Chuẩn đoán PRRSV bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào

1  TIỂU LUẬN 2  I. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong nhiều năm gần đây, ngành chăn nuôi nước ta ngày càng chiếm vai trò quan trọng trong nền kinh tế vì cơ bản nước ta vẫn là nước Nông nghiệp.Nhưng từ đầu 2007 tới nay, nhà chăn nuôi và người tiêu dùng đang vô cùng hoang mang lo lắng vì đàn heo bị chết do biểu hiện bệnh tai xanh.Và càng ngày bệnh heo tai xanh diễn biến càng phức tạp.Dưới đây là một số thông tin về căn bệnh này. Bệnh tai xanh được ghi nhận lần đầu tiên ở Mỹ vào năm 1987, do chưa xác định được căn bệnh nên gọi là “bệnh bí hiểm” (MD: Mystery Swine). Năm 1992, hội nghi quốc tế về sức khỏe gia súc đã được tổ chức thú y thế giới nhất trí và công nhận bệnh bí hiểm này là Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo (PRRS: Porcine reproductive and respiratory syndrome). Bệnh do virus PRRS gây ra, tiến triển phức tạp, khó khống chế lại ít biểu hiện triệu chứng, tỷ lệ mắc bệnh cao, bệnh xảy ra ở mọi lứa tuổi. Bệnh gây sảy thai ở thời kỳ cuối, chậm động dục, gia tăng số thai chết và heo con sơ sinh yếu, heo con chết trước khi sinh, còi cọc, chậm lớn.( “Nhà chăn nuôi cần biết”- Phan Bùi Ngọc Thảo,Phòng Di truyền Giống gia súc-Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam) Dựa vào các triệu chứng lâm sàng và bệnh tích mô tả ở phần trên để chẩn đoán. Trong phòng thí nghiệm, có thể dùng phản ứng Immunoperoxidase một lớp (IPMA) để phát hiện kháng thể 1-2 tuần sau khi nhiễm; phản ứng kháng thể huỳnh quang gián tiếp (IFA) kiểm tra kháng thể IgM trong 5-28 ngày sau khi nhiễm và kiểm tra kháng thể IgG trong 7-14 ngày sau khi nhiễm; phản ứng ELISA phát hiện kháng thể trong vòng 3 tuần sau khi tiếp xúc, tuy nhiên chỉ xác định được tỷ lệ nhiễm.Một phương pháp khác là chẩn đoán bằng nuôi cấy tế bào động vật sau đó dùng RT- PCR để xác định( có thể sử dụng phương pháp nhuộm miễn dịch, hóa miễn dịch), mặc dù việc nuôi cấy phân lập virus trên môi trường tế bào khó, tuy nhiên xác định sự hiện diện của virus từ mẫu huyết thanh dương tính và các mẫu lâm sàng là rất cần thiết để làm cơ sở cho công tác phòng bệnh và các nghiên cứu sau này. (“Nhà chăn nuôi cần biết”- Phan Bùi Ngọc Thảo,Phòng Di truyền Giống gia súc-Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam). II. TỔNG QUAN 1. Tìm hiểu về bệnh do virus PRRS (Porcine reproductive and respiratory syndrome): Khái niệm Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo: Là một bệnh do virus gây nên với đặc điểm: - Gây chứng ăn không ngon, khó thở, sốt, sảy thai và chậm lên giống trở lại cùng với sự tăng số heo chết lúc sinh, tăng số heo con chết trước khi cai sữa. - Gây nên hô hấp khó khăn, chậm tăng trưởng và tăng tỷ lệ heo cai sữa chết (trên những đàn mắc bệnh mãn tính). 1.1. Lịch sử căn bệnh: Năm 1987, bệnh được phát hiện lần đầu tiên ở Mỹ với tên gọi “bệnh thần bí trên heo” (Mystery Swine Disease - MSD). 3  Tháng 11 năm 1990, ổ dịch PRRS đầu tiên xảy ra ở Đức và lan tràn nhanh chóng sang các quốc gia khác ở Châu Âu. Mùa đông năm 1990- 1991, lần lượt các quốc gia Châu Âu như Hà Lan, Bỉ, Pháp và Tây Ban Nha đã báo cáo về hội chứng này với nhiều tên gọi khác nhau: “Bệnh tai xanh” (Blue-eared Pig Disease), “Hội chứng hô hấp và sảy thai trên heo” ( Porcine Epidemic Abortion and Respiratory Syndrome -PEARS), hay “Hội chứng hô hấp và vô sinh” (Swine Infertility and Respiratory Disease - SIRD). Năm 1991, lần đầu tiên Wenvoort và cộng sự đã phân lập được căn bệnh ở Viện thú y trung ương Lelytad – Hà Lan đã phân lập được căn bệnh và đặt tên cho loại virus này là “Lelystad”. Năm 1992, Collins và cộng sự ở Mỹ cũng báo cáo về việc phân lập được virus gây bệnh và sử dụng tên gọi VR-2332 để chỉ các chủng phân lập ở Bắc Mỹ. Cũng trong năm 1992, hội nghị quốc tế và tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) đã nhất trí đặt tên cho bệnh này là “Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo” (porcine reproductive and respiratory syndrome- PRRS) (Võ Thị Đan Thanh, 2006) Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện vào năm 1997 trên đàn lợn nhập từ Mỹ (10/51 con có huyết thanh dương tính). Các nghiên cứu về bệnh trên những trại giống lớn tại các tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ lợn có huyết thanh dương tính với bệnh rất khác nhau, từ 1,3% cho tới 68,29%. Ở các nước khác, tỷ lệ đàn trong vùng bệnh có huyết thanh dương tính rất cao, như ở Anh là 6-75%, Mỹ là 36%,… (Phòng Dịch tễ-Cục Thú y) 1.2. Đặc điểm hình thái cấu trúc: 1.2.1. Phân loại Virus PRRS thuộc: Bộ Nidovirales. Họ Arteriviridae. Giống Arterivirus. Hình 2.1. Virus PRRS (Nguồn: http//www. agraroldal.hu) 1.2.2. Đặc điểm hình thái: Virus PRRS có cấu trúc RNA mạch đơn dương, có đường kính 40-70 nm, có vỏ bọc, kích thước genome dài 14,5 kb mã hoá cho việc tái tạo virus (Jeong-Ki Kim và cs, 2005). 