Chẩn đoán virus gumboro (infectiuos bursal disease) bằng kỹthuật gen

Semina                                                       Chn đoán virus Gumboro bng k thut gen  1  ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỚP DH06SH SERMINA CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO (INFECTIUOS BURSAL DISEASE) BẰNG KỸ THUẬT GEN Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện TS. Nguyễn Ngọc Hải Nguyễn Thị Thu Thanh MSSV: 06126133 10/2009 Semina                                                       Chn đoán virus Gumboro bng k thut gen  2  I. MỤC LỤC II. ĐẶT VẤN ĐỀ......................................................................................3 III. TỔNG QUAN………………………………………………………...4 III.1. Virus Gumboro (IBDV)……………………………………..7 III.2. Bệnh Gumboro………………………………………………7 III.2.1. Sơ lược về túi Fabricius…………………………………8 III.2.2. Lịch sử phát hiện………………………………………..9 III.2.3. Cơ chế……………………………………………….......9 III.2.4. Triệu chứng……………………………………………....11 III.2.5. Bệnh tích……………………………………………….11 III.3. Các phương pháp chẩn đoán virus Gumboro………………14 III.3.1. RT-PCR………………………………………………...14 III.3.2. RFLP…………………………………………………...17 IV. KẾT LUẬN…………………………………………………..20 V. TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………...20 Semina                                                       Chn đoán virus Gumboro bng k thut gen  3  II. ĐẶT VẤN ĐỀ Sinh học phân tử là một môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật ở mức độ phân tử. Phạm vi nghiên cứu của môn này có phần trùng lặp với các ngành khác trong sinh học đặc biệt là di truyền học và hóa sinh. Sinh học phân tử chủ yếu tập trung nghiên cứu mối tương tác giữa các hệ thống cấu trúc khác nhau trong tế bào, bao gồm mối quan hệ qua lại giữa quá trình tổng hợp của DNA, RNA và protein và tìm hiểu cách thức điều hòa các mối tương tác này. Kỹ thuật gen ngày càng có nhiều ứng dụng trong nông nghiệp và y học bảo vệ sức khoẻ con người. Nguyên lí kỹ thuật gen và các phương pháp nghiên cứu cơ bản trong công nghệ sinh học phân tử là những kiến thức cần thiết cho các nhà sinh học và kỹ sư công nghệ sinh học. Các thành tựu nghiên cứu bộ gen người, bộ gen cây lúa, và nhân bản động vật … đã mở ra một thời kỳ mới trong sinh học, giúp con người hiểu biết rõ bản chất của nhiều loại bệnh di truyền, bệnh truyền nhiễm, chẩn đoán bệnh sớm, góp phần điều trị có hiệu quả và bảo vệ sức khoẻ con người cũng như gia súc và gia cầm. Kỹ thuật gen đã được áp dụng nhiều trong chẩn đoán virus, cho phép xác định kết quả chỉ trong vòng 24 giờ. Những phương pháp chẩn đoán này có những ưu điểm cơ bản như: nhanh chóng, đơn giản, nhạy, chính xác và chi phí thấp… Hiện nay, việc chăn nuôi gia cầm ở nước ta đang gặp nhiều khó khăn. Nguyên nhân là do có nhiều dịch bệnh xuất hiện trên gia cầm gây thiệt hại nặng nề cho nhà chăn nuôi như H5N1, bệnh Gumboro… Vì vậy, việc ứng dụng những kỹ thuật gen vào việc chẩn đoán, điều trị bệnh trên gia cầm hiện nay là một tất yếu. Semina                                                       Chn đoán virus Gumboro bng k thut gen  4  III. TỔNG QUAN III.1. Virus Gumboro (IBDV) Virus Gumboro hay còn gọi là Infectious Bursal Disease Virus (IBDV). IBDV có dạng hình khối, nhiều góc cạnh, kích thước: 55-65 nm, phân tử khối: 2.10 6 Dalton (Nick, 1976). IBDV