Chẩn đoán vi khuẩn E.Coli nhóm STEC bằng kỹ thuật gen
- Do tính chất chuyên biệt rất cao của enzyme cắt nên kỹ thuật này cho phép
xác định sự tương đồng hoặc khác biệt rất nhỏ giữa các dòng vi khuẩn hoặc
virus.
- Có thể xác định nguồn gốc căn bệnh ởcác ổ dịch không chỉ trong phạm vi
một vùng mà cả toàn thế giới.
- Có thể kết hợp với kỹ thuật lai trong chẩn đoán các tác nhân gây bệnh.
18 trang |
Chia sẻ: lylyngoc | Lượt xem: 4883 | Lượt tải: 3
Bạn đang xem nội dung tài liệu Chẩn đoán vi khuẩn E.Coli nhóm STEC bằng kỹ thuật gen, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Sinh viên : Lương Thế Thịnh
MSSV : 05126112
1
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Vi sinh vật nói chung và vi khuẩn nói riêng giữ vai trò rất quan trọng
trong mọi hệ sinh thái. Chúng tồn tại khắp nơi ngay cả trong cơ thể của các
sinh vật khác. Đa số các loài vi khuẩn có lợi được ứng dụng trong sản xuất các
chế phẩm phục vụ cho vật nuôi và con người. Một số ít lại là nguyên nhân gây
bệnh. Điều này thúc đẩy các kỹ thuật chẩn đoán vi khuẩn ra đời.
Thông thường trong chẩn đoán vi khuẩn thường áp dụng kỹ thuật nuôi
cấy phân lập trên một số môi trường chuyên biệt và xác định vi khuẩn thông
qua các phản ứng sinh hóa… Quy trình chẩn đoán xét nghiệm này có ưu điểm
là đơn giản nhưng lại không đảm bảo tính chính xác của kết quả cũng như
không cho thấy những mối liên hệ về mặt di truyền, sự biến chủng của vi
khuẩn theo thời gian.
Các kỹ thuật sinh học phân tử, kỹ thuật gen, kỹ thuật chẩn đoán dựa trên
cấu trúc gen của vi khuẩn như kỹ thuật PCR, Real-time PCR, PCR-RFLP… với
những ưu điểm nổi trội như nhanh, nhạy, chính xác đã thay thế rất tốt cho các
phương pháp chẩn đoán cổ điển trong các trường hợp xảy ra ổ dịch, nhất là đối
với các loại vi khuẩn khó nuôi cấy và chẩn đoán như vi khuẩn lao, Leptospira…
hoặc những vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm như Salmonella, E. Coli nhóm
STEC.
2
II. TỔNG QUAN
II.1. Trực khuẩn Escherichia coli:
Escherichia coli là một loại trực
khuẩn sống thường xuyên trong ruột
người và một số động vật được Eschrich
phát hiện ra từ năm 1885. Chúng chiếm
tới 80% vi khuẩn hiếu khí sống ở ruột.
Bình thường chúng không gây bệnh, khi
cơ thể suy yếu một số chủng có khả
năng gây bệnh. Vi khuẩn E. Coli thuộc
họ trực trùng đường ruột
(Enterobacteriacae). Ở trong ruột chúng
sống đối kháng với một số vi khuẩn
khác như Salmonella và Shigella
(Thương hàn và lỵ) nhờ có khả năng tạo
ra một loại chất ức chế có tên là
Colixin. Chúng còn có khả năng tổng hợp một số vitamin thuộc nhóm B, E và
K. Vì thế khi không gây bệnh chúng có lợi cho đường ruột nhờ hạn chế được
một số vi khuẩn gây bệnh khác, giữ thế cân bằng sinh thái trong ruột và sinh
tổng hợp một sốvitamin. E. Coli được thải ra môi trường theo phân, do chiếm
tới 80% vi khuẩn hiếu khí trong ruột và luôn giữ thế cân bằng sinh thái nên E.
Coli được chọn làm vi sinh vật chỉ thị ô nhiễm.