1.2.3. Đặc điểm cấu trúc: 4  Virus structure Genome PRRSV Bộ gene của virus PRRS gồm có 8 khung độc mở (ORFs) mã hoá cho các thành phần khác nhau của virus. Tuy nhiên chỉ có 3 khung ORFs có ý nghĩa quan trọng trong định danh virus, đó là ORFs 7,6 và 5 quy định tổng hợp các protein tương ứng: nucleocapsid (N) 15-kDa, matrix (M) 19-kDa và glycoproteins envelope (protein GP5) 25-kDa. Đây là những protein cấu trúc quan trọng nhất, chúng chiếm 90-95% lượng protein cấu trúc của virus. • Protein N là một protein nhỏ (15 kDa) và có tính kiềm cao, điều này có thể giúp nó tương tác dễ dàng hơn với bộ gen RNA. Protein N hiện diện ở mức độ cao trong những tế bào bị nhiễm virus PRRS và chiếm từ 20- 40% lượng protein của phân tử virus. Hiện nay protein N được dùng như là một kháng nguyên để phát hiện kháng thể trong huyết thanh của heo. • Protein M có trọng lượng phân tử khoảng 18 kDa. Mặc dù chức năng của nó được biết rất ít nhưng nó được xem như có vai trò trong sự kết hợp với thụ thể trên tế bào đích, vì protein M kết hợp GP5 tạo phức hợp M-GP5 để kết hợp với thụ thể trên tế bào đích (Delputte và cs, 2001). • Protein GP5 có trọng lượng phân tử khoảng 25 kDA, là nguyên nhân gây ra hiện tượng apoptosis và đóng vai trò quan trọng trong việc nhận diện thụ thể trên tế bào đích (Nathalie và cs, 2003). Về mặt di truyền, khi phân tích gene của các dòng virus PRRS gây bệnh khác nhau, người ta xác định được 2 dòng virus riêng biệt: dòng Châu Âu (Lelystad) và dòng Châu Mỹ (VR-2332). Hai dòng virus này không những khác biệt về đặc tính gây bệnh mà khác nhau về mức độ nhất định về kiểu gene. Qua phân tích gene và theo dõi sự thay đổi trình tự Nu của các dòng PRRS, người ta đã xác định rằng ở dòng Châu Mỹ, các ORFs 7 và 6 có tính ổn định rất cao, chúng gần như không thay đổi trong suốt quá trình tiến hoá của dòng virus này, tuy nhiên, sự khác biệt giữa dòng virus Châu Âu và Châu Mỹ ở 2 khung đọc mở này là rất rõ, chẳng hạn sự tương đồng về trình tự axit amin của ORFs 7 giữa 2 dòng virus này chỉ vào khoảng 57-59% và của ORFs 6 là 70-81%. Trong khi đó, khung đọc mở ORFs 5 lại biến đổi nhiều giữa các chủng trong cùng 1 dòng Châu Mỹ và chỉ tương đồng với dòng Châu Âu khoảng 51-59%. Sự tương đồng về trình tự axit amin quy định do các khung đọc mở ORFs 2, 3 và 4 giữa các dòng Châu Mỹ và Châu Âu tương ứng chỉ ở từ 63,58% và 68% (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). 5  Nghiên cứu virus ở mức độ phân tử còn cho phép xác định được khả năng sản xuất và sử dụng virus nhược độc để làm văcxin. Người ta đã ghi nhận nhiều trường hợp hội chứng PRRS trở nên trầm trọng hơn sau khi đàn heo được tiêm vắcxin virus PRRS nhược độc vì cấu trúc gene của virus nhược độc thay thế glycine bằng arginine ở vị trí 151 của ORFs 5 sẽ hoàn nguyên rất nhanh bộ gene của chúng so với bộ gene của virus nguyên thuỷ ngay sau khi xâm nhập vào cơ thể vật chủ, và như thế độc lực của chúng cũng được phục hồi (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). 1.3. Dịch tễ học: 1.3.1. Cơ chế sinh bệnh: 6  1.3.2. Tác nhân gây bệnh: Bình thường, đại thực bào sẽ tiêu diệt tất cả vi khuẩn, virus xâm nhập vào cơ thể, riêng đối với virus PRRS, virus có thể nhân lên trong đại thực bào, sau đó phá huỷ và giết chết đại thực bào (tới 40%) phòng Dịch tễ-cục Thú y).. Đại thực bào bị giết sẽ làm giảm chức năng của hệ thống bảo vệ cơ thể và làm tăng nguy cơ bị nhiễm các bệnh kế phát. Virus xâm nhập vào tế bào bằng con đường nhập nội bào (endocytosis) qua trung gian receptor. Người ta đã xác định heparan sulfate là thụ thể của đại thực bào phế nang đối với virus(Delputte và cs, 2001; Nathalie và cs, 2003) và trên MARC-145 là vimentin, vimentin là một yếu tố quan trọng trong việc làm ổn định cấu trúc của tế bào chất trong nhiều loại tế bào khác nhau (Jeong-Ki Kim và cs, 2005). Theo Jeong-Ki Kim và cs, 2005 thì kháng thể kháng vimentin ngăn cản sự gây nhiễm của virus trên tế bào MARC-145. Khi chuyển vimentin tái tổ hợp vào 2 dòng tế bào BHK-21 và CRFK (Crandall Rees feline kidney), không nhạy cảm với virus PRRS, thì 2 dòng tế bào này trở nên nhạy cảm với PRRSV, điều đó chứng tỏ sự tấn công và gây nhiễm của virus liên quan tới vimentin, 1 loại intermediate-filament protein (Jeong-Ki Kim và cs, 2005). Khi gây nhiễm tế bào, hầu hết các chủng virus PRRS đều gây bệnh tích tế bào nhưng vẫn có một số chủng virus PRRS thì không (Christianson và Joo, 1994; Yoon và cs, 1992). Bệnh tích tế bào do virus PRRS gây ra là: tế bào co tròn, tập trung lại, sau đó dày lên, nhân co lại và cuối cùng là tách ra khỏi bề