là virus dạng trần, không có vỏ bọc ngoài. IBDV có cấu trúc mạch đôi RNA cuộn tròn và được phân thành 2 đoạn riêng biệt, nó thuộc loài Avibirnavirus của họ Birnaviridae (Leong et al., 2000). Quanh nhân là vỏ protein (vỏ capsid). Lớp capsid này được hợp thành bởi 32 capsomer (đơn vị hình thái). Mỗi capsomer được tạo bởi 5 loại protein cấu trúc khác nhau: VP1, VP2, VP3, VP4 và VP5 (Viral ProteinVP). Semina                                                       Chn đoán virus Gumboro bng k thut gen  5  IBDV genome chứa hai mạch, A và B. Mạch B (2.9kb) mã hóa cho VP1 (VP1: 95kDa), người ta vẫn cho nó là một enzyme RNA polimerase phụ thuộc RNA (RNA dependent RNA polimerase-RdRp) (Bruenn, 1991; Macreadie & Azad, 1993; Spies et al., 1987). Polipeptide này hiện diện dưới dạng virus nghỉ ở ngoài tế bào chủ (virion), mang bản chất của một protein tự do và của một protein liên kết genome (còn được gọi là VPg). VPg được cố định vào đuôi 5’ của sợi dương của 2 mạch trong genome (Dobos, 1993; Spies & Muller, 1990). Mạch A lớn hơn (3.2kb) chứa hai khung đọc mở thành phần (overlapping open reading frame-ORF). ORF nhỏ sẽ mã hóa cho protein không cấu trúc VP5, không cần thiết cho quá trình sao chép virus in vitro nhưng lại quan trọng đối với khả năng gây bệnh của virus (Mundt et al., 1997; Yao et al., 1998). ORF lớn hơn mã hóa cho 1 polyprotein 110 kDa, tự xúc tác phân cắt hình thành 3 loại polipeptide: pVP2 (48 kDa), VP3 (32 kDa) và VP4 (28 kDa). VP4, một loại enzyme protease phân cắt serine- lysine (Birghan et al., 2000), nó còn tham gia quá trình tự tách RNA dư thừa (Lejal et al., 2000; Sanchez & Rodriguez, 1999). pVP2 sẽ được tách thêm những RNA dư thừa tại những Carbon cuối cùng để trở thành VP2 (40 kDa) (Da Costa et al., 2002; Lejal et al., 2000). VP2 và VP3 là những protein cấu trúc. Trong đó, VP2 chứa những vị trí kháng nguyên quan trọng và hệ thống đáp ứng miễn dịch (Heine and Boyle, 1993). Semina                                                       Chn đoán virus Gumboro bng k thut gen  6  Về miễn dịch: IBDV có hai serotype khác biệt rõ ràng, nhưng chỉ có loại serotype 1 mới có khả năng gây bệnh trên gia cầm. Serotype 1: gồm nhiều chủng gây bệnh cho gà. Có ít nhất khoảng 6 loại kháng nguyên phụ của serotype 1 được xác định bằng các thử nghiệm trung hòa trong ống nghiệm. Những virus thuộc một trong những loại kháng nguyên phụ này thường được biết dưới dạng những biến thể, nguyên nhân gây tỉ lệ tử vong trên gà từ 60-100%. Có sự khác nhau về kháng nguyên giữa các chủng cổ điển và biến thể. Miễn dịch chéo giữa những biến chủng rất nhỏ (Mc Ferran và Cs 1980). Serotype 2: gồm có chủng virus gây bệnh cho gà tây. Về phương diện miễn dịch, giữa hai serotype không có khả năng miễn dịch chéo với nhau. Tuy nhiên gà và gà tây có thể bị nhiễm các chủng virus của nhau mà không phát bệnh. Sức đề kháng: IBDV có sức đề kháng cao với các tác nhân lý, hóa và môi trường. Chịu đựng được pH từ 2-12 (Benton và cs, 1967). Ở 56 o C, IBDV tồn tại trong 5h, ở 70 o C thì bị tiêu diệt sau 30 phút, ở -50 o C trong 18 tháng độc lực không suy giảm (Landgraf và cs, 1967). Semina                                                       Chn đoán virus Gumboro bng k thut gen  7  Trong chất thải, phân, nước tiểu,... IBDV vẫn giữ nguyên tính gây nhiễm và gây bệnh trong vòng ít nhất là 52 ngày. IBDV đề kháng hoàn toàn với ether, chloroform. Trong phenol 0.5% và timerosal 1.125% ở 50 o C trong 1h, formalin 0.5% trong 6h, chloramin 0.5% trong 10 phút. Các hợp chất như: dẫn suất phenol, phức hợp iode, formol nồng độ cao, có thể diệt được IBDV. Chất chứa mầm bệnh: thận và túi Fabricius, nơi chứa nhiều virus nhất. Ngoài ra, trong các chất tiết, thức ăn, nước uống, chất độn chuồng... cũng chứa virus. Đường xâm nhiễm: trong tự nhiên, lây truyền qua đường tiêu hóa là phổ biến nhất, việc lây nhiễm qua không khí ít quan trọng. Trong phòng thí nghiệm, có thể dùng đường mũi và mắt. Sự lan truyền: Bệnh có thể truyền ngang từ gà ốm sang gà khỏe qua thức ăn, nước uống, dụng cụ chăn nuôi,... Bệnh mang tính phức tạp trong đường lây lan do sức chịu đựng của virus trong môi trường ở nhiệt độ cao, cũng như với một số hóa chất sát trùng. III.2. Bệnh Gumboro Bệnh Gumboro là bệnh cấp tính của gà, virus gây bệnh Gumboro (IBDV) phá huỷ túi Fabracius, làm giảm khả năng miễn dịch của gà.  Animated view of IBDV VP2 fit using 12 modes Mầm bệnh có thể sống hàng tháng trong chuồng trại, thức ăn, nước uống, phân... Lứa tuổi gà mắc bệnh cao nhất là 3 – 6 tuần tuổi, gà nhỏ hơn có thể mắc bệnh ở thể tiềm ẩn, không biểu hiện triệu chứng nhưng ảnh hưởng rất lớn vì nó làm ức chế quá trình sinh miễn dịch. Semina                                                       Chn đoán virus Gumboro bng k thut gen  8  III.2.1. Sơ lược về túi Fabricius Túi Fabricius là cơ quan dạng lympho, nằm gần hậu môn. Trong quá trình phát triển của bào thai, nó xuất hiện sau tuyến ức và giống như tuyến ức, túi Fabricius có cấu trúc lympho biểu mô. Túi Fabricius là cơ quan dạng lympho trung ương, quá trình biệt hóa trong túi diễn ra không bị ảnh hưởng bởi kích thích kháng nguyên từ bên ngoài. Túi Fabricius nhỏ đi rất sớm: gà khoảng tháng thứ 4 (tuổi dậy thì), nó bắt đầu teo và tới tháng 11-12 thì mất hẳn. Fig. 1. Normal size bursa of Fabricius (top left) and abnormally smaller size bursa (top right). Normal proventriculus (lower left) and abnormal proventriculus (lower right). Abnormal proventriculus has thickened lining with viscous white material over glands. Chia túi ra thành các đơn vị cấu trúc gọi là các nang (Foliculum). Mỗi nang gồm có một vùng vỏ giàu lympho bào và một vùng tủy ít tế bào hơn nhưng có chứa tương bào. Đây còn là nơi biệt hóa dòng lympho B. Semina                                                       Chn đoán virus Gumboro bng k thut gen  9  III.2.2. Lịch sử phát hiện Năm 1962, Cosgrove đã phát hiện và mô tả một bệnh mới, xuất hiện ở thành phố Gumboro, vùng Dalaware ở Hoa Kỳ. Bệnh thường thấy trên gà con với bệnh tích thường gặp chủ yếu ở thận và túi Fabricius. Lúc đầu, người ta cho rằng, bệnh là biến thể của bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (Infectious Bronchitis, IB) vì bệnh tích ở thận tương đối giống nhau. Sau này, Winterfield và Hitchner đã chứng minh rằng những con gà đã miễn dịch với IB rồi vẫn nhiễm bệnh viêm túi Fabricius. Cuối năm 1962, Winterfield đã phân lập được từ phôi trứng tác nhân gây bệnh truyền nhiễm ở gà (bệnh tích ở túi Fabricius và thận). Năm 1986-1987, lần đầu tiên những dòng biến thể của IBDV được công bố. Năm 1987, sự nguy hiểm của IBDV lần đầu tiên được công bố tại