3
II.1.1 Đặc điểm sinh học của E. Coli:
a) Đặc điểm hình thái & cấu tạo:
E. Coli có hình que, hai đầu tròn, kích thước dài ngắn khác nhau, thường
từ 2 – 3 micromet x 0,5 micromet. Thường đứng riêng rẽ từng tế bào, cũng có
khi ghép từng đôi một, có khi kết với nhau thành từng đám hoặc một chuỗi
ngắn. Thường có tiêm mao mọc khắp bề mặt,có khả năng di động. Không có
khả năng hình thành bào tử, có khả năng hình thành giáp mạc (vỏ nhày) khi
gặp môi trường dinh dưỡng tốt. Nhuộm gram âm.
b) Tính chất nuôi cấy:
Dễ nuôi cấy, pH thích hợp 7 – 7,2, nhiệt độ thích hợp 37oC. E. Coli có phản
ứng đỏ Methyl dương tính. E. Coli có khả năng sinh Indol.
c) Sức đề kháng:
E. Coli dễ bị tiêu diệt bởi các thuốc sát trùng thông thường, sức đề kháng yếu.
E. Coli thường bị tiêu diệt ở nhiệt độ 60oC trong 30 phút. Dễ bị tiêu diệt bởi
các thuốc sát trùng thông thường.
4
II.1.2 Khả năng gây bệnh:
Bình thường E. Coli sống trong ruột người không gây bệnh. Khi cơ thể
suy yếu một số chủng trở nên gây bệnh. E. Coli không những chỉ gây bệnh
đường ruột như tiêu chảy, kiết lỵ mà còn có thể gây một số bệnh khác như
viêm đường tiết niệu, viêm gan, viêm phế quản, viêm màng phổi, v…v…
Độc tố của E. Coli thuộc loại nội độc tố, có khả năng chịu nhiệt. Đặc biệt
có một số chủng đột biến có khả năng sinh ngoại độc tố, có khả năng tác động
lên tế bào thần kinh.
Cái tên EHEC được áp dụng đối với Vi khuẩn Verotoxigenic E. Coli
(VTEC), có liên quan đến bệnh viêm thành ruột kết ở người. Verotoxin là độc
tố của E. Coli gây chết tế bào Vero. Những độc tố này gần giống với độc tố
Shiga, được tạo ra từ Shigella dysenteriae, và vì vậy chúng cũng được gọi là
độc tố giống Shiga (Shiga-like toxin). Độc tố Verotoxin chứa 2 nhóm: VT-1
(Shiga-like toxin I [SLT-I]) và VT-2 (Shiga-like toxin II [SLT-II]).
5
Yếu tố độc lực của nhóm STEC bao gồm enzyme haemolysin phá hủy
hồng cầu (gen Hly), yếu tố kết bám Intimin (gen eae), độc tố SLT-I hay VT1
hoặc stx1 (gen stx1), độc tố SLT-II hay VT2 hoặc stx2 (gen stx2), độc tố SLT-
Iie hay VT2e hoặc stx2e (gen stx2e)… các loại độc tố của STEC có tính chất
sinh học tương đối giống nhau, đều cùng có khả năng phá hủy tế bào Vero vì
vậy việc phân biệt được chúng cũng không đơn giản, đòi hỏi các phương tiện
chẩn đoán hiện đại: Nuôi cấy tế bào hoặc ELISA xác định độc tố stx; PCR, lai
xác định gen eae, VT1, VT2…; RFLP, PFGE phân biệt kiểu gen…
II.1.3 Các phương pháp chẩn đoán E. Coli:
Cũng giống như vi khuẩn Salmonella, sự phân loại và chẩn đoán vi
khuẩn E. Coli theo type kháng nguyên là khá phức tạp,dựa theo 3 loại kháng
nguyên bề mặt chính là: Kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông roi H và
kháng nguyên capsul K.
Trong phân lập vi khuẩn STEC, người ta thường sử dụng môi trường
sorbito-MacConkey agar (SMAC) hoặc môi trường SMAC bổ sung cefixime
và potassium tellurite (CT-SMAC). Tuy nhiên việc phân lập vi khuẩn trên 2
môi trường này cho phép phát hiện chủ yếu vi khuẩn STEC thuộc serotype
O157, trong khi đó còn không ít STEC không thuộc serotype O17 và có tính
chất lên men đường sorbitol rất biến đổi. Kết quả phân lập STEC trên 2 môi
6
trường SMAC và CT-SMAC chỉ phù hợp từ 30-80% kết quả chẩn đoán độc tố
stx trên môi trường tế bào Vero.
Xét về tính chất sinh hóa, vi khuẩn O157:H7 STEC phần lớn không sản
sinh được enzyme β-D-glucuronidase, do vậy có thể dùng tính chất này để sơ
bộ đánh giá sự nhiễm O157:H7 STEC.
