Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng

Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - 1 - BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Seminar : Chẩn đoán bệnh CHẨN ĐOÁN VIRUS CÚM GIA CẦM BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY PHÔI TRỨNG. Giảng viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS. Nguyễn Ngọc Hải Hồ Bảo Quốc 06126117 DH06SH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 1 Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - 2 - A. Đặt vấn đề Virus cúm và đại dịch cúm gia cầm gây thiệt hại rất lớn về kinh tế của mọi quốc gia trên thế giới và chúng là một thách thức lớn cho ngành y tế trong những năm qua. Việt Nam là một trong những quốc gia chịu ảnh hưởng nhiều nhất của đại dịch này. Mặc dù chúng ta đã có nhiều biện pháp và nỗ lực trong việc phòng chống nhưng vẫn chưa mang lại hiệu quả như mong muốn. Trong công tác phòng chống việc chẩn đoán để xác định chính xác virus gây bệnh là một khâu hết sức quan trọng. Một trong những kỹ thuật chẩn đoán virus cúm gia cầm có độ chính xác cao đó là kỷ thuật nuôi cấy phôi trứng. Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - 3 - B. Tổng quan I. Thông tin chung về cúm gia cầm 1. Cúm gia cầm là gì ? Cúm gia cầm, còn được gọi là cúm gà, là bệnh truyền nhiễm trên động vật, chủ yếu là loài chim, đôi khi cũng thấy trên lợn do vi- rút cúm gia cầm týp A gây ra. Chủng vi-rút cúm này có độc tính cao, đôi khi vượt qua hàng rào bảo vệ lây nhiễm cho con người. Dựa trên kháng nguyên, người ta chia cúm gia cầm thành 16 phân nhóm H (Haemagglutinin: H1-H16) và 9 phân nhóm N (Neuraminidase: N1-N9), trong đó phân nhóm H5 và H7 có độc tính cao. Hiện nay chỉ có 2 vi-rút H1N1 và H3N2 đang lưu hành và gây bệnh ở người. Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - 4 - Vi-rút cúm gây dịch cúm gia cầm hiện nay là H5N1 và được chia làm 2 nhóm: - Vi-rút cúm gia cầm có độc tính thấp (Low pathogenic avian virus: LPAV): thường lưu hành trong loài chim hoang dã, không gây bệnh hay gây bệnh nhẹ: xù lông, giảm sản lượng trứng và thường không được phát hiện. - Vi-rút cúm gia cầm có độc tính cao (Highly pathogenic avian virus: HPAV): rất nguy hiểm. Chúng lan truyền rất nhanh trong đàn gia cầm, gây bệnh nặng ảnh hưởng đến nhiều cơ quan và cuối cùng gây tử vong gần 100% trong vòng 48 giờ kể từ khi nhiễm bệnh. Bệnh lý LPAI ( low pathogenic avian influenza virus ) Những thương tổn thay đổi với giống, loài virus và tuổi của kí chủ. Thông thường, chỉ những gà tây và những con gà biểu lộ một vài sự thay đổi đặc biệt lớn và cực kỳ nhỏ với những giống đã thích nghi với ký chủ ( Capua và Mutinelli 2001). Trong gà tây, bệnh viêm xoang, viêm khí quản và airsacculitis đã được phát hiện, mặc dầu sự tiêm nhiễm vi khuẩn sơ cấp có thể góp phần không có hại gì.Tuỵ của gà tây đã được mô tả. với những con gà bình thường, sự bọc nhẹ của đường hô hấp thì thường được thấy. Thêm vào, những tổn thương tập trung trên những cơ quan sinh sản của những con gà đẻ trứng ( buồng trứng, vòi trứng, viêm màng noãn hoàn.) HPAI (hightly pathogenic avian influentza viruses ) Những thay đổi lớn về bệnh lý và mô bệnh học của HPAI bộc lộ sự phụ thuộc giống nhau để ghi vào danh sách cho sự hiện diện của triệu chứng lâm sàn. Bốn loại thay đổi của tác nhân gây bệnh đã được thăm dò nguyên lí cơ bản ( Perkins and Swayne 2003): (i) Có lẽ (chết trong khoảng thời gian 24- 36 hours tiêm nhiễm, phần lơn trông thấy trong loài galliforme) và dạng cấp tính của bệnh biểu lộ những thay đổi bệnh tích không đặc thù: một sự hydropericardium rời rạc, sung huyết nhẹ trong ruột và Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - 5 - thỉnh thoảng có những đóm xuất huyết trên màng treo và màng ngoài của màng ói được mô tả không nhất quán ( Mutinelly 2003a, Jones and Swayne 2004). Những con gà đã bị tác động bởi dòng H5N1 châu Á đôi lúc biểu hiện xuất huyết từng mảng và tổng lượng chất nhầy đáng kể trong khí quản ( Elbers 2004). Tiết dịch rỉ huyết thanh trong các khoang cơ thể và phù nề ở phổi có thể được trông thấy không có hại gì. Những đóm chảy máu trong màng nhầy của dạ dày tuyến, nó thường được mô tả trong phần chính của sách trong phần trước, chỉ có sự khác biệt được gặp trong gia cầm đã nhiễm với dòng H5N1 châu Á (Elbers 2004). Những tổn thương mô học khác nhau gắn với kháng nguyên của virus