Cố định enzyme – amylase bằng gel alginate

1 Phaàn 1. LÔØI NOÙI ÑAÀU Enzyme laø moät chaát xuùc taùc sinh hoïc khoâng chæ coù yù nghóa cho quaù trình sinh tröôûng, sinh saûn cuûa moïi sinh vaät maø noù coøn ñoùng vai troø raát quan troïng trong coâng ngheä cheá bieán thöùc phaåm, trong y hoïc, trong kyõ ngheä phaân tích, trong coâng ngheä gen vaø trong baûo veä moâi tröôøng. Ngaøy nay, nhöõng nghieân cöùu veà öùng duïng enzyme trong saûn xuaát coâng nghieäp phaùt trieån raát maïnh. Caùc höôùng nghieân cöùu nhaèm muïc ñích taêng khaû naêng söû duïng enzyme, keùo daøi thôøi gian, soá laàn söû duïng enzyme giaûm giaù thaønh söû duïng enzyme. Moät trong nhöõng böôùc tieán quan troïng nhaát hieän nay laø kyõ thuaät coá ñònh enzyme treân giaù theå taïo ra caùc daïng enzyme coá ñònh (enzyme khoâng hoøa tan). Enzyme coá ñònh ôû caùc nöôùc phaùt trieån ñaõ ñöôïc öùng duïng roäng raõi trong nhieàu qui trình coâng ngheä nhö: cheá bieán thöïc phaåm, y sinh hoïc vaø nghieân cöùu khoa hoïc. Tuy nhieân hieän nay vieäc nghieân cöùu vaø öùng duïng enzyme coá ñònh ôû Vieät Nam chöa ñöôïc phoå bieán laém vaø vaãn coøn laø höôùng phaùt trieån môùi meû. Ñeå goùp phaàn vaøo nhöõng nghieân cöùu veà enzyme coá ñònh ñoàng thôøi ñöôïc söï chaáp thuaän cuûa boä moân coâng ngheä sinh hoïc tröôøng Ñaïi Hoïc Noâng Laâm Tp. Hoà Chí Minh vaø boä moân coâng ngheä sinh hoïc tröôøng Ñaïi Hoïc Baùch Khoa Tp. Hoà Chí Minh, döôùi söï höôùng daãn cuûa Th.S Huyønh Ngoïc Oanh, toâi thöïc hieän ñeà taøi “Coá ñònh enzyme – amylase baèng gel alginate” taïi phoøng thí nghieäm Coâng ngheä Sinh hoïc thuoäc tröôøng Ñaïi Hoïc Baùch Khoa Tp. Hoà Chí Minh. 2 Phaàn 2. TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU 2.1. NHÖÕNG KHAÙI NIEÄM CHUNG VEÀ ENZYME [2 ] 2.1.1 Khaùi nieäm veà enzyme Trong caùc phaûn öùng hoùa hoïc neáu ta cho theâm vaøo phaûn öùng moät chaát naøo ñoù phaûn öùng seõ xaûy ra vôùi toác ñoä taêng haøng chuïc laàn. Chaát cho theâm vaøo naøy goïi laø chaát xuùc taùc. Chaát xuùc taùc coù hai ñaëc ñieåm quan troïng  Laøm taêng phaûn öùng hoùa hoïc.  Baûn thaân chaát xuùc taùc khoâng coù söï thay ñoåi naøo sau phaûn öùng. Chaát xuùc taùc hoùa hoïc chæ laøm thay ñoåi toác ñoä phaûn öùng, chöù khoâng tham gia laøm thay ñoåi chieàu höôùng phaûn öùng, traïng thaùi phaûn öùng hay naêng löôïng söû duïng trong phaûn öùng. Trong caùc phaûn öùng sinh hoïc xaûy ra trong cô theå sinh vaät cuõng coù caùc chaát laøm taêng phaûn öùng. Chaát ñoù döôïc goïi laø enzyme. Enzyme ñöôïc caùc cô theå sinh vaät toång hôïp neân vaø tham gia vaøo caùc phaûn öùng hoùa hoïc trong cô theå. Enzyme laø moät chaát höõu cô, trong khi caùc chaát xuùc taùc hoùa hoïc thöôøng laø chaát voâ cô. Sau naøy caùc nhaø khoa hoïc xaùc ñònh baûn chaát cuûa enzyme laø protein. Nhö vaäy enzyme laø moät protein coù khaû naêng tham gia xuùc taùc caùc phaûn öùng hoùa hoïc trong vaø ngoaøi cô theå. Ñieåm raát khaùc bieät cuûa enzyme laø chuùng hoaït ñoäng trong ñieàu kieän nhieät ñoä oân hoøa gioáng nhö nhieät ñoä oân hoøa trong cô theå sinh vaät. Trong khi ñoù, caùc chaát hoùa hoïc caàn phaûi coù nhieät ñoä caàn thieát cho phaûn öùng. Nhöõng öu ñieåm cô baûn cuûa enzyme coù theå toùm taét nhö sau : 3 1. Enzyme coù theå tham gia haøng loaït caùc phaûn öùng trong chuoãi phaûn öùng sinh hoùa ñeå giaûi phoùng hoaøn toaøn naêng löôïng hoùa hoïc coù trong vaät chaát. 2. Enzyme coù theå tham gia nhöõng phaûn öùng ñoäc laäp nhôø khaû naêng chuyeån hoùa raát cao. 3. Enzyme coù theå taïo ra nhöõng phaûn öùng daây chuyeàn. Khi ñoù saûn phaåm cuûa phaûn öùng ñaàu seõ laø nguyeân lieäu hay cô chaát cho nhöõng phaûn öùng tieáp theo. 4. Trong caùc phaûn öùng enzyme, söï tieâu hao naêng löôïng thöôøng raát ít. 5. Enzyme luoân luoân ñöôïc toång hôïp trong teá baøo cuûa sinh vaät. 6. Coù nhieàu enzyme khoâng bò maát ñi sau phaûn öùng. Ngaøy nay, caùc nhaø khoa hoïc ñaõ tìm ra hôn 1000 loaïi enzyme khaùc nhau coù trong teá baøo sinh vaät, soá löôïng naøy laø raát nhoû so vôùi soá löôïng thaät coù trong moãi teá baøo. Dò hoùa ngoaøi teá baøo Vaät chaát coù kích thöôùc nhoû Teá baøo Vaät chaát dò hoùa ra khoûi teá baøo Vaät chaát toång hôïp ra khoûi teá baøo Moâi tröôøng Sinh khoái (saûn phaåm baäc 1) Saûn phaåm baäc 2 Hình 2.1 : Heä thoáng toång hôïp enzyme trong teá baøo sinh vaät Enzym ngoaïi baøo Vaät chaát coù kích thöôùc lôùn Enzym Dò hoùa noäi baøo trong teá Quaù trình baøo toång hôïp 4 2.1.2 Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán hoaït tính cuûa enzyme a. AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä cô chaát ñeán hoaït tính enzyme Cô cheá taùc ñoäng cuûa enzyme vaøo cô chaát qua ba giai ñoaïn Giai ñoaïn 1 : Enzyme töông taùc vôùi cô chaát taïo thaønh phöùc enzyme cô chaát E S. Giai ñoaïn 2 : Phöùc enzyme cô chaát seõ ñöôïc taùch ra. Giai ñoaïn 3 : Enzyme seõ ñöôïc giaûi phoùng, cô chaát seõ chuyeån thaønh saûn phaåm. Nhö vaäy ôû giai ñoaïn ñaàu, neáu cô chaát coù noàng ñoä thaáp thì toác ñoä phaûn öùng enzyme seõ phuï thuoäc tuyeán tính vôùi noàng ñoä cô chaát. Hình 2.2 AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä cô chaát ñeán toác ñoä phaûn öùng cuûa enzyme Vaän toác phaûn öùng ñöôïc tính nhö sau : SK S VV m max Phöông trình treân goïi laø phöông trình Michealis Menten Trong giai ñoaïn ñaàu khi noàng ñoä cô chaát taêng, toác ñoä phaûn öùng seõ taêng. Nhöng khi toác ñoá phaûn öùng ñaït giaù trò cöïc ñaïi, cho duø coù taêng noàng ñoä cô chaát, toác ñoä phaûn öùng cuõng seõ hoaøn toaøn khoâng coù khaû naêng taêng theo. Noàng ñoä cô chaát Toác ñoä phaûn öùng Km 5 b. AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán hoaït tính enzyme Trong caùc phaûn öùng hoùa hoïc, nhieät ñoä caøng taêng, toác ñoä phaûn öùng xuùc taùc caøng taêng. Trong caùc phaûn öùng sinh hoïc, nhieät ñoä taêng khaû naêng xuùc taùc cuûa enzyme seõ taêng. Nhöng khaû naêng taêng cuûa toác ñoä phaûn öùng coù moät giôùi haïn nhaát ñònh. Quaù giôùi haïn nhieät ñoä ñoù, phaûn öùng enzyme seõ giaûm vaø giaûm raát nhanh. Hình 2.3: AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán toác ñoä phaûn öùng cuûa enzyme Hieän töôïng ñaëc bieät naøy