Công nghệ Protease

biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. Hình 1: Mô hình phân tử enzyme protease (papain) Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (gan, dạ dày bê...). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có thể sử dụng các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các liên kết peptitd định trước. Yếu tố tăng cường quá trình tổng hợp bao gồm pH, các nhóm carboxyl hoặc nhóm amin được lựa chọn để bảo vệ, khả năng kết tủa sản phẩm,… Trong cơ thể protein thực phẩm được phân giải ở bộ máy tiêu hóa bởi các enzyme phân giải protein, đầu tiên là pepsin trong dịch dạ dày và sau đó là các protease được tiết ra ở tuyến tụy và từ các tế bào ở màng nhày thành ruột. Các acid amin tự do và các peptid ngắn được hấp thụ và đi qua các tế bào hình lông ở thành ruột. Phần lớn các peptid được hấp thụ bị thủy phân ở các tế bào thành ruột. Các acid amin được hấp thụ sẽ đi vào gan và sau đó tham gia vào quá trình chuyển hóa. Quá trình thủy phân protein đóng vai trò quan trọng trong sản xuất nhiều loại thực phẩm. Quá trình này có thể được thực hiện nhờ chính protease của thực phẩm đó hay do các protease vi sinh vật được đưa vào trong quá trình chế biến thực phẩm. Trong nhiều trường hợp các tính chất protein thực phẩm được cải thiện nhờ thủy phân hạn chế hoặc sâu sắc nhờ các enzyme protease. Sự thủy phân hạn chế có tác dụng tăng khả năng nhũ hóa và tạo bọt của protein (do tăng tính hòa tan và khả năng khuếch tán đến bề mặt phân chia). Hình 2: Cấu trúc không gian enzym protease (renin) Phân loại protease Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) trong hệ thống phân loại các nhóm enzyme; Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase; Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptit, exopeptidase được phân chia thành hai loại: Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptit ở đầu N tự do của chuỗi polypeptit để giải phóng ra một amino acid, một dipeptid hoặc một tripeptit; Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptid ở đầu C của chuỗi polypeptid và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptid. Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm: Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như Subtilisin Carlsberg, Subtilisin BPN. Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng. Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng. Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng. Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, rennin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính. Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA. Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm: Protease acid: pH = 2 – 4; Protease trung tính: pH = 7 – 8; Protease kiềm: pH = 9 – 11. Nguồn thu protease vi sinh vật Trong công nghiệp protease có thể thu từ nhiều nguồn chủ yếu từ vi sinh vật như: vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn. Vi khuẩn: Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng. Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptid trong phân tử protein. Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium. Trong đó, B. subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất. Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu. Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5 – 8) và có khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng. Các protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm. Chúng được sinh ra nhiều bởi B. subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium. Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử từ 20.000-30.000. Ổn định trong khoảng pH 6 – 12 và hoạt động trong khoảng pH rộng 7 – 12. Nấm mốc: Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A. terricola, A. fumigatus, A. saitoi, Penicillium chysogenum… Các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5 – 3. Một số nấm mốc khác như: A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti… cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất fomat. Xạ khuẩn: Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S. fradiae, S. trerimosus... Hình 3: Bào tử xạ khuẩn Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được tách chiết từ S. grieus, enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân tới 90% liên kết peptit của nhiều protein thành amino acid. Ở Liên Xô (cũ), người ta cũng tách được chế phẩm tương tự từ S. grieus có tên là protelin. Từ S. fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân karetin. Ở Mỹ, chế phẩm được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da. Protease từ S. fradiae cũng có hoạt tính elastase cao, do đó chúng được dùng trong công nghiệp chế biến thịt. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng. 1.4. Thu nhận protease từ vi sinh vật Sự thu nhận protease từ vi sinh vật trải qua các giai đoạn chính có thể tóm tắt thành sơ đồ như sau: Sơ đồ 1: Các giai đoạn trong quá trình thu nhận protease Tuyển chọn chủng: Yêu cầu tuyển chọn chủng tổng hợp được enzyme cần thiết, với lượng đáng kể và hoạt tính cao. Đối với việc thu protease thì thu từ nguồn như nấm mốc, vi khuẩn, xạ khuẩn. Môi trường tuyển chọn phân lập thường từ đất, nước, lương thực, thực phẩm…Tuy nhiên các chủng phân lập theo phương pháp thông thường chỉ tổng hợp được một lượng nhỏ enzyme (enzyme bản thể), người ta cần tiến hành gây đột biến bằng phương pháp sinh học, lý, hóa học… để tạo chủng có khả năng “siêu tổng hợp enzyme”. Vi sinh vật sau khi được tuyển chọn cần được nhân giống và nuôi trong điều kiện tối ưu để chúng sinh sản và phát triển tốt, tổng hợp nhiều enzyme. Môi trường và phương pháp nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp Protease: Cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Trong thành phần môi trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme. Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện tượng cảm ứng. Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì chất đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng phong toả của chất kìm hãm nhằm bảo đảm khả năng sinh tổng hợp enzyme đã cho không bị cản trở. Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường là cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp. Thành phần chính của môi trường: C, N, H, O. Ngoài ra các chất vô cơ: Mn, Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác. Về phương pháp nuôi cấy hiên nay người ta thường dùng hai phương pháp sau: Nuôi bề mặt (môi trường nuôi dạng rắn) hay trên bề mặt dạng lỏng; Nuôi bề sâu (nuôi chìm) – môi trường nuôi dạng lỏng. Phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme: Tách chiết enzyme theo các công đoạn như sau: Phá vỡ màng tế bào để giải phóng enzyme: có thể dùng các phương pháp vật lý, hóa học, cơ học…; Dùng dung môi chiết enzyme: thường dùng nước, NaCl, dung dịch đệm có pH ổn định và phù hợp với enzyme; Lọc, ly tâm; Kết tủa enzyme: có thể dùng dung môi hữu cơ (ethanol, acetol), dùng muối, điểm đẳng điện pH = pI; Ly tâm, tách tủa; Sấy kết tủa cho đến khô. Qua các bước như trên ta thu được enzyme chưa tinh khiết, cần qua giai đoạn tinh sạch enzyme để được enzyme tinh khiết. Có nhiều phương pháp tinh sạch như sau: Phương pháp thẩm tích Dialise: là phương pháp sử dụng màng lọc bán thấm chỉ cho những chất có khối lượng phân tử nhỏ đi qua; Phương pháp kết tủa phân loại: thay đổi nồng độ chất kết tủa; Phương pháp điện di; Phương pháp lọc gel (gel Sephadex); Phương pháp sắc ký. ỨNG DỤNG CỦA PROTEASE TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Ứng dụng trong công nghiệp chế biến sữa và các sản phẩm từ sữa Ứng dụng trong công nghiệp chế biến sữa [4]: Sữa là loại thực phẩm chứa các chất dinh dưỡng đầy đủ và cân đối nhất. Các sản phẩm từ sữa là rất đa dạng và phổ biến. Từ nguyên liệu sữa, người ta đã cho ra vô vàn các sản phẩm có cấu trúc, trạng thái và hương vị khác nhau. Sữa chứa hầu hết các men có trong tự nhiên. Các men này vào sữa theo tuyến sữa và từ các vi sinh vật trong không khí hay dụng cụ chứa sữa như lipase, protease. Protease tham gia vào quá trình thủy phân protein tạo thành các sản phẩm như pepton, acid amin,.... Một số peptone được hình thành có thể gây vị đắng trong sữa. Protease được hình thành tự nhiên trong sữa và chúng không bị phân hủy hoàn toàn khi thanh trùng ở nhiệt độ 76 ÷ 78oC. Khi điều kiện vệ sinh không tốt, một số men tạo ra từ các nguồn vi sinh vật xâm nhập vào gây tác hại đến sữa. Chúng có thể làm giảm nghiêm trọng chất lượng của sữa ban đầu. Sự có mặt một số men trong sữa được dùng làm chỉ tiêu trong kiểm tra chất lượng sữa. Các sản phẩm từ sữa có thể ở dạng rắn như các fomat với kết cấu hình thù và tính cảm vị đặc trưng, dạng hạt đơn điệu như trong các sữa bột, dạng đặc mịn màng như trong các sữa chua, dạng lỏng như trong các sữa cô đặc với đường. Trong đó, mảng sản phẩm lên men truyền thống từ sữa vô cùng phong phú và chiếm một vị trí quan trọng trong ngành công nghiệp chế biến các sản phẩm sữa. Có thể kể ra đây là bơ, fomat, kefir, yoghurt,…do đó các enzyme sử dụng trong công nghiệp sữa ngày càng được nghiên cứu và ứng