Công nghệ enzyme - Tổng quan về enzyme

* CHÖÔNG 2 * Tài liệu tham khảo Hóa sinh công nghiệp- Lê Ngọc Tú Công nghệ enzyme- Đặng Thị Thu Công nghệ enzyme- Nguyễn Trọng Cẩn Các tài liệu hóa sinh Động học các quá trình xúc tác sinh học- Trần Đình Toại Food enzymes- Dominic .W.S. Wong Biotechnology, volume 9- G.Reed and T.W. Nagodawithana Food biotecnology- R.D. King and P.S.J. Cheetham * Đề tài seminar Protease và ứng dụng Amylase và ứng dụng Cellulase, pectinase và ứng dụng Lipase Enzyme trong ngành bánh kẹo Enzyme trong chế biến rau quả Enzyme trong ngành rượu bia Enzyme trong ngành bột, đường Enzyme trong ngành thịt, cá Enzyme trong ngành sữa Ngày báo cáo: Chủ nhật, 30/08/2008 * CHAÁT XUÙC TAÙC Thay ñoåi toác ñoä phaûn öùng: döông, aâm Giuùp chuyeån hoùa löôïng lôùn chaát phaûn öùng Tæ leä chaát phaûn öùng: chaát xuùc taùc lôùn Sau phaûn öùng: khoâng ñi vaøo saûn phaåm cuoái, khoâng bieán ñoåi, khoâng thay ñoåi soá löôïng H2 + O2  H2O platine Ñöôøng boác chaùy, khoâng caramel hoùa, khi raéc leân 1 ít taøn thuoác laù (moät soá muoái, oxit voâ cô) * ENZYME- Khaùi nieäm Chaát xuùc taùc sinh hoïc Do sinh vaät toång hôïp Xuùc taùc phaûn öùng trong cô theå Ñaëc tính: Cöôøng löïc cao: 1g pepsin, 5kg protein tröùng (2h), 1 β-amylase, 4000 glucoside Ñaëc hieäu Xuùc taùc meàm= ñieàu kieän bình thöôøng: 30-500C, pH trung tính, aùp suaát thöôøng. . . . Baûn chaát: chuû yeáu laø protein * Amylase * Back * TÍNH ÑAËC HIEÄU Chuyeån hoùa 1 hoaëc 1 soá ít cô chaát khoâng taïo saûn phaåm phuï Tuyeät ñoái: 1 cô chaát nhaát ñònh, vd urease Töông ñoái= ñaëc hieäu lieân keát hoùa hoïc: lipase: lieân keát ester Ñaëc hieäu nhoùm= ñaëc hieäu lieân keát + ñieàu kieän Carboxypeptidase: peptide gaàn –COOH töï do Ñaëc hieäu quang hoïc: 1 trong 2 ñoàng phaân, L hoaëc D, cis hoaëc trans Ñaëc hieäu moâi tröôøng: chymoptrypsin, trypsin * BAÛN CHAÁT ENZYME- Protein phaân töû löôïng lôùn: 20-1000kDa  khoâng qua ñöôïc maøng baùn thaám Caàu tan trong nöôùc Coù caáu truùc baäc 4 Deã bò bieán tính maát hoaït tính: nhieät, acid, kieàm, kim loaïi naêng. . . Löôõng tính: aâm, döông, trung hoøa tuøy pH Catalase * Enzyme ENZYME 2 CAÁU TÖÛ = ENZYME PHÖÙC TAÏP = PROTEIN + PHI PROTEIN (Coenzyme: kim loaïi, vitamine. . .) ENZYME 1 CAÁU TÖÛ = ENZYME ÑÔN GIAÛN = CHÆ COÙ PROTEIN amylase * GOÏI TEÂN TEÂN THOÂNG THÖÔØNG: amylase, bromelin TEÂN THÖÔNG MAÏI: vd: neutrase laø emzyme duøng trong sx bia cuûa haõng Novo Ñan Maïch THEO QUI ÖÔÙC QUOÁC TEÁ Phaàn 1: teân cô chaát ñaëc hieäu Phaàn 2: kieåu phaûn öùng enzyme xuùc taùc Phaàn 3: ñuoâi “ase” Vd: alcohol dehydrogenase= enzyme xuùc taùc phaûn öùng laøm maát H cuûa röôïu * PHAÂN LOAÏI LÔÙP (class) LÔÙP PHUÏ (subclass) NHOÙM (section) cuøng tính chaát ñaëc tröng cho phaûn öùng do enzyme xuùc taùc. 6 lôùp cuøng lôùp nhöng taùc ñoäng leân nhoùm chöùc hoaëc lieân keát