ôû enzyme coù lieân quan ñeán baûn chaát hoùa hoïc cuûa enzyme. Caùc enzyme laø nhöõng protein thöôøng khoâng beàn nhieät. Tröôøng hôïp ta taêng nhieät ñoä trong giai ñoaïn ñaàu cuûa phaûn öùng enzyme seõ laøm taêng khaû naêng taïo caáu truùc khoâng gian cuûa enzyme cho phuø hôïp vôùi caáu truùc khoâng gian cuûa cô chaát. Khi vöôït quaù giôùi haïn veà nhieät ñoä, caáu truùc khoâng gian cuûa trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme khoâng coøn phuø hôïp vôùi caáu truùc khoâng gian cuûa cô chaát nöõa, khi ñoù hoaït tính enzyme seõ maát daàn vaø ñi ñeán choã trieät tieâu. c. AÛnh höôûng cuûa pH ñeán hoaït tính cuûa enzyme Trong nhöõng nghieân cöùu thí nghieäm veà aûnh höôûng cuûa pH ñeán hoaït tính cuûa enzyme, caùc nhaø khoa hoïc cho thaáy hieän töôïng : neáu taêng hoaëc giaûm giaù trò pH tôùi moät ñieåm xaùc ñònh naøo ñoù, vaän toác phaûn öùng enzyme seõ taêng daàn vaø ñaït tôùi ñieåm cöïc ñaïi giaù trò pH, maø ôû ñoù vaän toác phaûn öùng enzyme ñaït giaù trò cöïc ñaïi goïi laø pH toái öu cho hoaït ñoäng cuûa enzyme. Vöôït quaù giaù trò pH naøy hoaït ñoäng enzyme seõ giaûm. Nhieät ñoä Toác ñoä phaûn öùng 6 Hình 2.4: AÛnh höôûng pH ñeán hoaït tính enzyme Moãi loaïi enzyme seõ coù khoaûng pH toái öu vaø ñieåm pH toái öu. pH coù aûnh höôûng raát lôùn ñeán traïng thaùi ion hoùa cuûa caùc nhoùm chöùc trong trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme, traïng thaùi ion hoùa cuûa cô chaát vaø phöùc chaát ES. d. AÛnh höôûng cuûa caùc chaát kìm haõm caùc hoaït tính enzyme Hoaït tính cuûa enzyme coù theå bò aûnh höôûng bôûi nhöõng chaát kìm haõm. Nhöõng chaát kìm haõm laø nhöõng chaát hoa hoïc coù khaû naêng laøm giaûm hoaït tính hoaëc laøm ngöng hoaït tính cuûa enzyme. Caùc chaát kìm haõm thöôøng laø nhöõng ion, caùc phaân töû voâ cô, höõu cô vaø caû protein. Caùc chaát chia ra laøm 2 loaïi : Chaát kìm haõm caïnh tranh. Chaát kìm haõm khoâng caïnh tranh. Chaát kìm haõm caïnh tranh : Caùc chaát kìm haõm caïnh tranh coù caáu truùc khoâng gian töông töï caáu truùc khoâng gian cuûa cô chaát. Do ñoù, chuùng coù khaû naêng keát hôïp vôùi enzym, keát quaû laø enzym khoâng theå keát hôïp ñöôïc vôùi cô chaát ñeå taïo thaønh phöùc chaát ES. pH Vaän toác phaûn öùng pH op 7 Hình 2.5 : AÛnh höôûng cuûa chaát kìm haõm caïnh tranh ñeán hoaït tính enzyme Chaát kìm haõm khoâng caïnh tranh : Caùc chaát kìm haõm khoâng caïnh tranh tham gia keát hôïp vôùi enzym khoâng phaûi ôû trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzym maø laø ôû moät vò trí ngoaøi trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzym. Ngöôøi ta coøn goïi vò trí naøy laø trung taâm kìm haõm cuûa enzym. Khi chaát kìm haõm keát hôïp vôùi enzym ôû ngoaøi trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzym seõ laøm thay ñoåi caáu truùc khoâng gian cuûa trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzym. Nhôø vaäy, chuùng seõ laøm giaûm toác ñoä phaûn öùng cuûa enzym. Trong raát nhieàu tröôøng hôïp, saûn phaåm cuoái cuûa chuoãi phaûn öùng hay cuûa moät phaûn öùng thöôøng laø chaát kìm haõm khoâng caïnh tranh. Hình 2.6 : AÛnh höôûng cuûa chaát kìm haõm khoâng caïnh tranh ñeán hoaït tính enzyme 8 e. AÛnh höôûng cuûa chaát hoaït hoùa ñeán hoaït tính cuûa enzym Caùc chaát hoaït hoùa (activator) laø nhöõng chaát laøm taêng khaû naêng xuùc taùc cuûa enzym. Caùc chaát hoaït hoùa coù baûn chaát hoùa hoïc khaùc nhau. Caùc amin, caùc chaát höõu cô coù caáu truùc hoùa hoïc khaùc nhau. Khaû naêng laøm taêng hoaït tính cuûa enzym cuûa nhöõng chaát hoaït hoùa cuõng coù moät giôùi haïn nhaát ñònh, vöôït quaù giôùi haïn naøy raát coù theå laïi laøm giaûm hoaït tính cuûa enzym. 2.2. NHÖÕNG KHAÙI NIEÄM CHUNG VEÀ ENZYM COÁ ÑÒNH 2.2.1. Khaùi nieäm, ñaëc ñieåm cuûa enzym coá ñònh a. Khaùi nieäm enzym coá ñònh Enzym coá ñònh (immobilised enzym) hay enzym khoâng hoøa tan (insolube enzym) ñöôïc hieåu theo caû nghóa heïp vaø nghóa roäng. Theo nghóa heïp : ñöôïc hieåu theo Michael Trevan: thuaät ngöõ enzyme coá ñònh laø nhöõng enzyme ñöôïc ñöa vaøo nhöõng pha rieâng reõ, pha naøy ñöôïc taùch rieâng vôùi pha dung dòch töï do. Pha enzyme thöôøng khoâng tan trong nöôùc vaø ñöôïc gaén vôùi nhöõng polymer öa nöôùc coù troïng löôïng phaân töû lôùn. Pha enzyme // Pha dung dòch töï do Hình 2.7 : Moâ hình heä thoáng hai pha cuûa enzym coá ñònh Theo nghóa roäng : Theo Kkaus Mosbach : Caùc chaát xuùc taùc coá ñònh laø caùc enzyme, teá baøo, cô theå soáng ôû traïng thaùi cho pheùp söû duïng laïi. Nhö vaäy theo nghóa roäng, enzyme khoâng hoøa tan bao goàm caû enzyme ñaõ ñöôïc coá ñònh vaø moät 9 chaát mang, bao goàm caû enzyme coù trong teá baøo soáng ñöôïc coá ñònh trong caùc bình phaûn öùng sinh hoïc coù söï gaén keát vaøo moät chaát mang cho pheùp ta söû duïng nhieàu laàn. Enzyme coá ñònh thöôøng laø nhöõng enzyme hoøa tan ñöôïc gaén vaøo moät chaát mang baèng nhieàu kyõ thuaät khaùc nhau. Nhôø quaù trình gaén naøy enzyme chuyeån töø traïng thaùi hoøa tan sang traïng thaùi khoâng hoøa tan. b. Ñaëc ñieåm cuûa enzyme coá ñònh Nhôø nhöõng tính chaát öu vieät do ñoù ngaøy nay enzyme coá ñònh ñang ngaøy caøng söû duïng roäng raõi trong caùc lónh vöïc coâng ngheä : Nhöõng öu ñieåm noåi baät cuûa enzyme coá ñònh. Enzyme laø nhöõng cheá phaåm sinh hoïc ñaét tieàn, neáu söû duïng ôû daïng hoøa tan thì chæ söû duïng ñöôïc moät laàn vaø khoù thu hoài trôû laïi. Ngöôïc laïi khi enzyme ñöôïc coá ñònh treân giaù theå polymer neân coù theå söû duïng lieân tuïc trong nhieàu ngaøy, thaäm chí haøng thaùng maø khoâng maát hoaëc chæ giaûm hoaït tính, vì vaäy raát kinh teá. Do ñöôïc coá ñònh ôû moät pha rieâng, do ñoù deã daøng taùch saûn phaåm ra khoûi enzyme, vì vaäy saûn phaåm deã tinh saïch hôn do khoâng troän laãn vôùi enzyme. Ñieàu naøy ñaëc bieät coù yù nghóa khi öùng duïng enzyme coá ñònh trong döôïc hoïc, trong coâng ngheä saûn xuaát hoùa chaát vaø trong phaân tích. Coù theå döøng hoùa trình chuyeån hoùa ôû baát kyø giai ñoaïn naøo caàn thieát khi deã daøng taùch enzyme coá ñònh ra khoûi cô chaát trong tröôøng hôïp yeâu caàu saûn phaåm chæ laø caùc saûn phaåm trung gian cuûa quaù trình chuyeån hoùa. – Khi ñöôïc