dụng, có thể kể đến như rennin (chymosin), pepsin có thể làm đông tụ sữa được dùng trong sản xuất fomat, sữa đông tụ… Ứng dụng trong việc sản xuất fomat: Hình 4: Sản xuất Fomat Fomat là sản phẩm chế biến từ sữa có sử dụng quá trình lên men lactic. Đây là môt thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, bảo quản được lâu, rất phổ biến và thích hợp khẩu vị người châu Âu, châu Mỹ. Protease ngoài khả năng thuỷ phân protein đều có khả năng đông tụ sữa tuỳ mức độ khác nhau, mạnh nhất là rennin, sau đó là pepsin và các protease khác. Quá trình đông tụ sữa được ứng dụng trong sản xuất fomat. Protease được thu nhận từ một số vi sinh vật như Asp. candidus, P. roquerti, Bac. mesentericus,… Bảng 1: Một số enzyme đông tụ sữa trong sản xuất FomatNhómNguồn gốcTên enzymeĐộng vậtDạ dày bêChymosin A, pepsin và gastriscinDạ dày cừuChymosin và pepsinDạ dày dêChymosin và pepsinDạ dày heoPepsin A, B và gastricinThực vậtCynara cardunculusCyprosin 1, 2, 3 hoặc cardosin A, BVi sinh vậtRhizomucor mieheiAspartic proteaseR. pusillusCryphonectria parasiticaVi sinh vật chuyển gen Chymosin từ bêAspergillus nigerChymosine BKluyveromyces lactisRennin: Khái niệm chung: Năm 1951, Heinz khám phá ra enzyme đông tụ sữa ở dịch tiêu hoá ngăn thứ tư dạ dày bê gọi là rennin. Rennin có trong dịch dạ dày của động vật đang bú mẹ (trâu, bò, dê… mới đẻ), đặc biệt ngăn thứ tư dạ dày bê. Khi con vật lớn hơn 5 tháng tuổi, bắt đầu ăn, hàm lượng rennin giảm dần và được thay thế bằng pepsin. Từ năm 1971, người ta đã thành công trong việc dung chymotrypsin cố định trên carboxylmethylcellulose để làm dông tụ sữa thay cho rennin đắt tiền [3]. Phân loại: Rennin là một protease acid tính, số phân loại E.C.3.4.4.3. Rennin đặc biệt có khả năng đông tụ sữa cao và phân giải protein (chủ yếu casein của sữa). Rennin là enzyme thuỷ phân liên kết peptit trong protein có trọng lượng phân tử khoảng 33.000 – 34.000 Da. Rennin tinh khiết có dạng tinh thể hình lập phương. Về mặt cấu tạo phân tử, rennin có mạch polypeptit có gắn glycine trong mạch có vòng cacbon. Các liên kết hydro có thể đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cấu trúc bậc 2, 3 của rennin ở dạng hoạt động. Trong thành phần hoá học, rennin chứa nhiều amino acid có tính acid nhưng ít hơn pepsin. Do đó, rennin thể hiện tính acid yếu hơn pepsin. Đặc tính và khả năng thuỷ phân của rennin: Rennin tinh khiết có đặc tính của một globulin. Điểm đẳng điện của rennin pI = 4,5. Rennin thấm chọn lọc qua màng tế bào nhưng không thấm qua màng tế bào ở môi trường kiềm. Đặc hiệu thuỷ phân: Rennin chỉ thuỷ phân các liên kết peptit và không làm ảnh hưởng đến liên kết ester và amin. Rennin đặc biệt có tác động mạnh lên các liên kết được tạo nên bởi tyrosine và phenylalanine. Rennin tác động lên cơ chất casein của sữa bò và những loại sữa khác. Đặc tính thuỷ phân casein của rennin phụ thuộc rất nhiều vào pH. Ở pH = 6,8 rennin phân cắt trung bình 1/33 còn ở pH = 2,3 thì phân cắt 1/8 số liên kết peptit trong phân tử casein. Sự hoạt hoá prorennin thành rennin: Prorennin là một chuỗi protein đơn chứa 3 cầu nối disulfite được giữ lại trong phân tử rennin hỗ trợ cho hoạt động của enzyme. Quá trình hoạt hoá prorennin giống sự hoạt hoá pepsinogen, ở pH 6 kèm theo sự xuất hiện protein kết tủa trong dung dịch ở nhiệt độ cao. Rennin tiếp xúc trong môi trường kiềm yếu pH = 9 sẽ bị bất hoạt dần nhưng trong môi trường acid mạnh sẽ bất hoạt nhanh chóng. Bảo quản rennin: Dịch rennin có màu hổ phách nhạt đến màu nâu đậm hoặc bột màu trắng đến nâu nhạt. Rennin tinh khiết được bảo quản ở 15oC. Dịch rennin được bảo quản ở nồng độ cao 14 – 20% và có thể thêm Na – benzoate và propylene – glycol để bảo quản. Thu nhận enzyme rennin: Nguyên liệu thu rennin là ngăn thứ tư dạ dày bê non (dạ múi khế) dưới 5 tháng tuổi. Xử lý sơ bộ: tách mỡ, rửa sơ: Lấy phần múi khế của bao tử bê và lộn ngược một cách nhẹ tay để bỏ hết thức ăn dư, tách bỏ phần mỡ, cân trọng lượng. Rửa nhẹ bằng nước lạnh , không nên rửa quá kỹ sẽ làm mất enzyme, sau đó rửa bằng dung dịch muối NaCl 15%. Xay nhuyễn: Dùng kéo cắt nhuyễn màng nhầy dạ dày thành miếng nhỏ khoảng 1cm rồi xay nhuyễn đồng nhất nhằm phá vỡ các mô tế bào tạo điều kiện cho quá trình trích ly. Chiết enzyme và chỉnh pH = 4: Bản chất của quá trình chiết tách enzyme từ màng nhầy dạ dày động vật là sự phối hợp của ba giai đoạn: phá vỡ tế bào, hoạt hoá và chiết tách enzyme. Có hai phương pháp là: phương pháp chiết và phương pháp tự phân. Cả hai phương pháp này đều dựa trên nguyên tắc: enzyme rennin được giải phóng từ màng nhầy