mặt nuôi cấy (dẫn liệu Hoàng Văn Năm, 2001). Benfield và cs (1992) cũng mô tả bệnh tích tế bào do virus PRRS gây ra như: các tế bào co tròn, trở nên thoái hoá (nhân kết đặc lại) và tách khỏi tế bào một lớp sau 2- 4 ngày nuôi cấy. Toàn bộ lớp tế bào bong ra sau 6 ngày. Các dòng PRRSV của Bắc Mỹ phát triển khá tốt trên MARC-145 trong khi các dòng PRRSV của Châu Âu phát triển nhanh hơn trên PAM. Nhiều phòng thí nghiệm ở Hàn Quốc và Bắc Mỹ chỉ sử dụng MARC-145 vì khó khăn khi phải nuôi cấy PAM (Han-Kook Chung và cs, 2002). Một nghiên cứu khác của Bloemraad (1994) cho thấy sau 40 giờ nuôi cấy, gần 40% tế bào PAM có bệnh tích tế bào. Tuy nhiên, kết quả này có thể thay đổi giữa các phòng thí nghiệm (Yoon, 2003). 1.3.3. Sức đề kháng của virus Virus PRRS tồn tại được trong thời gian dài hơn 4 tháng ở -700C đến -200C nhưng khoảng 90% khả năng gây nhiễm của virus bị mất trong vòng 1 tuần ở 40C. khả năng hồi phục của virus đã được báo cáo kéo dài đến 20 phút ở 560C, 24 giờ ở 370C và 6 ngày ở 210C. Virus bền vững ở pH từ 6,5 -7,5 nhưng chết nhanh khi pH 7,65 (Benfield và cs, 1999). Như vậy, virus PRRS không bền với nhiệt độ và pH. Ngoài ra, virus dễ bị diệt bởi chất sát trùng và tia cực tím 7  (dẫn liệu Trần Thanh Phong, 1996). Các chất tẩy uế có tác dụng làm giảm khả năng lây nhiễm của virus và các chất tan dầu mỡ như chloroform và eter đặc biệt hữu hiệu trong việc phá vỡ cấu trúc vỏ ngoài của virus và làm ngừng sự tái sản (Trần Đức Minh). 1.3.4. Triệu chứng lâm sàng: Lợn nái giai đoạn đẻ và nuôi con: Biếng ăn, lười uống nước, mất sữa và viêm vú, đẻ sớm khoảng 2-3 ngày, da biến màu, lờ đờ hoặc hôn mê, thai gỗ (10-15% thai chết trong 3-4 tuần cuối của thai kỳ), lợn con chết ngay sau khi sinh (30%), lợn con yếu, tai chuyển màu xanh. Tỷ lệ chết ở đàn con có thể tới 70% ở tuần thứ 3-4 sau khi xuất hiện triệu chứng. Rối loạn sinh sản có thể kéo dài 4-8 tháng trước khi trở lại bình thường. Lợn đực giống: Bỏ ăn, sốt, đờ đẫn hoặc hôn mê, giảm hưng phấn hoặc mất tính dục, lượng tinh dịch ít, chất lượng tinh kém và cho lợn con sinh ra nhỏ. Lợn con theo mẹ: Thể trạng gầy yếu, nhanh chóng rơi vào trạng thái tụt đường huyết do không bú được, mắt có dử màu nâu, trên da có vết phồng rộp, tiêu chảy nhiều, giảm số lợn con sống sót, tăng nguy cơ mắc các bệnh về hô hấp, chân choãi ra, đi run rẩy.. Lợn con cai sữa và lợn choai: Chán ăn, ho nhẹ, lông xác xơ... tuy nhiên, ở một số đàn có thể không có triệu chứng. Bệnh tích: Viêm phổi hoại tử và thâm nhiễm đặc trưng bởi những đám chắc, đặc trên các thuỳ phổi. Thuỳ bị bệnh có màu xám đỏ, có mủ và đặc chắc (nhục hoá). Trên mặt cắt ngang của thuỳ bệnh lồi ra, khô. Nhiều trường hợp viêm phế quản phổi hoá mủ ở mặt dưới thuỳ đỉnh. Điều trị: Hiện nay, vẫn chưa có thuốc đặc trị để điều trị bệnh này. Có thể sử dụng một số thuốc tăng cường sức đề kháng, điều trị triệu chứng và chủ yếu ngăn ngừa nhiễm bệnh kế phát. Phòng bệnh: Có thể sử dụng vaccine và các biện pháp vệ sinh chuồng trại. Vaccine bệnh heo tai xanh đang có bán tại Công ty thuốc thú y TW 29 Nguyễn Đình Chiểu Quận 1 TP. HCM. Đây là nơi nhập khẩu duy nhất Vaccine phù hợp với bệnh heo tai xanh ở VN. 1.4. Chẩn đoán PRRSV: 1.4.1 Chẩn đoán lâm sàng 8  Theo Benfiled (1999), khi trong đàn heo có dấu hiệu rối loạn hô hấp trên các hạng heo, sinh sản bất ổn và năng suất đàn giảm hơn bình thường thì có thể nghi ngờ bệnh do virus PRRS. Mặt khác, theo Taylor (1995) và dẫn liệu của Hoàng Văn Năm (2001) có cơ sở nghi ngờ bệnh khi: • Tỷ lệ chết lúc sinh >20% • Tỷ lệ sảy thai >8% • Tỷ lệ heo con chết trước khi cai sữa >26% • Tỷ lệ heo con chết trong tuần đầu tiên vượt quá 25%. Tuy nhiên, để xác định đúng căn bệnh cần thực hiện các phương pháp chẩn đoán phi lâm sàng khác (dẫn liệu của Võ Thị Đan Thanh, 2006). 1.4.2 Chẩn đoán phi lâm sàng: Dựa vào các triệu chứng lâm sàng và bệnh tích mô tả ở phần trên để chẩn đoán. Trong phòng thí nghiệm, có thể dùng phản ứng Immunoperoxidase một lớp (IPMA) để phát hiện kháng thể 1-2 tuần sau khi nhiễm; phản ứng kháng thể huỳnh quang gián tiếp (IFA) kiểm tra kháng thể IgM trong 5-28 ngày sau khi nhiễm và kiểm tra kháng thể IgG trong 7-14 ngày sau khi nhiễm; phản ứng ELISA phát hiện kháng thể trong vòng 3 tuần sau khi tiếp xúc, tuy nhiên chỉ xác định được tỷ lệ nhiễm.Một phương pháp khác là chẩn đoán bằng nuôi cấy tế bào động vật sau đó dùng RT- PCR để xác định( có thể sử dụng phương pháp nhuộm miễn dịch, hóa miễn dịch), mặc dù việc nuôi cấy phân lập virus trên môi trường tế bào khó, tuy nhiên xác định sự hiện diện của virus từ mẫu huyết thanh dương tính và các mẫu lâm sàng là rất cần thiết để làm cơ sở cho công tác phòng bệnh và các nghiên cứu sau này 1.4.2.1. Phương pháp phát hiện kháng thể 1.4.2.1.1. Phản