độ trên lúc primer tách ra khỏi DNA mẫu. Nhiệt độ biến tính tỉ lệ thuận với chiều dài primer. Primer quá ngắn sẽ bám nhiều vị trí trên DNA mẫu dài và sẽ cho kết quả không rõ ràng. Mặt khác chiều dài DNA bị giới hạn bởi nhiệt độ cần biến tính. Nhiệt độ biến tính quá cao, ví dụ như trên 80°C sẽ gây ra nhiều vấn đề vì DNA-polymerase hoạt động kém ở nhiệt độ đó. Chiều dài tốt nhất của primer là từ 20-40 nucleotide với nhiệt độ biến tính khoảng từ 60 – 75°C. Hàm lượng GC nên trong primer khoảng 40-60%. c. Thành phần phản ứng. Enzyme DNA polymerase Buffers Nồng độ và dNTP Nhiệt độ và primer Một số chất khác d. Quy trình Quy trình PCR gồm 20 đến 30 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước (Hình 2) 8  • Nhiệt độ tăng lên 94-96°C để tách hai sợi DNA ra. Bước này gọi là biến tính, nó phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA. Trước chu kỳ 1, DNA thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn. Thời gian: 1-2 phút • Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn. Bước này gọi là gắn mồi. Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt độ biến tính 50°C (45-60°C). Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện. Thời gian: 1-2 phút. • Cuối cùng, DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống. Nó bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo sợi DNA. Bước này gọi là kéo dài. Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc DNA-polymerase. Thời gian của bước này phụ thuộc vào cả DNA- polymerase và chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại. Chu trình PCR dưới dạng sơ đồ. (1) Nóng chảy ở 96°C. (2)Gắn mồi ở 68°C. (3)Kéo dài ở 72°C (P=Polymerase). (4)Chu trình đầu tiên hoàn thành. Hai sợi DNA kết quả thành DNA mẫu cho chu trình kế tiếp, mặc dù gấp đôi lượng DNA bản sao cho mỗi chu kỳ. 9  e. Đọc kết quả sản phẩm của phản ứng PCR Sau phản ứng PCR, kết quả được kiểm tra bằng cách chạy điện di trên gel agarose. Vạch đặc trưng cho DNA khuếch đại có thể quan sát được khi nhuộm ethidium bromide, hoặc nếu hàm lượng DNA khuyeechs đại thấp có thể được phát hiện bằng phương pháp Southern. Hình bên là một ví dụ về sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose. III. Vật liệu và phương pháp. Phương pháp PCR nhân bản và khuếch đại trình tự DNA của virus gây hội chứng PMWS. a. Vật liệu: Bộ gen PCV1 được nhân bản bằng cách sử dụng PCR với đoạn mồi có trình tự: 5’-GGCGGCGCCATCTGTAACGGTTT-3’ Và ngược lại: 5’-GATGGCGCCGAAAGACGGGTATC-3’ (Mankertz & ctv, 2000) 10  Bộ gen PCV2 được nhân bản trong cùng một phản ứng PCR bằng cách sử dụng đoạn mồi chuyển tiếp, trình tự của đoạn mồi: 5-GTGGAGCTCCTAGATCTCAGGG-3 và 5-TAGGAGCTCCACACTCCATCAG-3 (Mankertz et al, 2000.). Sự khuếch đại được thực hiện với: 0-1mm dNTP 2-5U Taq DNA polymerase(Boehringer) 0-4µM Primer a. Phương pháp Các hạch bạch huyết, mô phổi và amidan được lấy từ những heo mắc hội chứng PMWS Được giữ đông lạnh ở nhiệt độ , trước khi đem tách chiết DNA. DNA được tách ra, sau đó đem nhân bản và khuếch đại bộ gen của PCV bằng kĩ thuật PCR. Phản ứng được thực hiện trong 35 chu kỳ: Biến tính ở trong 30s Bắt cặp ở Kéo dài chuỗi ở Sản phẩm PCR sau đó