có thể được phát hiện ở các mô khác nhau ( Mo 1997). Virus được trông thấy đầu tiên trong màng trong của những tế bào. Vào một giai đoạn sau đó những tế bào bị nhiễm virus được phát hiện trong cơ tim, tuyến thượng thận và tuỵ tạng. Những tế bàp thần kinh cũng như tế bào thần kinh đệm của bộ não cũng bị nhiễm.Về bệnh lý, một tiến trình tương tự virus màng trong khác có thể được thừa nhận nơi màng trong và sự hoạt hoá của bạch cầu chỉ dẫn đến một hệ thống và sự phân bào rời rạc phóng thích khả năng dễ mắc bệnh đến tim phổi hoặc nhiều cơ quan hoạt động kém (Feldmann 2000, Klenk 2005). (ii) Ở động vật hữu nhũ chúng thể hiện một sự tấn công kéo dài của những triệu chứng bệnh và một tiến trình kéo dài của bệnh, triệu chứng thần kinh và mô học, những tổn thương bộ não gây mưng mủ trội hơn hẳn sự hình dung (Perkins and Swayne 2002a, Kwon 2005). Tuy nhiên, virus cũng có thể được phân lập từ những cơ quan khác. Quá trình được mô tả trong ngỗng, vịt, đà diểu và những loài khác tiêm thí nghiệm với dòng HPAI H5N1 châu Á. Trong những chim cho trứng, chứng viêm của buồng trứng, vòi trứng, và sau đó nang bị vỡ, cái gọi là viêm phúc mạc lòng đỏ trứng, có thể được trông thấy. Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - 6 - (iii) Ở vịt, mồng biển, chim sẻ, chỉ sự tái bản của virus được tìm thấy. Những loài chim này đã thể hiện viêm phổi nhẹ, viêm khí quản và thỉnh thoảng tế bào bạch cầu và viêm mô cơ tim ( Perkins and Swayne 2002a, 2003). (iv) Trong những thí nghiệm được mô tả bởi Perkins và Swayne (2003), chim bồ câu và chim sáo biển chứng tỏ khả năng kháng lại sự tiêm nhiễm của virus H5N1. Tuy nhiên, Werner và cộng sự ( công bố) đã có khả năng gây ra bệnh thần kinh, sự thừa hưởng đến viêm não không làm mưng mủ (KlopBesch 2006), trong 5/16 chim bồ câu dùng một chủng H5N1 HPAI phân lập cách đay không lâu. 2. Vi-rút cúm khuyếch tán và lây truyền như thế nào? Loài thủy cầm là nguồn của tất cả các loại vi-rút cúm trong tự nhiên qua hàng thế kỷ, kể cả týp H5 và H7 nhưng thường có độc tính thấp. Tuy nhiên chính các chủng độc tính thấp H5 và H7 này khi truyền cho gia cầm, chúng biến đổi, đột biến gen để trở thành chủng độc tính cao gây nên dịch. Trong thời gian gần đây, người ta ghi nhận một số loài chim di trú có khả năng khuyếch tán vi-rút H5N1 độc tính cao này. 3. Hiện nay dịch cúm gia cầm xảy ra như thế nào? - Dịch cúm gia cầm bắt đầu xảy ra vào giữa năm 2003 tại Đông Nam Á, là dịch cúm gia cầm lớn nhất và nghiêm trọng nhất trong lịch sử loài người, làm chết hàng loạt các loài chim. Tác nhân gây bệnh là vi-rút H5N1 tồn tại dai dẳng, đã giết chết hay khiến con người tiêu hủy ước tính khoản 150 triệu con chim và gia cầm. Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - 7 - Hiện nay vi-rút này được xem là tác nhân gây dịch tại Indonesia, Việt Nam, một số tỉnh Cambodia, Trung Quốc, Thái Lan và Cộng Hoà Nhân Dân Lào. Ngoài ra từ giữa tháng 12/2003 – đầu tháng 2/2004, cúm gia cầm do H5N1 được báo cáo ở 8 quốc gia Châu Á: Hàn Quốc, Việt Nam, Nhật Bản, Thái Lan, Cambodia, Cộng Hoà Nhân Dân Lào, Indonesia và Trung Quốc. Hầu hết các quốc gia này chưa bao giờ từng xảy ra dịch cúm gia cầm trong lịch sử của họ. - Đầu tháng 8/2004: cúm gia cầm do H5N1 lần đầu tiên bùng nổ tại Malaysia, kế đến là Nga vào cuối tháng 7/2005, một số tỉnh Cộng Hoà Kazakhtan và Mông Cổ vào đầu 8/2005. Vào đầu 9/2005 cúm cũng ghi nhận tại Thổ Nhĩ Kỳ và Romania. Hiện nay Nhật Bản, Hàn Quốc và Malaysia được đưa ra khỏi danh sách các quốc gia bị dịch. - Tính đến 24/08/2006 có 59 quốc gia có gia cầm bị nhiễm vi-rút cúm H5N1. 4. Cúm gia cầm ảnh hưởng đến sức khoẻ con người như thế nào? (a) Sự lan rộng và tồn tại lâu dài của dịch cúm gia cầm gây ra 2 mối nguy cơ lớn đối với sức khoẻ con người: Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - 8 - - Nguy cơ lây nhiễm trực tiếp vi-rút cúm từ gia cầm bị bệnh, gây bệnh rất nặng, trong đó chủng vi-rút H5N1 gây bệnh nghiêm trọng và có tỉ lệ tử vong cao (>50%), chủ yếu là bệnh viêm phổi và suy đa cơ quan. Đa số xảy ra trên những bệnh nhân trước khi mắc bệnh thì hoàn toàn khoẻ mạnh. - Quan trọng hơn, nguy cơ vi-rút bị đột biến, biến đổi gen nên dễ lây truyền từ gia cầm sang người, rồi từ người sang người. Sự biến đổi này là khởi phát đại dịch. (b) Các trường hợp cúm gia cầm H5N1 xảy ra trên con người: - 1997: có 18 trường hợp đầu tiên