ứng IPMA (Immuno peroxidase Monolayer Assay) Đây là phản ứng đầu tiên được sử dụng để phát hiện kháng thể kháng virus PRRS được gọi là kỹ thuật miễn dịch peroxidase một lớp. Kỹ thuật này có thể thực hiện trên các dòng tế bào PAM, CL2621, MARC-145. Tế bào sau khi nuôi cấy 24 giờ sẽ được gây nhiễm với PRRSV và được ủ ở 370C trong 24 giờ. Sau đó tế bào được gây nhiễm sẽ được cố định và tác dụng với huyết thanh mẫu, ủ khoảng 1 giờ ở 370C và được cho tác dụng tiếp tục với kháng kháng thể heo cộng hợp HRPO (horseradish peroxidase). Nếu mẫu huyết thanh có chứa kháng thể kháng virus thì 30- 50% tế bào sẽ có màu đỏ khi cho lớp tế bào tác dụng với dung dịch chromogen trong 30 phút. Không có sự thay đổi màu của tế bào khi kết quả là âm tính. IPMA được sử dụng nhiều ở châu âu. Trong chẩn đoán phát hiện thú nhiễm sớm, người ta thường sử dụng IPMA vì xét nghiệm này cho phép xác định thú nhiễm sau 7-15 ngày và có thể phát hiện kháng thể đến 3 tháng sau khi nhiễm PRRSV (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). Nhược điểm của phương pháp này là không thể xác định trực tiếp hàm lượng kháng thể bảo vệ. 1.4.2.1.2. Phản ứng IFA (Indirect Immunhofloresence Assay) Giống như trong kỹ thuật IPMA, kỹ thuật IFA (kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp) cũng sử dụng nuôi cấy tế bào. Quá trình thực hiện IFA cũng giống với IPMA, chỉ khác là kháng kháng thể heo sử dụng không cộng hợp với HRPO mà cộng hợp với chất phát huỳnh quang FITC (fluorescein isothiocynate). Việc đọc kết quả cần phải có kính hiển vi huỳnh quang. sự hiện diện 9  của màu huỳnh quang trong mẫu xét nghiệm chứng tỏ mẫu có kháng thể kháng virus. Phản ứng có độ đặc hiệu cao 99,5% và cho phép phát hiện kháng thể kháng virus đến 3 tháng sau khi nhiễm (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). Nhược điểm của IFA và IPMA là không thể làm tự động nên khó thực hiện với quy mô lớn. 1.4.2.1.3. Phản ứng SN (Serum Neutralizing) Đây là phản ứng trung hòa virus, phản ứng này có độ đặc hiệu cao nhất, được sử dụng để phát hiện và định hiệu giá kháng thể kháng virus. Nhược điểm của phản ứng này là đắc tiền, khó thực hiện và tốn thời gian vì kháng thể trung hoà xuất hiện chậm (1-2 tháng sau khi nhiễm). Tuy nhiên đây là phản ứng rất tốt để xác định miễn dịch bảo hộ (Nguyễn Ngọc Hải, 2007 và dẫn liệu của Võ Thị Đan Thanh, 2006). 1.4.2.1.4. Phản ứng ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Xét nghiệm ELISA (xét nghiệm miễn dịch hấp phụ gắn kết enzyme) có độ nhạy và độ đặc hiệu cao và thực hiện đơn giản hơn so với IFA và IPMA, có thể phát hiện kháng thể trong vòng 3 tuần sau khi nhiễm bệnh. Tuy nhiên hạn chế lớn nhất của phương pháp này là dễ cho kết quả dương tính giả. Tỷ số S/P (sample/position)≥0,4 thì kết quả được ghi nhận là dương tính. Các phản ứng IFA, SN, ELISA được sử dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm ở miền Nam nước Mỹ (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). 1.4.2.2. Các phương pháp phát hiện kháng nguyên Phương pháp FA (florescent antibody staining-kháng thể huỳnh quang) và IHC (immunohistochemistry staining-hoá mô miễn dịch) có thể được sử dụng để phát hiện kháng nguyên virus trong mẫu mô. Phương pháp FA có thể thực hiện trực tiếp trên các mẫu đông lạnh. Phương pháp này cho kết quả nhanh và chi phí thấp, tuy nhiên lại có độ nhạy và độ đặc hiệu không cao. để đảm bảo kết quả chẩn đoán, mẫu cần được lấy và làm lạnh nhanh. Phương pháp IHC cũng được thực hiện trên mẫu mô cắt lát, tuy nhiên phương pháp này có thể thực hiện với các mẫu mô đã được cố định bằng formol. Điều này là khá quan trọng vì rất thuận lợi trong việc bảo quản mẫu bệnh phẩm. IHC có độ nhạy cao hơn so với FA nhưng mất nhiều thời gian và tốn chi phí hơn (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). 1.4.2.3 Phát hiện gen của virus PRRS Kỹ thuật PCR được phát triển để phát hiện RNA của virus PRRS trong các mẫu bệnh phẩm. Kỹ thuật này không những có độ đặc hiệu và độ nhạy cao mà thời gian cần thiết thực hiện xét nghiệm cũng ngắn hơn so với phương pháp nuôi cấy tế bào vì thế nó được sử dụng khá rộng rãi trong chẩn đoán phát hiện virus. Nhiều dạng khác nhau của PCR được sử dụng, hầu hết chúng được sử dụng để phát hiện các vùng ORFs 7, ORFs 6 hay ORFs 1b của virus. Để gia tăng độ nhạy trong chẩn đoán PRRSV, nhất là để phân biệt 2 dòng virus thì Han-Kook Chung và cs (2002) đã sử dụng phương pháp multiplex reverse transcription-nested PCR (RT-nPCR) . Fun in wang (1994) đã sử dụng kỹ thuật RT-PCR trực tiếp để phát hiện sự tồn tại của virus PRRS trong xác heo thương phẩm và trong tinh dịch con đực. Tuy nhiên kết quả chẩn đoán chưa đủ làm cơ 10  sở để kết luận bệnh mà chỉ cho phép xác định tình trạng nhiễm