Công nghệ lên men tạo enzym α - Amylase và ứng dụng

pha và không định hướng. Sản phẩm lên men là đa dạng, không ổn định; do dó, chất lượng sản phẩm kém không đồng nhất. Quá trình lên men trong sản xuất công nghiệp, tất cả các khâu về phân lập giống VSV, cơ chất, nhiệt độ, pH, độ ẩm… các quá trình phản ứng sinh học, quá trình thu nhận, tinh sạch sản phẩm đều được kiểm soát hoàn toàn ( Sản phẩm tạo ra mang tính định hướng rõ ràng ngay từ lúc đầu ở khâu chọn giống VSV cho đến cuối quá trình thu nhận sản phẩm ) . Do đó chất lượng sản phẩm được cải thiện . I.Vai trò của giống trong công nghệ enzyme Trong công nghệ enzyme từ VSV, giống đóng vai trò quyết định: Giống VSV quyết định đến năng suất enzyme của nhà máy Giống VSV quyết định đến chất lượng sản phẩm sinh học ( hay là hoạt tính enzyme) Giống VSV quyết định vốn đầu tư cho sản xuất Và cuối cùng là giống VSV quyết định đến giá thành sản phẩm Như vậy, giống VSV có ý nghĩa to lớn trong phát triển công nghệ VSV II.Yêu cầu giống VSV trong công nghiệp enzyme Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại và được sản xuất theo quy mô công nghiệp. Do đó, giống VSV ứng dụng trong công nghệ enzyme cần phải có những yêu cầu và những chuẩn mực nhất định. Đó là: Giống VSV phải cho ra sản phẩm mà ta mong muốn. Sản phẩm này phải có số lượng và chất lượng cao hơn các sản phẩm phụ khác. Vì trong quá trình trao đổi chất, để chuyển hóa một khối lượng sinh chất khổng lồ lớn gấp hàng nghìn lần cơ thể mình trong một khoảng thời gian cực kỳ ngắn thì cơ thể VSV cần tổng hợp nhiều chất. Do đó, sản phẩm tạo ra sẽ chứa nhiều loại khác. Chính vì thế, giống VSV dùng trong sản xuất một sản phẩm nào đó, thì sản phẩm này phải trội hơn các sản phẩm khác cả về số lượng và chất lượng. Giống phải cho năng suất sinh học cao. Giống VSV phải có khả năng thích nghi nhanh và phát triển mạnh trong điều kiện sản xuất công nghiệp. Giống VSV phải có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm tại địa phương nơi nhà máy đang hoạt động. Giống sử dụng trong các quá trình sản xuất hiện đại phải là những VSV thuần khiết, có tốc độ sinh sản nhanh. Tốc độ trao đổi chất mạnh để tạo nhanh sản phẩm mong muốn; dễ dàng tách sản phẩm ra khỏi các tạp chất môi trường và sinh khối VSV giống. Giống phải ổn định trong bảo quản và dể dàng bảo quản. Để tạo thuận lợi nhất về chủng giống VSV cung cấp cho quá trình lên men công nghiệp, ta cần tiến hành phân lập giống VSV thuần khiết. III. Giới thiệu về chủng nấm mốc Aspergillus oryzae  Condium of Aspergillus oryzae Asp. oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp Ascomycetes ( nang khuẩn ). Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang 5-7 µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang , chia sợi thành nhiều bao tế bào ( nấm đa bào ). Từ những sợi nằm ngang này hình thành những sợi đứng thằng gọi là cuống đính bào tử, ở đó có cơ quan sinh sản vô tính. Cuống đính bào tử của Asp.oryzae thường dài 1-2 mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Phía đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng. Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi là những tế bào hình chai. Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử đính vào nhau, nên gọi là đính bào tử. Đính bào tử của Asp.oryzae có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau… Đặc điểm của giống Asp.oryzae giàu các enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào ( amylase, protease, pectinasa,… ), ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột, gạo… đã hết nhưng không được rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lỏi ngô, ở bã sắn… Chúng mọc và phát triển có khi thành lớp mốc, có màu sắc đen ,vàng… Màu do các bào tử già có màu sắc. Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới. IV.Qúa trình phân lập giống VSV VSV phân bố rất rộng trong tự nhiên từ nơi có địa hình bình thường đến nơi có địa thế phức tạp, đâu đâu cũng có mặt VSV.Ở những nơi giàu chất hữu cơ, những nơi nghèo chất hữu cơ, trong không khí, trên bề mặt các vật, trong cơ thế người, động vật, nơi có nhiệt độ rất thấp và hiện diện cả ở nơi có nhiệt độ cao. VSV có khả năng thích nghi trong mọi hoàn cảnh môi trường. Chính nhờ khả năng tuyệt vời này mà VSV có khả năng tồn tại ngay cả trong hoàn cảnh khắc nghiệt nhất. Thông thường để phân lập một giống chủng VSV để thu nhận enzyme thì có 3 cách phân lập: + Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên + Phân lập giống trong điều kiện sản xuất + Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng Tùy thuộc vào khả năng và những điều kiện thực tế mà ta chọn cách phân lập cho phù hợp nhất. Mỗi cách phân lập trên đều cho thấy những ưu điểm riêng biệt. Sau đây là 1 số ưu điểm: IV.1.Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên -Trong điều kiện tự nhiên, VSV để có thể tồn tại và thích nghi nhanh được thì cần phải có khả năng sinh tổng hợp thật nhiều loại enzyme để chuyển hóa nhanh cơ chất có trong môi trường thành vật chất cung cấp cho tế bào. Điều này thì không thích hợp cho việc sinh tổng hợp enzyme ( ở quy mô sản xuất công nghiệp ) với một loại enzyme thật sự mạnh. -Do phát triển trong điều kiện tự nhiên, VSV phải cùng lúc đối phó với hàng loạt các yếu tố ngoại cảnh và phải phân giải rất nhiều loại cơ chất khác nên VSV bắt buộc phải tổng hợp nhiều loại enzyme với một nỗ lực rất lớn. -Ở điều kiện tự nhiên và trong điều kiện sản xuất công nghiệp thì có sự khác biệt đáng kể các giống VSV có khả năng sinh tổng hợp enzyme trong điều kiện tự nhiên, được gọi chung là các chủng VSV hoang dại. Chúng đã quá quen thuộc với sự thay đổi thất thường của điều kiện tự nhiên. Khi chúng ta đưa chúng vào điều kiện sản xuất công nghiệp với nhiều điều kiện môi trường cố định, đòi hỏi các loài VSV giống phải có một thời gian thích nghi với điều kiện sản xuất công nghiệp. Huấn luyện chúng thích nghi với điều kiện sản xuất công nghiệp là điều rất cần thiết. -Các loài VSV có khả năng sinh tổng hợp một loại enzyme nào đó thường tập trung ở vùng môi trường chứa nhiều cơ chất tương ứng. Dựa và đặc điểm này để chúng ta có thể dễ dàng xác định vị trí cần phân lập loại VSV sinh tổng hợp enzyme mà ta cần. Ví dụ: Nếu ta muốn phân lập VSV có khả năng sinh tổng hợp protease cao, ta phải tìm nơi có chứa nhiều protein trong tự nhiên, còn nếu muốn phân lập VSV có