xảy ra ở Hong Kong, gây tử vong 6 trường hợp (chiếm tỉ lệ 33,33%). - 2003: có 2 trường hợp xảy ra ở Hong Kong trong 1 gia đình có tiền sử đi du lịch Trung Quốc gần đây, gây tử vong 1 trường hợp (chiếm tỉ lệ 50 %). - 2004: tại Thái-lan có 17 ca và tử vong 12 (chiếm tỉ lệ 70,59%), Việt Nam có 29 ca và tử vong 20 (chiếm tỉ lệ 68,97 %). - 2005: có 5 quốc gia có bệnh nhân nhiễm, tổng cộng 95 ca và tử vong 41 (chiếm tỉ lệ 43,16 %) - Tính đến 23/08/2006: các trường hợp nhiễm vi-rút cúm H5N1 được xác định bằng xét nghiệm được báo cáo tại 9 quốc gia với 96 ca bị nhiễm và tử vong 64 (chiếm tỉ lệ 66,67 %) trong đó không có Việt Nam. Tóm lại, dịch cúm A (H5N1) ở người đã ghi nhận tại 10 quốc gia trên thế giới, với 232 trường hợp mắc bệnh và có tổng cộng 134 trường hợp tử vong (chiếm 57,9%). - Riêng tại Việt Nam, từ ngày 14/11/2005 đến nay gần 9 tháng không ghi nhận trường hợp mắc mới cúm A (H5N1) ở người. Tính từ trường hợp mắc cúm A(H5N1) đầu tiên tại Việt Nam (26/12/2003) đến nay đã ghi nhận 93 trường hợp mắc tại 32 tỉnh/thành phố, trong đó có 42 trường hợp tử vong. (xem chi tiết số liệu bảng 1) (c) Con người bị nhiễm vi-rút cúm H5N1 trong trường hợp nào? - Tiếp xúc trực tiếp với gia cầm bị bệnh, tiếp xúc với bề mặt hay vật dụng bị nhiễm phân của gia cầm bị bệnh. Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - 9 - - Hầu hết các trường hợp xảy ra ở nông thôn, ngoại ô hay nơi có nuôi gia cầm. - Phân và chất tiết của chim nhiễm bệnh thảy ra môi trường chứa nhiểu vi-rút cúm gây bệnh xuống môi trường rất lớn. - Nghiêm trọng hơn cả là người nuôi gia cầm trong vùng dịch tễ thấy gia cầm có triệu chứng nhiễm bệnh là làm thịt, chế biến rồi dùng hay bán ra thị trường. Nguồn tiếp xúc có nguy cơ cao là khi con người giết gia cầm, nhổ lông và chế biến trước khi đem nấu chín. 5. Triệu chứng của bệnh cúm gia cầm ở người là gì? Dựa trên các yếu tố và triệu chứng sau: (a) Yếu tố dịch tễ: - Tiếp xúc với gia cầm bị bệnh trong vòng 2 tuần trước đó (nuôi, buôn bán, vận chuyển, giết mổ, ăn thịt gia cầm bị bệnh, ăn tiết canh v.v...), hoặc sống ở vùng có dịch cúm gia cầm. - Tiếp xúc gần với người bệnh đã xác định cúm, hoặc người bệnh tử vong vì viêm phổi chưa rõ nguyên nhân. (b) Lâm sàng: Bệnh diễn biến cấp tính và có thể có các biểu hiện sau đây: - Có dấu hiệu nhiễm khuẩn: sốt trên 38oC, có thể rét run - Các triệu chứng về hô hấp: o Ho, thường ho khan, đau ngực, ít gặp triệu chứng viêm long đường hô hấp trên. o Khó thở, thở nhanh, tím tái, o Ran nổ, ran ẩm khi nghe phổi o Có thể dẫn đến suy hô hấp cấp tiến triển (ARDS). - Triệu chứng tuần hoàn: nhịp tim nhanh, đôi khi có sốc. - Các triệu chứng khác: đau đầu, đau cơ, tiêu chảy, rối loạn ý thức - Suy đa tạng. Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - 10 - (c) Cận lâm sàng: - X quang phổi: Tổn thương thâm nhiễm lan toả một bên hoặc hai bên, tiến triển nhanh - Xét nghiệm máu: o Công thức máu: số lượng bạch cầu: bình thường hoặc giảm. o Khí máu: giảm oxy máu khi bệnh tiến triển nặng + PaO2 giảm (< 85 mmHg), có thể giảm nhanh (dưới 60 mmHg). Tỷ lệ PaO2/FiO2 dưới 300 khi có tổn thương phổi cấp (ALI), dưới 200 khi có suy hô hấp cấp tiến triển (ARDS). - Chẩn đoán vi sinh vật: o Làm RT-PCR để xác định vi rút cúm A/H5 o Phân lập vi khuẩn theo thường quy II. Chẩn đoán bệnh trong phòng thí nghiệm 1. Sự thu thập mẫu xét nghiệm Những mẫu xét nghiệm nên dược thu thập từ một vài xác xúc vật chết còn tươi và từ những chim bị bệnh của một ßock. Theo lý tưởng, sự lấy mẫu đầy đủ được nhìn lại bằng phương pháp thống kê và sự chẩn đoán được làm trên một đế ßock. Khi thu thập mẫu nghi nhiễm HPAI, tiêu chuẩn an toàn phải được khảo sát để tránh sự phơi bày của những người sưu tập mẫu đến khả năng của HPAIV (Bridges 2002), Nguyên tắc chỉ đạo được đề nghị bỡi CDC (CDC 2005). Khi xét nghiệm virus, những bông thấm thu được từ lỗ huyệt và vùng hầu thông thường cho phép một phòng thí nghiệm điều tra đầy đủ và hoàn chỉnh. Vật liệu thu thập trên những mẫu bông nên được trộn vào trong 2-3ml mẫu đại diện của một môi trường vận chuyển đẳng trương vô trùng bao gồm kháng sinh bổ sung và một protein nguồn (e.g. 0,5%[ w/v] albumin huyết thanh bò, 10% huyết thanh bò hoặc một dung dịch pha lấy ở giữa não). Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - 11 - Khi mổ xẻ để phân tích, mang ra ngoài dưới những điều kiện an toàn và tránh phát tán mầm bệnh (xem trọng), những mẫu bệnh phẩm của não, khí quản/phổi, lách và cái gì đó chứa trong ruột không được bảo quản được thu thập cho việc phân lập virus. Mục đích của huyết thanh học, những mẫu máu tự nhiên được lấy. Một số mẫu đã thu thập nên phát hiện bằng một khoảng thời gian tin cậy 95% cho một giới hạn với một sự phổ biến 30% . 2. Sự vận chuyển mẫu xét nghiệm Những mẫu bông thấm, mô và máu nên được giữ lạnh khi vận chuyển nhưng không cho phép đông đá. Nếu những trở ngại gặp phải trên đường vận chuyển làm thời gian kéo dài hơn 48h, những mẫu xét nghiệm nên được đóng băng và vận chuyển trên cacbondioxit đậm đặc. Trong tất cả các trường hợp, những điều chỉnh an toàn khi vận chuyển (e.g. IATA rules) nên được khảo sát kỹ để tránh phát tán mẫu bệnh và sự phơi nhiễm của con người trong suốt quá trình vận chuyển. Nó là thích hợp cao để tiếp xúc phòng thí nghiệm được bổ nhiệm Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - 12 - cho việc chẩn đoán trước khi gửi những mẫu phân tích đến và, lý tưởng, troen tru trước khi thu thập chúng. 3. Phát hiện trực tiếp sự tiêm nhiễm của AIV Cơ bản, đó là hai (parallel) con đường của những phương pháp chẩn đoán chúng được thử để phân lập và kiểu phụ của virus bằng những phương pháp cơ bản ( xem sổ tay OIE 2005 ) và phát hiện phân tử và đặc trưng của bộ gen virus. Thông thường, AI virus được phân lập bỡi sự tiêm miễn dịch của những miến gạt ướt hoặc những mô đồng chất của trứng gà có phôi từ 9- 11 ngày tuổi, thường bằng màng đệm túi niệu ( Woolcock 2001 ). Phụ thuộc dạng tác nhân, những phôi có thể hoặc không thể chết với 5 ngày khảo sát , và thừơng đó là những thương tổn đặc thù để được trông thấy trong phôi này hoặc màng túi niệu ( Mutinelli 2003b). Những quả trứng được tiêm chủng với HPAIV bao gồm vật liệu thường chết trong vòng 48 giờ. Sự xuất hiện của một tác nhân ngưng kết có thể được phát hiện trong tấm gạt của túi niệu. Sự ngưng kết (HA) là một kỹ thuật vô tình yêu cầu ít nhất 106.0 mảnh nhỏ trong mỗi ml. Nếu chỉ tập trung một lượng thấp virus được hiện diện trong chất để tiêm chủng, tuỳ vào hai sự đi qua được đẩy mạnh trong những trứng được thụ tinh có thể cần thiết cho một vài giống LPAIV, trong kiểu để sản xuất đủ virus để phát hiện bằng HA. Trong trường hợp của HPAIV , một sự đi qua thứ hai sử dụng chất để tiêm chủng pha loãng có thể thuận lợi cho sự sản xuất tối ưu của sự ngưng kết. Sự phân lập ngưng kết được mô tả kháng nguyên bằng thử nghiệm ức chế ngưng kết (HI) sử dụng (mono-) kháng kháng huyết thanh loại phụ 16 H và cho việc kiểm soát, kháng lại những những type khác nhau của virus trên gia cầm, những type này cũng thể hiện hoạt động nhưng kết. Loài phụ NA có thể được được xác định sau đó bởi thử nghiệm ức chế neuraminidase, mặc khác yêu cầu laọi phụ huyết thanh dặc biệt ( Aymard 2003 ). Trong trường hợp phân lập những dòng H5 hoặc H7 được chạm trán, bảng liệt kê tác nhân trong động mạch gây bệnh (IVPI) cần thiết cho việc xác định để Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - 13 - phân biệt giữa kiểu LP và HP (Allan 1977 ). Đó được hoàn thành bởi sự tiêm chủng iv của 10 con gà được 6 tuần tuổi với virus phân lập trong trứng phát triển ( 0,1 ml của 1 trong 10dung dịch pha loãng của dịch túi niệu bao gồm một độ chuẩn lớn hơn 1 trong 16). Những con gà được khảo sát trên một thời kỳ mười ngày có triệu chứng bệnh. Những kết quả được nhập và bên trong một bảng biểu thị một virus HPAI khi tỷ lệ lớn hơn 1.2 vẫn được sử dụng. Như một sự lựa chọn, một HPAI phân lập được thử sức khi tối thiểu 7 ngoài 10 ( 75% ) gà được tiêm chủng chết với giai đoạn khảo sát. Những thủ tục cơ bản được mô tả có thể đưa đến một sự chẩn đoán HPAI trong khoảng thời gian 5 ngày nhưng có thể đòi hỏi nhiều hơn hai tuần để loại trừ sự có mặt của AIV. Trong tình huống thêm vào, những công cụ chẩn đoán chất lượng cao ( SPF eggs, H- and N-subtype specific antisera) và kỹ năng của mỗi người là điều kiện quyết định trước hết. Ngày nay, không một sự ứng dụng nuôi cấy tế bào nào cho việc phân lập AIV, sự phân lập AIV có thể đạt được sự nhạy cảm của những trứng mái có phôi ( Seo 2001). ii) Một sự tiếp cận nhanh chóng, đặc biệt khi loại trừ sự tiêm nhiễm được đòi hỏi, tận dụng kỷ thuật sinh học phân tử, nó nên theo một kiểu phân tầng: sự hiện diện của RNA đặc biệt của virus cúm được phát hiện thông qua kỹ thuật RT-PCR kỹ thuật này nhằm vào những đoạn của gen M, hầu hết những vùng genome bảo tồn cao của những virus cúm ( Fouchier 2000, Spackman 2002), hoặc những gen mã hoá capsid (Dykaer 2004). Khi một kết quả dương tính đạt được, RT-PCRs sẽ khuếch đại những đoạn của gen ngưng kết của loài phụ H5 và H7 được chạy để phát hiện sự có mặt của AIVs có thể khai báo ( Dybkear 2004, Spackman 2002). Khi sự đáp lại dương tính, một chẩn đoán phân tử của loại tác nhân gây bệnh (LP chống lại HP) có thể thực hiện được sau khi giải trình tự một đoạn của gen HA trải dài vùng phân tách bỡi enzyme proteoza nội thích ứng. Hiện tại phân lập với những amino acid phức tạp có tính bazơ được phân loại như HPAI. PCRs và những kỷ thuật DNA khác đang được thiết kế cho việc phát hiện dòng H5N1 châu Á (Collins 2002, Payoungporn 2004, Ng 2005). Loài phụ Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - 14 - Non-H5/ H7 có thể được nhận diện bởi một RT-PCR hợp với tiêu chuẩn và phân tích trình tự sau đó của đơn vị dưới HA-2 (Phípp 2004).Đó là những primer cho mỗi loài phụ NA. Một đặc trưng đầy đủ có thể đạt được trong vòng 3 ngày, đặc biệt khi kỷ thuật real time PCR được sử dụng (Perdue 2003, Lee and Suarez 2004). Tuy nhiên những chip DNA được phát triển chúng có thể xúc tiến việc sắp xếp có hiệu quả hơn các loại virus AI (Li 2001, Kessler 2005). Một sự chẩn đoán loại trừ thì có khả năng thực hiện trong khoảng một ngày làm việc một mình. Những bất lợi của những phương pháp chẩn đoán phân tử là giá thành để trả cho việc mua những thiết bị và những thứ có thể dùng, nhưng nếu có sẵn, một vài mẫu có thể được phân tích với ít người trong thời gian ngắn hơn cực kì so với phân lập virus trong trứng. Tuy nhiên, không nên giữ bí mật rằng mỗi phản ứng PCR hoặc lai phân tử, ngược với phân lập virus trong những quả trứng, chứa chấp một bản chất không rõ ràng liên quan đến sự hiện diện của những thay đổi đặc biệt trong việc phân lập tại những vị trí liên kết của những primer và/hoặc những probe chúng có thể đưa đến thử nghiệm âm tính giả. Do đó, một sự kết hợp của sinh học phân tử ( e.g. kết quả sàng lọc) và những phương pháp phân loại (e.g. đặc trưng không thay đổi của phân lập và xác nhận của phương pháp chẩn đoán của một bảng phụ lục) có thể giúp để đối trọng sự bất lợi của hai nguyên lý. Những phương pháp thử nghiệm nhanh được thiết kế cho việc phát hiện kháng nguyên của virus trong những vết mô trong phương pháp xét nghiệm kính phết và cryostat section khi sử dụng miễn dịch phát huỳnh quang hoặc thử nghiệm miễn dịch liên kết enzyme bắt giữ kháng nguyên (ELISA) và những hệ thống que đo mực nước dòng chảy phần bên ở trong chất lưu trong miếng gạt. Cho đến bây giờ, những kỷ thuật có độ nhạy thấp hơn kỷ thuật phân lập virus hoặc PCR,và do đó có thể gặp khó khăn để chấp nhận cho một phương pháp chẩn đoán hợp lý, đặc biệt của một bảng danh mục ( Davision 1998, Selleck 2003, Cattoli 2004). Ứng dụng của những phương Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - 15 - pháp xét nghiệm nhốt trên mắt phẳng trong lĩnh vực thú y thì vẫn còn trong giai đoạn phôi thai và cần được đẩy mạnh việc phát triển. 4. Phân lập và nhận dạng virus 4.1. Phân lập virus băng tiêm miễn dịch trong những quả trứng gà có phôi 4.1.1. Quá trình vật liệu cho chẩn đoán virus 4.1.1.1. Miếng gạt lấy mẫu ở lỗ huyệt 30 miếng gạt lấy mẫu ở lỗ huyệt sẽ được chia ra như một mẫu được phân phối trong buffer chứa những kháng thể 30 ml ( isotonic PBS, pH 7,2, penicilin 2000 IU/ml, streptomycin 2 mg/ml và fungizone 0,025mg/ml). Lấy miếng gạt ra ngoài trước khi tim chủng. Sau đó, mẫu đối chứng dương tính trong nhóm đầu tiên tiêm chủng 200 µl avian influenza virus HA 107,5. Nhóm thứ hai tiêm chủng 200 µl PBS 1x cho đối chứng âm. Nhóm cuối cùng tiêm chủng 200 µl thể vẩn bước đầu của nồng độ virus. Thể vẩn từ 3 nhóm được ly tâm 3000 vòng trong 30 phút trong máy ly tâm lạnh (4oC) để lắng những mảnh mô và tất cả vi khuẩn, chất lỏng sạch trong được thu thập, sau đó chất lỏng được lọc bằng màng lọc (0,45µm). Khi nhóm đối chứng dương và âm mỗi thứ lấy 3ml vật liệu tiêm chủng cho vào ống siêu li tâm, và nhóm cuối cùng cho thể vẩn bước đầu của nồng độ virus chia vào 10 phần giống hệt nhau. Cho dung dịch pha loãng tiếp nhau (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9) thủ tục giống như nói đén ở trên được sử dụng. 