của đàn và kỹ thuật này đòi hỏi kỹ thuật viên phải có trình độ kỹ thuật cao. Các quy trình thu nhận và trữ mẫu, quy trình chiết tách và tinh sạch RNA phải được thực hiện một cách nghiêm ngặt. Do đó kết quả của phản ứng PCR giữa các phòng thí nghiệm khác nhau có thể sẽ khác nhau. 1.4.2.4. Phân lập virus trên môi trường tế bào Trong phân lập virus, cũng như các phương pháp chẩn đoán khác, khâu đầu tiên và quan trọng nhất đó là cách lấy mẫu và bảo quản mẫu. Mẫu xét nghiệm có thể là huyết thanh, dịch tràn ổ bụng, dịch phế nang, dịch mẫu mô (hạch, phổi, lách). Trong số đó thì dịch phế nang và huyết thanh được đánh giá là mẫu tốt nhất cho việc phân lập virus khi dịch bùng phát. PRRSV tồn tại trong huyết thanh lâu hơn trong mô, nhưng đối với thú già thì lại có nhiều PRRSV trong mô hơn trong máu. Đối với các trường hợp sảy thai ở thời kỳ cuối hay sinh sớm thì nên lấy mẫu ở những heo con sinh ra yếu, trước khi cho bú hơn là thai khô, thai chết lưu. Việc phân lập virus đối với những thú nhiễm bệnh mãn tính thì hạch amiđan, dịch rữa khí quản là những mẫu có khả năng nuôi cấy tốt hơn so với mẫu huyết thanh và phổi. Một điểm quan trọng khác cần chú ý là nhiệt độ bảo quản mẫu trong quá trình vận chuyển và phân lập virus. Các mẫu bệnh phẩm cần phải được bảo quản ở 40C hay thấp hơn trong quá trình vận chuyển mẫu đến phòng thí nghiệm và thời gian giữ mẫu ở nhiệt độ này tốt nhất là không quá 48 giờ. Những mẫu bệnh phẩm lưu giữ trong một thời gian dài bắt buộc phải được bảo quản ở - 700C, không được đông và rã đông mẫu nhiều lần. Việc phân lập virus gặp nhiều khó khăn vì virus chỉ có thể nhân lên trên hai loại tế bào, đó là: đại thực bào phế nang heo (Porcine Alveolar Macrophage-PAM) và tế bào thận khỉ (MARC-145, CL2621). Tuy nhiên theo Yoon và Stevenson (1999) thì không phải tất cả virus PRRS đều phát triển ở cả hai loại tế bào này mà PAM nhạy cảm với virus hơn so với CL2621, đặc biệt khi mẫu được dùng là huyết thanh. Còn Han-Kook Chung và cs (2002) cho rằng PRRSV chủng Châu Mỹ phát triển tốt hơn trên MARC- 145, ngược lại PRRSV chủng Châu Âu lại phát triển nhanh hơn trên PAM. Trong Tiểu luận Chẩn đoán PRRSV bằng kỹ thuật nuôi cấy tế báo này, chúng ta sẽ tìm hiểu kỹ về phương pháp chẩn đoán PRRSV bằng cách phân lập trên môi trường tế bào MARC-145 và xác định bằng RT-PCR. 2. Chẩn đoán PRRSV bằng cách phân lập trên môi trường tế bào MARC-145 và xác định bằng RT-PCR 2.1. Tổng quan về nuôi cấy tế bào Nuôi cấy tế bào là kỹ thuật duy trì và phát triển các tế bào ở ngoài cơ thể sống nhưng vẫn thực hiện đầy đủ các chức năng biến dưỡng và chức năng chuyên biệt của tế bào. Quá trình nuôi cấy tế bào cho phép mỗi tế bào đóng vai trò như những tế bào độc lập, nó có thể phân chia nhờ quá trình nguyên phân và quần thể tế bào tiếp tục phát triển cho đến khi bị giới hạn bởi bề mặt nuôi cấy hay sự cạn kiệt dinh dưỡng. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào được tiến hành lần đầu tiên vào năm 1907 bởi Harrison. Ngày nay kỹ thuật này đã được ứng dụng rộng rãi trong y học và thú y học để nghiên cứu tác động của các chất lên tế bào hay nghiên cứu virus để phân lập, giám định, chuẩn độ virus, xác định tính chất huyết thanh học, quan sát hình thái siêu cấu trúc của virus và đặc biệt là sản xuất vaccine. Quá trình nuôi cấy thường gồm những tế bào thuộc cùng một loại. 11  2.1.1. Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy tế bào Môi trường nuôi cấy tế bào phức tạp và giàu chất dinh dưỡng để tạo điều kiện tốt nhất cho sự phát triển của tế bào. Môi trường có thể được cung cấp dưới dạng dung dịch để sử dụng ngay hay dưới dạng dung dịch đậm đặc hoặc dạng bột. Dạng dung dịch đậm đặc có thể sử dụng sau khi pha loãng với nước cất tiệt trùng, trong khi dạng bột phải được hoà tan trong nước và tiệt trùng bằng cách lọc qua lưới lọc 0,22μm. Thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy: • Carbonhydrate: glucose (5-10mM) được dùng trong hầu hết các công thức để cung cấp nguồn năng lượng cũng như tiền chất cho tổng hợp sinh học, như ribose cần cho tổng hợp acid nucleic. • Amino acid (0,1-0,2mM) cũng được dùng như là nguồn tiền chất cho tổng hợp protein. Người ta thường sử dụng glutamine, tuy nhiên, ammoniac được thành lập từ chuyển hoá glutamine có thể ức chế sự sinh trưởng trong một số quá trình nuôi cấy. • Muối cũng được dùng để làm cho môi trường có tính đẳng trương, duy trì sự cân bằng với phần bên trong tế bào. • Bicarbonate (NaHCO3) cũng được dùng để đóng vai trò như hệ thống đệm trong sự kết hợp với 5-10% CO2 được cung cấp bởi tủ ủ. Điều này cho phép môi trường duy trì có pH từ 7,2-7,4. • Vitamin và hormone hiện diện ở nồng độ tương đối thấp và được dùng để kích thích sinh trưởng. Lượng vitamin và hormone