dạ dày động vật bằng cách chiết trong dung dịch acid loãng hay nhờ sự tự phân trong môi trường acid. Phương pháp 1: phương pháp chiết: dạ dày rửa sạch, tách màng nhầy, nghiền ngâm vào nước 5% butanol hay glycerin có cloroform để tránh nhiễm khuẩn, thời gian ngâm 48 – 72 giờ, nhiệt độ thường. Sau đó chế hoá bằng etanol để rennin kết tủa. Phương pháp 2: phương pháp tự phân: Niêm mạc dạ dày xay nhỏ, dùng HCl hay H3PO4, H2SO4 với nồng độ thích hợp để chiết xuất và hoạt hoá prorennin thành rennin. HCl là acid vô cơ quan trọng có trong thành phần dịch vị dạ dày động vật giúp prorennin được hoạt hoá thành rennin. Thời gian tự phân 30 giờ ở 40 – 42oC. Dùng HCl để điều chỉnh pH môi trường về 4 sẽ cho hoạt tính enzyme cao, khả năng hoà tan tốt. Chiết enzyme dựa theo phương pháp tự phân do phương pháp này có sự phá vỡ một cách triệt để cấu trúc tế bào, hiệu suất thu enzyme cao hơn phương pháp chiết 5–7 lần. Phối trộn NaCl 12% vào dạ dày bê theo tỉ lệ 1: 3 giúp cho quá trình chiết tách . Khuấy: khuấy đều, bổ sung thêm chất bảo quản Natri benzoat 1% để tránh VSV phát triển trong dung dịch, chống oxy hoá,.. Lọc: vớt bỏ hết lớp mỡ phía trên mặt, sau đó lọc qua nhiều lớp vải mùn để thu được dịch enzyme. Kết Tủa: tiến hành tủa enzyme theo phương pháp diêm tích với muối NaCl nồng độ bão hoà 25%. Cho muối từ từ, khuấy nhẹ đến khi dung dịch bão hoà, để tủ lạnh 20 phút. Tủa bằng muối trung tính có nồng độ cao để kết tủa thuận nghịch enzyme mà không làm giảm hoạt tính của chúng. Ngoài ra, có thể dùng các tác nhân tủa như: amon sulfate, cồn tuyệt đối, aceton, izopropanol… Trong quá trình kết tủa bằng dung môi hữu cơ tạo ra một nhiệt lượng lớn có thể làm mất hoạt tính enzyme. Do đó, dung dịch sau tự phân đã lọc cùng dung môi được làm lạnh trước khi sử dụng và dung môi phải được cho từ từ và tránh sự tăng nhiệt độ cục bộ bên trong hỗn hợp. Thời gian 5–10 phút, nhiệt độ thấp 0–5oC. Ly tâm: hỗn hợp dung dịch sau khi kết tủa để yên đem ly tâm lạnh ở 4oC, trong 45 phút, tốc độ 5000 vòng/phút để thu tủa. Tinh sạch enzyme rennin: Có thể sử dụng hai phương pháp sau: Phương pháp1: thẩm tích bằng màng bán thấm (cellophan) Nguyên tắc: Màng bán thấm (cellophane) có cấu tạo gồm nhiều lỗ nhỏ dùng để tách muối và cho chất có phân tử lượng nhỏ qua túi và giữ lại những chất có phân tử lượng lớn theo nguyên tắc khuyếch tán từ nồng độ cao (dung dịch trong cellophane) đến nồng độ thấp (bên ngoài cellophane) cho đến khi đạt cân bằng nồng độ. Cho dịch rennin thô vào giấy cellophan, đặt vào nước cất lạnh có nhiệt độ 0–4oC, khuấy và thay nước cất lạnh cho đến khi thử âm tính với AgNO3, thời gian thẩm tích khoảng 2 ngày đêm. Phương pháp 2: phương pháp sắc ký lọc gel sephadex G–50 Nguyên tắc: Khi cho một dung dịch chứa nhiều chất có phân tử lượng khác nhau chạy qua cột chứa các hạt gel sephadex đã trương nở thì xảy ra quá trình tách những phân tử có kích thước và trọng lượng khác nhau. Những chất có phân tử lượng nhỏ sẽ lọt vào bên trong lỗ gel do đó sẽ di chuyển chậm qua cột. Các chất có phân tử lượng lớn hơn sẽ di chuyển bên ngoài hạt gel nên sẽ chuyển nhanh và giải phóng ra khỏi cột trước. Sau đó, chất có phân tử lượng nhỏ sẽ lần lượt đi ra theo mức độ phân tử lượng của chúng. Kết quả là tách được các chất có phân tử lượng khác nhau thành các phân đoạn theo trình tự: các phân đoạn có trọng lượng phân tử lớn ra trước, các phân đoạn có trọng lượng phân tử nhỏ ra sau. Sấy đông khô: Nguyên tắc của quá trình sấy đông khô: Nguyên tắc của phương pháp sấy đông khô là tách nước ra khỏi nguyên liệu bằng cách chuyển từ trạng thái đá (rắn) vào trạng thái khí mà không qua giai đoạn lỏng (nước). Nhờ vậy, nước được đưa ra khỏi nguyên liệu mà không làm hỏng nguyên liệu. Quá trình sấy đông khô: gồm 3 giai đoạn: Giai đoạn 1– làm lạnh: đây là giai đoạn quan trọng làm lạnh nguyên liệu xuống điểm eutectic - điểm có nhiệt độ thấp nhất mà tại đó pha lỏng và pha rắn cùng tồn tại - đảm bảo cho quá trình thăng hoa xảy ra ở giai đoạn kế tiếp. Giai đoạn 2– sấy bậc 1: tạo áp suất chân không và hạ nhiệt độ xuống -40oC để nước trong nguyên liệu thăng hoa ở trạng thái lạnh. Giai đoạn 3– sấy bậc 2: giai đoạn này có nhiệt độ cao hơn giai đoạn sấy bậc 1 để giúp cho nguyên liệu giữ nguyên các tính chất hoá lý. Giai đoạn này áp suất chân không tiếp tục thúc đấy quá trình thăng hoa. Tính chất của sản phẩm sấy đông khô: Nếu sấy ở nhiệt độ thường dễ làm enzyme bị hư hỏng, mất đi tính chất ban đầu thì phương pháp này giúp cho enzyme giữ nguyên được tính chất hoá lý và có thể bảo quản trong thời gian dài. Sau khi