khả năng sinh tổng hợp amylase ta cần phải tìm nơi có chứ nhiều tinh bột trong tự nhiên. -Trong quá trình sinh sản và phát triển, cạnh tranh giữa các loài VSV, VSV trong điều kiện tự nhiên luôn xảy ra những thường biến và đột biến. Những đột biến thường cho ra hai hiệu ứng: Thứ nhất gây cho cá thể chết; thứ hai là nhiều đột biến tạo ra loài mới có khả năng sinh tổng hợp enzyme rất cao. Việc tìm ra những đột biến kiểu này thì hết sức có ý nghĩa và rất cần tiến hành. Và một lợi điểm nữa là, những đột biến có lợi kiểu này thường rất bền vững. Rất thích hợp để đưa vào sản xuất ở qui mô công nghiệp. IV.2. Phân lập giống trong điều kiện sản xuất -Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường đã thích nghi với điều kiện sản xuất. Nhờ đó, sau khi phân lập, các giống này không cần qua giai đoạn sản xuất thử, thí nghiệm. -Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường là những giống đã được chọn lọc hoặc đã qua quá trình biến đổi gen và có những đặc điểm sinh hoá hơn hẳn các giống vi sinh vật hoang dại. -Mật độ tế bào vi sinh vật trong điều kiện sản xuất (trong dịch lên men, dịch nước thải, chất thải của quá trình lên men) thường rất cao. Do đó, khả năng thu nhận được những chủng có bản năng sinh tổng hợp cao thường rất cao. IV.3. Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng Các ống giống có thể bị nhiễm do quá trình bảo quản. Do bị nhiễm, có thể rất nhiều tế bào VSV giống bị thoái hoá, nhưng cũng còn nhiều tế bào không bị thoái hoá. Việc phân lập lại từ nguồn giống này nhiều khi lại đạt được những kết quả tốt. V.Giới thiệu phương pháp phân lập nấm mốc Aspergillus Oryzae Trong đất có nhiều loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase. Ở nấm mốc nguồn cơ chất thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzyme amylase này là tinh bột. Chúng ta có thể phân lập từ đất, thức ăn hay có thể mua trực tiếp từ cung cấp nấm mốc giống. Ưu điểm của việc này là giống mua thì thời gian bảo quản và hiệu suất chất lượng giống được đảm bảo chắc chắn. Tuy nhiên, quá trình phân lập giống này có thể cho những kết quả đầy thú vị và có ý nghĩa trong việc bổ sung một chủng giống mới tại phòng thí nghiệm. Quá trình lấy mẫu: Có thể lấy mẫu từ đất ẩm khoảng 100g hay khoai tây cắt lát đem chôn xuống đất. Sau khoảng 8 ngày, đào hố lấy những miếng khoai tây ra, rủ sạch cát đất bám trên bề mặt miếng khoai tây. Sau đó cho vào bao nyclon và mang về phòng thí nghiệm. Tiến hành thí nghiệm phân lập: Nghiền mẫu đối với những mẫu khoai tây Lấy 10g mẫu đất hoặc mẫu khoai tây (đã làm nhuyễn) cho vào 90ml nước cất vô trùng sau đó đảo trộn mẫu. Dùng pipet hút 10ml từ dung dịch mẫu ban đầu chuyển sang 1 ông nghiệm khác có chứa 90ml nước cất vô trùng. Tiếp tục pha loãng mẫu ở nồng độ 10-3, 10-4 ở những ống nghiệm tiếp theo. Hút 0,1ml cho vào đĩa petri có chứa môi trường dinh dưỡng chọn lọc cho nấm mốc phát triển,môi trường PDA (Potato Dextro Agar). Dùng que trải, trải đều phần dinh dưỡng trên bề mặt môi trường đem ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 3 ngày. Mốc sẽ sử dụng nguồn tinh bột làm cơ chất, nên ở những chỗ này sẽ xuất hiện những quầng sáng xung quanh khuẩn lạc. Nhận biết bằng cách bổ sung Iodine vào trong môi trường trước khi cấy. Có tác dụng là chất chỉ thị cho tinh bột. Cấy truyền những mốc đặc trưng trong môi trường PDA trong ống thạch nghiêng với 1% tinh bột cho phép mốc phát triển trong 72 giờ sau đó có thể dự trữ trong máy làm đông. -Nhân giống vi sinh vật ở bình tam giác (qui mô nhỏ). Đổ 10ml H2O cất vô trùng vào ống thạch nghiêng có chứa bào tử nấm. Lắc đều cho bào tử hoà trộn vào môi trường đến khi tạo dung dịch huyền phù. Hút 0,1ml dịch huyền phù có chứa bào tử nấm cho vào bình tam giác có chứa môi trường sinh trưởng của nấm. KH2PO4 1,4 MgSO4.7H2O 0,1 NH4NO3 10 FeSO4.7H2O 0,01 PH = 6,5 KCl 0,5 hồ tinh bột 20 Phân phối khoảng 30 – 40ml môi trường vào erlen 50ml đem khử trùng bởi Autoclave ở 1210C trong 15 phút sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng. Sau đó đem ủ ở 25 – 300C trong vòng 72 giờ trên máy lắc 200 vòng/phút. Sau khi nhân giống thành công có thể sử dụng ngay hoặc đem đi bảo quản và dự trữ, để có hiệu quả cao cho nấm mốc giống ta cần có những phương pháp bảo quản thích hợp. VI. Phương pháp bảo quản giống vsv Mục đích của bảo quản giống VSV dùng trong sản xuất enzym là đảm bảo tính ổn định trong quá trình tổng hợp enzym và tính ổn định của hoạt tính enzym. Có các phương pháp để thực hiện quá trình này như sau: VI.1. Cấy truyền và bảo quản lạnh Phương pháp dựa trên nguyên tắt là VSV sẽ hạn chế quá trình trao đổi chất trong điều kiện lạnh ở một khoảng thời gian nhất định. Trong thời gian này VSV có khả năng bảo tồn được khả năng sinh tổng hợp enzym. Cách thực hiện: Ống giống VSV được cấy truyền vào 3-5 ống nghiệm có môi trường tối thiểu. Trong đó một ống dùng để kiểm tra, một ống dùng cho sản xuất hoặc nghiên cứu và một ống dùng để bảo quản.Có thể làm thêm hai ống để tránh sai sót do thao tác đối với những người mới bắt đầu làm công tác bảo quản giống. Sau khi cấy truyền, ống giống cần được bảo quản ở điều kiện nhiệt độ lạnh từ 4-70C. Sau thời gian định kỳ, sẽ phải cấy truyền trở lại, thao tác này được thực hiện liên tục. VI.2.Bảo quản giống trong đất hoặc trong cát Phương pháp dựa trên nguyên tắt: Trong môi trường tối thiểu có độ ẩm thấp, vsv có bào tử có thể bảo tồn khả năng sinh tổng hợp enzym trong thời gian dài. Phương pháp này rất phù hợp và có hiệu quả đối với nấm mốc Asp. oryzae. Trước khi sử dụng , đất, cát phải được làm sạch và sấy đến độ ẩm < 5%. Asp. oryzae được nuôi cho đến khi tạo bào tử. Người ta trộn bào tử với đất hoặc cát đã được làm sạch và sấy khô. Sau đó hỗn hợp này cho vào bao, hàn kín và bảo quản ở nhiệt độ thường. VI.3.Bảo quản giống trong hạt ngũ cốc Phương pháp dựa trên nguyên tắt bào tử nấm mốc được giữ trong hạt ngũ cốc đã xử lý nhiệt có độ ẩm < 8% và giữ được khả năng sinh tổng hợp enzym trong một thời gian dài. Người ta thực hiện bảo quản giống trong hạt ngũ cốc như sau: Giống ống nấm mốc được nuôi trong môi trường hạt ngũ cốc cho đến khi tạo nhiều bào tử. Bào tử cùng thành phần môi trường được sấy khô ở nhiệt độ < 50oC cho đến khi độ ẩm < 8%, đưa vào bao, hàn kín và bảo quản ở nhiệt độ thường. Phần III: Công nghệ lên men tạo enzym α-amylase I. Giới thiệu về phương pháp lên men bề mặt Thiết kế công nghệ: Cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20, việc nuôi cấy VSV thường được thực hiện theo phương pháp bề mặt. Phương pháp này được phát triển rất rộng rãi, không chỉ để thu nhận chế phẩm enzyme mà trước tiên đó là phương pháp thu nhận kháng sinh và một số quá trình lên men truyền thống. I.1.Ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho VSV phát triển trên bề mặt môi trường. Những ưu điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt là: Nuôi cấy bề mặt rất dễ thực hiện. Quy trình công nghệ thường không phức tạp. Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy chìm. Đây là đặc điểm ưu việt rất quan trọng trong giải thích tại sao phương pháp nuôi cấy bề mặt hiện nay phát triển mạnh trở lại. Chế phẩm enzyme thô ( bao gồm thành phần môi trường sinh khối VSV, enzyme và nước ). Sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản. Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vận hành công nghệ cũng như việc đầu tư vừa đơn giản vừa không tốn kém. Trong trường hợp bị nhiễm các VSV lạ, ta rất dễ dàng xử lý. Môi trường đặc là môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm ta chỉ cần loại bỏ khu vực đó khỏi toàn bộ khối nuôi cấy. Những khu vực khác sẽ hoàn toàn được an toàn. Phương pháp nuôi cấy bề mặt cũng có những ưu điểm cần quan tâm để khắc phục và hoàn thiện dần phương pháp này. Nhược điểm lớn nhất và dễ nhận thấy nhất đó là: Phương pháp này tốn khá lớn diện tích cho nuôi cấy. Trong phương pháp này VSV phát triển trên bề mặt môi trường ( môi trường lỏng hoặc môi trường bán rắn) nên rất cần nhiều diện tích. I.1.1.Môi trường lỏng Ở môi trườn lỏng, VSV sẽ phát triển trên bề mặt môi trường, tạo thành khuẩn lạc ngăn cách pha lỏng ( môi trường ) và pha khí ( không khí ). Ở đây, VSV sẽ sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, O2 từ không khí, tiến hành quá trình tổng hợp enzyme. Enzyme ngoại bào sẽ được tách ra từ sinh khối và hòa tan vào dung dịch môi trường. Enzyme nội bào sẽ nằm trong sinh khối VSV. Nuôi cấy bề mặt trên môi trường lỏng trong các khay: Nuôi cấy VSV thu nhận enzyme trên môi trường lỏng theo phương pháp cấy bề mặt thường được tiến hành trong các khay có chiều cao khoảng 12-15 cm, chiều rộng và chiều dài được thiết kế tùy theo kích thước phòng nuôi sao cho thuận tiện trong thao tác. Ở đây người ta quan tâm nhiều đến chiều cao môi trường lỏng. Nếu chiều cao môi trường lỏng quá lớn, VSV sẽ không có khả năng đồng hóa hết các chất dinh dưỡng ở phía đáy khay nuôi cấy. Nếu chiều cao môi trường nhỏ, sẽ thiếu thành phần chất dinh dưỡng, hiệu suất thu nhận enzyme sẽ không cao. Trong nghiều nhà máy, người ta thường tạo môi trường trong kháy nuôi cấy có chiều cao môi trường từ 5-7 cm là hợp lý. I.1.2.Môi trường đặc Phần lớn các nhà máy sản xuất enzyme, khi nuôi cấy VSV thu nhận enzyme, người ta thường sử dụng môi trường đặc . Để tăng khả năng xâm nhập của không khí vào trong lòng môi trường, người ta thường sử dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc để làm môi trường. Trong trường hợp này, VSV phát triển trên bề mặt môi trường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường và sinh tổng hợp ra enzyme nội bào và ngoại bào. Các enzyme ngoại bào sẽ thẩm thấu vào trong các hạt môi trường, còn các enzyme nội bào nằm trong sinh khối VSV. VSV không chỉ phá triển trên bề mặt môi trường, nơi ngăn cách pha rắn ( môi trường ) và pha khí ( không khí ) mà còn phát triển trên bề mặt của các hạt môi trường nằm hẳn trong lòng môi trường. Môi trường nuôi cấy vừa có độ xốp cao và vừa phải có độ ẩm thích hợp. Nếu độ ẩm quá cao sẽ làm bết môi trường lại , không khí không thể xâm nhập vào trong lòng môi trường, nếu có độ ẩm thấp quá sẽ không thuận lợi cho VSV phát triển. Thông thường người ta thường tạo độ ẩm khoảng 55-65% W là hợp lý. Nếu sử dụng cám làm nguyên liệu chính để nuôi cấu VSV thu nhận enzyme, người ta phải cho thêm 20-25% trấu để làm xốp môi trường, tạo điều kiện thuận lợi không khí dễ xâm nhập vào lòng môi trường. Phương pháp nuôi cấy bề mặt bán rắn(môi trường đặc ) này rất thích hợp cho len men ở nấm mốc Asp.oryzae. I.2.Qui trình sản xuất nấm mốc giống I.2.1Nguyên liệu cho sản xuất mốc giống Gạo nếp:Nước 14% ,Glucid 79,4%, Lipid 1,5% và protein 8,2% trong đó Protein của gạo nếp chủ yếu là glutein(oryzaine)và glubuline ngoài ra còn một ít lẫn Cozine và Prolamin. Glucid của gạo nếp chủ yếu là tinh bột, đường, cellulose và hemicellulose.Trong tinh bột chủ yếu là amylopectin.Ngoài ra còn chứa một số vitamin như B1,B2,B6,PP và E. Gạo tẻ:Nước 13,84%; Glucid 77,55%; Protein 7,35%; Lipid 0,52%; cellulose 0,18% và muối khoáng :0,54%. Bột Mì:Nước 11,6%; Glucid 72%; Lipid 4,8%,Protein 9%; cellulose 1,5% và muối khoáng 1,2%. Bắp mảnh:Nước 11,4%; Glucid 78,9%; Lipid0,8%; Protein8,5%,cellulose 0,4% và muối khoáng 0,4%. I.2.2.Chuẩn bị mốc giống Nuôi cấy giồng bao gồm: -Trong ống thạch nghiêng hay giữ giống trong ống nghiệm -Trong bình tam giác (nhân giống nhỏ) -Trên sàng, khay (nhân giống lớn) I.2.2.1.Nuôi cấy trong ống thạch nghiêng Sau khi phân lập thành công trên môi trường chọn lọc từ đĩa petri cấy chuyển những mốc sợi sang (hay lấy nấm mốc từ ống giống) ống thạch khác.Yêu cầu ống giống phải tuyệt đối đảm bảo thuần khiết, không được lẫn lộn bất kỳ một loài VSV nào khác.Môi trường thạch nghiêng phải đảm bảo đầy đủ dinh dưỡng. I.2.2.2.Nuôi cấy giống trong bình tam giác Cách làm môi trường trong bình tam giác: Môi trường gạo:gạo tẻ loại tốt, nấu cơm như nấu bình thường, hạt cơm chín đều không qúa nhão và không qúa khô.