coá ñònh treân giaù theå enzyme coù khaû naêng beàn vöõng hôn, hoaït tính oån ñònh hôn khi coù nhöõng thay ñoåi cuûa moâi tröôøng nhö nhieät ñoä, pH,… so vôùi enzyme töï do. Nhôø ñöôïc coá ñònh treân giaù theå neân enzyme ít bò bieán tính hôn khi moâi tröôøng thay ñoåi. Söû duïng cheá phaåm enzyme coá ñònh, ñaëc bieät thích hôïp vôùi caùc qui trình coâng ngheä lieân tuïc, töï ñoäng hoùa ngaøy nay. Thöôøng thì enzyme coá ñònh ñöôïc nhoài 10 vaøo caùc coät, thaùp, fermentor, vôùi doøng cô chaát lieân tuïc ñöôïc chaûy vaøo vaø ñaàu ra laø saûn phaåm. Tuy nhieân enzyme coá ñònh cuõng coù nhöõng nhöôïc ñieåm nhaát ñònh laø vì ñöôïc coá ñònh neân ñaõ haïn cheá khaû naêng tieáp xuùc giöõa enzyme vaø cô chaát. Vì vaäy hoaït tính rieâng (specific activity) cuûa enzyme coá ñònh thöôøng thaáp hôn so vôùi enzyme töï do, ñaëc bieät laø trong tröôøng hôïp cô chaát laø caùc chaát coù troïng löôïng phaân töû lôùn nhö : protein, tinh boät, chitosan. Trong tröôøng hôïp enzyme ñöôïc coá ñònh baèng phöông phaùp nhoát (entrapment method) trong khuoân gel thì chæ moät phaàn enzyme naèm ôû lôùp voû ngoaøi cuûa gel laø hoaït ñoäng. Ñaëc bieät khi enzyme ñöôïc coá ñònh baèng phöông phaùp coäng hoùa trò thì moät löôïng ñaùng keå enzyme bò maát hoaït tính do chaát hoaït hoùa vaø coù theå do lieân keát khoâng ñaëc hieäu xaûy ra ôû trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme. 2.2.2. Chaát mang duøng ñeå coá ñònh enzyme  Theo Michael Trevan, moät chaát mang lyù töôûng caàn coù nhöõng tính chaát sau ñaây : + Chaát mang lyù töôûng trong söû duïng coá ñònh enzyme ñieàu tröôùc heát laø caàn phaûi reû. Ñieàu naøy lieân quan ñeán hieäu quaû kinh teá cuûa qui trình coâng ngheä. + Chaát mang phaûi coù tính chaát cô lyù beàn vöõng, oån ñònh. + Veà maët hoùa hoïc, chaát mang phaûi beàn vöõng, khoâng tan trong moâi tröôøng phaûn öùng. Chaát mang khoâng ñöôïc laøm maát hoaït tính enzyme. + Chaát mang phaûi coù tính khaùng khuaån cao, beàn vöõng vôùi söï taán coâng cuûa vi sinh vaät. + Chaát mang phaûi coù ñoä tröông toát, coù dieän tích beà maët tieáp xuùc lôùn. Tính chaát naøy cuûa chaát mang vöøa taêng khaû naêng coá ñònh enzyme vöøa taêng khaû naêng tieáp xuùc cuûa cô chaát vôùi enzyme, nhôø ñoù laøm taêng hoaït tính enzyme coá ñònh vaø soá laàn taùi söû duïng. 11 + Chaát mang coù theå coù caáu truùc loã xoáp, sieâu loã, coù theå söû duïng ôû daïng haït, daïng maøng, daïng phim moûng …  Phaân loaïi chaát mang : Taát caû chaát mang duøng trong coá ñònh enzyme ñöôïc chia laøm 2 nhoùm : Chaát mang polymer höõu cô. Chaát mang voâ cô. a. Chaát mang laø polymer höõu cô Trong nhoùm chaát mang laø polymer höõu cô ñöôïc chia laøm 2 nhoùm laø polymer toång hôïp vaø polymer töï nhieân.  Chaát mang laø polymer töï nhieân (natural polymer)  Chaát mang laø polysaccharide (gluxit) : Laø nhoùm chaát mang ñang thònh haønh vaø ñöôïc söû duïng roäng raõi nhaát hieän nay, ñoù laø cellulose, agarose, dextran, sephadex vaø caùc daãn xuaát cuûa chuùng. Agarose laø vaät lieäu oån ñònh, ñoàng nhaát deã daøng taïo haït. Tuy nhieân do vaán ñeà veà giaù caû neân agarose chæ thöôøng ñöôïc söû duïng trong nghieân cöùu vaø muïc ñích y hoïc (theo signa : 800 2000 USD/kg). Cellulose vaø caùc daãn suaát cuûa chuùng nhö CM Cellulose, DEAE Cellulose coù tính chaát cô lyù khaù toát, giaù reû nhöng laïi khoâng ñoàng nhaát vaø oån ñònh neân chæ söû duïng ôû daïng sôïi vaø daïng vi haït. Alginate vaø carrageenam laø hai loaïi vaät lieäu khaù môùi meû. Caû hai loaïi vaät lieäu naøy taïo gel trong dung dòch CaCl2 duøng ñeå nhoát teá baøo vaø enzyme. Tuy nhieân, hai loaïi vaät lieäu naøy coù moät nhöôïc ñieåm caên baûn laø gel khoâng oån ñònh trong moâi tröôøng coù phosphate. Tinh boät laø vaät lieäu phong phuù vaø reû tieàn. Töø laâu tinh boät, tinh boät khaâu maïch, diathanolamin tinh boät ñaõ ñöôïc duøng laøm chaát mang coá ñònh enzyme nhö lipase, glucoisomerase, tripsin, amilase. Tuy nhieân tinh boät coù nhöôïc ñieåm laø ñoä tröông coøn haïn cheá vaø thieáu caùc nhoùm chöùc naêng (functional groups). Vì vaäy khaû 12 naêng coá ñònh vaø hoaït tính enzyme coá ñònh coøn thaáp : ñeå khaéc phuïc nhöôïc ñieåm naøy tinh boät thöôøng ñöôïc gheùp copolymer vôùi caùc vinyl monomer öa nöôùc, acrylamide, acrylic acid vöøa caûi thieän tính chaát cô lyù, ñoä tröông, vöøa taïo caùc nhoùm chöùc naêng treân beà maët nhö [ NH2], [ COOH] laøm taêng dieän tích tieáp xuùc vaø khaû naêng coá ñònh enzyme. Chitin vaø chitosan laø vaät lieäu polymer coù nhieàu trieån voïng trong coá ñònh teá baøo vaø enzyme. Chitin laø moät polymer raát phoå bieán trong töï nhieân, chæ ñöùng thöù hai sau cellulose, chitin coù caáu truùc töông töï cellulose, laø polymer cuûa 2 acetomido deoxy D glucose. Chitin tham gia vaøo thaønh phaàn caáu truùc cuûa voû toâm cua, coân truøng, thaønh teá baøo vi sinh vaät. Chitosan laø daãn xuaát cuûa chitin khi xöû lyù baèng kieàm ñaëc. Chitin, chitosan coù caáu truùc sieâu loã, deã taïo maøng, taïo haït, khaû naêng haáp thuï toát, tính chaát cô lyù beàn vöõng, oån ñònh, thöôøng ñöôïc duøng coá ñònh enzyme qua caàu noái glutaraldehyde. Tuy nhieân caû chitin vaø chitosan ñeàu coù moät nhöôïc ñieåm laø tính chaát kî nöôùc, ñoä tröông keùm, dieän tích beà maët tieáp xuùc nhoû. Ñeå khaéc phuïc nhöôïc ñieåm naøy, hieän nay ñang coù xu höôùng gheùp copolymer vôùi monomer öa nöôùc nhö acrylamide, acrylic acid, hydroxy ethylmethacrylate. Hieän nay, cuõng coù xu höôùng chung laø caùc vaät lieäu töï nhieân ñöôïc gheùp copolymer vôùi caùc polymer toång hôïp ñeå caûi thieän tính chaát cô lyù.  Chaát mang laø Protein : Chaát mang laø protein thöôøng duøng laø getalin, keratin, albumin. Vaät lieäu thuoäc nhoùm naøy thöôøng deã taïo maøng, taïo haït, coù nhoùm chöùc naêng laø nhoùm NH2 vaø vì vaäy thöôøng duøng söû duïng nhoát enzyme trong khuoân gel vôùi taùc nhaân khaâu maïch laø glutaraldehyde. Nhoùm chaát mang naøy laø protein coù nhöôïc ñieåm laø thöôøng keùm beàn, deã nhieãm khuaån. 