4.1.1.2. Mẫu mô (cơ quan phổi) 20 mẫu phổi thu thập từ từ 10 con gà được chia ra như một mẫu cho sự phân lập virus. Nghiền mẫu mô trong một cái cối và chày tiệt trùng với thuỷ tinh tán vụn từ một pipette tiệt trùng, tạo ra một thể vẩn 10% với môi trường vận chuyển được phân phối trong buffer bao gồm kháng thể 30 ml (PBS đẳng trương, pH 7,2, penicilin 2000 IU/ml, streptomycin 2mg/ml và fungizone 0,025mg/ml), sau đó chuyển mẫu đồng nhất với môi trường vận chuyển vào bên trong ống li tâm. Khi đối chứng dương trong nhóm đầu tiêm chủng 200µl vius cúm gia cầm HA7,5. Nhóm thứ hai tiêm chủng 200 µl Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - 16 - PBS 1x cho mẫu đối chứng âm. Nhóm cuối cùng tiêm chủng 200 µl thể vẩn bước đầu của nồng độ virus. Thể vẩn từ 3 nhóm được li tâm 3000 vòng 30 phút trong máy li tâm lạnh (4oC) để lắng những mảnh mô và hầu hết vi khuẩn, dịch lỏng sạch bên trên được thu thập, sau đó dịch lỏng được lọc bằng màng lọc (0,45µm),. Sau đó nhóm đối chứng lấy 3ml vật liệu tiêm chủng vào trong ống siêu li tâm, nhóm thứ hai là đối chứng âm lấy 3ml vật liệu tiêm chủng vào trong ống siêu li tâm, và nhóm cuối cùng cho thể vẩn bước đầu của nồng độ virus chia vào 10 bản sao giống hệt nhau. Cho dung dịch pha loãng cận nhau (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9) tiến trình giống như đề cập ở trên được sử dụng. 4.1.1.3. Vật liệu • Những quả trứng gà đặc biệt sạch với mầm bệnh (SPF), 9-11 ngày tuổi • Vật soi trứng • Ethanol 70% • Kim nhọn • 22 Máy đo • Ống tiêm 1ml, 1/1/2 • Cái thoi dùng để tạo lỗ thủng trên quả trứng • Keo hồ hoặc men trám • Chất để tiêm chủng • Khay để trứng 4.1.2. Thủ tục 1. Soi trứng 1. Khảo sát những quả trứng với một biện pháp soi trứng và đặt đầu cùng của quả trứng quay lên vào bên trong những cái khay trứng. 2. Loại bỏ những trứng không được thụ tinh, có những vết nứt, phát triển không đày đủ, hoặc xuất hiện lỗ thủng. Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - 17 - 2. Sự tiêm chủng cho những quả trứng. 1. Đặt những quả trứng với đầu cùng của nó quay lên vào bên trong những cái khay trứng và đánh dấu mỗi quả trứng với một con số nhận dạng đặc biệc ( 3 quả trứng cho một mẫu bệnh phẩm). 2. Lau sạch mặt trên của những quả trứng bằng ethanol 70% và thọc một lỗ nhỏ vào bên trong vỏ xuyên qua túi khí. Ba quả trứng cho mỗi mẫu bệnh phẩm thường được tiêm chủng trong túi niệu. 3. Hút 200µl mẫu đã được xử lý vào bên trong một ống tiêm vaccine với một 22 gauge, kiêm tiêm 1/1/2 inch. Lồng kiêm vào bên trong cái lỗ đã được tạo của quả trứng. dừng một máy đâm ngắn , tiêm chủng 200µl mẫu xử lý chúng được chuẩn bị từ miếng gạt lỗ huyệt và phổi trong mỗi dung dịch pha loãng cho sự tập trung virus bên trong khoang huyệt, 10 mẫu cho mỗi nồng độ pha loãng. Rút kim ra. Tim chủng hai quả trứng khác với cách giống nhau với ống tiêm giống nhau, kim giống nhau cho toàn bộ 3 trứng đã tiêm chủng mỗi mẫu xét nghiệm. Vứt bỏ ống tiêm vào bên trong một vật chứa an toàn riêng biệt. Bịt kín những cái lỗ thủng trong những quả trứng bằng một giọt keo dáng. Ấp những quả trứng ở nhiệt độ 38-39oC và độ ẩm 60%- 70% thời gian 5 ngày. Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - 18 - 3. khảo sát những quả trứng đã được tiêm chủng Trứng được tiêm chủng được soi đến 5 ngày. Ghi nhận những quả trứng bị chết và ghi chép thời gian làm cho phôi chết. Những quả trứng chết trong ngày đầu tiên được quan tâm như không đặc biệt và không cần để ý đến. Vứt bỏ những phôi này. Những quả trứng chết trong những ngày sau đó thí có khả năng thừa hưởng virus cúm gia cầm.( hình 2) HPAI chết trong 1-2 ngày LPAI chết sau 2-4 ngày Thuận lợi: - Nguyên tắc vàng: Phương pháp được tiến cử bởi WHO, OIE - Chính xác : Độ chính xác cao nhất - Hữu ích : cho phép những nghiên cứu tiếp sau. Bất lợi : - Tốn thời gian : thường mất hơn 1 ngày - Sự an toàn phòng thí nghiệm : BLS-3 - Chất lượng cao hơn của mẫu - Những tác nhân khác nên được loại trừ - Sự nhiễm chéo 4. Sự thu hoạch của những quả trứng gà được tiêm chủng Những quả trứng được giữ lạnh ở 4oC qua đêm hoặc khoảng 4 giờ trước khi thu hoạch. Dáng nhãn một ống plastic (15ml) cho mỗi quả trứng tương ứng với con số ghi cho mẫu bệnh phẩm. Lau sạch chóp của mỗi quả trứng bằng ethanol 70%. Với kiềm vô trùng, làm vỡ lớp vỏ bên trên túi khí và đẩy màng túi niệu về một bên bằng kiềm. Sau đó sử dụng