sấy đông khô, enzyme thu được có dạng mảnh, màu trắng hoặc phớt hồng. Quy trình chế biến fomat: Giai đoạn lên men sữa, kết tủa casein: Sữa sau khi đã thanh trùng Pasteur ở 85 – 95oC từ 15 - 20 phút, dùng chế phẩm men Rennin và vi khuẩn lactic để kết tủa sữa. Vi khuẩn lactic lên men sinh ra acid lactic, làm giảm pH môi trường tạo điều kiện thuận lợi để casein kết tủa và enzyme Rennin giúp cho sự kết tủa casein tốt hơn, casein lắng xuống và thu được fomat. Ngoài tác dụng kết tủa, Renin còn thủy phân một phần casein thành pepton, acid amin… Chú ý: Thanh trùng để tiêu diệt các loại vi trùng là cần thiết. Tuy nhiên, thanh trùng đã phá vỡ cân bằng giữa các muối, làm giảm hàm lượng muối calci mà kết quả là làm giảm khả năng đông tụ sữa bằng men sữa (rennin). Để khắc phục nhược điểm này, người ta phải bổ sung calci dưới dạng CaCl2. Giai đoạn ép nén tách huyết thanh: Phần casein kết tủa được ép từ 20 - 24 giờ, ở nhiệt độ 35 – 50oC. Trong thời gian này sự lên men lactic vẫn tiếp tục mạnh mẽ. Sau khi ép huyết thanh ra khỏi cục sữa kết tủa, Fomat lúc này có thành phần chủ yếu là casein và lipid. Huyết thanh sữa bị loại ra chứa lacto, lactalbumin, lactoglobulin… Giai đoạn muối fomat: Khối fomat sau khi tách huyết thanh sẽ cho vào bể nước muối nồng độ 24% ngâm trong vài ngày để tăng vị mặn, tạo sự đồng nhất về thành phần cho khối fomat và kìm hãm vi sinh vật có hại phát triển chủ yếu là trực khuẩn đường ruột. Giai đoạn ủ chín: Sau khi muối xong, khối fomat được chuyển vào hầm lên men ở nhiệt độ 18 – 22oC, độ ẩm 80 - 90%. Quá trình lên men chậm dần do đường lactoza đã bị tách hầu hết trong giai đoạn ép nén. Trong khối fomat, vi khuẩn Propionic hoạt động mạnh, lên men lactic thành acid propionic, acid acetic và CO2. Cả hai acid này làm cho Fomat có vị chua, hăng đặc biệt. Sự lên men propionic sẽ kết thúc sau 2 – 2,5 tháng. Giai đoạn này gọi là quá trình ủ chín. Tuy vậy, quá trình ủ chín Fomat vẫn được tiếp tục một thời gian nữa cho fomat hoàn toàn chín. Trong thời gian này casein tiếp tục được phân giải thành đạm dưới tác dụng của enzyme Rennin và vi khuẩn lactic. Khi fomat chín thì 2/3 casein được phân giải thành pepton, acid amin và một ít NH3. Fomat được bảo quản lạnh, bao gói bằng một số vật liệu thích hợp, cách ẩm và chống oxy hóa tốt để sử dụng lâu dài và vận chuyển đi xa. Ứng dụng protease trong công nghệ sản xuất nước mắm Nước mắm là loại thực phẩm, gia vị giàu dinh dưỡng, chứa nhiều loại acid amin, đặc biệt là các loại acid amin không thay thế. Nhờ hệ enzyme có sẵn do hệ vi sinh vật sống trong ruột cá, các protid của cá được thủy phân thành acid amin, peptid. Thành phần đạm có trong nước mắm: Đạm toàn phần 13 – 30g/l Đạm formon 12 – 18g/l Đạm NH3 4 – 6g/l Các hệ enzyme trong sản xuất nước mắm Gồm 3 hệ enzyme lớn: Hệ enzyme Metalo-protease (Aminodipeptidase): Hệ enzyme này tồn tại trong nội tạng của cá và chịu được nồng độ muối cao nên ngay từ đầu nó đã hoạt động mạnh, giảm dần từ tháng thứ 3 trở về sau. Loại enzyme này có hoạt tính khá mạnh, có khả năng thủy phân rộng rãi đối với các loại peptid. Đây là nhóm thủy phân enzyme trung tính, pH tối thích từ 5–7, pI = 4–5, nó ổn định với ion Mg2+, Ca2+và mất hoạt tính với Zn2+, Ni2+, Pb2+, Hg2+.. Hệ enzyme serin-protease: Điển hình là enzyme trypsin, tồn tại nhiều trong nội tạng của cá. Ở giai đoạn đầu của quá trình sản xuất nước mắm hoạt động của nó yếu đến tháng thứ 2 và phát triển dần đạt giá trị cực đại ở tháng tứ 3 rồi giảm dần đến khi chượp chín (protein phân giải gần như hoàn toàn không còn ở dạng pepton). Hệ enzyme này luôn bị ức chế bởi chuỗi acid amin trong cấu trúc của enzyme. Để tháo gỡ chuỗi này phải nhờ đến hoạt động của men cathepsin B nhưng men cathepsin B dễ bị ức chế bởi nồng độ muối cao. Vì vậy để men cathepsin B hoạt động được người ta thực hiện phương pháp cho muối nhiều lần. Enzyme serin-protease hoạt động mạnh ở pH từ 5–10, mạnh nhất ở pH=9. Hệ enzyme acid-protease: Có trong thịt và nội tạng cá, điển hình là enzyme cathepsin D. Hệ enzyme này dễ bị ức chế bởi nồng độ muối khoảng 15% nên thường nó chỉ tồn tại một thời gian ngắn ở đầu thời kỳ của quá trình thủy phân. Loại men này đóng vai trò thứ yếu trong quá trình sản xuất nước mắm. Quá trình sản xuất nước mắm xảy ra theo 3 pha Pha 1 (trong khoảng 25 ngày đầu): Có sự gia tăng thể tích của phần chất lỏng nổi ở trên bề mặt sản phẩm và protein hòa tan. Pha 2 (80 – 120 ngày): Mô tế bào bị phá vỡ, protein của tế bào trở nên tiếp xúc với enzyme, sản phẩm của quá trình tự phân protein được phóng thích. Hầu như tất cả mô tế bào