13  Chaát mang laø caùc polymer toång hôïp : Hieän nay coù raát nhieàu polymer toång hôïp ñöôïc söû duïng laøm chaát mang coá ñònh enzyme nhö polyacrylamide, polyester, polyvinilalcohol, polyvinylacetate, polyacrylic, polyhydroxylethylacrylate, polystyren, polyethylen gheùp vôùi vinyl monomer, …Öu ñieåm chung cuûa caùc polymer toång hôïp laø beàn, tính chaát cô lyù toát, hoaøn toaøn trô vôùi söï taán coâng cuûa vi khuaån, ñoä tröông toát, moät soá polymer coù theå ñieàu chænh ñöôïc kích thöôùc sieâu lo ã, … – Polyhydroxyethylmethacrylate : khaû naêng töông hôïp sinh hoïc keùm vaø moät nhöôïc ñieåm quan troïng nöõa laø do quaù beàn vöõng, khoâng phaân huûy trong töï nhieân. Vì vaäy gaây oâ nhieãm moâi tröôøng. Ñaây laø vaán ñeà quan troïng ñoøi hoûi con ngöôøi caàn quan taâm giaûi quyeát. – Polyacrylamide laø moät polymer raát ñoàng nhaát, ñoä tröông toát, kích thöôùc loã gel coù theå ñieàu chænh ñöôïc vaø dieän tích beà maët tieáp xuùc lôùn. Polyacrylamide vaø polyacrylate thöôøng ñöôïc naïp vaøo coät, vaø coù raát nhieàu daïng khaùc nhau nhö polymer coù nhoùm amin hoaëc aldehyde. Phöông phaùp coá ñònh chuû yeáu laø nhoát enzyme teá baøo trong khuoân gel khi ñöôïc polymer baèng hoùa chaát nhö ammoniumpersulphate, böùc xaï gamma, tia rônghen, thöôøng thì ñeå taêng khaû naêng khaâu maïnh cuûa gel poly acrylamide, caàn phaûi boå sung theâm N, N methylenbisacrylamide laøm chaát khaâu maïch (crosslinking agent). Ngoaøi ra coøn coù theå coá ñònh enzyme treân caùc vaät lieäu naøy baèng phöông phaùp haáp thuï, lieân keát coäng hoùa trò vaø microcapsule. b. Chaát mang voâ cô Ngoaøi caùc polymer ñöôïc söû duïng laøm chaát mang, coøn coù moät soá chaát mang voâ cô ñaõ ñöôïc söû duïng thöông maïi nhö sôïi boâng thuûy tinh (contra pore glass), oxyde silica, oxyde nhoâm, oxyde magie. Ñaây laø nhöõng daïng oxyde coù caáu truùc loã vaø coù khaû naêng haáp thuï toát. Moät soá vaán ñeà caàn chuù yù khi duøng caùc vaät lieäu coù nguoàn goác töø silic laø khaù ñaét tieàn, neân chæ söû duïng trong saéc kyù loïc gel vaø coá ñònh nhöõng enzyme ñaëc bieät. Nhöôïc ñieåm cuûa caùc vaät lieäu naøy laø tan trong kieàm, coù pH > 7.5. 14 Ñeå haïn cheá ñieàu naøy pore glass, pore silics ñöôïc phuû lôùp ziconia ñeå taïo moät lôùp oån ñònh vôùi kieàm, hoaëc ñeå traùnh vaán ñeà naøy coù theå söû duïng ceramic xoáp ñeå coá ñònh enzyme. Gaàn ñaây moät soá vaät lieäu voâ cô ñöôïc giôùi thieäu thöông maïi hoùa laø caùc saûn phaåm diatomic, coù teân thöông maïi laø celite. Ñaây laø moät vaät lieäu khoâng ñoàng nhaát, chöùa nhieàu ion kim loaïi, laø loaïi vaät lieäu reû tieàn, nhöng coù raát nhieàu öùng duïng trong coâng nghieäp, ñaëc bieät laø trong coá ñònh enzyme vaø trong coâng nghieäp. Vaät lieäu töø tính (magnetic materials) coù raát nhieàu daïng ñaõ ñöôïc söû duïng trong coá ñònh enzyme. Burns ñaõ so saùnh daïng haït cuûa vaät lieäu töø tính vôùi caùc vaät lieäu khaùc vaø vôùi söï caûi tieán cuûa toå hôïp alginite/ vi haït töø tính. Alginite thöôøng söû duïng ôû daïng coäng hoùa trò vì ligand vôùi enzyme hôn laø ôû daïng nhoát. Vi haït (microphere) cuûa vaät lieäu alginite/ vi haït töø tính coù tính chaát cô lyù toát, dieän tích beà maët vaø ñoä phaân taùn toát, caùc khaû naêng coá ñònh baèng phöông phaùp coäng hoùa trò cao. Nhöõng öùng duïng cuûa vaät lieäu naøy voâ cuøng phong phuù. 2.2.3. Caùc phöông phaùp coá ñònh enzyme Hieän nay coù 4 phöông phaùp chính ñieàu cheá enzyme coá ñònh döïa treân cô sôû lyù hoùa hoïc nhö sau : – Phöông phaùp haáp thuï vaät lyù enzyme leân caùc vaät lieäu coá ñònh khoâng hoøa tan coù mang hoaëc khoâng mang ñieän tích. – Phöông phaùp nhoát enzyme ôû beân trong polymer taïo thaønh xung quanh enzyme moät heä thoáng löôùi coù loã nhoû ñeå khoâng cho phaân töû enzyme ñi khoûi maøng, nhöng caùc loã ñuû lôùn ñeå cô chaát vaø saûn phaåm taïo ra ñi qua ñöôïc deã daøng. – Phöông phaùp hoùa hoïc : lieân keát coäng hoùa trò vaø lieân leát ion. – Phöông phaùp khaâu maïch. a. Phöông phaùp haáp thuï vaät lyù (Physical Absortion) Phöông phaùp naøy coù öùng duïng roäng raõi, ñaëc bieät laø trong giai ñoaïn ñaàu cuûa vieäc nghieân cöùu enzyme coá ñònh. Quaù trình thöïc hieän haáp thuï khaù ñôn giaûn : chaát 15 haáp thuï vaø enzyme ñöôïc troän laãn vôùi nhau, uû moät thôøi gian roài loïc, röûa phaàn enzyme khoâng haáp thuï. Enzyme gaén ñöôïc treân giaù theå nhôø töông taùc cuûa caùc lieân keát yeáu nhö lieân keát : ion, kî nöôùc, hydrogen vaø löïc Vander Waals. Khaû naêng haáp thuï cuûa enzyme phuï thuoäc vaøo caùc ñieàu kieän moâi tröôøng nhö : nhieät ñoä, noàng ñoä enzyme, dieän tích beà maët tieáp xuùc cuûa vaät lieäu coá ñònh. Vaät lieäu coá ñònh höõu cô chuû yeáu ñöôïc söû duïng laø caùc daãn xuaát cuûa polysacchride töï nhieân nhö : cellulose vaø dextran. Theo Mitz vaø Schlueter thì caùc enzyme coù tính acid nhö pepsin deã daøng keát hôïp vôùi DEAE Cellulose, coøn caùc enzyme coù tính kieàm nhö trypsin vaø chymotrypsin thì keát hôïp deã daøng vôùi CM cellulose, phosphate cellulosehoaëc citrate cellulose. Caùc daãn xuaát cellulose naøy coù theå gaén ñöôïc 2 50% enzyme. Vaät lieäu coá ñònh voâ cô nhö: thuûy tinh xoáp, silicagel, cytochrom cuõng ñöôïc söû duïng, caùc vaät lieäu naøy coù öu ñieåm laø chuùng coù khaû naêng thay ñoåi ñoä xoáp lôùn vaø coù khaû naêng haáp thuï cao ñoái vôùi protein. Phöông phaùp naøy coù nhöôïc ñieåm laø quaù trình giaûi haáp thuï enzyme (enzyme coá ñònh trôû thaønh deã hoøa tan) deã daøng xaûy ra khi thay ñoåi pH, nhieät ñoä vaø thaønh phaàn ion.  Yeáu toá aûnh höôûng ñeán khaû naêng coá ñònh cuûa vaät lieäu Noàng ñoä enzyme : noàng ñoä enzyme caøng cao thì söï haáp thuï caøng nhieàu, theo coâng thöùc cuûa Freundlick. 2.1 K CKm Vôùi : K1, K2 haèng soá. m soá löôïng enzyme coù khaû naêng haáp thuï leân beà maët vaät lieäu. C : Noàng ñoä enzyme Coâng thöùc cuûa Langmuiz : CK CKK m .1 .. 