Độ ẩm khoảng 45% để nguội bớp rời thành từng hạt cho vào bình tam giác thành lớp dày khoảng 1cm. Đậy nút bình tam giác bằng giấy chống ẩm. Hấp thanh trùng ở P = 1atm trong vòng 30-45 phút. Môi trường ngô mảnh: Ngô mảnh có kích thước khoảng 0,2-0,5 mm cho nước vào theo tỷ lệ 90% trọng lượng so với ngô, trộn đều trong khay để 1-2 giờ cho ngấm nước đều. Bóp tơi cho vào bình tam giác khác thành lớp dày 1cm. Đậy nút bình bằng giấy chống ẩm. Hấp thanh trùng đồng thời làm chín ở P = 1atm, 1200C, trong thời gian 60 phút, lấy ra để nguội lắc cho khỏi vón cục. Môi trường cám: Chọn cám tốt, mới nhưng loại thô không cần mịn hạt, sau đó làm tương tự như đối với ngô mảnh. Thường sử dụng các bình tam giác dung tích 0,3-0,5 lít hay 1 lít có cổ rộng. Sau khi chuẩn bị môi ttrường trong bình thuỷ tinh ta tiến hành nuôi cấy nấm mốc. Trước tiên cần phải chuẩn bị lấy 5ml nước vô trùng cho vào các ống nghiệm. Sau đó, đổ nước vô trùng cho bào tử hoà vào trong nước đồng thời cấy chuyển chúng sang bình tam giác. Trung bình cứ một ống nghiệm có thể cấy chuyển sang 2-3 bình tam giác có dung tích 1 lít, lắc cho giống phân bố đều trong môi trường và tiến hành nuôi cấy chúng trong điều kiện thích ứng. Thường nuôi khoảng 5-6 ngày là được. Yêu cầu cơ bản trong giai đoạn này là làm sao tạo được nhiều bào tử mạnh khoẻ. Trường hợp nào thấy bình bị nhiễm thì phải loại bỏ ngay. I.2.2.3.Nuôi cấy mốc trên khay Chuẩn bị môi trường làm mốc trên khay: Nguyên liệu thường dùng là ngô mảnh có kích thước 0,2-0,5mm. Trộn với nước theo tỷ lệ 80-90% trọng lượng so với ngô nếu hấp dưới áp lực cao. Trộn xong để khoảng 3-4 giờ cho ngô ngấm nước đều rồi hấp chín. Thời gian hấp khoảng 3-4 giờ, dài hơn so với thời gian hấp cám hay gạo. Nguyên liệu sau khi hấp phải chín đều, không được quá bết hoặc quá khô. Độ ẩm còn lại 45-50% là vừa. Cách gieo cấy và nuôi mốc trên khay: Nguyên liệu dỡ ra, làm nguội nhanh. Nếu ít có thể bóp bằng tay cho tơi ra, nếu nhiều cho qua máy đánh tơi và dùng quạt thổi. Sau khi làm nguội đến 26-280C thì trộn nước giống từ bình tam giác vào với tỷ lệ 0,5-1% hoặc với tỷ lệ cao hơn. Sau khi trộn giống, ủ môi trường vào khay thành luống cao (0,3m). Đặt ở nhiệt độ 30-320C, độ ẩm 85-100%. Thời gian ủ 6-8 giờ, nhiệt độ khối môi trường lên tới 34-360C và bào tử đã nảy mầm gần hết nhưng chưa thành sợi dài. Lúc này cần rải môi trường thành lớp mỏng 2-3cm cần giữ cho nhiệt độ môi trường không vượt quá 360C. Lượng nhiệt tỏa ra nhiều nhất ở khoảng 10-14 giờ sau khi trộn giống. Sau khi nuôi 34-36 giờ, nhiệt độ khối môi trường bắt đầu giảm, cần phải điều chỉnh nhiệt độ lên 34-350C, để duy trì sự hình thành bào tử của nấm mốc. Thời gian nuôi mốc giống trên khay thường vào khoảng 60 giờ. Nếu thấy hình thành bào tử chậm thì có thể kéo dài đến 70-72 giờ. Mốc giống khi lấy ra thường có độ ẩm 32-35 % có thể dùng ngay làm giống cho công đoạn sản xuất. Nếu không dùng ngay thì phải đem sấy khô đến độ ẩm 8%, giữ dùng dần hoặc là cung cấp giống cho các nơi sản xuất. Nhiệt độ phòng sấy không được quá 400C. Các bao mốc giống cần được bảo quản nơi thoáng, mát ( có thể bảo quản lạnh 4-50C ) tránh ánh nắng. Thời gian bảo quản tùy điều kiện có thể, từ 1-2 tháng hoặc lâu hơn. I.2.3.Qui trình sản xuất Cấy chuyển Chuẩn bị môi trường thạch nghiêng Nuôi cấy 30-32oC trong 5-6 ngày Giống trong ống thạch nghiêng Trộn đều bào tử Ống mốc giống Nước vô trùng Chuẩn bị môi trường trong bình tam giác Nuôi cấy 30-32 oC trong 5-6 ngày Mốc giống trong bình tam giác Trộn giống 0,5 – 10% Ngô mảnh hấp thanh trùng Làm tơi Sấy khô Nuôi mốc 60 h Bao gói Mốc giống cho sàn xuất II. Qui trình lên men công nghiệp tạo enzym α-amylase II.1. Nguyên liệu Nguồn tinh bột: Ở nước ta nguồn nguyên liệu chứa tinh bột thì vô cùng đa dạng và phong phú.Ví dụ tinh bột từ gạo ( gạo tẻ, gạo nếp), ngô (bắp), sắn, …Nhưng để phù hợp cho sản xuất enzym amylase ở qui mô công nghiệp thì cần phải tính đến chi phí cho giá thành sản phẩm. Do vậy, nguồn nguyên liệu cần được quan tâm và chú trọng về mức độ rẻ tiền và dể kiếm. Đây là một lợi thế rất quan trọng cho nhà sản xuất và cho cả người tiêu dùng để có giá thành thấp và được sản xuất đại trà.Sau đây, giới thiệu một số nguồn nguyên liệu dễ tìm: +Thành phần dinh dưỡng của hạt gạo: Thành phần dinh dưỡngĐơn vị tínhHàm lượng/100gProteing6Tinh bộtg82Lipid (tổng số)g0,8Cellulseg0,6Nướcg10,2Năng lượngkcal361 (Viện Nghiên cứu dinh dưỡng thuộc Đại học Mahidol, Thái Lan,1999) - Protein của gạo chiếm khoảng 8-9%, chủ yếu là glutelin và glubuline. Ngoài ra còn cólẫn ít : cozine và prolamin. Lượng protein thoái hoá và biến tính dần trong quá trình bảo quản. - Glucid thì chủ yếu là tinh bột, đường, cellulose hemicellulose.Trong tinh bột chủ yếu là amylopectin, có chứa một ít chất khoáng như: P,K,Mg,…Ngoài ra còn có một số Vitamin:B1, B2, B6, PP, H, C, E và carotenoid. +Thành phần dinh dưỡng của ngô: Thành phần dinh dưỡng /100gBắp nếpBắp ngọt Protein9,112,9 Tinh bột72,869,3 Lipid(tổng số)2,23,9 Cellulose1,82,9 Nước11,29,5 Khoáng2,91,5 (Cortez và Wild-Altamirano,1972) Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy bề mặt thường là những nguyên liệu có nguồn gốc tự nhiên như cám mì, cám gạo, gạo, ngô mảnh, đậu nành và các loại hạt ngũ cốc khác.Trong các loại nguyên liệu trên, cám gạo, cám mì được sử dụng nhiều hơn cả. Hai loại này có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho VSV phát triển. Mặt khác khi tạo môi trường, chúng thường có tính chất vật lý rất thích hợp để vừa đảm bảo khối kết dính cần thiết, vừa đảm bảo lượng không khí lưu chuyển trong khối nguyên liệu. Trong nhiều trường hợp, để tạo khả năng thoáng khí tốt hơn, người ta thường cho thêm trấu với tỷ lệ thích hợp cho từng loại enzym đươc tạo ra từ VSV. Thực chất cho trấu vào là làm tăng độ xốp của môi trường, tạo nên những khoảng trống để không khí có thể lưu thông trong lòng môi trường. Chính vì thế ta thấy rằng nấm mốc Asp. oryzae không chỉ phát triển trên bề mặt môi trường mà còn phát triển rất mạnh trên bề mặt hạt môi trường. Hay nói cách khác, chủng nấm mốc Asp.oryzae có khả năng phát triển ở giữa hai pha rắn và pha khí của môi trường.Trong trường hợp này, nó có khả năng phát triển hẳn trong lòng môi trường nhưng nó vẫn hoàn toàn mang ý nghĩa của quá trình lên men bề mặt. +Thành phần dinh dưỡng của sắn(khoai mì): Sắn là loại củ chứa nhiều tinh bột, rất thích hợp là nguồn cơ chất cảm ứng cho quá trình tổng hợp enzym amylase ở nấm mốc Asp.oryzae. Củ sắn gồm ba phần chính: vỏ, thịt củ và lõi. Ngoài ra còn có cuống và rễ củ. -Vỏ gồm hai phần: Vỏ gỗ ở bên ngoài, cấu tạo chủ yếu là cellulose, thường chiếm khoảng 1,5-2% khối lượng củ, vỏ cùi cũng cấu tạo từ cellulose nhưng trong vỏ cùi còn có mủ sắn là các polyphenol, chiếm tới 85-90% polyphenol của củ sắn . -Thịt chứa nhiều tinh bột, ít protein và một lượng dầu, lượng polyphenol ở đây có khoảng 10-15%, nhưng các polyphenol gây trở ngại khi chế biến, đặt biệt là để sắn chảy mủ sẽ làm cho bột sắn biến màu, thay đổi mùi vị khó ăn trực tiếp khi luộc, khó thoát nước khi sấy hay phơi khô sắn lát hay săn bột. -Thành phần hoá học tươi của sắn: Tinh bột:20-34%; protein: 