thay đổi nhiều giữa các công thức môi trường khác nhau. Điều này cho thấy nhu cầu vitamin của các dòng tế bào là khác nhau. • Huyết thanh: được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để cải thiện sự sinh trưởng của tế bào, giúp tế bào dễ bám vào bề mặt thủy tinh và phát triển mạnh hơn. Huyết thanh thai bò (Fetal Bovine Serum- FBS) thường được sử dụng bổ sung vào cho môi trường nuôi cấy, nhưng lại đắt tiền và hiếm. Nồng độ huyết thanh thường được dùng từ 5- 20%. Các protein trong huyết thanh như albumin, fibronectin, globulin giúp tế bào bám dính và phát triển. • Kháng sinh thường được cho vào môi trường nuôi cấy trong thời gian ngắn nhằm làm giảm nguy cơ tạp nhiễm. Nồng độ tối ưu của kháng sinh được xác định theo kinh nghiệm của người tiến hành nuôi cấy. Kháng sinh thường được dùng dưới dạng kết hợp. Có thể sử dụng Penicilin G, Streptomycin và Amphotericin B để ức chế sự phát triển của vi khuẩn Gram dương, Gram âm và chống nấm (Butler, 2004). 2.1.2. Điều kiện nuôi cấy Hầu hết tế bào trong môi trường nuôi cấy sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 370C và pH 7,4. Nếu ở nhiệt độ thấp hơn một chút so với 370C thì tốc độ sinh trưởng sẽ giảm xuống nhưng tế bào không bị phá hủy. Tuy nhiên nhiệt độ cao hơn, từ 39- 400C sẽ phá huỷ tế bào. Do vậy, việc đảm bảo rằng nhiệt độ không tăng trong tủ cấy là rất quan trọng (Butler, 2004). 2.1.3. Sự tạp nhiễm và cách hạn chế Nguyên nhân chính của sự thất bại trong nuôi cấy tế bào là sự tạp nhiễm. Sự tạp nhiễm thường do tiệt trùng dụng cụ không đạt yêu cầu và thường bắt nguồn từ sự tiếp xúc của con người như là từ bàn tay, hơi thở, tóc. Môi trường và thiết bị ngày nay được cung cấp sẵn nhằm hạn chế tới 12  mức tối đa những nguy cơ tạp nhiễm này. Nguy cơ này cũng có thể được giảm bớt hơn nữa bởi sự quan tâm cẩn thận tới từng chi tiết khi tiến hành nuôi cấy. Nhằm giảm bớt các nguồn tạp nhiễm, cần chú ý các điểm sau: • Rửa tay với xà phòng diệt khuẩn trước và sau quá trình có liên quan đến cấy tế bào. Có thể dùng găng tay nhựa. • Hạn chế những con đường tới phòng thí nghiệm khi thí nghiệm đang tiến hành. • Làm sạch bề mặt làm việc trước và sau mỗi quá trình nuôi cấy. • Dùng không gian tiệt trùng (ví dụ tủ cấy tiệt trùng) cho tất cả các thao tác. • Dùng ống nghiệm nuôi cấy bằng plastic được tiệt trùng và chỉ dùng một lần. • Mua môi trường và huyết thanh từ nhà cung cấp đáng tin cậy để đảm bảo rằng sự tạp nhiễm không phát sinh từ nguồn này (Butler, 2004). 2.2. Tổng quan về phương pháp RT-PCR RT- PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction) là một phương pháp dùng để khuyếch đại cDNA được tạo ra từ RNA dựa vào đặc tính phiên mã ngược. RT- PCR thường được sử dụng để tạo ra thư viện cDNA (complementary DNA) lớn từ một lượng rất nhỏ mRNA, sử dụng trong việc nhận biết các đột biến và đa hình dựa vào những trình tự phiên mã ngược và sử dụng trong việc định lượng mức độ phân tử của gene. Ngoài ra, RT- PCR còn có một ứng dụng quan trọng nữa đó là chúng được sử dụng trong việc chẩn đoán các bệnh do virus RNA. Nguyên tắc : Trong kỹ thuật RT-PCR có sự tham gia của 2 loại enzyme tổng hợp chuỗi oligonucleotide: enzyme phiên mã ngược ( reverse transcriptase) và DNA polymerase. Enzyme reverse transcriptase cần cho quá trình tổng hợp sợi cDNA từ RNA và enzyme cần cho sự tổng hợp sợi DNA từ cDNA. Do enzyme reverse transcriptase chịu nhiệt kém nên quá trình phiên mã ngược để tạo ra cDNA phải được thực hiện ở nhiệt độ thấp (thường khoảng từ 42-450C). Điều này gây ra những trở ngại: • Sự tạo thành các sản phẩm khuếch đại không mong muốn do sự bắt cặp không đặc hiệu của các primers. • Giảm hiệu quả kéo dài chuỗi gen do sự hình thành RNA cấu trúc bậc hai. • Tuy nhiên những trở ngại này có thể được giải quyết nhờ vào việc sử dụng enzyme DNA polymerase chịu nhiệt được chiết từ vi khuẩn Thermus thermophilus. Enzyme này trong những điều kiện nhất định, có đặc tính sinh học đặc biệt là có thể thực hiện cùng lúc 2 chức năng: chức năng của reverse transcriptase và chức năng của DNA polymerase. 2.3. Phương pháp tiến hành: 2.3.1. Vật liệu và dụng cụ 2.3.1.1. Thiết bị và dụng cụ dùng cho nuôi cấy tế bào và phân lập virus PRRS • Các dụng cụ lấy mẫu: xilanh lấy mẫu, lọ đựng mẫu, túi nylon, bình đá… • Tủ cấy; tủ ấm CO2. • Kính hiển vi soi ngược. • Máy ly tâm.Ống ly tâm vô trùng. • Lọ nuôi cấy tế bào 25cm2. 13  • Pipette. 