2 21 16 Thôøi gian tieáp xuùc : cho enzyme tieáp xuùc vôùi beà maët cuûa vaät lieäu coá ñònh, toác ñoä haáp thuï phuï thuoäc vaøo ñaëc tính lyù hoùa cuûa chaát haáp thuï vaø enzyme. Kích thöôùc cuûa vaät lieäu coá ñònh : toác ñoä haáp thuï caøng taêng khi kích thöôùc caøng giaûm. Nhieät ñoä : khi nhieät ñoä taêng, toác ñoä haáp thuï taêng, quaù trình haáp thuï xaûy ra raát nhanh chæ sau vaøi phuùt thì enzyme seõ haáp thuï leân treân beà maët. pH : quaù cao hoaëc quaù thaáp ñeàu laøm giaûm khaû naêng haáp thuï, thoâng thöôøng söï haáp thuï toái ña ôû pH ñieåm ñaúng ñieän. Thaønh phaàn moâi tröôøng : caùc chaát laøm giaûm tính hoøa tan cuûa enzyme trong pha nöôùc, seõ laøm taêng khaû naêng haáp thuï. Nhö vaäy muoán haáp thuï caøng nhieàu, caøng laøm giaûm tính hoøa tan cuûa enzyme. b. Phöông phaùp “nhoát” enzyme (Entrapment Method) Ñaây laø phöông phaùp ñôn giaûn, enzyme ít bò bieán ñoåi bôûi quaù trình coá ñònh. Phöông phaùp naøy coù theå coá ñònh nhieàu enzyme cuøng moät luùc. Giôùi haïn cuûa phöông phaùp naøy laø haïn cheá khaû naêng tieáp xuùc giöõa enzyme vaø cô chaát, do ñoù hoaït tính enzyme thöôøng thaáp, nhaát laø trong tröôøng hôïp cô chaát coù troïng löôïng phaân töû lôùn. Enzyme ñöôïc bao boïc trong moät maøng khoâng thaåm thaáu ñoái vôùi enzyme vaø caùc chaát coù troïng löôïng phaân töû cao, nhöng laïi cho cô chaát vaø saûn phaåm thaåm thaáu qua moät caùch deã daøng. Phöông phaùp naøy cho pheùp giöõ enzyme trong dung dòch gaàn gioáng vôùi töï nhieân vaø söû duïng enzyme nhieàu laàn vì coù theå taùch vaø thu noù deã daøng khoûi saûn phaåm cuûa quaù trình phaûn öùng baèng caùch loïc. Caùc phöông phaùp nhoát enzyme trong maøng baùn thaám : Hình 2.8: Nhoát Enzym trong sôïi coù loã nhoû E E E 17 Hình 2.9: Enzym ñöôïc nhoát trong sôïi maõûnh Hình 2.10: Nhoát enzym trong gel Hình 2.11: Nhoát enzym trong micro – capsule  Nhoát trong caáu truùc maïng Gel Enzyme ñöôïc nhoát trong caáu truùc maïng gel cuûa caùc polymer nhö poly sacchride, protein, polymer toång hôïp nhö polyacrylamide, polyhydroethylacrylate … Caùc polysaccharide thöôøng duøng laø gel alginate vaø carrageenan laø caùc poly anion deã daøng taïo haït trong dung dòch muoái Ca, K vaø khoâng beàn trong moâi tröôøng coù phosphate. Khaéc phuïc nhöôïc ñieåm naøy baèng caùch cho gel khaâu maïch trong dung dòch glutaraldehyde. Gel chitosan oån ñònh hôn, chitosan ñöôïc taïo haït trong dung dòch khaâu maïch laø polyphosphate, K4Fe(CN)6 thöôøng ñöôïc söû duïng nhoát teá baøo vaø enzyme. Protein thöôøng duøng laø gelatin, enzym ñöôïc troän vôùi gel gelatin sau ñoù ñöôïc khaâu maïch trong dung dòch glutaraldehyde hoaëc aldehyte collagen laø vaät lieäu protein coù theå duøng ñeå nhoát enzyme trong gel cuûa noù, nhôø khaû naêng khaâu maïch cuûa gel trong dung dòch khaâu maïch glutaraldehyde khi ñöôïc khaâu maïch haït gel khoâng tan vaø oån ñònh cao. E E E E E E 18  Giôùi thieäu veà gel alginate thöông phaåm Laø loaïi vaät lieäu thích hôïp nhoát enzyme. Phöông phaùp taïo haït raát ñôn giaûn. Hoãn hôïp enzyme vaø alginate ñöôïc nhoû xuoáng dung dòch CaCl2 ñeå taïo haït gel bao boïc laáy enzyme. Saûn phaåm khi hoøa tan hoaøn toaøn trong nöôùc seõ taïo thaønh daïng gel lieân keát thaønh moät chuoãi caùc polyanion vôùi söï saép xeáp cuûa 2 thaønh phaàn: mannuronate vaø glucuronate coù theå laø moät chuoãi (M M M) (G G G) hoaëc coù theå ñoù laø (M G M G). Tæ leä cao cuûa glucuronate laøm gia taêng söï beàn vöõng cuûa gel. Caáu truùc lieân keát do Phillips, Wedlock and Williams ñöa ra : Khi cho hoãn hôïp enzyme vaø sodium alginate nhoû töøng gioït xuoáng dung dòch CaCl2 seõ taïo thaønh nhöõng haït keát tuûa coù caáu truùc beàn vöõng (0.5 4mm) chöùa enzyme beân trong. Enzyme ñöôïc bao boïc trong moät maøng khoâng thaåm thaáu ñoái vôùi enzyme vaø caùc chaát coù troïng löôïng phaân töû cao, nhöng laïi cho cô chaát vaø saûn phaåm thaåm thaáu qua moät caùch deã daøng. Ñieàu naøy cho pheùp giöõ enzyme trong dung dòch gaàn gioáng vôùi töï nhieân vaø söû duïng enzyme nhieàu laàn. Enzyme + alginate CaCl2 Haït Calcium alginate vôùi enzyme coá ñònh 19 Phöông trình phaûn öùng : NainateACaCainateANa 2)lg()lg(2 2  Ñaëc ñieåm cuûa gel alginate Gel alginate coù khaû naêng nhoát moät löôïng lôùn teá baøo vaø enzyme, hieäu suaát nhoát enzyme cao, thao taùc vaø kyõ thuaät tieán haønh ñôn giaûn. Haït gel coù kích thöôùc coù thay ñoåi töø 0.5 4mm. Haït coù caáu truùc beàn vöõng. Ñeå oån ñònh haït gel coù theå cho haït gel khaâu maïch trong dung dòch glutaraldehyde hoaëc caùc chaát khaâu maïch khaùc. Tuy nhieân gel naøy laïi khoâng beàn trong moâi tröôøng coù phosphate.  Phöông phaùp nhoát gel trong heä sôïi Naêm 1972, Dinelli ñaõ tieán haønh moät thí nghieäm khaù ñoäc ñaùo laø nhoát enzyme trong heä sôïi vaø nhöõng nghieân cöùu naøy ñöôïc keát thuùc naêm 1978. Theo keát quaû nghieân cöùu cuûa Dinelli, enzyme khi ñöôïc nhoát vaøo heä sôïi phaùt huy khaû naêng xuùc taùc raát toát. Phöông phaùp nhoát enzyme trong heä sôïi coù khaû naêng xuùc taùc phaûn öùng toát hôn phöông phaùp nhoát enzyme trong gel. Caùc sôïi söû duïng ñeå nhoát enzyme thöôøng laø sôïi nhaân taïo. Caùc loaïi sôïi naøy coù ñoä beàn vôùi acid, kieàm, caùc loaïi ion vaø caùc loaïi dung moâi hoøa tan. Tính chaát treân phuï thuoäc raát nhieàu vaøo baûn chaát hoùa hoïc cuûa caùc polymer taïo ra loaïi sôïi naøy.  Phöông phaùp taïo vi nang (microcapsule) Khaùc vôùi phöông phaùp nhoát trong gel, ôû phöông phaùp naøy enzyme ñöôïc nhoát trong moät maøng baùn thaám, nhöng cô chaát vaø saûn phaåm deã daøng ñi qua. Vì hoaït ñoäng trong moâi tröôøng dung dòch, neân khaû naêng tieáp xuùc giöõa cô chaát vaø enzyme lôùn hôn trong tröôøng hôïp nhoát trong khuoân gel. 20 Hình 2.12: Qui trình nhoát enzyme trong microcapsule  Phöông phaùp sieâu loïc (ultrafilitration) Nguyeân taéc cuûa phöông phaùp naøy cuõng töông töï phöông phaùp micro capsule. Enzyme ñöôïc giöõ laïi trong caùc maøng, sôïi sieâu loïc. Phöông phaùp naøy ñaõ ñöôïc öùng duïng coá ñònh glucose amylase, glucose isomerase, galactosidase. c. Phöông phaùp hoùa hoïc  Lieân keát coäng hoùa trò Coá ñònh enzyme baèng lieân keát coäng hoùa trò vôùi caùc polymer ñaõ ñöôïc hoaït hoùa, laø moät trong nhöõng phöông phaùp coá ñònh enzyme phoå bieán nhaát, ñaûm baûo lieân keát vöõng chaéc cuûa enzyme vôùi vaät lieäu coá ñònh.  