đều bị phân hủy và biến mất sau 120 – 140 ngày. Pha 3 (140 – 200 ngày): Enzyme phóng thích và tấn công vào các phần protein hòa tan. Đây là nguyên nhân làm thay đổi hợp chất Nitơ. Ngoài ra đường, chất béo cũng bị phân giải thành rượu và các acid hữu cơ. Nhân tố ảnh hưởng đến quá trình chế biến nước mắm Nhiệt độ: Nhiệt độ tăng vận tốc phản ứng tăng, đến một nhiệt độ nào đó sẽ không tăng nữa và có thể giảm xuống do nhiệt độ cao làm cho hệ enzyme serin–protease mất hoạt tính. Quá trình thủy phân kém. Vì vậy phải tạo một nhiệt độ thích hợp cho enzyme hoạt động. Nhiệt độ 30 – 47oC thích hợp cho quá trình chế biến chượp. Chượp càng phơi nắng nhiều nước mắm càng ngon, càng rút ngắn đườc thời gian “chượp chín” tăng hiệu suất thủy phân. Nhiệt độ 70oC trở lên hầu hết các hệ enzyme trong cá mất hoạt tính. Đây là yếu tố điều chỉnh tốc độ phản ứng cho enzyme xúc tác, đơn giản nhưng rất hiệu quả. pH: Mỗi hệ enzyme có pH tối thích khác nhau, vì vậy phải xem loại enzyme nào nhiều nhất và đóng vai trò chủ yếu nhất trong quá trình sản xuất nước mắm để tạo pH thích hợp cho enzyme đó hoạt động. Qua thực nghiệm cho thấy: pH môi trường tự nhiên từ 5,5–6,5 enzyme trypsin và pepsin hoạt động được, đồng thời ở pH này có tác dụng ức chế một phần vi khuẩn gây thối. Vì vậy ở môi trường tự nhiên có pH thích hợp cho quá trình sản xuất nước mắm hơn. Lượng muối: Muối là nguyên liệu quan trọng cho quá trình sản xuất nước mắm, thiếu muối nước mắm không hình thành được. Yêu cầu của muối trong sản xuất nước mắm phải là loại muối ăn, càng tinh khiết càng tốt, kết tinh hạt nhỏ có độ rắn cao, màu trắng óng ánh (không vón cục, ẩm ướt, vị đắng chát). Nồng độ muối thấp có tác dụng thúc đẩy quá trình thủy phân protein nhanh hơn, chượp mau chín. Nồng độ muối quá cao có tác dụng ức chế làm mất hoạt tính của enzyme, quá trình thủy phân chậm lại, thời gian thủy phân kéo dài (protein bị kết tủa bởi muối trung tính bão hòa). Thường lượng muối cho vào khoảng 20–25% so với khối lượng cá. Nên thực hiện phương pháp cho muối nhiều lần và cần phải xác định số lần cho muối, tỉ lệ muối của mỗi lần và khoảng cách giữa các lần cho muối để không ảnh hưởng đến quá trình sản xuất nước mắm. Diện tích tiếp xúc: Muốn phản ứng xảy ra nhanh phải có sự tiếp xúc tốt giữa enzyme và cơ chất. Các enzyme trong cá tập trung nhiều ở nội tạng, nên để tăng tốc độ thủy phân người ta tìm cách tăng diện tích tiếp xúc giữa enzyme và thịt cá. Có thể dùng các biện pháp: Phương pháp xay nhỏ cá: Ưu điểm: xay nhỏ cá diện tích tiếp xúc lớn, enzyme phân tán. Nhược điểm: protein dễ bị biến tính do tác dụng cơ học, làm nồng độ enzyme loãng ra. Phương pháp đập dập: Ưu điểm: Cá đập dập sẽ giữ được hình dạng ban đầu, cơ thịt bên trong bị mềm ra, tổ chức cơ thịt lỏng lẻo giúp enzyme dễ ngấm vào trong thịt. Cá đập dập xương cá không bị vỡ vụn, khi chượp chín kéo rút dễ dàng. Phương pháp cắt khúc: Nhược điểm: thịt cá vẫn còn chắc nên enzyme khó ngấm vào hơn phương pháp đập dập, protein ở mặt ngoài dễ bị biến tính do tiếp xúc với dung dịch có nồng độ muối cao. Như vậy, để tăng diện tích tiếp xúc sử dụng phương pháp đập dập kết hợp với đánh khuấy chượp là tốt nhất. Bản thân nguyên liệu: Những loài cá khác nhau, thành phần hóa học và cấu trúc cũng khác nhau, nhất là hệ enzyme trong cá vì vậy tạo ra loại nước mắm có chất lượng khác nhau. Cá tươi chế biến chất lượng tốt hơn cá ươn. Loại cá có kết cấu cơ thịt lỏng lẻo, mềm mại, ít vảy dễ chế biến hơn loại cá cứng, chắc, nhiều vảy. Nếu cá có nhiều mỡ thì nước mắm có mùi ôi khét khó chịu, mùi chua (do sự thủy phân chất béo thành acid béo và glycerid) hoặc khét do oxy hóa chất béo.. Các phương pháp chế biến nước mắm Phương pháp chế biến nước mắm cổ truyền Nguyên lý: Sử dụng enzyme protease có sẵn trong trong nguyên liệu cá [9] ban đầu( do vi sinh vật trong ruột cá và mang cá), thủy phân protein cá thành axit amin. Có 3 phương pháp chế biến chượp cổ truyền * Phương pháp đánh khuấy: - Cho muối nhiều lần, - Cho nước lã, - Đánh khuấy liên tục. * Phương pháp gài nén: - Cho muối một lần hoặc nhiều lần, - Không cho nước lã, - Gài nén và không đánh khuấy. * Phương pháp hỗn hợp: - Kết hợp giữa 2 phương pháp gài nén và đánh khuấy, - Lúc đầu thực hiện phương pháp gài nén, - Sau đó thực hiện phương pháp đánh khuấy. Phương pháp: Sơ đồ 2: quy trình chế biến nước mắm bằng phương pháp cổ truyền Ưu điểm: nước mắm có hương vị thơm ngon đặc trưng, không gây hại cho sức khỏe. Nhược điểm: thời gian lên men dài, có độ đạm thấp (khoảng 30 độ). Chế biến nước mắm sử dụng protease vi sinh vật Nhằm khắc