2.3.1.2. Vật liệu dùng cho nuôi cấy tế bào MARC- 145 - Dòng tế bào và gốc virus chuẩn do AAHL (Australian Animal Health Laboratory) cung cấp. - Môi trường phát triển: trong 100ml môi trường gồm: • EMEM (Egle Minimun Essential Medium): 86,25 ml • Huyết thanh thai bò (FBS): 8ml. • Glutamine 2,92%: 1ml. • Na Pyruvate 100mM: 1ml. • LAH (Lactalbumin hydrolysate) 25%: 2ml. • Sodium Bicarbonate 7%: 1ml. • Kháng sinh (trong 1ml dung dịch có 40000UI Penicillin, 40000μg Streptomycin): 0,25ml. • Kháng nấm (trong 1ml có 500μg Amphotericin B): 0,5ml • Môi trường duy trì: giống môi trường phát triển nhưng chỉ dùng 2% huyết thanh thai bò. • PBSA (Phosphate buffer saline solution A). • Trypsin X. • Thuốc nhuộm Trypan Blue 0,22%. 2.3.1.3. Thiết bị và dụng cụ dùng cho phản ứng PCR • Tủ cấy vô trùng. • Máy ly tâm (Mikro Z2K/ Sigma 3K30C). • Tủ -700C (Sanyo Ultra Low). • Tủ -200C (CFC Free Sanyo Brandt) • Tủ lạnh. • Máy vi sóng (Electrolux). • Máy chụp gel (Biorad). • Máy PCR (Biorad). • Máy Vortex. • Bộ nguồn và bồn điện di. • Micropipet, đầu tuýp và eppendorf. 2.3.1.4. Vật liệu và hoá chất cho chiết tách RNA • Vật liệu và hoá chất trong phương pháp không sử dụng TRIzol - Dung dịch ly giải tế bào(guanidium isothicyanate 4M; sodium citrate 25mM; sarkosyl 0,5%; 2- mercaptoethanol, pH 7.0). • Phenolchloroform. • Isopropanol. • Ethanol 75%. • RNAse - free water. 2.3.1.5. Vật liệu và hoá chất sử dụng cho RT-PCR • Nước không có Rnase. • Tfl DNA Polymerase (Promega). 14  • dNTPs (Promega). • Cặp mồi. • RNA mẫu chuẩn. • RNA thu được từ mẫu ly trích. • AMV reverse transcriptase (Promega). • MgSO4 (Promega). • AMV/Tfl reaction buffer (Promega). 2.3.1.5. Vật liệu và hoá chất cho điện di sản phẩm RT-PCR • Agarose (Biorad). • TBE 0.5X (Tris HCl, acid boric, Na2EDTA, nước cất hai lần khử ion đã hấp khử trùng). • Loading dye (Bromophenol blue, sucrose, TE). • Ladder 100bp. • Ethidium bromide. 2.3.2. Phương pháp lấy mẫu • Huyết thanh: cố định heo, lấy máu khoảng 4- 5ml tại tĩnh mạch cổ (heo cai sữa), tĩnh mạch tai (heo nái). Sau đó cho vào bình đá vận chuyển về phòng thí nghiệm và chắt lấy huyết thanh vào eppendorf vô trùng. • Hạch phổi, phổi (chỉ lấy ở heo chết sau khi sinh và heo sau cai sữa): lấy mẫu hạch phổi, phổi cho vào bao nylon sạch, buộc chặt và cho vào bình đá vận chuyển về phòng thí nghiệm. Mẫu sau khi lấy được chuyển về phòng thí nghiệm và được xử lý tiến hành phân lập virus ngay. Nếu mẫu chưa được phân lập ngay sẽ đem bảo quản ở -700C 2.3.3.Phương pháp nuôi cấy tế bào MARC- 145 2.3.3.1.Hồi phục tế bào : Tế bào được trữ dưới dạng đông lạnh ở trong nitơ lỏng, khi muốn sử dụng thì phải hồi phục lại tế bào. Các bước hồi phục tế bào: • Lấy lọ đựng tế bào từ bình nitơ lỏng ra, ngâm vào nước ấm 370C, chờ đến khi nước đá tan hết thì lấy ra. • Dùng pipette chuyển lượng tế bào bên trong lọ sang ống ly tâm. Cho thêm 10ml môi trường phát triển vào, chầm chậm từng giọt một. Dùng pipette trộn nhẹ để hỗn hợp hòa đều với nhau. • Ly tâm 1500 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó bỏ phần nước trên, búng đều vào đáy lọ ly tâm để các tế bào tách rời nhau. • Cho 3ml môi trường phát triển vào, dùng pipette trộn đều rồi hút khoảng 0,1ml ra để đếm. • Cho tế bào vào lọ nuôi cấy đã có sẵn 8-10ml môi trường phát triển. Đưa lọ tế bào vào tủ ấm ở 370C có bổ sung 5% CO2. • Sau 24 giờ thì thay đổi môi trường. 15  2.3.3.2. Cấy chuyển tế bào : Khi tế bào đã mọc đầy bề mặt nuôi cấy, tạo thành tế bào một lớp thì tiến hành cấy chuyển. Tách tế bào ra khỏi lọ : • Rút bỏ môi trường trong lọ nuôi cấy, rửa lớp tế bào bằng 8-10ml PBSA, rồi rút bỏ. • Cho vào 3ml trypsin, để trong tủ ấm 5 phút sau đó cho một tay cầm lọ tế bào đập nhẹ vào lòng tay kia để đảm bảo tách ra thành những tế bào riêng lẻ. • Bất hoạt trypsin bằng 3ml môi trường phát triển, rồi rút cho vào ống ly tâm (loại 15ml). Dùng thêm 7ml môi trường phát triển để rửa lại lọ nuôi cấy rồi hút cho vào ống ly tâm. • Ly tâm 1500 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó đổ phần nước trên, búng vào đáy lọ ly tâm cho các tế bào rời nhau. Cho vào ống ly tâm 3ml môi trường phát triển, trộn đều bằng pipette rồi lấy ra 0,1ml để đếm tế bào. Đếm tế bào bằng buồng đếm Neubauer : ™ Cách tiến hành : • Trộn 100μl huyễn dịch tế bào và 900μl thuốc nhuộm trypan blue 0,22% (tỷ lệ pha là 1/10). • Đưa hỗn hợp thuốc nhuộm và tế bào này lên buồng đếm bằng cách chạm đầu hút có chứa hỗn hợp vào chỗ tiếp giáp giữa buồng đếm và lamella. • Chỉ đếm những tế bào còn sống (màu vàng nhạt, có điểm sáng ở giữa), không đếm những tế bào chết (bắt màu xanh). Vùng đếm là 4 ô vuông lớn (ký hiệu L). ™ Cách tính kết quả : Trong đó: C: số tế bào trong 1ml. n: số tế bào trong 4 ô vuông. d: nồng độ pha loãng. 16  • Cho lượng tế bào cần cấy chuyển vào trong lọ nuôi cấy mới đã có 8-10 ml môi trường phát triển. • Đưa lọ tế bào vào ủ ấm 370C có bổ sung 5%CO2. • Theo dõi cứ 3 giờ một lần sự phát triển của tế bào đầy bề mặt nuôi cấy lọ 25cm2 với những lượng tế bào 7.105 và 106. Kết quả được xử lý bằng phần mềm staTGraphics Ver. 7,0. 