khaùc cuøng lôùp phuï, cô chaát khaùc * 6 LÔÙP ENZYME EC 1: Oxyreductase: oxi hoùa khöû EC 2: Transferase: chuyeån nhoùm chöùc EC 3: Hydrolase: thuûy phaân EC 4: Lyase: taùch nhoùm chöùc khoâng caàn nöôùc EC 5: isomerase: ñoàng phaân hoùa EC 6: ligase: taïo lieân keát coù ATP tham gia * OXYREDUCTASE: oxi hoùa khöû Coù 4 nhoùm Dehydrogenase: Taùch H tröïc tieáp töø cô chaát Coù caùc coenzyme: NAD+, NADP+, . . . Coù vai troø trong sinh toång hôïp Vd: alcohol dehydrogenase, chuyeån röôïu thaønh aldehyd CH3CH2OH + NAD+  CH3CHO + H+ Oxidase Chuyeån e- ñeán Oxi oxi coù khaû naêng keát hôïp vôùi proton Vd: Cytocrom C oxydase xuùc taùc 4 ferrocytocrom C + O2 + 4H+  4 ferrocytocrom C + H2O * Oxygenase Xuùc taùc phaûn öùng keát hôïp oxi vaøo hôïp chaát höõu cô Goàm oxygenase (keát hôïp O2) vaø hydroxylase (keát hôïp OH) Peroxydase Xuùc taùc oxi hoùa caùc chaát höõu cô khi coù H2O2 Ñieån hình laø catalase, giaûi ñoäc H2O2 cho cô theå Vd: catalase H2O2 + H2O2  O2 + 2H2O OXYREDUCTASE: oxi hoùa khöû * Xuùc taùc chuyeån caùc goác, nhoùm töø chaát naøy sang chaát khaùc. Tuøy baûn chaát nhoùm Acyl-transferase: chuyeån nhoùm acyl, quan troïng trong trao ñoåi chaát Glucozyl-transferase: chuyeån goác ñöôøng Amino-transferase: chuyeån amin töø acid amin sang α-ketoacid acid amin môùi Phospho-transferase (kinase): chuyeån goác phosphat töø ATP ñeán –OH cuûa alcohol hoaëc ñöôøng TRANSFERASE * Xuùc taùc phaûn öùng thuûy phaân, luoân coù nöôùc tham gia Khoâng caàn coenzyme Quan troïng trong quaù trình tieâu hoùa Peptihydrolase: thuûy phaân lieân keát peptide Lipase (esterase): thuûy phaân lieân keát ester trong daàu môõ Glycoside hydrolase: thuûy phaân glucoside trong tinh boät, cellulose HYDROLASE * Lyase Taùch nhoùm chöùc khoâng caàn nöôùc Ví duï: pyruvat-decarboxylase, loaïi CO2 khoûi pyruvat  Acetaldehyd Xaûy ra trong quaù trình leân men röôïu CH3COCOO-  CH3CHO + CO2 isomerase Ñoàng phaân hoùa hình hoïc, quang hoïc, chuyeån vò noäi phaân Ví duï: Glucoisomerase chuyeån glucose thaønh fructose * Ligase Xuùc taùc toång hôïp caùc chaát höõu cô Ví duï: Pyruvat-carboxylase chuyeån C ñeán acid pyruvic vaø taïo thaønh oxaloacetic Trong chu trình krebs quan trong trong trao ñoåi chaát * CÔ CHEÁ PHAÛN ÖÙNG Laøm giaûm naêng löôïng hoaït hoùa cuûa phaûn öùng Ví duï: H2O2  H2O + O2 - Naêng löôïng hoaït hoùa: 18 kcal/mol - Coù xuùc taùc hoùa hoïc platin: 11,7 kcal/mol Coù enzyme: 5,5 kcal/mol Naêng löôïng hoaït hoùa giaûm toác ñoä phaûn öùng taêng leân * * 3 giai ñoaïn CÔ CHEÁ PHAÛN ÖÙNG E + S ES P + E Giai ñoaïn 1: - Enzyme keát hôïp vôùi cô chaát baèng lieân keát yeáu - Taïo phöùc enzyme-cô chaát (ES) - Xaûy ra nhanh, caàn ít naêng löôïng Giai ñoaïn 2: Bieán ñoåi cô chaát Keùo caêng  ñöùt lieân keát ñoàng hoùa trò Giai ñoaïn 3: Taïo saûn phaåm (P) Giaûi phoùng E töï do * TRUNG TAÂM HOAÏT