Öu ñieåm Do lieân keát chaët cheõ vôùi vaät lieäu coá ñònh baèng lieân keát coäng hoùa trò, neân enzyme khoâng bò ly giaûi trong suoát quaù trình söû duïng. Enzyme deã daøng tieáp xuùc cô chaát do enzyme ñöôïc gaén treân beà maët vaät lieäu coá ñònh. Enzyme coù khaû naêng oån ñònh vôùi söï thay ñoåi nhieät ñoä. Monomer öa nöôùc Pha nöôùc Pha höõu cô Monomer kî nöôùc hoùa polymer polymer 21  Nhöôïc ñieåm Enzyme coù theå bò maát hoaït tính vì caáu truùc cuûa enzyme bò thay ñoåi do quaù trình lieân keát. Giaûm khaû naêng tieáp xuùc giöõa enzyme vaø cô chaát do ñoù laøm giaûm hoaït tính enzyme coá ñònh. Vaät lieäu coá ñònh khoâng taùi söû duïng ñöôïc, phöông phaùp naøy aùp duïng cho caùc enzyme oån ñònh hoaït tính khi coá ñònh.  Enzyme coá ñònh coù theå taïo ra baèng hai caùch – Noái ñoàng hoùa trò lieân keát caùc phaân töû enzyme rieâng bieät laïi thaønh moät lieân hôïp cao phaân töû khoâng hoøa tan. Ñaây laø phöông phaùp khoâng söû duïng chaát mang. Caùc phaân töû enzyme seõ lieân keát vôùi nhau qua caùc caàu noái trung gian ñeå trôû thaønh daïng khoâng hoøa tan. Caùc caàu noái trung gian thöôøng duøng laø glutaraldehyte. – Keát hôïp phaân töû enzyme vôùi vaät lieäu coá ñònh khoâng hoøa tan baèng lieân keát coäng hoùa trò. Ñieàu cheá caùc enzyme coá ñònh loaïi 1, khi duøng caùc taùc nhaân löôõng chöùc nhö bisdiazobenzidin, bisdiazobenzidin, 2,2’ disulfur acid vaø moät soá hôïp chaát khaùc. Ñaëc bieät ngöôøi ta thöôøng duøng glutaraldehyte laøm taùc nhaân ñeå ñính caùc phaân töû enzyme laïi vôùi nhau. Caùc enzyme coá ñònh loaïi 2 thöôøng ñöôïc ñieàu cheá phoå bieán hôn. Chaát mang ñeå coá ñònh enzyme phaûi thoûa maõn nhöõng ñoøi hoûi nhaát ñònh sau : Coù ñoä hoøa tan thaáp vaø beàn vöõng ñoái vôùi caùc taùc ñoäng cô hoïc vaø hoùa hoïc nhaát ñònh … Khoâng gaây taùc duïng kìm haõm ñeán enzyme. Khoâng taïo ra hieän töôïng haáp thuï khoâng ñaëc hieäu ñoái vôùi caùc protein. Vì phaûn öùng enzyme thöôøng xaûy ra trong moâi tröôøng nöôùc, neân vaät lieäu coá ñònh toát hôn caû laø coù chaát öa nöôùc. 22 Trò soá vaø daáu ñieän tích cuûa vaät lieäu coá ñònh cuõng coù vai troø nhaát ñònh. Vieäc gaén enzyme coù hieäu quaû hôn caû khi ñieän tích cuûa enzyme vaø cuûa vaät lieäu coá ñònh coù daáu ngöôïc nhau. Vì leõ ñieän tích cuøng daáu coù theå ngaên caûn söï lieân keát. Quaù trình coá ñònh enzyme coù theå xaûy ra qua moät giai ñoaïn neáu vaät lieäu coá ñònh coá ñònh coù chöùa caùc nhoùm coù khaû naêng tham gia töông taùc tröïc tieáp vôùi nhoùm amin cuûa enzyme. Tröôøng hôïp ngöôïc laïi quaù trình xaûy ra qua 2 giai ñoaïn :  Giai ñoaïn hoaït hoùa vaät lieäu coá ñònh baèng caùch ñöa vaøo caùc nhoùm chöùc naêng coù khaû naêng phaûn öùng hôn.  Giai ñoaïn hai giai ñoaïn keát hôïp enzyme. Tröôøng hôïp khoâng caàn hoaït hoùa vaät lieäu coá ñònh theå hieän roõ trong tröôøng hôïp copolymer cuûa maleic alhydric vaø ethylen. Copolymer ñöôïc duøng phoå bieán laøm vaät lieäu coá ñònh ñeå ñieàu cheá caùc daãn xuaát khoâng tan cuûa protease vaø moät soá enzyme khaùc. Tröôøng hôïp hoaït hoùa vaät lieäu coá ñònh :  Hoaït hoùa chaát mang baèng cyanogen halogenur : Caùc chaát mang coù baûn chaát laø polysaccharide ( OH) thöôøng ñöôïc hoaït hoùa sô boä baèng cyanogen halogenur. Phaûn öùng hoaït hoùa xaûy ra trong moâi tröôøng kieàm. Chaát mang hoaït hoùa coù khaû naêng lieân keát coäng hoùa trò vôùi [ NH2] cuûa protein cuûa enzyme. Porath vaø Bar Eli laàn ñaàu tieân hoaït hoùa cellulose, agarose vaø dextran baèng phöông phaùp naøy. Quaù trình dieãn ra nhö sau: Khi xöû lyù polysaccharide baèng BrCN seõ taïo ra imidocarbonate. Carbonate beàn vöõng, coøn imidocarbonate töông taùc vôùi [ NH2] 23 NH C O O OH N CNOH OH OH CNBr + ENZYME + ENZYME OH ENZYMENHCO NH OH ENZYMENHCO O  Hoaït hoùa baèng ethyl chloroformate : Khi söû duïng phöông phaùp hoaït hoùa baèng cyanogenbromide, Cyanogenbromide vaø caùc saûn phaåm trung gian raát ñoäc. Chloroformate coù theå ñöôïc söû duïng ñeå taïo ra caùc saûn phaåm trung gian töông töï nhöng khoâng coù ñoäc tính. Phöông phaùp ñöôïc thöïc hieän nhö sau : OH ENZYMENHCO O O C O O HCClO OH OH ENZYM 522  Hoaït hoùa baèng carbodiimide Caùc chaát mang coù chöùa nhoùm carboxyl, coù theå ñöôïc hoaït hoùa baèng caùc daãn xuaát carbodiimide. Phaûn öùng xaûy ra trong moâi tröôøng acid yeáu (pH = 5), neân phöông phaùp hoaït hoùa naøy phuø hôïp vôùi caùc enzyme amylase, pepsin, cellulase … 24 ENZYMNHC O R' N C CO NH O HOC O ENZYMR'NCNR R  Hoaït hoùa baèng glutaraldehyde Caùc chaát mang coù chöùa nhoùm NH2 nhö polyacrylamide,chitin, chitosan, cellulose, tinh boät gheùp acrylamide ñeàu coù theå söû duïng phöông phaùp naøy. Glutaraldehyde laø chaát coù chöùa hai nhoùm aldehyde hoaït hoùa. Moät nhoùm seõ gaén vôùi NH2 cuûa chaát mang, nhoùm coøn laïi seõ gaén vaøo NH2 cuûa enzyme. OCH CH CH CH OCH 2 2 2 22 22 22 CHCHC OCH CHCHCHC OCH CHCHCHC OCH CH 22 22 22 CHCHCH OCH CHCHCH ENZYMNCH CHCHCH OCH NH CH  Hoaït hoùa baèng 3 aminopropyltriethoxysilane Hoaït hoùa baèng trialkoxysilane cho pheùp hoaït hoùa nhöõng vaät lieäu trô nhö thuûy tinh coù theå gaén vôùi enzyme. Thöïc hieän nhö sau : ENZYM + ENZYM 25 232 232NH)Si(CHO)H(C NH)(CHSiOSiO O O NH)(CHSiOSiO O OHSiO O OHSiO O 232352 2 CClS NCS)(CHSiOSiO O O NCS)(CHSiOiO O 32 32 + ENZYM ENZYMNHCNH)(CHSiOSiO S O O ENZYMNHCNH)(CHSiOSiO S O 32 32  Hoaït hoùa baèng azide Hieän nay phöông phaùp naøy ñöôïc xem laø phöông phaùp haøng ñaàu. Caùc chaát mang coù chöùa nhoùm chöùc COOH nhö CM Cellulose, polyacrylamide vaø nylon coù theå hoaït hoùa baèng phöông phaùp naøy. Tröôùc heát laø ester hoùa CM Cellulose. Sau ñoù chuyeån ester thaønh hydrazide, roài azide. Azide trong moâi tröôøng kieàm seõ phaûn öùng [ NH2] cuûa enzyme. Phaûn öùng xaûy ra theo sô ñoà : Glass 26 OH NHNHCOCH O NHNH OH OCHCOCH O OHCH OH COOHOCH 22 22 32 3 2 HNO2 ENZYM OH ENZYMNHCOCH O 2 OH COCH O 32  Hoaït hoùa baèng phaûn öùng diazo Nhöõng chaát mang coù nhoùm amine coù theå söû duïng phöông phaùp naøy. Muoái diazo cuûa chaát mang hoaït hoùa coù theå phaûn öùng khoâng chæ vôùi nhoùm amin maø caû nhoùm phenol, imidizol cuûa protein cuûa enzyme. Phaûn öùng coäng hoùa trò vôùi enzyme xaûy ra nhanh choùng ôû nhieät ñoä thöôøng vaø moâi tröông nöôùc trung bình. Quaù trình hoaït hoùa vaø gaén enzyme nhö sau : OH NN CHO HCl ,NaNO OH NH CHO 2 2 22 + ENZYM OH ENZYMNN CHO 2 27  Phöông phaùp lieân keát ion Döïa treân khaû naêng