được chuyển vào vector pPCR-Script SK bằng cách sử dụng pPCR-Scrip Amp cloning kit(Stratagene). Việc chuyển gene được giải trình tự trên cả 2 sợi với một trình tự ABI 373 bằng cách sử dung M13 chuyển tiếp và đảo ngược mồi cũng như mồi đặc hiệu cho circovirus và bộ kit giải trình tự ABI Prism Dye(PE Biosystems) 11  Nhân bản gen PCV Các gen mã hóa ORF1 và ORF2 từ cả 2 loại PCV bởi PCR sau đó nhân bản vào trong vector pcDNA ở động vật có vú, hoặc là 1 trong 2 vector pVL1393 hoặc pAcGHLT. Các cặp mồi được dùng cho sự khuếch đại PCV:PCV1,ORF1 được khuếch đại với primer ORF1.1 chuyển tiếp (5’-CGGGATCCCAGTGAAAATGCCAAGCAAGAAAAG -3’) và ngược lại (5’-CGGGATCCCGATGTGATAACAAAAAAGAC- TCAG -3’) mồi, trong khi ORF2 đã được khuếch đại với ORF2.1 chuyển tiếp (5’-CGGGATCCCTTTTTTGTTATCACATCGTAATGG -3’) và ngược (5’-CGGGATCCTCTTTCACTTTTATAGGATGACGTG-3’) . Đối với khuếch đại gen PCV2, ORF1.2 chuyển tiếp (5’-ATGGATCCAGCAGACACATGCCCAGCAAG -3’) và ngược lại (5’-GGGGATCCGAAGTGATAAAAAAGACTCAG-3’) mồi đã được sử dụng để tạo ra các gen ORF1 trong khi ORF2 được khuếch đại bằng cách sử dụng ORF2.2 chuyển tiếp (5’-CCGGATCCTCCATTAAGGGTTAAGTGGG-3’) và ngược lại (5’-CCGGATCCTCAGATATGACGTATCCAAG-3’) . Tất cả các mồi bao gồm BamHI được định vị ở đuôi 5’của chúng. Sự khuếch đại được biến tính ở , và thời gian kéo dài rút ngắn đến 45s. 12  Sản phẩm PCR của gen PCV2 được clone trong pPCR-Scrip SK plasmid như đã nói ở phần trên. plasmid tái tổ hợp sau đó đã được phân cắt với BamHI. Các plasmid tái tổ hợp sau đó được phân cắt bởi BamHI. b. Đọc kết quả Đọc kết quả trên bảng điện di gel. Sự khác biệt của PCV1 và PCV2 được thể hiện đó là: ORF1.PCV1(ở giếng số 1-4) mang lại các đoạn khuếch đại có kích thước nhỏ hơn đoạn khuếch đại của ORF2.PCV2 IV. Kết luận Có thể sử dụng kĩ thuật PCR trên để phân biệt các type của PMWS, nhưng chưa cho phép phân biệt được các PCV2 tư các vùng địa lí khác nhau. Đó là một vấn đề rất khó khăn về khía cạnh dịch tễ, trong việc kiểm soát sự lan nhanh của PCV2 trên toàn thế giới. Việc gia trình tự gen những phân lập PCV2 như vậy đều cho thất chúng cung thuộc một kiểu gen. Điều này có ý nghĩa cực kỳ quan trọng trong việc tìm kiếm vaccine nhằm kiểm soát PMWS. Sự khác biệt di truyền giữa các phân lập PCV2 càng lớn thì việ sản xuất một loại vaccine hiệu quả trong phong chốn chúng càng khó khăn. Hiện nay, người ta đang phát triển kĩ thuật PCR-RFLP ,sử dụng các cặp mồi đặc hieeujtuwowng ứng ở các vùng gen bảo tồn của PCV1, PCV2 và một enzyme cắt tương ứng với vị trí cắt chỉ có ở PCV2. Kĩ thuật này cho phép có thể cùng lúc 13  phân biệt được PCV1 và PCV2 cũng như phân biệt được nguồn gốc địa lí của PCV2 phân lập. V. Tài liệu tham khảo • Benh&loai=3&id=108 • • • 09352003000500002 • Ellis, J., Hassard, L., Clark, E., Harding, J., Allan, G., Willson, P., • Strokappe, J., Martin, K., McNeilly, F., Meehan, B., Todd, D. & Haines, • D. (1998). Isolation of circovirus from lesions of pigs with postweaning • multisystemic wasting syndrome. Canadian Veterinary Journal • Nguyễn Ngọc Hải(2007). Công nghệ sinh học trong thú y • • SHPT/Ch%C6%B0%C6%A1ng_18._K%E1%BB%B9_thu%E1%BA%ADt _PCR_c%C4%83n_b%E1%BA%A3n