phục thời gian sản xuất nước mắm cổ điển quá dài (khoảng 9 tháng), phương pháp mới chỉ 1-1,5 tháng. Nguyên lý: Trên cơ sở sản xuất nước mắm dân gian, dùng enzyme trong ruột, mang cá. Đồng thời bổ sung thêm các enzyme từ vi sinh vật bên ngoài nhằm tăng enzyme tổng số Các chế phẩm enzyme sản xuất từ vi khuẩn Bacillus subtilis, nấm mốc Asp. Orzyzae dạng bột, dạng lỏng. Phương pháp: Sơ đồ 3: Qui trình chế biến nước mắm bằng phương pháp vi sinh vật * Xử lý: cá phải rửa sạch bùn, đất, tạp chất, cá to phải cắt nhỏ. * Thủy phân: Mốc: yêu cầu tốc độ sinh trưởng và phát triển nhanh, hình thái khuẩn ty to và mập, tốt nhất là sau 2 ngày ở nhiệt độ và độ ẩm thích hợp. Tỉ lệ giữa mốc và cá từ 3–4% tính theo chế phẩm mốc thô và cá xay nhỏ trộn với mốc. Nước: cho vào 5–10% để vừa đủ ngấm mốc, giúp men hoạt động tốt, nhiệt độ thủy phân 37–41oC, thời gian 10–15 ngày chượp sẽ chín. Muối: sử dụng muối có tinh thể nhỏ, màu sáng, độ trắng cao, không vón cục, không bị chát, lượng muối cho vào 4-6% so với khối lượng cá Lọc: nước lọc và nước rửa bã bằng 30% so với khối lượng cá. Đun sôi: nhỏ lửa có tàc dụng khử mùi, vi sinh vật, chất bẩn. Thêm muối vào để đạt đến độ mặn nước chấm. Ưu điểm: Thiết bị đơn giản, dễ chế tạo, giá thiết bị không cao, phù hợp điều kiện sản xuất ở địa phương, vốn đầu tư ban đầu không lớn. Không cần sử dụng thiết bị chịu axit, chịu kiềm, chịu áp suất và nhiệt độ cao. Không độc hại với công nhân và môi trưòng do không sử dụng hóa chất. Điều kiện sản xuất nhẹ nhàng, ôn hòa: nhiệt độ khoảng 30 – 45oC, pH trung tính (hay acid yếu hay kiềm yếu), áp suất thường. Không tổn hao acid amin trong quá trình sản xuất Nhược điểm: Hiệu suất thủy phân không cao. Thời gian và quy trình sản xuất kéo dài hơn phương pháp hóa giải, cần thêm công đoạn nuôi mốc giống cho quá trình thủy phân. Phương pháp cho muối nhiều đợt và thêm H2O: Phương pháp cho muối nhiều đợt là làm cho protease không bị ức chế bởi nồng độ NaCl cao ngay từ đầu, ở nồng độ muối thấp, quá trình thủy phân xảy ra với tốc độ cao hơn. Người ta còn cho thêm nước vào khối cá và muối ướp, tác dụng làm khối cá được mềm, loãng ra, dễ dàng thủy phân hơn. Tỉ lệ nước – muối thường theo bảng sau: Bảng 2: Tỉ lệ nước, muối trong ướp cá Loại cáCá (kg)Nước (lit)NaCl (kg)Cá to 20cm10020 – 3036 – 39Cá vừa 8cm10015 – 2535 – 36Cá nhỏ 2 – 5cm10010 – 2030 – 35Ướp muối đợt 1: làm cho nồng độ muối chung giảm đi, khối cá loãng hơn và tạo điều kiện thích hợp cho sự thủy phân protit cá của enzyme vi sinh vật. Ướp muối đợt 2, 3: Sự cho muối lần 2, 3 đúng thời gian rất quan trọng, quyết định chất lượng nước mắm thành phẩm. Toàn bộ thời gian cho muối đợt 1 đến 4 là 15 – 25 ngày (mùa hè); 20 – 30 ngày (mùa đông). Cá ướp muối, được phơi nắng, khuấy đều luôn, với nhiệt độ ấm, sự thủy phân sẽ nhanh hơn. Cơ sở khoa học phương pháp này là: Sự cho nước thêm vào chượp: tác dụng làm loãng nồng độ muối, làm loãng chượp tạo điều kiện cho enzyme hoạt động tốt. Cho muối nhiều đợt: mục đích cho muối là để khống chế kìm hãm hoạt động của vi sinh vật gây thối. Nhưng nếu cho tất cả lượng muối cần cho sản xuất nước mắm vào một lúc thì nồng độ muối cao ngay từ đầu sẽ ức chế đối với hoạt động của enzyme protease. Enzyme này chỉ hoạt động tốt khi không có muối hay muối lạt, mặt khác với nồng độ muối cao thịt cá sẽ chắc lại khó thủy phân, do vậy làm chậm tốc độ thủy phân protit cá. Nhược điểm: cho nước dễ tạo điều kiện xâm nhập, hoạt động vi sinh vật gây thối. Cần theo dõi sát sao quá trình sản xuất các hiện tượng bất thường, tạo mùi vị xấu… để bổ sung kịp thời NaCl ngăn chặn sự hư hỏng chượp cá. Protease trong công nghệ sản xuất tương [1] Xì dầu hay nước tương (phương ngữ miền Nam Việt Nam) là một loại  HYPERLINK "" \o "Nước chấm (trang chưa được viết)" nước chấm được sản xuất bằng cách  HYPERLINK "" \o "Lên men" lên men hạt  HYPERLINK "" \o "Đậu tương" đậu tương,  HYPERLINK "" \o "Ngũ cốc" ngũ cốc rang chín,  HYPERLINK "" \o "Nước" nước và  HYPERLINK "" \o "Muối ăn" muối ăn. Nước chấm này, có nguồn gốc từ  HYPERLINK "" \o "Trung Quốc" Trung Quốc, được sử dụng khá phổ biến trong  HYPERLINK "" \o "Ẩm thực (trang chưa được viết)" ẩm thực  HYPERLINK "" \o "Châu Á" châu Á tại khu vực  HYPERLINK "" \o "Đông Á" Đông Á và  HYPERLINK "" \o "Đông Nam Á" Đông Nam Á. Trong công nghiệp nước tương thường được sản xuất từ bánh dầu đậu phộng (bã đậu phộng sau khi đã ép dầu) hoặc bánh dầu đậu nành (bã đậu nành). Sản xuất nước chấm lên men nhìn chung bao gồm các giai đoạn sau: Sơ đồ 4: Các giai đoạn trong sản xuất nước chấm lên men chìm Nước tương có