ÑOÄNG Laø moät phaàn raát nhoû cuûa phaân töû enzyme Goàm: Taâm xuùc taùc: tham gia vaøo hoaït ñoäng xuùc taùc Mieàn xuùc taùc: tham gia taïo lieân keát vôùi cô chaát * TRUNG TAÂM HOAÏT ÑOÄNG Taâm hoaït ñoäng coù theå laø: - Caùc nhoùm chöùc cuûa phaàn protein - Caùc nhoùm ngoaïi Caùc nhoùm taïo taâm hoaït ñoäng xa nhau trong maïch peptide nhöng gaàn veà khoâng gian. Ñuû gaàn ñeå töông taùc * * Taâm hoaït ñoäng - S: töông öùng veà caáu truùc theo kieåu: * Caùc nhoùm chöùc ôû taâm hoaït ñoäng thay ñoåi vò trí taïo hình theå E khôùp vôùi S meàm deûo * TAÂM ÑIEÀU HOØA Allosteric site Treân enzyme Khaùc vò trí taâm hoaït ñoäng Ñieàu hoaø hoaït ñoäng cuûa enzyme Keát hôïp vôùi chaát ñieàu hoøa thay ñoåi caáu truùc enzyme thay ñoåi hình theå taâm hoaït ñoäng thay ñoåi khaû naêng xuùc taùc cuûa enzyme Chaát ñieàu hoøa: kieàm haõm hoaëc hoaït hoùa * cartoon * HOAÏT TÍNH ENZYME Laø möùc ñoä hoaït ñoäng cuûa enzyme caàn xaùc ñònh hoaït tính. 3 phöông phaùp: Ño S maát ñi hoaëc P taïo thaønh (noàng ñoä E khoâng ñoåi) Ño thôøi gian thu 1 löôïng cô chaát Ño noàng ñoä E caàn ñeå thu ñöôïc löôïng P nhaát ñònh Ñôn vò hoaït tính: 1UI= löôïng E chuyeån hoùa 1µmol cô chaát /phuùt (ñieàu kieän tieâu chuaån) * HOAÏT TÍNH ENZYME Hoaït ñoä cuûa moät cheá phaåm enzym: soá UI trong 1ml hoaëc 1mg Hoaït ñoä rieâng phaân töû: soá phaân töû cô chaát ñöôïc chuyeån hoùa bôûi 1 phaân töû E Xaùc ñònh hoaït tính E caàn chuù yù: [S]: thích hôïp, ñuû nhöng khoâng quaù cao Cho chaát hoaït hoùa, chaát laøm beàn vaøo tröôùc, loaïi chaát kieàm haõm pH thích hôïp, oån ñònh Nhieät ñoä: thaáp hôn nhieät toái öu Thôøi gian:5-30phuùt. Quaù daøi caàn chaát dieät vsv * ÖÙNG DUÏNG CUÛA ENZYME Trong thöïc phaåm: bia, nöôùc giaûi khaùt: amylase, papain, pectinase Thöïc phaåm dinh döôõng cao: thuûy phaân protein ngöôøi khoâng theå tieâu hoùa (vd: taûo) . . . Trong y döôïc Tính ñaëc hieäu ñieàu cheá döôïc phaåm vd: chitin chitinase, esterase glucosamin khaùng sinh Chöõa beänh: ribonuclease chöõa beänh nhieãm virus (vd: vieâm naõo) Phaùt hieän beänh: aldolase: vieâm gan; creatinkinase: nhoài maùu cô tim. . . * ÖÙNG DUÏNG CUÛA ENZYME Trong phaân tích - Cô chaát saûn phaåm phaùt hieän Phuû enzyme leân ñieän cöïc phaùt hieän Ñoä nhaïy cao (106 phöông phaùp hoùa hoïc) Saûn xuaát vaø ñònh löôïng khaùng sinh Khaùng sinh baùn toång hôïp: beàn, ít ñoäc, hoaït tính maïnh, khoâng dò öùng Vsv khaùng sinh enzyme khaùng sinh baùn toång hôïp Vd: penicillin (do Penicillin chrysogenum) penicillinase, acylase penicillinic acid * * ÖÙNG DUÏNG CUÛA ENZYME Moät soá ngaønh coâng nghieäp khaùc: Thuoäc da: protease laøm meàm, taùch loâng, da Giaët taåy Myõ phaåm Giấy . . . Giaûi quyeát vaán ñeà naêng löôïng Hydrolase, naêng löôïng maët trôøi Chuyeån H2O thaønh H2 Chuyeån naêng löôïng maët trôøi thaønh naêng löôïng döï tröõ - H2 taïo naêng