2.3.4.Phương pháp phân lập virus Virus PRRS được phân lập theo sơ đồ 3.1. 2.3.4.1 Phương pháp xử lý mẫu để phân lập virus Mẫu hạch phổi, phổi được nghiền trong dung dịch đệm phosphat PBS (cứ 1gam bệnh phẩm nghiền trong 5ml PBS). Sau đó, ly tâm huyễn dịch 5000vòng/phút trong 15 phút. Hút phần nước trong cho vào eppendorf vô trùng và bảo quản trong tủ -700C. Huyết thanh và mẫu sau khi được xử lý sẽ lọc qua lưới lọc 0,2μm trước khi đưa vào môi trường tế bào. 2.3.4.2. Phương pháp gây nhiễm tế bào lần thứ nhất với các mẫu đã xử lý 17  Khi tế bào đã phát triển đầy bề mặt lọ nuôi cấy tạo thành tế bào một lớp thì tiến hành gây nhiễm tế bào. • Lấy lọ tế bào ra, thay môi trường phát triển bằng môi trường duy trì. • Gây nhiễm tế bào bằng mẫu huyết thanh, phổi, hạch phổi đã được xử lý với thể tích là 1ml. Lưu ý khi đưa mẫu vào môi trường tế bào cần đưa vào bề mặt khác bề mặt tế bào tăng trưởng trong lọ nuôi cấy. • Cho lọ tế bào đã được gây nhiễm vào tủ ấm 370C có 5%CO2. Sau 24 giờ thay môi trường duy trì. • Theo dõi và ghi nhận bệnh tích tế bào hằng ngày. Sau 7 ngày thu hoạch dịch tế bào nuôi cấy. 2.3.4.3.Phương pháp thu hoạch dịch tế bào • Để lọ tế bào sau khi gây nhiễm 7 ngày vào ngăn đá tủ lạnh cho đến khi tế bào và môi trường đông thành đá, sau đó lấy ra đánh nhẹ vào lòng bàn tay để tế bào bong ra hết rồi để ở nhiệt độ phòng để rã đông tế bào và môi trường. Lặp lại động tác trên thêm 2 lần nữa. • Hút toàn bộ môi trường trong lọ tế bào vào một ống ly tâm. Ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút. Hút lấy phần nước bên trên cho vào eppendorf vô trùng và bảo quản ở -700C. 2.3.4.4.Phương pháp gây nhiễm lần hai bằng dịch tế bào đã thu hoạch Các bước thực hiện giống như gây nhiễm lần thứ nhất nhưng thay mẫu huyết thanh, phổi và hạch phổi bằng dịch tế bào đã thu hoạch. 2.3.4.5.Phương pháp xác định sự hiện diện của virus bằng kỹ thuật RT-PCR Phản ứng RT- PCR được thực hiện theo sơ đồ 3.2 với các mẫu thu hoạch được sau hai lần gây nhiễm. 18  Để thực hiện phản ứng phiên mã ngược và khuếch đại đoạn cDNA sau phiên mã ngược với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, chúng tôi thực hiện kỹ thuật RT-PCR một bước nhằm hạn chế sự lây nhiễm. 2.4. Kết quả: 2.4.1. Kết quả sau 2 lần gây nhiễm: 19  20  Như vậy, sau 2 lần gây nhiễm trên môi trường tế bào MARC-145, có 3 mẫu có biểu hiện bệnh tích tế bào, chiếm tỷ lệ 27,27% (3/11) là 2 mẫu hạch phổi và 1 mẫu phổi. 2.4.2. Kết quả RT-PCR: III. KẾT LUẬN 21  Việc gây bệnh tích tế bào và kết quả RT-PCR dương tính dã xác định sự hiện diện của virus trong mẫu xét nghiệm. Điều này cũng cho thấy môi trường tế bào MARC-145 là môi trường thích hợp cho sự phát triển của virus PRRS và có thể sử dụng cho phân lập. Kết quả của chúng tôi phù hợp với sự nhận định của Jeong-Ki Kim và cs (2005): tế bào MARC-145 là dòng tế bào nhạy cảm với virus PRRS nên thích hợp cho việc phân lập virus này. Sự thành công trong việc chẩn đoán PRRSV bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào ( trên MARC-145) sẽ là cơ sở thuận lợi cho việc nghiên cứu phương pháp điều trị căn bệnh này. IV. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Hoàng Thanh Hải, 2005. Thử nghiệm nuôi cấy tế bào MARC-145, ứng dụng kỹ thuật ELISA và nuôi cấy tế bào để chẩn đoán bệnh do virus PRRS trên heo. Luận văn tốt nghiệp, khoa Chăn Nuôi Thú Y, trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. HCM. 2. Hoàng Văn Năm, 2001. Hội chứng sinh sản và hô hấp ở lợn (bài dịch tổng hợp). Tạp chí khoa học thú y. Số 1/2002. Tr. 74- 87. 3. Nguyễn Ngọc Hải, 2007. Công nghệ sinh học trong thú y. NXB Nông Nghiệp, Tp.HCM. 4. Phòng Dịch tễ-Cục Thú y. Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn. 5. Trần Đức Minh. Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Bài dịch từ “Theriogenology 66 (2006): 655-662”). 6. Võ Thị Đan Thanh, 2006. Phân lập virus PRRS trên môi trường tế bào MARC-145 và xác định virus bằng kỹ thuật RT-PCR. Luận văn tốt nghiệp, Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Trƣờng Đại Học Nông Lâm, Tp. HCM. 7. “Nhà chăn nuôi cần biết”- Phan Bùi Ngọc Thảo,Phòng Di truyền Giống gia súc-Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam 8. Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus: Description of Persistence in Individual Pigs upon Experimental Infection. (JOURNAL OF VIROLOGY) 9. Benfield D.A., Collins J.E., Dee S.A., Halbur P.G., Joo H.S., Lager K.M., Mengelling W.L., Murtaugh M.P., Rossow K.D., Stevenson G.W., and Zimmerman J.J., 1999. Porcine reproductive and respiratory syndrome. In disease of swine, 8th edition. Ed.Straw B.E., D’Alleire S.D., Mengelling W.L., Taylor D.J..Iowa State University Press, Ames- Iowa, USA. p.201- 220 10. Tài liệu Internet