Belgium và The Netherlands. Năm 1970, Hitchner đề nghị tên chính thức cho bệnh này là Infectious Bursal Disease (IBD) hay còn gọi là Gumboro. Virus gây bệnh là Infectious Bursal Disease Virus (IBDV). III.2.3. Cơ chế IBDV tấn công chủ yếu vào mô lympho. Tế bào lympho B của túi Fabricius bị phá hủy. Tế bào lympho T của tuyến Thymus bị tổn thương. Sau 2 ngày xâm nhập vào cơ thể, thấy xuất hiện những biến đổi viêm túi Fabricius. Đặc biệt đến ngày 3-4 ở túi Fabricius, thấy xung huyết, xuất huyết, phù thủng và sự thâm nhiễm của các tế bào viêm đạt ở độ cực đại. Cùng với sự phóng virus, thân nhiệt cũng tăng đột ngột; sau đó, gây hoại tử tiến triển ở các nang (Foliculu) của túi, phá hủy tất cả các mô lympho và cuối cùng sau 5-7 ngày túi teo nhanh. Những thay đổi suy thoái phát triển ở những nơi tế bào lympho B hay tụ tập. Semina                                                       Chn đoán virus Gumboro bng k thut gen  10  Semina                                                       Chn đoán virus Gumboro bng k thut gen  11  III.2.4. Triệu chứng Thời gian ủ bệnh ngắn 2-3 ngày. - Sau khi nhiễm bệnh gà biểu hiện triệu chứng đầu tiên là cắn mổ vào hậu môn của nhau, giảm ăn, lông xù, lờ đờ, đi run rẩy, giảm cân, phân tiêu chảy màu trắng, loãng còn nhiều chất nhầy sau đó chuyển sang màu nâu, phân dính đầy xung quanh hậu môn. Hình 3.1: Gà bệnh nằm ủ rũ, xù lông. Hình 3.2: Gà bệnh tiêu chảy phân loãng trắng. III.2.5. Bệnh tích - Xác chết khô, lông xơ xác, chân khô. - Cơ đùi, cơ ngực, cơ cánh xuất huyết đỏ thành vệt hoặc thâm đen. - Mổ khám túi Fabricicus sưng to, đỏ, có xuất huyết tấm tấm hoặc cả đám, thận sưng nhạt màu. Xuất huyết trên niêm mạc dạ dày tuyến (chổ tiếp giáp giữa mề và tiền mề), ruột sưng to có nhiều dịch nhầy bên trong. Semina                                                       Chn đoán virus Gumboro bng k thut gen  12  - Nếu gà nhiễm bệnh đến ngày thứ 5,6,7 thì túi Fabricius nhỏ lại, đến ngày thứ 8 thì chỉ bằng 1/3 trọng lượng ban đầu. Hình 3.3: Túi Fabricius sưng to, đỏ, xuất huyết lấm tấm Hình 3.4: Cơ đùi xuất huyết thành từng vệt. Hình 3.5: Xuất huyết trên niêm mạc dạ dày tuyến (chổ tiếp giáp giữa mề và tiền mề). Semina                                                       Chn đoán virus Gumboro bng k thut gen  13  Semina                                                       Chn đoán virus Gumboro bng k thut gen  14  III.3. Các phương pháp chẩn đoán virus Gumboro III.3.1. RT-PCR Kỹ thuật sinh học phân tử phát triển cho phép ta có thể xác định IBDV một cách nhanh hơn bằng cách phân lập virus. Trong số những phương pháp sinh học phân tử thường được sử dụng để phát hiện bộ gene, thì phương pháp RT-PCR được sử dụng khá phổ biến. Phương pháp này có thể phát hiện bộ gene IBDV mà không cần phải tăng sinh trong môi trường nuôi cấy trước khi khuyếch đại. RT-PCR được tiến hành trong 3 bước: B1: Ly trích acid nucleic từ mẫu nghiên cứu. B2: thực hiện phiên mã ngược RNA IBDV thành cDNA. B3: khuyếch đại cDNA thu được bằng PCR. Chọn những mồi oligonucleotide trình tự ngắn bổ sung với trình tự nucleotide đặc hiệu virus. Những vùng khác nhau của bộ gen sẽ được khuyếch đại phụ thuộc vào sự định vị từ những primer được chọn. Sự khuyếch đại gen mã hoá protein vỏ bên ngoài (protein capsid outer). Ly trích acid nucleic: Trong khi RNA chuỗi đơn rất dễ bị phân huỷ bởi enzyme Rnase, thì bộ gene RNA IBDV chuỗi đôi (dsRNA) kháng sự phân huỷ bởi enzyme RNase. Trong thực tế, những tế bào nhiễm (dương tính với IBDV) chứa các chủng RNA chuỗi đơn có thể được sử dụng như một mẫu ở bước RT. Sự ly trích RNA được tiến hành một cách cẩn thận: sử dụng găng tay, những tác nhân không có RNase và phòng thí nghiệm nhân tạo. RNA IBDV có thể được ly trích từ những mô nhiễm bằng cách sử dụng một vài bộ kit có sẵn. Bằng cách khác RNA IBDV có thể được ly trích bằng cách bổ sung 1% SDS (sodium dodecyl sulphate) và 1mg/ml protein K đối với 700 μl dịch huyền phù virus (như dịch đồng nhất bìu). Ủ ấm khoảng 60 phút ở 37 0 C. Acid nucleic được thu bằng cách sử dụng protocol chuẩn cho việc ly trích phenol/chloroform ( chú ý: phenol là một chất độc và nên được xử lý và loại bỏ sau đó). Acid nucleic được thu hoạch từ giai đoạn dịch cuối cùng bằng việc kết tủa ethanol và được giữ ở trong nước cất không có RNase hoặc dung dịch đệm bền. RNA pha loãng nước nên được giữ lạnh ở nhiệt độ dưới -20 0 C cho đến khi sử dụng. Semina                                                       Chn đoán virus Gumboro bng k thut gen  15  Semina                                                       Chn đoán virus Gumboro bng k thut gen  16  Sự phiên mã ngược ( Reverse transscription) Sử dụng mồi PCR “lower” ( bổ sung với mạch dương của bộ gen IBDV) có thể tổng hợp cDNA từ cả dsRNA IBDV cũng như từ những RNA chuỗi đơn lấy từ IBDV được lấy từ những tế bào nhiễm. Hỗn hợp RNA IBDV phải được biến tính trước khi chuyển vào hỗn hợp phản ứng RT. Thêm 20% (bằng thể tích) dimethylsulphoxide vào dung dịch RNA IBDV giải lạnh. Đun nóng khoảng 3 phút ở 92 0 C và làm lạnh trên đá; một phương pháp khác là đun nóng khoảng 5 phút và ủ ấm hỗn hợp tức thì trong nitơ lỏng. Chuyển thể tích hỗn hợp biến tính vào trong hỗn hợp phản ứng. Ủ ấm theo sự chỉ dẫn của nhà cung cấp enzyme. Dung dịch cDNA thu được sau bước RT nên được giữ lạnh ở < -20 o C. Việc trì hoãn bước PCR vài tuần sau khi tổng hợp cDNA có thể là nguyên nhân gây ra kết quả PCR âm tính giả. PCR Enzyme DNA polymerase dùng cho phản ứng PCR nay đã được thương mại hóa. Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng PCR theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Cặp mồi U3/L3 được dùng để khuyếch đại gen VP2 thuộc dòng IBDV serotype 1 đã được thiết kế: Upper U3: 5'-TGT-AAA-ACG-ACG-GCC-AGT-GCA- TGC-GGT-ATG-TGA-GGC-TTG-GTG-AC-3' Lower L3: 5'-CAG-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC-GAA- TTC-GAT-CCT-GTT-GCC-ACT-CTT-TC-3' . Những mồi U3 và L3 là những mồi lai dài 44 nucleotide. Chúng bao gồm một đầu tận cùng 3’ đặc hiệu IBDV (ở những chỗ nghiêng trong trình tự chỉ ở trên) bắt cặp tại vị trí nucleotide 657 đến 676 hoặc 1193 đến 1212 của đoạn IBDV. Đầu tận cùng đặc hiệu IBDV được ghép với đầu tận cùng 5’ không đặc hiệu (loại bôi đen trong trình tự ở trên), sản phẩm PCR được tinh sạch từ quá trình khuếch đại với cặp mồi U3/L3 thì thuận lợi cho quá giải trình tự. Trong mồi U3 và L3 có những vị trí cắt giới hạn của enzyme endonuclease restriction (gạch dưới trong trình tự ở trên), kết quả sản phẩm PCR này có thể được ứng dụng trong việc tạo dòng. Cặp mồi U3/L3 tạo sản phẩm 743 bp chúng đặc hiệu cho trình tự IBDV được khuyếch