một ống tiêm và kim, chọc thủng túi ói và Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - 19 - rút kim ra khi một số lượng lớn dịch trong túi ói có thể chấp nhận được. Đặt kết quả trong một ống tách rời, kết hợp dịch túi niệu từ 3 quả trứng được tiêm chủng mỗi mẫu xét nghiệm . Ly tâm dịch thu hoạch và thực hiện một xét nghiệm hemagglutination và ủ ở 4oC/30 phút. 5. Xét nghiệm hemagglutination Vật liệu Sử dụng 96 đĩa vi chuẩn độ tốt với kiểu đáy chữ V Multichannel micropipette 5-50 µl.,single micropipette 1-200 µl Đồng hồ bấm giờ Muối phosphate buffer (PBS) pH 7,2 1% tế bào máu đỏ của gà Mẫu đối chứng dương và huyết thanh virus bệnh Newcastle. Phương pháp Dùng khay dùng một lần đáy chữ V. Phân phối 50µl dịch túi niệu từ mỗi mẫu cho vào trong một đĩa vi chuẩn độ tốt. Dùng một tip riêng biệt cho mỗi mẫu. Kể cả chứng âm và chứng dương kiểm soát những mẫu dịch túi niệu trên một trong những cái đĩa. Phân phối 50µl PBS vào trong mỗi đĩa. Thêm 25 µl 1% red blood cell vào mỗi đĩa. Mở nhẹ những tấm của đĩa để trộn. Đặt một vỏ bọc lên trên đĩa. Để cho đĩa đứng 45 phút tại phòng nhiệt. khảo sát và ghi chép kết quả. 6. Đọc kết quả a) Giải thích kết quả HI âm tính: Một cái nút nhọn của những tế bào máu màu đỏ tại đáy của V- Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - 20 - botton well. HI dương tính: một hình ảnh mờ mờ của những tế bào máu đỏ, không nút hoặc một nút rất nhỏ của những tế bào máu đỏ tại đáy của V-botton well. Đó sẽ thể hiện sự kháng ngưng kết hồng cầu và chứa đựng một đơn vị kháng ngưng kết hồng cầu. Nếu virus gây bệnh Newcastle (NDV) thì xét nghiệm ngưng kết hồng cầu là âm tính. Sau đó, chứng thực bằng kiểu phụ với xét nghiệm nhanh trực tiếp bởi việc sử dụng vet smart® test. b) Xét nghiệm nhanh bằng sử dụng vet smart® test Bộ kit xét nghiệm vet smart® test quảng cáo trên thị trường. Rockeby Avian Influenza Virus Antigen đã được sử dụng Bộ kít là một sự phát hiện kháng nguyên của Avian Influenza (Test Type A) cho việc chẩn đoán, Rockeby biomed. Singapore.Pte.Ltd ). Phương pháp xét này được thiết kế để đo lường chất lượng của kháng nguyên. 200 µl mẫu được lấy từ mỗi ống nghi ngờ kết quả avian influenza từ xét nghiệm kháng ngưng kết hồng cầu và góp phần như một mẫu. Lấy một phần chia của mẫu (dịch túi niệu) từ ống vi ly tâm với mẫu gạt thu thập. chèn miếng gạt vào trong ống mẫu xét nghiệm chứa đựng dung dịch xét nghiệm pha loãng. Trộn miếng gạt cho đến khi mẫu được tan rã vào bên trong dung dich xét nghiệm pha loãng. Để mặt ống xét nghiệm cho đến khi những mẩu rộng được đọng xuống đáy của ống. Thoát thiết bị chẩn đoán từ túi nền, và đặt nó lên trên một bề mặt nhẵn khô. Dùng ống nhỏ giọt dùng một lần đã cung cấp, giữ nổi trên bề mặt từ mẫu phân tách trong ống. Thêm 8 giọt vào bên trong lỗ thủng của mẫu bằng ống nhỏ giọt dùng 1 lần. (Hình 3). Giải thích kết quả sau 10 phút. Sự giải thích kết quả; C : band đối chứng được tìm thấy chỉ band này nó là kết quả âm tính Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - 21 - T : Nhóm xét nghiệm được xét nghiệm mẫu Kết quả âm tính từ xét nghiệm tìm thấy ở band C Kết quả dương tính từ xét nghiệm tìm thấy ở cả band C và T Xét nghiệm nhanh trực tiếp bỡi sử dụng vet smart® test bước trước để phát hiện kháng nguyên trong thể vẩn của nghiên cứa thí nghiệm trong mỗi dịch pha loãng của nồng độ virus. Kết quả dương tính trong xét nghiệm nhanh dùng để có khả năng thể hiện ghi nhận kết quả. ( Cho việc phân lập virus và phát hiện virus bằng việc sử dụng những quả trứng gà có phôi) Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - 22 - C. Kết luận - Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỷ thuật nuôi cấy phôi trứng cho kết quả chính xác nhất - Phương pháp chẩn đoán bằng kỷ thuật nuôi cấy phôi trứng tốn nhiều thời gian. - Trong phương pháp chẩn đoán bằng kỷ thuật nuôi cấy phôi trứng việc đảm bảo những quả trứng sạch là rất quan trọng. - Để khắc phục những nhược điểm của phương pháp chẩn đoán bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng cần kết hợp với các phương pháp khác như : sinh học phân tử, huyết thanh học,… D. Tài liệu tham khảo: • www.influenzaReport.com • www.adb.org/Documents/Events/2007/HPAI-control-technology- CAREC/Detection-Avian-influe • www.vphcap.org • www.who.int Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - 23 - ài liệu tham khảo A. Đặt