Có thể chẩn đoán E. Coli O157 bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang
trực tiếp với việc sử dụng kháng thể đa dòng kháng O157 gắn fluorescein
isothiocyanate với thời gian xét nghiệm chỉ cần khoảng 2 giờ.
Kỹ thuật ELISA trực tiếp cũng cho phép phát hiện vi khuẩn E. Coli O157
trong mẫu với thời gian rất ngắn, chỉ trong vòng 1 giờ.
Tuy cả 2 kỹ thuật: Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp và ELISA
trực tiếp đều có độ nhạy tương đương với việc phân lập trên môi trường
SMAC và CT-SMAC nhưng cần phải khẳng định sự hiện diện của độc tố stx
trong mẫu. Điều này được thực hiện qua kỹ thuật PCR-RFLP.
7
II.2 Phương pháp:
II.2.1 Nhận diện STEC (VTEC) bằng kỹ thuật PCR:
a) Xử lý mẫu:
Mẫu phân được lọc nước và xử lý với phosphate-buffered saline (PBS)
và được kiểm tra độ loãng để đảm bảo hoạt tính của độc tố có tác dụng trên
lớp đơn tế bào Vero.
b) Quá trình thực hiện:
Primers
Qua việc xác định gen độc lực của nhóm STEC (gen stx), người ta có thể
nhận diện được chúng. Kỹ thuật này sử dụng 2 cặp mồi tương ứng khuyếch đại
cho 2 gen VT-1 và VT-2:
) Theo báo cáo của Karam Ramotar và cộng sự năm1995:
VT-1 Primer
GAAGAGTCCGTGGGATTACG
AGCGATGCAGCTATTAATAA
VT-2 Primer
TTAACCACACCCACGGCAGT
GCTCTGGATGCATCTCTGGT
Trong đó: VT-1 Primers dùng khuyếch đại 130 cặp Nu (Từ Nu 1191 –
1320 của gen VT-1)
VT-2 Primers dùng khuyếch đại 346 cặp Nu (Từ Nu 426 – 771
của gen VT-2)
8
) Theo báo cáo của L. Mansouri-Najand và M. Khalili năm 2007:
Vật liệu: Hỗn
hợp thực hiện PCR chứa:
- 5 μl Buffer
- 50 mM KCL
- 0,01 % gelatin
- 10 mM Tris-HCL (pH
8.3)
- 2,5 mM MgCl2
- 0,2 mM từng loại dNTP
- 0,001 mM từng loại
Primers
- 1 μl ADN khuôn
- Phản ứng PCR bắt đầu
với 2.5 U Tag
polymerase
9
Phản ứng:
- Khởi đầu là biến tính ADN ở 95oC trong 5 phút
- 40 chu kì sau diễn ra với chu trình nhiệt: 94oC trong 1 phút, 55oC trong 1
phút, 72oC trong 1 phút
- Chu kì cuối giữ 72 oC trong 7 phút
Sản phẩm khuyếch đại từ phản ứng PCR sau đó được điện di trên gel Agarose
2% và được nhuộm với Ethidium bromide.
10
II.2.2 Ứng dụng kỹ thuật PCR-RFLP trong chẩn đoán vi khuẩn E.Coli
nhóm STEC (Shiga-like toxin Escherichia coli):
Sản phẩm khuếch đại của phản ứng PCR có thể được sử dụng để dùng
trong kỹ thuật RFLP để xác định các chủng trong nhóm STEC. Kỹ thuật RFLP
tiến hành trên cơ sở sử dụng các enzyme cắt khác nhau kết hợp với các trình
tự ADN được cắt cũng khác nhau (trình tự ADN khác nhau là sản phẩm của
phản ứng PCR trước đó). Kết quả là thu nhận được sản phẩm cắt khác nhau
(mang tính đa hình). Và như vậy cho phép phân biệt được các cá thể với nhau.
Thông thường trong kỹ thuật PCR để chẩn đoán vi khuẩn nhóm STEC
người ta sử dụng các cặp mồi xác định gen stx1 và stx2, tuy nhiên để chẩn
đoán một số vi khuẩn đặc biệt thuộc nhóm STEC người ta sử dụng thêm những
cặp mồi cho phép xác định các gen eae, stx2e … và các biến thể của chúng.