đại. Sau đó, ta tiến hành bước biến tính lần cuối với 35 chu kỳ (mỗi một chu kỳ gồm một bước biến tính, một bước bắt cặp và một bước kéo dài). Đối Semina                                                       Chn đoán virus Gumboro bng k thut gen  17  với cặp mồi U3/L3, trong một chu kỳ, biến tính ở 95 0 C/30 giây và bắt cặp ở 64 0 C/ 45 giây (nhiệt độ biến tính được điều chỉnh thích ứng nếu những mồi khác được sử dụng). Những thông số đối với bước kéo dài nên được thiết lập theo lời chỉ dẫn của nhà cung cấp. Sự phát hiện có thể được tiến hành bằng điện di với sản phẩm PCR và marker trọng lượng phân tử DNA trong gel agarose 1% nhuộm với ethidium bromide ( chú ý: EB là độc chất và là tác nhân gây ung thư. Nên xử lý và loại bỏ sau đó). Ưu điểm: Phát hiện nhanh, sớm, lượng mẫu dùng để phát hiện đòi hỏi không nhiều. Nhược điểm: Ba bước phản ứng PCR phải được tiến hành đối với từng mẫu cDNA (tinh sạch, cDNA pha loãng 10-100 fold) để tránh những kết quả âm tính. Mỗi phản ứng PCR phải có phản ứng đối chứng âm và dương. Việc trì hoãn PCR khoảng một vài tuần sau bước RT có thể gây ra kết quả PCR âm tính giả. IV.4. RFLP Những năm gần đây, những kĩ thuật phân tử được sử dụng để kiểm tra những thay đổi di truyền trên IBDV đã tăng nhanh ( Wu và cộng sự,1992; Stram và cộng sự, 1994; Jackwood và Jackwood, 1997; Akin và cộng sự, 1998). Kĩ thuật thông dụng cho định dạng IBDV bao gồm những phương pháp phân tử để khuếch đại những đoạn đặc trưng của bộ gen IBDV bằng RT/PCR tiếp sau đó là bằng RFLP (Dybing và Jackwood, 1996; Jackwood và Niselsen, 1997; Jackwood và Sommer, 1997; Ture và cộng sự, 1998). Những nghiên cứu phân tích chuỗi nucleotide của VP2 giúp ta có thể phân tích được gen mã hoá cho nhóm kháng nguyên xác định của virus (Schnitzler, 1993). Phân tích RT/PCR-RFLP đã cho thấy nhạy hơn những phương pháp khác bao gồm AC-ELISA.. Sử dụng RT/PCR và RFLP cho phép ta xác định được những đặc trưng kháng nguyên phụ cũng như cho phép phân lập mầm bệnh khác từ virus vaccine (Lin và cộng sự, 1993; Liu và cộng sự, 1994; Jackwood và Jackwood, 1994, 1997; Jackwood và Nielsen, 1997). Những enzyme cắt giới hạn khác nhau đã được sử dụng cho RFLP của IBDV như BstNI hoặc EcoRII, Sty1, DraI, SspI, SacI, SauAI hoặc NboI, StuI HaeIII, TaqI và BspMI, là tất cả hiện nay được sử dụng kết hợp hoặc sử dụng riêng rẽ ( Jackwood và Jackwood, 1997; Jackwood và Neilsen, 1997; Semina                                                       Chn đoán virus Gumboro bng k thut gen  18  Dormitorio và cộng sự, 1997; Jackwood và Sommer, 1998, 1999; Banda và cộng sự, 2001). RFLP đã thành công trong việc tìm vùng biến đổi của gen VP2 trên IBDV. RNA của IBDV sau khi được chiết tách và thực hiện phản ứng RT- PCR sẽ thu được sản phẩm 743bp. Sản phẩm 743bp này còn được gọi là 700+RT-PCR. Phân tích RT/PCR-RFLP sản phẩm 743 bp về sự hiện diện và vùng đa dạng của vị trí cắt giới hạn BstNI hoặc MboI bằng cách so sánh với kích thước những đoạn giới hạn trong kết quả (jackwood và Sommer, 1997). Giữa chúng, BstNI và MboI xuất hiện để cung cấp sự nhận biết đúng đắn nhất cho sự phân lập IBDV ( Jackwood và Sommer, 1998). Jackwood và Sommer (1998) đã báo cáo 1 vài đáp ứng RFLP đạt được khi sử dụng enzyme BstNI so với enzyme MboI. Enzyme BstNI ghi nhận 1 trình tự 6 base trong sản phẩm