taïo lieân keát giöõa chaát mang vôùi enzyme. Lieân keát ion thöôøng khoâng beàn baèng söï haáp thuï giöõa enzyme vôùi chaát mang. Naêm 1956, Mitz laø ngöôøi ñaàu tieân thöïc hieän phöông phaùp lieân keát ion ñeå gaén enzyme vaøo chaát mang. OÂng ñaõ söû duïng DEAE ñeå gaén enzyme vaøo. Naêm 1966, Tosa ñaõ söû duïng DEAE sephadex nhö moät chaát mang ñeå gaén aminoacrylase trong qui trình coâng nghieäp saûn xuaát amino acid, sau ñoù laø haøng loaït nghieân cöùu theo phöông phaùp naøy vaø ñöôïc aùp duïng khaù thaønh coâng ôû qui moâ coâng nghieäp. d. Phöông phaùp khaâu maïch (cross linking) Nhöõng hôïp chaát coù hai hoaëc ña nhoùm chöùc naêng nhö glutaraldehyde, diisocyanate ñöôïc duøng laøm caàu noái khaâu maïch taïo thaønh ñaïi phaân töû khoâng tan trong nöôùc. Phöông phaùp naøy thöôøng cho hoaït tính thaáp laø do caùc hôïp chaát khaâu maïch coù theå lieân keát vaøo trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme. Treân ñaây laø moät soá phöông phaùp coá ñònh enzyme, söï löïa chon ñuùng phöông phaùp thích hôïp cho töøng enzyme vaø vaät lieäu coá ñònh chuyeân bieät laø moät yeáu toá toái quan troïng ñeå thu ñöôïc cheá phaåm enzyme coá ñònh coù hoaït tính cao. Ñoàng thôøi caàn xaùc ñònh caùc ñieàu kieän hoaït ñoäng thích hôïp cho enzyme coá ñònh. Vì vaäy ñeå cho quaù trình coá ñònh coù keát quaû neân löu yù : Enzyme phaûi oån ñònh trong nhöõng ñieàu kieän dieãn ra phaûn öùng. Caùc chaát tham gia phaûn öùng taïo lieân keát ngang chuû yeáu chæ töông taùc vôùi nhöõng nhoùm chöùc naêng naèm ngoaøi trung taâm hoaït ñoäng enzyme hoaëc taïo lieân keát ngang coù kích thöôùc lôùn khoâng cho pheùp noù xaâm nhaäp vaøo trung taâm hoaït ñoäng enzyme. Trung taâm hoaït ñoäng phaûi luoân ñöôïc “baûo veä” baèng nhieàu phöông phaùp khaùc nhau nhö : Enzyme chöùa nhoùm SH thì caàn phaûi xöû lyù sô boä noù baèng glutathinon hay cystein vaø chæ taùi hoaït hoùa enzyme sau khi ñaõ gaén noù vaøo vaät 28 lieäu coá ñònh hoaëc boå sung vaøo hoãn hôïp phaûn öùng cô chaát ñaõ ñöôïc baõo hoøa bôûi enzyme. Caàn choïn bieän phaùp thích hôïp ñeå taùch “enzyme khoâng ñöôïc gaén” leân vaät lieäu coá ñònh, maø khoâng gaây aûnh höôûng xaáu ñeán enzyme ñöôïc gaén. Khi löïa choïn heä coá ñònh caàn ñeå yù ñeán phaûn öùng cuï theå vaø thaät voâ nghóa neáu ñöa enzyme vaøo vaät lieäu coá ñònh maø baûn chaát vaät lieäu coá ñònh laø polymer bò phaân giaûi bôûi enzyme naøy xuùc taùc hoaëc ñaëc bieät neáu enzyme bò öùc cheá bôûi saûn phaåm cuûa phaûn öùng taïo ra. 2.3. ÖÙNG DUÏNG CUÛA ENZYME COÁ ÑÒNH [3] 2.3.1. Trong coâng nghieäp Ngaøy nay, nhieàu qui trình öùng duïng enzyme coá ñònh trong coâng nghieäp nhö coâng nghieäp saûn xuaát röôïu bia, nöôùc giaûi khaùt, cheá bieán söõa, saûn xuaát da, hoùa chaát. Röôïu bia : caùc enzyme amylase, teá baøo naám men coá ñònh enzyme ñöôïc söû duïng vôùi qui moâ lôùn. Cheá bieán söõa : Enzyme lactase coá ñònh ñeå thuûy phaân lactose trong söõa. Naêm 1969 Wilson ñaõ saûn xuaát lieân tuïc glucose baèng glucoamylase coá ñònh. Naêm 1971 ñaõ duøng chymotrysin lieân keát coäng hoùa trò vôùi carboximethyl cellulase laøm ñoâng tuï söõa thay cho renin ñaét tieàn.  Thu nhaän hoãn hôïp glucose fructose Naêm 1973 haõng Clinton Corn (Myõ) ñöa vaøo saûn xuaát coâng nghieäp glucoisomerase chuyeån hoùa glucose thaønh fructose vôùi tæ leä 1:1, thoâng thöôøng ñöôïc gaén vôùi caùc polymer voâ cô qua caùc lieân keát ñoàng hoùa trò.  Taùch hoãn hôïp aminoacid nhôø aminocylase Coâng trình ñöôïc söû duïng ñaàu tieân ôû Nhaät Baûn ñeå saûn xuaát methionine. Haõng Snam Progetti (YÙ) nhoát aminoacid trong sôïi cellulose triacetat. Haõng Tanaka Cuaky (Nhaät) söû duïng phöông phaùp haáp thuï aminoacid treân DEAE Cellulose. 29  Thu nhaän l asparric acid Aspartase coá ñònh xuùc taùc quaù trình gaén nhoùm NH3 vaøo fumaric acid ñeå nhaän ñöôïc L aspartic acid (1973) hieäu suaát chuyeån hoùa laù 80%. Aspartic coá ñònh thu nhaän baèng caùch nhoát teá baøo trong gel polyacrylamide.  Thu nhaän l succinic acid Fumarase coá ñònh chuyeån hoùa fumaric acid thaønh L succinic acid ñöôïc thöïc hieän ôû qui moâ coâng nghieäp naêm 1974, phaûn öùng xaûy ra cho ñeán khi 80% fumaric acid ñöôïc chuyeån hoùa. Fumarase coá ñònh ñöôïc thu nhaän baèng caùch nhoát teá baøo trong gel polyacrylamide hoaëc sôïi triacetate cellulose.  Thu nhaän 6 amino penicillinic acid 6 APA laø baùn saûn xuaát ñeå toång hôïp caùc loaïi penicilin khaùc nhau, laàn ñaàu tieân ñöôïc haõng Snam Progetti 1975 ñaõ söû duïng penicillinamiolase coá ñònh ñeå saûn xuaát penicillin.  Thuûy giaûi lactose Lactose hay coøn goïi laø “ñöôøng söõa” coù ñoä ngoït vaø ñoä hoøa tan thaáp, bò thuûy giaûi bôûi lactase thaønh glucose vaø galactose. Caùc cheá phaåm lactase coá ñònh ñaõ ñöôïc cheá taïo theo phöông phaùp khaùc nhau: nhoát trong sôïi triacetate cellulose, lieân keát ñoàng hoùa trò vôùi caùc polymer chöùa silic, haáp thuï treân caùc chaát trao ñoåi ion.  Thu nhaän töø tinh boät Ñeå thu nhaän glucose phaûi söû duïng hai enzyme laø amylase vaø glucoamylase phaân caét tinh boät thaønh caùc oligosaccharide, coøn glucoamylase phaân caét tinh boät vaø taïo thaønh glucose. Hieän nay ngöôøi ta chuù yù taïo glucoamylase coá ñònh. Haõng Corning Glass ñaõ söû duïng glucoamylase coá ñònh ñeå saûn xuaát 450 kg glucose/ngaøy. Cheá phaåm glucoamylase coá ñònh ñöôïc thu nhaän baèng caùch gaén enzyme treân silicagel, nhoát trong sôïi triacetate cellulose haáp thuï treân DEAE Cellulose. 30 Ngoaøi ra, hieän nay voâ soá enzyme ñaét tieàn khaùc ñang ñöôïc tieán haønh coá ñònh vaø nghieân cöùu söû duïng ôû qui moâ coâng nghieäp. 