0,8-1,2%; chất béo: 0,3-0,4%; cellulose: 1-3,1%; chất tro: 0.54%; polyphenol: 0,1-0,3%; và nước: 60-74,2% . II.2. Qui trình công nghệ Nguyên liệu Xử lý nguyên liệu Hấp thanh trùng Làm nguội Trộn giống VSV Nuôi cấy Thu nhận phế phẩm enzyme thô Chế phẩm enzyme thô đem tinh chế Nghiền mịn Trích ly Lọc Kết tủa enzyme Thu nhận kết tủa Sấy kế tủa Tinh chế kết tủa Thu nhận chế phẩm enzyme tinh khiết Enzyme tinh khiết Giống VSV Nhân giống Giống cho sản xuất Chế phẩm ezyme thô đem sử dụng Bã Dùng trong chăn nuôi Cồn hoặc Sulfat amon Sử dụng chế phẩm ezyme tinh sạch Thuyết minh qui trình: Nguyên liệu: Trong phương pháp lên men bề mặt, cấu trúc chính là cám mì, cám gạo. Hai loại này là nguyên liệu hoàn hảo và có thể là một cấu tử duy nhất của môi trường để nuôi nấm không cần bổ xung thêm chất khác nữa. Tuy nhiên do là phế liệu của công nghệ xay xát, nhưng làm cũng tương đối đắt tiền. Hơn nữa trong quá trình nuôi nấm, các chất dinh dưỡng không được sử dụng hết, vì thế có thể thay thế hoặc pha trộn thêm một số cấu tử rẻ tiền hơn. Mặt khác cấu tử bổ sung vào (trấu, mạt cưa,…) để làm tăng độ xốp giúp cho hệ sợi nấm phát triển tốt hơn tận dụng tối đa nguồn cơ chất để sinh ra hoạt lực enzyme cao nhất. Đặc biệt chú ý, cám không được chứa tinh bột dưới 20-30%. Nên dùng cám tốt, cám mới không có vị chua hay đắng, không hôi mùi mốc. Độ ẩm của cám không quá 15%, tạp chất độc không quá 0,05%. Hấp thanh trùng: Cám và các chất phụ gia chứa nhiều bào tử VSV khác nên cần phải thanh trùng để đảm bảo chủng nuôi phát triển bình thường và canh trường sản xuất không chứa VSV ngoại lai, cần thanh trùng dưới áp suất hơi 1-1,5 atm trong thời gian 45-60 phút. Để thuận lợi cho việc thanh trùng có hiệu quả, cũng như tạo điều kiện cho nấm sợi phát triển, trước khi thanh trùng, người ta thường dùng HCl hay H2SO4 để điều chỉnh pH môi trường. Sau khi thanh trùng môi trường được làm nguội người ta bắt đầu nuôi cấy để thu nhận enzyme. Trộn giống vi sinh vật: Sau khi làm nguội, tiến hành cấy giống hoặc rắc bào tử vào môi trường đã thanh trùng, ủ thành đống vài giờ, giống mốc có thể nuôi cấy riêng ở phòng thí nghiệm hay tại các phân xưởng nhân giống hoặc là giống thương phẩm có bán ở nơi cung cấp giống. Các loại giống này thường chứa nhiêu bào tử. Khi cấy vào môi trường dinh dưỡng, chúng sẽ phát triển thành tế bào nấm mốcvà tạo ra các loại enzyme mà ta mong muốn.Tỷ lệ giống đưa vào nuôi cấy thường vào khoảng 0,5-20% so với khối lượng của môi trường. Kỹ thuật nuôi cấy: Sau khi đã trộn giống, môi trường được trải đều ra các khay với chiều dài 2-3cm, rồi được đưa vào phòng nuôi cấy, đặt trên những giá đỡ. Các giá đỡ này được thiết kế sao cho lượng không khí được lưu thông thường xuyên. Phòng nuôi cấy phải có hệ thống điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm không khí.Nhiệt độ thích hợp cho nấm sợi phát triển là 28-320C. Nhiệt độ thấp quá hoặc cao quá đều ảnh hưởng không tốt cho nấm sợi phát triển. Trong quá trình nuôi cấy, ta hoàn toàn không cần điều chỉnh pH. Môi trường bán rắn là môi trường tĩnh nên sự thay đổi pH ở một vùng nào đó ít khi ảnh hưởng đến toàn bộ khối môi trường. Thời gian nuôi nấm sợi thu nhận enzyme vào khoảng 36-60 giờ. Điều này còn phụ thuộc vào chủng nấm mốc Asp.oryzae và điều kiện môi trường cũng như phụ thuộc vào điệu kiện nuôi cấy. Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng phương pháp bề mặt này trải qua các giai đoạn sau: Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy. Ở giai đoạn này có những thay đổi sau: -Nhiệt độ tăng rất chậm. -Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa. -Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi. -Khối môi trường còn rời rạc. -Enzyme mới bắt đầu đươc hình thành. Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt độ. Tuyệt đối không được đưa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kỳ đầu này giống rất mẫn cảm với nhiệt độ. Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài 14-18 giờ. Trong giai đoạn này có những thay đổi cơ bản sau: Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất mạnh các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp trong các hạt môi trường trong lòng môi trường. -Trong giai đoạn này ta có thể hoàn toàn nhìn rõ các sợi nấm có màu trắng xám bằng mắt thường. -Môi trường được kết lại khá chặt -Độ ẩm môi trường giảm dần -Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-450C. -Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh do sự đồng hoá mạnh của nấm sợi. -Enzyme amylase được tổng hợp mạnh. -Lượng O2 trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng 29-300C là tốt nhất. Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài 10-20 giờ. Ở giai đoạn này có một số thay đổi cơ bản như sau: -Quá trình trao đổi chất yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại. -Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí môi trường xuống 20-25 thể tích không khí /thể tích phòng nuôi cấy/ 1giờ. Nhiệt dộ nuôi duy trì ở 300C,trong giai đoạn này, bào tử được hình thành nhiều do đó luợng enzym amylase tạo ra sẽ giảm xuống . Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết để thu nhận enzym rất cần thiết. Thu nhận sản phẩm: Kết thúc qúa trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzym amylase, chế phẩm này được gọi là chế phẩm enzym thô (vì ngoài thành phần enzym ra, chúng còn chứa sinh khối VSV, thành phần môi trường và nước trong môi trường). Để đảm bảo cho chế phẩm enzym thô α-amylase không bị mất hoạt tính nhanh người ta thường sấy khô chế phẩm enzym đến một độ ẩm thấp ( thiết bị sấy thường dùng ở đây là máy sấy chân không- có thể xem ở phần phụ lục). Độ ẩm cần đạt được sau khi qúa trình sấy kết thúc là nhỏ hơn10% độ ẩm. Để đảm bảo hoạt tính enzym không thay đổi người ta thường sấy ở nhiệt độ 38-400C. Enzym α-amylase ở nấm mốc Asp.oryzae sẽ bị bất hoạt nếu nhiệt độ lên đến 60-70 độ C. Tùy theo mục đích sử dụng ta có thể dùng chế phầm thô này ngay không cần phải qúa trình tinh sạch. Trong những trường hợp cần thiết khác, ta phải tiến hành làm sạch enzym. Để sản xuất enzym tinh khiết người ta phả tiến hành như sau: -Toàn bộ khối lượng enzym thô amylase được đem đi nghiền nhỏ.Mục đích của qúa trình nghiền là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ các thành phần của chế phẩm thô.Khi thành tế bào được phá vỡ ,các enzym nội bào chưa thoát ra khỏi tế bào sẽ dễ dàng thoát khỏi tế bào.Phần lớn enzym amylase ngoại bào khi được tổng hợp và thoát khỏi tế bào ngay lập tức thấm vào thành phần môi trường.Khi ta nghiền nhỏ, enzym thoát ra khỏi các thành phần này dễ dàng hơn. -Trong khi nghiền người ta thường sử dụng những chất trợ nghiền trong trường hợp này đượcdùng là cát thạch anh và bột thủy tinh. Các chất này là những chất vô cơ không tham gia vào phản ứng và khả năng tăng mức độ ma sát trước khi sử dụng cát thạch anh và bột thủy tinh phải được rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ lớn hơn 100oC để loại bỏ nước và tiêu diệt VSV. Trích ly:Sau khi nghiền mịn, người ta cho nước vào để trích ly enzym α-amylase. Các loại enzyme thủy phân có khả năng tan trong nước nên người ta thường dùng nước như một dung môi hòa tan. Cứ một phần chế phẩm enzym thô, người ta cho 4-5 phần nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch, phần bã thu riêng dùng làm thực phẩm gia súc ( chú ý cần loại bỏ cát thạch anh và bột thủy tinh ra khỏi hỗn hợp bã rồi mới cho gia súc ăn). Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzym thô vì trong đó có chứa nước, các chất hòa tan khác từ khối môi trường nuôi cấy. Việc tiếp theo là làm sao tách enzym ra khỏi vật chất này. Qúa trình kết tủa enzym α-amylase: Để làm việc trên người ta tiến hành kết tủa enzym nhờ những tác nhân gây tủa.Trong công nghệ tinh chế enzym, người ta thường dùng cồn và sunfat amon. Hai tác nhân kết tủa này dễ tìm kiếm và giá rẻ so với những tác nhân gây tủa khác. Trong khi tiến hành kết tủa, người ta phải làm lạnh cả dung dịch enzym thô và cả những tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính enzym. Khi đổ chất làm kết tủa enzym vào dung dịch enzym thô phải hết sức từ từ để tránh hiện tượng biến tính. Trong qúa trình kết tủa người ta dùng cồn hoặc sulfat amon với liều lượng như sau: Cứ một phần dung dịch enzym thô người ta cho 2 đến 2,5 lần cồn hoặc sulfat amon. Khi cho chất kết tủa vào dung dich enzym thô, người ta tiến hành khuấy nhẹ, sau đó để yên trong điều kiện nhiệt độ lạnh (thường từ 4-7OC) theo thời gian, các enzym sẽ được tạo kết tủa và lắng xuống đáy, người ta tiến hành gạn và lọc thu nhận kết tủa ở dạng paste (độ ẩm lớn hơn 70%W). Ở trạng thái này enzym rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước để dễ bảo quản người ta sấy kết tủa enzyn α-amylase ở 40OC cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5-8% W ( thiết bị sấy thường dùng là máy sấy phun sương – có thể xem ở phần phụ lục). Trong nhiều trường hợp chế phẩm enzym α-amylase ở dạng kết tủa vẫn hoàn toàn chưa sạch về mặt hóa học vì trong đố còn chứa 1 số enzym ngoài enzym amylase ta quan tâm, chẳng hạn enzym α- amylase này còn chứa hoạt tính protase có tính acid và cellulose do đó muốn thu nhận được enzym có độ tinh khiết cao hơn ta phải tinh chế enzym α-amylase kết tủa bằng các qúa trình lọc Gel hay sử dụng phương pháp cố định enzym ,… II.3. Thu nhận enzym α-amylase từ nấm mốc Aspergillus Oryzae II.3.1. Sinh trưởng và sinh tổng hợp amylase từ nấm Khi nuôi VSV tạo amylase có 2 quá trình liên quan mật thiết với nhau. Quá trình tổng hợp sinh khối VSV và quá trình tích tụ enzyme trong tế bào hoặc ngoài môi trường. Ở một số VSV, quá trình sinh tổng hợp amylase tiến hành song song với quá trình sinh trưởng, nghĩa là sự tích tụ enzyme phụ thuộc tuyến tính vào sự tăng khối. Trong trường hợp này, sinh tổng hợp enzyme amylase kết thúc ở pha logarit cùng đồng thời với sự ngưng sinh trưởng và sự bắt đầu pha phát triển ổn định tiếp theo sau. Tuy nhiên theo ý kiến của nhiều tác giả, sự tạo thành amylase cực đại thường xảy ra sau khi quần thể tế bào VSV đạt điểm sinh trưởng. Trong trường hợp này, sinh trưởng của VSV hầu như không kèm theo sự tích lũy enzyme amylase trong canh trường, chỉ sau khi kết thúc pha sinh trưởng mới xảy ra sự tổng hợp enzyme cực lớn. II.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng enzym II.3.2.1.Ảnh hưởng các nguồn Nitơ dinh dưỡng Nguồn dinh dưỡng Nitơ hết sức quan trọng. Khi chuẩn bị môi trường dinh dưỡng để nuôi nấm mốc Asp.oryzae để tạo enzym α-amylase, người ta dùng muối vô cơ Natri Nitrat là nguồn Nitơ dinh dưỡng để nuôi nhiều loại nấm sợi tạo α-amylase. Hàm lượng thường sử dụng là 0,91%. Nari Nitrat và Amoni Nitrat có hiệu qủa hơn so với các loại muối khác ( Kali Nitrat, Magie Nitrat, Amoni Sunfat….). Cho nguồn Nitơ nhất định vào môi trường có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác .Ví dụ:Kết qủa thí nghiệm Fenikvova và cộng tác viên về việc sử dụng các nguồn Nitơ từ những muối khác nhau. Nguồn NitơLiệu lượng muối, % theo NHoạt động enzyme sau 6 ngày nuôi đối với 100mlα-amylaseGlucomylaseNaNO30,301458000NaNO30,15263300(NH4)2SO20,15--NH4NO30,15984100NH4NO30,30454900NH4H2PO40,305,58000 (bảng : Ảnh hưởng của nguồn nitơ tới sinh tổng hợp các enzyme amylase). ( Sách Công nghệ enzym của Nguyễn Đức Lượng chủ biên, 2004) Ngoài ra cũng cần phải xác định tỷ lệ giữa nguồn carbon và Nitơ trong môi trường phù hợp cho mốc Asp.oryzae phát triển. Tính cân bằng của môi trường dinh dưỡng về carbon và Nitơ có ý nghĩa lớn đối với sự sinh tổng hợp sinh khối của nấm Asp.oryzae và sự tạo thành amylase. II.3.2.2.Ảnh hưởng của Amino acid Amino acid là những cấu tử hợp thành phân tử enzym, trong đó có một số các amino acid không đồng nhất về giá trị dinh dưỡng nên sử dụng hỗn hợp amino acid sẽ có giá trị lớn hơn cho những chất lượng mới. Amino acid có ảnh hưởng tốt tới sinh lý của nấm mốc cũng như việc sinh tổng hợp enzym amylase do những nguyên nhân sau: -Amino acid có thể đồng thời vừa là nguồn carbon , nguồn Nitơ vừa là nguồn năng lượng. -Một số amino acid riêng lẻ (Glutamic acid ,Aspatic acid….) đóng vai trò vô cùng quan trọng trong trao đổi amino acid cụ thể là sinh tổng hợp nhiều amino acid khác trong qúa trình chuyển amine hóa. Nhờ một số amino acid trước hết là glutamic acid, aspatic acid mà thực hiện đồng hóa dị dưỡng CO2 (Araiet al,1968). -Nhiều amino acid tham gia vào thành phần của các vitamin tan trong nước như: Pantotenic acid, biotin, folic acid, …các vitamin này có ý nghĩa sinh học rất lớn. Ngoài ra còn có những nhận xét cho rằng sự tổng hợp ARN trong tế bào một số VSV phụ thuộc vào sự có mặt của amino acid trong môi trường nuôi ( Kurland, Marloe, 1962 ). -Amino acid có tính đặc hiệu của sự cảm ứng và kiềm chế sinh tổng hợp enzyme. Một số amino acid kích thích và làm tăng cường sinh tổng hợp các enzyme amylase, một số lại có tác dụng ức chế ngược lại và một số khác thì không có ảnh hưởng gì cả. II.3.2.3.Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng Các yếu tố đa lượng và vi lượng có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và tổng hợp các enzym, α-amylsae ở nấm mốc Asp.oryzae. -Mg2+ có ảnh hưởng tới độ bên nhiệt của enzym. Thiếu MgSO4 sẽ có ảnh hưởng xấu đến sự tổng hợp mọi amylase bởi nấm sợi. Khi đó sự tổng hợp α-amylase bị ức chế hoàn toàn (Fenikxova, Muxaeva, 1967). Nồng độ tối ưu của muối này cho tổng hợp α-amylase là 0,05%. -Phospho cần để tổng hợp các hợp phần quan trọng của sinh chất (nucleic phospholipide acid) và nhiều coenzym, đồng thời để phosphoril hóa glucide trong quá trình oxy hóa sinh học. Phospho ảnh hưởng trực tiếp tới sinh sản của nấm sợi, do vậy mà tăng cường tổng hợp enzym. Các muối phosphate thường được dùng với nồng độ cao tới 0.15M. Hoạt độ của α-amylase tăng cao khi có 0,1% KH2PO4. -Canxi(Ca) cần cho tổng hợp và ổn định α-amylase hoạt động vì nó là cấu tử không thể thiếu được của enzym này. Canxi còn có tác dụng bảo vệ amylase khỏi tác động của protease ( Hsiu et amiloza, 1964). Muốn tích lũy nhiều α-amylase cấn có lượng Ca trong môi trường là 0,01-0,05%. -Lưu huỳnh(S) kích thích sự tạo amylase ( S có trong thành phần của các amino acid quan trọng : methionine, cystein, cystine). Lưu huỳnh với hàm lượng 0.04g/ml môi trường là thích hợp nhất cho Asp.oryzae tạo amylase. Ngoài những nguyên tố đa lượng này cần chú ý thêm với những nguyên tố vi lượng. Chẳnng hạn như: Coban, kẽm,…và các nguyên tố gây ức chế sự tổng hợp enzym amylase như: đồng, thủy ngân, … II.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men Độ ẩm(w) môi trường: Tốt nhất cho sự hình thành enzym của nấm mốc Asp.oryzae là 55-60%. Độ ẩm môi trường thích hợp cho sự hình thành bào tử là khoảng 45% nên cần giữ cho độ ẩm môi trường không bị giảm trong quá trình phát triển. Ảnh hưởng của việc giữ ẩm trong quá trình sinh trưởng tới sự tạo α-amylase của Asp. oryzae nuôi bằng phương pháp bề mặt: Phương án thí nghiệm20 giờ34 giờ42 giờĐộ ẩm %Hoạt độ amylase đối với canh I trường khôĐộ ẩm %Hoạt độ amylase đ/v g canh trường khôĐộ ẩm %Hoạt độ amylase đối với canh I trường khôKhay để hở27,815,023,818,022,020,5Khay đậy nắp46,420,442,432,942,436,7 BẢNG: Ảnh hưởng của việc giữ ẩm trong quá trình sinh trưởng tới sự tạo α-amylase của Asp.oryzae nuôi bằng phương pháp bề mặt Điều này thật sự cần thiết phải giữ ẩm cho môi trường ở mức độ tối thích. Cần thông khí liên tục trong suốt thời kỳ sinh trưởng của nấm mốc và còn phụ thuộc vào kích thước, chiều dày của lớp môi trường nuôi. -Độ ẩm tương đối của không khí: Độ ẩm cho phép từ 80% trở lên đến mức bão hoà tức là 100% W đều thích hợp cho nấm mốc phát triển. Trong phòng nuôi cần giữ cho độ ẩm không khí bão hoà để tránh cho môi trường khỏi bị khô. -Ảnh hưởng của không khí: Asp.oryzae là VSV hoàn toàn hiếu khí, chỉ phát triển bình thường khi đầy đủ oxy. Để đáp ứng điều kiện nuôi này, môi trường phải xốp, rải thành lớp dày không quá 2,5-3cm, phòng nuôi phải thoáng. Theo thực nghiệm, để thoả mãn cho sự hô hấp của nấm mốc Asp.oryzae trong toàn bộ chu kỳ phát triển cứ cách 1giờ, môi trường cần khoảng 1,7m3 không khí. Asp. oryzae phát triển bình thường khi nồng độ CO2 trong không khí đạt 8%. -Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ nuôi cũng là một yếu tố hết sức quan trọng đối với sự sinh trưởng của chủng nấm mốc này và sự tạo thành các enzym amylase. Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển và hình thành enzym là 28-320C. Nhiệt độ do nấm mốc tỏa ra môi trường có thể bị nóng lên 400C hoặc hơn. Do vậy cần giữ cho nhiệt độ môi trường không xuống dưới 270C và không cao hơn 360C. Toàn bộ chu kỳ sinh trưởng của nấm mốc cám có thể chia làm hai thời kỳ: +Thời kỳ trương và nảy mầm của đính bào tử trong 11 giờ đầu. Trong thời kỳ này cần phải cung cấp nhiệt cho phòng nuôi không hơn 23-300C . Độ ẩm tương đối của không khí là 96-100%. +Thời kỳ sinh trưởng nhanh của hệ sợi (có thể đạt từ 4-18 giờ). -Thời gian nuôi nấm mốc: Hầu hết các chủng nấm mốc Asp. oryzae có hoạt động cực đại của amylase ở khoảng giờ thứ 30-38, rồi sau đó là cực đại của protease ở giờ thứ 36-42. Một số chủng cho hai cực đại của enzym, ví dụ: cực đại của enzym amylase ở giờ thứ 36 và giờ thứ 60. Do đó, thời gian nuôi mốc có thể kéo dài từ 60-72 giờ. Thời gian nuôi để có lượng amylase cực lớn thường được xác định bằng thực nghiệm. Sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì thường làm giảm hoạt lực của enzym. Đối với Asp. Oryzae, sự tạo hoạt lực tối đa thường kết thúc khi nấm mốc bắt đầu sinh bào tử. -Ảnh hưởng của pH: pH thích hợp cho Asp.oryzae là môi trường acid yếu khoảng 5,5-6.5. Các môi trường tự nhiên từ cám, nhô thường có sẵn pH ở khoảng này nên không cần điều chỉnh. Đôi khi khả năng sinh bào tử của nấm mốc bị yếu hoặc mất hẳn. Để khôi phục khả năng này có thể nuôi nấm mốc trong ánh sáng khuếch tán trong một vài thế hệ. Phần IV: Ứng dụng và kết luận I.Ứng dụng Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đa và đang phát triễn mạnh mẽ trên qui mô công nghiệp. Thực tế đa có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán trên thị trường thế giới, các chế phẩm này đa được khai thác và tinh chế có mức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng. Chế phẩm enzyme không chỉ được ứng dụng trong y học mà còn được ứng dụng trong nhiều lãnh vực công nghiệp khác nhau, trong nông nghiệp, trong hóa học… "ý nghĩa của việc sử dụng enzyme trong các lãnh vực thực tế không kém so với ý nghĩa của việc sử dụng năng lượng nguyên tử". Theo thời gian, enzym công nghiệp ngày càng được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau, trong đó những enzym ứng dụng nhiều nhất là protease, cellulose, ligase, amylase,… và một số enzym đặc biêt khác đã thu được rất nhiều lợi nhuận từ ngành này. Dưới đây là một vài ứng dụng thực tế: I.1.