của RT/PCR. Như vậy, khả năng đạt được của 1 RFLP BstNI mới thấp hơn so với MboI đạt được bởi vì BstNI chứa trình tự nhận biết 6 base trong đoạn sản phẩm RT/PCR 743 bp so với trình tự nhận bíêt 4 base của MboI (Jackwood và Sommer, 1998). Do lí do này, chúng tôi sử dụng MboI trong phân tích giới hạn để phân tích đa dạng di truyền giữa các dòng IBDV phân lập. Một lượng sản phẩm 700+RT-PCR được phân cắt bởi BstNI và 1 lượng khác được phân cắt bởi MboI. Sau đó profile RFLP của những đoạn giới hạn BstNI và MboI đuợc xác định sự khác nhau trên gel agarose, tốt nhất là gel 2.5% agarose. Proflie tốt nhất nên được xác định bằng cách nhuộm màu gel với thuốc nhuộm SYBR.TM. green I. Những dữ liệu của RFLP đạt được trên sự phân cắt của sản phẩm RT/PCR trong những dòng vaccine và những dòng trong phòng thí nghiệm cho biết những dòng có thể đặt vào bên trong 6 nhóm phân tử có liên quan với tính trạng phụ của kháng thể đã được nhận biết trước đó. Nhóm 1 và 2 chứa đựng những dòng biến đổi, nhóm 3 và 4 chứa đựng những dòng truyền thống, nhóm 5 bao gồm những giống Lukert/Edgar. Nhóm phân tử 6 chứa đựng giống truyền thống đặc trưng tìm thấy bên ngoài nước Mỹ. Kết quả cắt của ezyme cắt giới hạn MboI và BstNI Đọan cDNA cắt giới hạn Enzyme Nhóm virus MboI BstNI 1 229 &b 234 119, 424, 172 2 229 & 403 119, 424, 172 3 229 & 362 119, 172, 154, 139 4 229 & 362 119, 209, 172, 154 Semina                                                       Chn đoán virus Gumboro bng k thut gen  19  5 229 & 480 119, 424, 172 6 229 & 362 119, 424, 172 Sau đó, dữ liệu RFLP từ gà nhiễm bệnh đem so sánh với dữ liệu RFLP từ những phân loại virus đã thu thập được trước đó trên1 nhóm gà nhiễm bệnh khác. Những phương pháp cho phép không chỉ chuẩn đóan được sự hiện diện của IBDV trên gà , mà còn xác định được đặc trưng kiểu kháng nguyên phụ của IBVD. Có thể xác định virus từ nhóm kháng nguyên phụ 1,2,3,4,5,6 hay các nhóm khác. Khi sử dụng RT- PCR tại Elazig, phía đông Thỗ Nhĩ Kỳ, người ta đã kiểm tra được 40 mẫu dương tính với IBVD trong tổng số 56 mẫu bursa gà thu được. Sử dụng RFLP với enzyme cắt giới hạn là MboI cho 40 mẫu này người ta đã thu được kết quả như sau: các đọan dài 349 và 236 được tìm thấy trên cả 40 mẫu IBDV dương tính nhưng đọan 142 chỉ được tìm thấy trên 10 mẫu. Điều này cho thấy độ đồng nhất di truyền tồn tại trên các chủng virus là rất thấp. Semina                                                       Chn đoán virus Gumboro bng k thut gen  20  IV. KẾT LUẬN Gumboro, một bệnh có tốc độ lây nhiễm cao, có khả năng gây chết đồng loạt ở gia cầm. Gây thiệt hại nhiều cho ngành kinh tế nông nghiệp gia cầm không chỉ ở nước ta mà trên toàn thế giới. Ngày nay, cùng với các kỹ thuật gen, việc chẩn đoán, điều trị bệnh Gumboro đã được nghiên cứu và phát triển rộng rãi. Một vài kỹ thuật điển hình đã được sử dụng như: -RT-PCR -RFLP Các kỹ thuật gen này đã giúp chẩn đoán bệnh một cách nhanh chóng, với độ nhạy và độ chính xác cao. V. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Công nghệ sinh học trong thú y – Nguyễn Ngọc Hải 2 3 4 5 6 7 8 9 Semina                                                       Chn đoán virus Gumboro bng k thut gen  21         Sermina                                                            Chn đoán virus Gumboro bng k thut gen  22