Những dịng E. Coli được tìm thấy đều tạo độc tố verotoxin (VT) hoặc
Shiga-like toxin (SLT). Cĩ 3 loại riêng biệt: VT-1 (SLT-1), VT-2 (SLT-2), và Vte
(là biến thể của VT-2: SLT-IIv). Dịng E. Coli O91:H21 được nghiên cứu là sản
xuất ra độc tố này. Sau khi giải trình tự và dịng hĩa dịng vi khuẩn này, ta xác
định được 2 gen riêng biệt mã hĩa cho 2 độc tố đặc tính tương tự như VT-2. Gen
thứ nhất gọi là vtx2ha mã hĩa cho độc tố VT2v-a, gen thứ hai gọi là vtx2hb mã
hĩa cho độc tố VT2v-b
11
Cách thực hiện: Chẩn đốn gen tiểu phần B biến thể của Verotoxin loại
2 (VT2v-b):
B1: Chọn dịng vi khuẩn trong bảng sau:
12
B2: Thực hiện phản ứng PCR như trình bày ở trên thêm một số cặp mồi:
Trong đó: VT2-c & VT2-d là primers đặc trưng cho VT2 và biến thể VT2;
VT2v-1 & VT2v-2 là primers đặc trưng cho biết thể VT2
B3: Sử dụng Enzyme cắt giới hạn:
Đối với chủng O157 có thể dùng các RE: XbaI, AvrII, SpeI.
13
B4: Điện di:
Những trình tự ADN được khuyếch đại sau phản ứng PCR sau khi được
cắt bởi enzyme cắt giới hạn sẽ tạo ra nhiều trình tự ADN nhỏ đặc trưng cho
từng loại và được xác định qua phương pháp điện di gel agarose 2%.
RFLP của sản phẩm PCR chẩn đoán gen VT2 (stx2)
(A) Dùng enzyme cắt HaeIII
(B) Dùng enzyme cắt RsaI
(C) Dùng enzyme cắt Nci
a: Thang chuẩnI
b, c, d, e, f, g: các chủng E.Coli
14
B5: Nhuộm bạc theo phương pháp của Sambrook và cộng sự thu nhận kết quả.
Ưu điểm của kỹ thuật PCR-RFLP:
- Do tính chất chuyên biệt rất cao của enzyme cắt nên kỹ thuật này cho phép
xác định sự tương đồng hoặc khác biệt rất nhỏ giữa các dòng vi khuẩn hoặc
virus.
- Có thể xác định nguồn gốc căn bệnh ở các ổ dịch không chỉ trong phạm vi
một vùng mà cả toàn thế giới.
- Có thể kết hợp với kỹ thuật lai trong chẩn đoán các tác nhân gây bệnh.
Khuyết điểm:
- Kỹ thuật này không cho phép phân biệt các chủng vi sinh vật nếu sự biến đổi
gen của chúng xảy ra ngoài vị trí cắt đặc hiệu.
15
III. KẾT LUẬN:
Chẩn đoán được vi khuẩn E.Coli nhóm STEC bằng kỹ thuật PCR-RFLP
thông qua gen độc tố của từng chủng.
Xác định được các biến thể độc tố của vi khuẩn nhóm STEC
16
IV. TÀI LIỆU THAM KHẢO
Công nghệ Sinh học trong thú y
(Nguyễn Ngọc Hải)
Giáo trình Vi sinh vật học môi trường
(Trần Cẩm Vân)
Identification of Verotoxin Type 2 Variant B Subunit gens in E.Coli by
PCR and RFLP
(S.D Styler và cộng sự - Tập 29, số 7)
Direct Detection of Verotoxin-Producing Escherichia coli in Stool Samples
by PCR
(KaRam Ramotar và cộng sự – Tập 33, số 3)
Typing of Bovine Attaching and Effacing Escherichia coli by Multiplex in
vitro amplification of Virulence-Associated genes
(Bernard China et al – Tập 62, số 9)
17
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
II. TỔNG QUAN
II.1 Trực khuẩn Escherichia coli E. Coli ...................................................3
II.1.1 Đặc điểm sinh học của E. Coli.......................................................4
II.1.2 Khả năng gây bệnh ........................................................................5
II.1.3 Các phương pháp chẩn đoán E. Coli..............................................6
II.2 Phương pháp.........................................................................................7
II.2.1 Nhận diện STEC (VTEC) bằng kỹ thuật PCR...............................8
II.2.2 Ứng dụng kỹ thuật PCR-RFLP trong chẩn đoán vi khuẩn E.Coli
nhóm STEC (Shiga-like toxin Escherichia coli)....................................11
III. KẾT LUẬN
IV. TÀI LIỆU THAM KHẢO
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- chan_doan_vk_e_coli_bang_ky_thuat_gen_5425.pdf