Ứng dụng amylase trong sản xuất bia Trong công nghệ sản xuất bia truyền thống, các nước phương Tây chủ yếu sử dụng enzym amylase của malt để thủy phân tinh bột trong malt, sau đó đến giai đoạn rượu hóa bởi nấm men Saccharomyces sp. Cơ sở khoa học của việc sử dụng amylase của malt ở chỗ, khi đại mạch chuyển từ trạng thái hạt sang trạng thái nảy mầm (malt), enzym amylase sẽ được tổng hợp và khi đó enzym này sẽ thủy phân tinh bột có trong hạt tạo ra năng lượng và vật chất cho sự tạo thành mầm. Như vậy việc đường hóa tinh bột trong hạt nhờ enzym của chính nó. Khi đó hạt chỉ tổng hợp ra lượng enzym amylase vừa đủ để phân hủy lượng tinh bột có trong hạt. Như thế cần rất nhiều mầm đại mạch để sản xuất bia ở qui mô lớn, dẫn đến chi phí cao cho sản xuất và sản phẩm. Để khắc phục điều này, trong quá trình lên men tạo bia thì nhà sản xuất không sử dụng hoàn tòan 100% nguyên liệu là malt đại mạch mà có sự pha trộn theo một công thức nào đó để thay thế malt và còn bổ sung nguồn tinh bột cho quá trịnh lên men. Lý do là một phần để tạo hương vị cho bia, màu sắc, độ cồn phù hợp cho người tiêu dùng và một phần là làm giảm giá thành cho sản phẩm bia nhưng vẫn giữ được đặc trưng cho bia. Chính vì điều này, các nhà sản xuất bia quan tâm đến việc sử dụng chế phẩm enzym amylase cung cấp cho quá trình thủy phân tinh bột .Enzym này có ý nghĩa rất lớn trong việc làm bia, giúp sản xuất bia ở qui mô công nghiệp. Ngoài ra, trong sản xuất bia, người ta còn sử dụng chế phẩm enzym cellulose có tác dụng phá vỡ thành tế bào, tạo điều kiện để các thành phần có trong tế bào hạt thóat ra phía ngoài nhờ đó chất lượng bia được nâng cao hơn. Một loại enzym khác cũng được sử dụng khá rộng rãi đó là gluco amylase, enzym này được sử dụng để loại trừ O2 có trong bia, giúp quá trình bảo quản bia kéo dài hơn rất nhiều. I.2. Ứng dụng amylase trong sản xuất cồn Để sản xuất cồn từ nguồn nguyên liệu tinh bột, mỗi nước sử dụng các loại nguyên liệu khác nhau.Ví dụ, ở Mỹ người ta sử dụng nguyên liệu từ bột ngô để sản xuất cồn, còn ở Brazin lại sử dụng khoai mì, các nước khác sử dụng gạo hoặc tấm từ gạo. Qúa trình sản xuất cồn trải qua hai giai đọan: giai đọan đường hóa và giai đọan rượu hóa. Giai đọan đường hóa, người ta bắt buộc phải sử dụng enzym amylase ( không thể sử dụng phương pháp thủy phân tinh bột bằng acid ). Người Nhật đã biết sử dụng enzym của nấm mốc trong quá trình đường hóa để sản xuất rượu Sake từ cách đây hơn 1700 năm. Người Trung Quốc thì đã sử dụng nhiều loại nấm mốc để đường hóa rượu trong sản xuất rượu cách đây 4000 năm. Còn người Việt Nam đã biết sản xuất rượu từ gạo cách đây hàng ngàn năm. Riêng ở Mỹ, mãi đến thế kỷ XIX khi Takamine người Nhật đưa nấm mốc Aspergillus sang mới biết sử dụng enzym này thay amylase của malt để sản xuất cồn. Chính vì thế mới có phương pháp Micomalt ( mầm mốc) trong sản xuất cồn và rượu. Nhờ sự du nhập kỹ thuật này từ Nhật mà người Mỹ tiết kiệm được một khối lượng malt khổng lồ trong sản xuất rượu. Giai đọan rượu hóa, nhờ nấm men Saccharomyces cerevisiae, cũng có thể xem đây là một quá trình áp dụng enzym. Qúa trình rượu hóa là quá trình hết sức phức tạp, trải qua rất nhiều giai đoạn chuyển hóa từ đường thành cồn nhờ sự tham gia của nhiều enzym khác nhau. Điểm khác với enzym amylase là ở chổ các enzym tham gia quá trình rượu hóa nằm trong tế bào nấm men. Việc điều khiển các quá trình chuyển hóa bởi enzym trong tế bào thực chất là quá trình trao đổi chất của nấm men trong môi trường chứa đường. I.3.Ứng dụng amylase trong chế biến th ực phẩm gia súc Trong chế biến thức ăn gia súc, thành phần ngũ cốc chiếm một khối lượng rất lớn. Trong khối lượng này, thành phần tinh bột rất cao. Để tăng hiệu suất sử dụng năng lượng từ nguồn tinh bột, ng ười ta thường cho thêm enzym amylase vào. Enzym amylase sẽ tham gia phân giải tinh bột tạo thành đường, giúp cho quá trình chuyển hóa tinh bột tốt hơn. I.4.Ứng dụng enzym amylase trong công nghiệp dệt Trong công nghiệp dệt, người ta thường sử dụng enzym amylase của vi khuẩn để tẩy tinh bột và làm cho vải mềm.Trong vải thô thường chứa khỏang 5% tinh bột và các tạp chất khác. Do đó, khi sử dụng chế phẩm enzym amylase của vi khuẩn vải sẽ tốt hơn. Người ta thường sử dụng l ượng chế phẩm amylase khỏang 0,3-0,6 g/l dung dịch và thời gian xử lý 5-15 phút ở nhiệt độ 90oC. Tuy nhiên ngoài chế phẩm enzym amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn, hiện nay người ta đã quan tâm đến việc sử dụng amylase từ nấm sợi.Cho đến nay có rất nhiều nước đã sử dụng enzym trong công nghiệp dệt để tăng khả năng cạnh tranh các hàng vải, sợi. Các nước sử dụng lượng enzym amylase nhiều nhất trong lĩnh vực này là Mỹ, Nhật, Pháp, Đan Mạch. Ngoài ra, enzyme amylase cũng được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trong sản xuất đường bột, sản xuất dextrin, maltodextrin, nha glucose, siro, glucose – fructose, sản xuất tương và nước chấm …ở quy mô công nghiệp. II.Kết luận Tóm lại, có thể nói rằng, việc nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm enzyme ngày càng được chú trọng ở các lĩnh vực khác nhau. Trong 20 năm cuối thế kỷ XX và các năm đầu của thế kỷ XXI các enzyme khác nhau đã được ứng dụng. Ở Việt Nam bước đầu đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng các enzyme trong chế biến nông sản, thực phẩm, nhất là trong lĩnh vực sản xuất bia, rượu, chế biến tinh bột (Viện công nghiệp thực phẩm, Viện công nghệ sinh học – công nghệ thực phẩm, Đại học Bách khoa Hà Nội…). Việc nghiên cứu các enzyme phục vụ nông nghiệp, công nghiệp cũng được quan tâm và có các kết quả đáng khích lệ. Ví dụ, chế phẩm enzyme mới ra đời phục vụ nông nghiệp E2001 có tác dụng tăng độ phì nhiêu đất, tăng năng suất cây trồng. Đã có các nghiên cứu ứng dụng protease trong sản xuất rượu bia, rút ngắn thời kỳ lên men cũng như sản xuất nước mắm ngắn ngày bằng công nghệ enzyme protease. Phần V: Phụ lục và tài liệu tham khảo Phụ lục Máy sấy phun sương Máy sấy chân không Máy nghiền siêu mịn khí nén Máy sấy Đông khô Tài liệu tham khảo Nguyễn Đức Lượng và một số tác giả, Công nghệ enzym, NXB Đại học quốc gia Tp.HCM, 2004 Nguyễn Đức Lượng, Vi sinh vật công nghiệp ( Công nghệ vi sinh Tập 2), NXB Đại học quốc gia Tp.HCM, 2006 Lương Đức Phẩm, Nấm men công nghiệp, NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội, 2006 Nguyễn Thị Hiền ( chủ biên), Công nghệ sản xuất mì chính và các sản phẩm lên men cổ truyền, NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội, 2006 Nguyễn Tiến Thắng, Gíao trình công nghệ enzym, Trường Đại học Kỹ thuật công nghệ Tp.HCM, 2008 www.bio-link.org/sharing_day/fungalamylase.pdf