vấn đề ...................................................................................................................2 B. Tổng quan....................................................................................................................2 I. Thông tin chung về cúm gia cầm..................................................................................3 1.Cúm gia cầm là gì? .......................................................................................................3 2. Vi-rút cúm khuyếch tán và lây truyền như thế nào?....................................................7 3. Hiện nay dịch cúm gia cầm xảy ra như thế nào? .........................................................7 4. Cúm gia cầm ảnh hưởng đến sức khoẻ con người .......................................................8 (a) Sự lan rộng và tồn tại lâu dài của dịch cúm gia cầm gây ra 2 mối nguy cơ lớn đối với sức khoẻ con người .........................................................................................................................8 (b) Các trường hợp cúm gia cầm H5N1 xảy ra trên con người .......................................9 (c) Con người bị nhiễm vi-rút cúm H5N1 trong trường hợp nào ....................................9 5. Triệu chứng của bệnh cúm gia cầm ở người là gì?......................................................10 (a) Yếu tố dịch tễ..............................................................................................................10 (b) Lâm sàng ....................................................................................................................10 (c) Cận lâm sàng ..............................................................................................................11 II. Chẩn đoán bệnh trong phòng thí nghiệm ....................................................................11 1. Sự thu thập mẫu xét nghiệm ........................................................................................11 2. Sự vận chuyển mẫu xét nghiệm...................................................................................12 3. Phát hiện trực tiếp sự tiêm nhiễm của AIV..................................................................13 4. Phân lập và nhận dạng virus ........................................................................................16 4.1. Phân lập virus băng tiêm miễn dịch trong những quả trứng gà có phôi ...................16 4.1.1. Quá trình vật liệu cho chẩn đoán virus ..................................................................16 4.1.1.1. Miếng gạt lấy mẫu ở lỗ huyệt .............................................................................16 4.1.1.2. Mẫu mô (cơ quan phổi).......................................................................................16 4.1.1.3. Vật liệu................................................................................................................17 4.1.2. Thủ tục ...................................................................................................................17 1. Soi trứng.......................................................................................................................17 2. Sự tiêm chủng cho những quả trứng............................................................................18 3. khảo sát những quả trứng đã được tiêm chủng ............................................................19 4. Sự thu hoạch của những quả trứng gà được tiêm chủng..............................................19 5. Xét nghiệm hemagglutination......................................................................................20 Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - 24 - 6. Đọc kết quả ..................................................................................................................20 a) Giải thích kết quả .........................................................................................................20 b) Xét nghiệm nhanh bằng sử dụng vet smart® test.........................................................21 C. Kết luận .......................................................................................................................23 D. Tài liệu tham khảo.......................................................................................................23