löôïng khoâng oâ nhieãm * * * PHAÛN ÖÙNG BAÄC 1 1 cô chaát saûn phaåm: k: haèêng soá vaän toác phaûn öùng (1/s) v: vaän toác phaûn öùng (mol/s) v = = = k [S] [S]: noàng ñoä cô chaát (mol/lít) Khi t taêng v giaûm vaø tieán veà 0, [S] giaûm k phuï thuoäc S * PHAÛN ÖÙNG BAÄC 2 2 cô chaát 1 hoaëc nhieàu saûn phaåm: k: haèêng soá vaän toác phaûn öùng (mol/s) v = = k [A][B] Neáu A>>B  [A] = [A]0 = const  v = k’[B] (Vôùi k’= k[A]0) xem nhö phaûn öùng baäc 1 (ví duï phaûn öùng thuûy phaân) v bieán ñoåi theo thôøi gian taïo ñk ñeå v khoâng ñoåi= ñk ban ñaàu ño ñöôïc vaän toác ñaàu * [S] thaáp: phaûn öùng baäc 1 [S] cao: phaûn öùng baäc 0 * Phaûn öùng taïo phöùc taïm thôøi enzyme-cô chaát E + S ES P + E k1 k -1 k2 k -2 Phaûn öùng xaûy ra theo 3 pha: Pha tieàn döøng: taïo phöùc ES, nhanh, taêng theo t, keùo daøi vaøi phaàn ngaøn giaây Pha döøng: [ES] cöïc ñaïi, P taêng , v=vaän toác ñaàu, P ít, boû qua chieàu nghòch, vaøi phuùt, vaøi chuïc phuùt Pha sau döøng: S caïn, ES giaûm, v giaûm0 * Caùc pha phaûn öùng enzyme 1 cô chaát * E + S ES P + E k1 k -1 k2 k -2 Phaûn öùng xaûy ra theo 2 giai ñoaïn: Giai ñoaïn ñaàu: E + S ES k1 k -1 Chieàu thuaân: phaûn öùng baäc 2, k1: haèng soá keát hôïp (mol/s) Chieàu nghòch: phaûn öùng baäc 1, k-1: haèng soá phaân ly (1/s) Tæ soá kal: haèng soá aùi löïc cuûa enzyme ñoái vôùi cô chaát * Giai ñoaïn 2: giai ñoaïn xuùc taùc Xaûy ra moät chuoãi caùc phaûn öùng ES  EP  E + P Phaûn öùng baäc 1 kcat: haèng soá xuùc taùc (1/s) Giai ñoaïn 2 daøi hôn 1 kcat> Km: [S] raát lôùn, v=Vmax, khoâng phuï thuoäc [S] Khi [S]=Km: v= ½ Vmax * YÙ NGHÓA CUÛA HAÈNG SOÁ Km Do kcat<< k1 neân Km= 1/kal bieåu thò aùi löïc enzyme-cô chaát Km caøng lôùn, aùi löïc enzyme-cô chaát caøng beù Cuøng enzyme,Vôùi nhöõng cô chaát khaùc nhau, Km caøng nhoû  cô chaát caøng thích hôïp = + * XAÙC ÑÒNH CAÙC THOÂNG SOÁ ÑOÄNG HOÏC Phöông trình Michaelis- Menten Phöông trình Michaelis- Menten nghòch ñaûo = Km Vmax 1 v 1 [S] + 1 Vmax DaÏng: y= ax+b * Phöông phaùp ñoà thò theo Lineweaver-Burk * Phaûn öùng enzyme nhieàu cô chaát Phaàn lôùn laø phaûn öùng enzyme 2 cô chaát Ít gaëp phaûn öùng vöôït quaù 3 cô chaát, 3 saûn phaåm Cô cheá: taïo nhieàu toå hôïp Enzyme-cô chaát Toå hôïp 2 (binary) Toå hôïp 3 (ternary) Coù 4 moâ hình phaûn öùng chính * Bi Bi coù traät töï Vaän toác phaûn öùng Xaùc ñònh caùc tham soá ñaëc tröng * - Coá ñònh [A] - Veõ ñoà thò - Coá ñònh [B] - Veõ ñoà thò * Bi-Bi baáp beânh Vaän toác phaûn öùng A, B gaén keát vôùi E moät caùch ngaãu nhieân taïo toå hôïp 3 Saûn phaåm cuõng giaûi phoùng theo traät töï baáp beânh * Bi-Bi ping-pong Vaän toác phaûn öùng Cô chaát 1 gaén vôùi E sp ñaàu tieân Cô chaát 2 gaén vaøo sp 2 F: daïng taïm thôøi cuûa E trong quaù trình phaûn öùng * Theorell-Chance Töông töï kieåu Bi-Bi coù traät töï EAB noàng ñoä raát thaáp, toàn taïi raát ngaén