2.3.2. Trong y hoïc Enzyme coá ñònh ñöôïc öùng duïng nhieàu trong y hoïc, ñeå chöõa caùc beänh di truyeàn do thieáu enzyme hoaëc hoaït ñoä enzyme yeáu. Naêm 1954 Chung ñaõ taïo ñöôïc vi tieåu caàu baùn thaám coù gaén enzyme, nhôø theá enzyme coù theå toàn taïi treân cô theå laâu daøi vì enzyme bò bieät laäp vôùi moâi tröôøng xung quanh. Nhôø theá maø cô theå taïo ñöôïc noàng ñoä cao cuûa enzyme thieáu maø khoâng bò aûnh höôûng ñeán caùc phaûn öùng phuï. Urease coá ñònh ñöôïc duøng ñeå loaïi urea trong maùu cuûa thaän nhaân taïo. Caùc tieåu caàu coù gaén catalase duøng trò thieáu catalase cô. Enzyme coá ñònh coøn ñöôïc duøng trong chaån ñoaùn beänh, ngoaøi caùc öùng duïng ñieän cöïc enzyme, trong phaân tích caùc chæ tieâu sinh hoùa cuûa maùu nhö löôïng glucose, urea, cholesterol… enzyme horse radish peroxidase coá ñònh treân polystyren cuøng vôùi khaùng theå giuùp chaån ñoaùn nhanh vaø chính xaùc (kyõ thuaät ELLISA). Enzyme 1 asparaginase coù khaû naêng öùc cheá söï phaùt trieån cuûa khoái u aùc tính, neáu ñöa tröïc tieáp enzyme naøy vaøo cô theå thì bò ñöa ra ngoaøi nhanh choùng vaø gaây hieän töôïng dò öùng, nhöng neáu ñöa caùc vi tieåu caàu coù gaén enzyme vaøo cô theå seõ coù hieäu quaû hôn. 2.3.3. Trong nghieân cöùu khoa hoïc Tröôùc tieân enzyme coá ñònh laø coâng cuï nghieân cöùu hoùa sinh raát quan troïng. Naêm 1967, ñieän cöïc enzyme ñaàu tieân ñaõ ñöôïc cheá taïo ñeå xaùc ñònh noàng ñoä glucose nhôø glucooxydase coá ñònh. Ñieän cöïc enzyme laø ñieän cöïc oxy treân beà maët coù gel poly acrylamide. Nhuùng ñieän cöïc vaøo dung dòch coù glucose thì cô chaát vaø oxy seõ khueách taùn vaøo gel chöùa enzyme. Nhö vaäy, söï bieán ñoåi doøng ñieän trong heä thoáng ñieän cöïc phuï thuoäc vaøo toác ñoä cuûa phaûn öùng vaø noàng ñoä glucose. Kaetsu ñaõ duøng ñieän cöïc urease ñeå ño noàng ñoä urea trong maùu, duøng cholesterol oxidase ño noàng ñoä cholesterol. 31 Clark duøng ñieän cöïc alcohol oxydoreductase ñeå xaùc ñònh noàng ñoä coàn. Ngoaøi ra enzyme coøn coù theå duøng vaøo nhieàu muïc ñích khaùc nhau nhö: hoaït hoùa zymogen, nghieân cöùu caáu truùc phaân töû protein, söû duïng phöông phaùp saéc kyù aùi löïc ñeå tinh cheá moät soá chaát coù khaû naêng lieân keát ñaëc bieät vôùi enzyme. Ngaøy nay coù nhieàu qui trình söû duïng cheá phaåm teá baøo coá ñònh ñeå xöû lyù nöôùc thaûi ñaït hieäu quaû. Caùc nghieân cöùu veà maøng enzyme coá ñònh ngaøy caøng taêng, nhöõng keát quaû ñaït ñöôïc cuõng phuï thuoäc nhieàu vaøo tính chaát cuûa maøng duøng ñeå gaén enzyme. Treân cô sôû nghieân cöùu tính chaát cuûa enzyme coá ñònh seõ goùp phaàn giaûi quyeát nhieàu vaán ñeà lôùn khaùc nhau nhö : – Giaûi thích toaøn dieän hôn chöùc naêng xuùc taùc sinh hoïc trong teá baøo soáng vaø ñieàu hoøa hoaït ñoäng enzyme trong teá baøo. – Ñieàu hoøa tính thaám cuûa maøng vaø khueách taùn qua maøng. – Ñaëc tính cuûa phaûn öùng enzyme ôû giôùi haïn phaân caùch giöõa caùc phase cuûa maøng, trong moâi tröôøng kî nöôùc, moâi tröôøng nöôùc trong maøng teá baøo. Ngaøy nay, vieäc nghieân cöùu enzyme coá ñònh ñöôïc tieán haønh theo höôùng ngaøy caøng phöùc taïp daàn, moâ hình töø moät enzyme rieâng leû ñeán heä thoáng nhieàu enzyme, seõ tieán ñeán taïo nhöõng caáu truùc treân phaân töû coù traät töï bao goàm nhieàu phöùc heä enzyme. Nghieân cöùu quaù trình xuùc taùc nhôø caùc heä thoáng phöùc taïp seõ giuùp hieàu bieát ñaày ñuû cô cheá caùc quaù trình trao ñoåi chaát cuûa teá baøo. 2.4. CAÙC NGHIEÂN CÖÙU VEÀ ENZYME COÁ ÑÒNH 2.4.1. Caùc nghieân cöùu trong nöôùc Vieäc nghieân cöùu vaø öùng duïng enzyme coá ñònh ôû Vieät Nam chöa phoå bieán laém vaø vaãn coøn ñöôïc xem laø höôùng môùi meû, keát quaû thu ñöôïc coøn haïn cheá. Tuy nhieân, gaàn ñaây ñaõ coù moät soá cuoäc thöû nghieäm veà vaán ñeà coá ñònh enzyme ôû teá baøo vi sinh, enzyme trích töø ñoäng vaät, thöïc vaät trong ñoù noåi baät laø : 32  Nhoùm nghieân cöùu cuûa GS TS Nguyeãn Vaên Uyeån thöû nghieäm saûn xuaát coàn baèng kyõ thuaät coá ñònh teá baøo naám men Saccharomyces Cerevisiae treân gel calcium alginate. Phöông phaùp naøy khoâng ñoøi hoûi thieát bò phöùc taïp vaø coù theå thöïc hieän nhanh choùng. Öu ñieåm phöông phaùp saûn xuaát lieân tuïc neân naêng suaát taïo coàn taêng, ít ñaàu tö voán, naám men hoaït ñoäng lieân tuïc (100 ngaøy) thay vì phaûi caáy vaø nhaân gioáng haøng ngaøy neáu theo qui trình cuõ.  Nhoùm nghieân cöùu cuûa Vieän Sinh Hoïc Nhieät Ñôùi keát hôïp vôùi boä moân sinh hoùa tröôøng Ñaïi hoïc Khoa Hoïc Töï nhieân naêm 1994 nghieân cöùu thöû nghieäm taïo pepsin coá ñònh vaø naêm 1995 thöû nghieäm taïo pancreatin coá ñònh treân cytochrom. Keát quaû thu ñöôïc môû ra höôùng nghieân cöùu tieáp theo cho caùc enzyme khaùc.  Phoøng nghieân cöùu coâng ngheä böùc xaï Vieän Nghieân Cöùu Haït Nhaân Ñaø Laït coù nhieàu coâng trình nghieân cöùu enzyme coá ñònh treân teá baøo vi sinh vaø caùc chaát coù hoaït tính sinh hoïc baèng kyõ thuaät böùc xaï nhö coá ñònh glucoamylase, protease, vi khuaån taû (Vibrio Cholerae), teá baøo naám men (Saccharomyces Serevisae), vi khuaån xöû lyù nöôùc thaûi (Pseudomonas Maltophila) vaø progesteron treân caùc giaù theå polymer toång hôïp.  Nghieân cöùu cuûa Nguyeãn Anh Duõng taïi Vieän Nghieân Cöùu Haït Nhaân Ñaø Laït naêm 1999 öùng duïng kyõ thuaät böùc xaï theo 2 höôùng chính laø : cheá taïo vaät kieäu töông hôïp sinh hoïc vaø coá ñònh caùc chaát coù hoaït chaát sinh hoïc leân caùc vaät lieäu polymer gheùp baèng böùc xaï. Ñeå cheá taïo vaät lieäu töông hôïp sinh hoïc thöôøng duøng phöông phaùp copolymer hoùa caùc monomer vôùi polymer vaø phöông phaùp khaâu maïch böùc xaï. Ñeå coá ñònh caùc chaát coù hoaït chaát coù hoaït tính sinh hoïc baèng caùch taïo lieân keát vôùi polymer hoaëc nhoát trong polymer. Taùc giaû ñaõ coá ñònh ñöôïc trypsin trong gel chitosan g.co HEMA traùnh söï taùc ñoäng tröïc tieáp cuûa böùc xaï coù theå ñaùp öùng ñöôïc yeâu caàu öùng duïng trong coâng nghieäp. 33 2.4.2. Caùc nghieân cöùu ngoaøi nöôùc  Enzyme coá ñònh ñaõ ñöôïc caùc nhaø khoa hoïc quan taâm vaø ñöa ra nhieàu höôùng nghieân cöùu töø raát laâu. Naêm 1916 khi Nelson vaø Griffin quan saùt khaû naêng thuûy phaân ñöôøng saccharose baèng invertase ôû naám men haáp thuï treân than hoaït tính.  Sau ñoù ñeán naêm 1953, Grubhofer vaø Schleith coá ñònh carboxipeptidase, pepsin, ribonuclease baèng lieân keát coäng hoùa trò treân nhöïa polyaminostyren ñöôïc diazo hoùa.  Vaøo naêm 1963 Bernfeld vaø Wan ñaõ moâ taû phöông phaùp nhoát. Caùc enzyme trypsin, papain, amylase vaø ribonuclease trong gel polyacrylamide.  Vaøo naêm 1964, Richard laàn ñaàu tieân duøng glutaraldehyde 1% ñeå ñieàu cheá ra carboxypeptidase axit amin ôû daïng tinh theå khoâng tan, sau khixöû lyù enzy