thể được chế biến theo 2 phương pháp chủ yếu: phương pháp lên men vi sinh vật và phương pháp thuỷ phân bằng hoá chất. 2.3.1 Phương pháp lên men vi sinh vật Nguyên lý: Chủ yếu dựa vào tác dụng của Enzym thu được từ mốc giống đã chọn lọc, nuôi cấy để thuỷ phân protid và glucid của nguyên liệu thực vật. Phương pháp: Sơ đồ 5: Quy trình sản xuất nước tương theo phương pháp vi sinh vật Mốc giống được nuôi trong môi trường thạch sẽ được nhân ra và cấy vào hỗn hợp khô đậu tương (bã đậu nành) hoặc khô lạc (bánh dầu đậu phộng) và bột mì (bột làm bánh mì chớ không phải bột khoai mì) đã hấp chín, đánh tơi ra và để nguội. Nấm mốc Aspergillus oryzae sinh ra các enzym amylaz, invertaz, maltoz, proteaz và cataz có khả năng phân giải tinh bột, protein thành đường, acid amin. Ủ mốc ở nhiệt độ ấm (30 – 380C), nơi thoáng khí, có độ ẩm tương đối của không khí hơn 90%. Khi giai đoạn phát triển mốc kết thúc, làm tơi nguyên liệu đã lên mốc, pha trộn vào đó dung dịch nước muối 20% theo tỷ lệ từ 25 – 30% và đem ủ ấm ở nhiệt độ 50 – 600C. Sau đó chiết rút và pha tiếp nước muối vào và tiếp tục chiết rút nước tương,.. (nước cốt hay nước 1, nước 2, nước 3,..) Ưu và nhược điểm: Nước tương được sản xuất bằng phương pháp lên men do không có phản ứng sinh ra Glycerin và không sử dụng axit HCl nên không tạo thành 3-MCDP. Tuy nhiên cần quan tâm đến độc tố Aflatoxin cũng là tác nhân gây bệnh ung thư như 3-MCPD. Aflatoxin được sinh ra từ nấm Aspergylus flavus lẩn trong nấm Aspergylus oryzae lên men tạo thành nước tương. Mặt khác nước tương sản xuất từ phương pháp lên men thời gian kéo dài và mùi vị khác so với phương pháp hoá giải. 2.3.2 Phương pháp thuỷ phân (hoá giải) Nguyên lý: Thuỷ phân bằng enzyme trước rồi sau đó mới thuỷ phân bằng axit hoặc thuỷ phân bằng axit rồi sau đó thuỷ phân bằng enzyme. Phương pháp: Sơ đồ 6: Quy trình sản xuất nước tương theo phương pháp thủy phân Ưu điểm: Giảm thiểu sử dụng hóa chất độc hại, giảm thiểu ô nhiễm môi trường, rút ngắn thời gian sản xuất. Có thể sản xuất trên hệ thống thiết bị sẵn có. Protease trong sản xuất Chao Chao là một thực phẩm đặc biệt của dân tộc Việt Nam và vùng châu Á, làm từ đậu hũ bằng phương pháp lên men nhờ vi sinh vật. Chao không những giúp ta ăn ngon miệng, dễ tiêu hóa, mà là một thực phẩm bổ, giàu dinh dưỡng vì thành phần chính là acid amin, peptit (đạm dễ tiêu hóa), các chất thơm (ester thơm), chất béo, NaCl, đặc biệt giàu acid amin không thay thế. Quá trình sinh hóa cơ bản trong sản xuất chao là sự thủy phân protid thành axit amin và peptid nhờ hệ enzyme protease của nấm mốc (Mucor), ngòai ra còn có quá trình tạo ester thơm do chuyển hóa lipid, do vậy trong chao thường gặp là nấm mốc Mucor như: Actinomucor alegans (chủ yếu) M. hiemalis M. silvaticus M. sultiliscimus Quy trình sản xuất bao gồm các giai đoạn: Làm mốc giống (bột bào tử mốc) Nuôi mốc trên đậu hũ Ướp muối Lên men chính Lên men phụ - sản phẩm Đóng gói – bao bì – bảo quản Làm mốc giống (bột bào tử mốc) Chủng nấm mốc Mucor được giữ giống trong môi trường thạch nghiêng, cách chuẩn bị tương tự các môi trường thạch nghiêng nuôi vi sinh vật khác. Thành phần môi trường có thể như sau: - Thạch 18 – 20g (agar) - Đường 20g - Nước chiết giá đậu 300g/l H2O - pH 4,5 – 5 Thanh trùng 1,2kg/cm2/giờ . Để nguội, đặt nghiêng. Sau khi cấy chuyền, nuôi ở 28 – 30oC trong 4 – 5 ngày rồi cấy chuyền ra môi trường trung gian (bình tam giác hay khay, thành phần môi trường có thể dùng bã sản xuất đậu hũ 1kg, bột mì 0,5kg H2O để có độ ẩm 70 – 72% pH 5,5 – 6. Thanh trùng 1,2kg/cm2/45 phút. Muốn sản xuất bột bào tử, người ta trộn môi trường trung gian với bột mịn – sấy 40oC ta có bột bào tử dùng dần cho sản xuất chao (bảo quản 0 – 3oC trong 7 – 10 ngày, trong túi PE hay lọ thủy tinh, sành sứ… khô, sạch, kín. Nuôi mốc trên đậu hũ Đậu hũ cắt thành miếng nhỏ 3x3x4cm hay 2x3x3cm trụng nước sôi 100oC/phút vớt ra cho ráo nước xếp so le, rắc bột bào tử mốc vào (phun bột mịn trên bề mặt đậu hũ). Mục đích xếp theo dang so le giữa các miếng đậu để tăng bề mặt thoáng tiếp xúc với không khí. Đưa vào phòng nuôi mốc, độ ẩm 90%,nhiệt độ 28 – 30oC, nuôi 36 – 42 giờ (nếu thấy bề mặt khô có thể phun tia nước sạch) trên bề mặt đậu hũ sẽ xuất hiện lớp long tơ mịn trắng ngà. Theo kinh nghiệm sản xuất dân gian, thì dùng hệ enzyme vi sinh vật trong không khí rơi trên bề mặt miếng đậu để thủy phân protit mà không cần sản xuất bột bào tử, tuy nhiên, trong sản xuất công nghiệp, qui mô lớn muốn sản xuất ổn định, không bị nhiễm trùng vi sinh vật lạ làm hỏng sản phẩm thì giai đoạn nuôi mốc thuần khiết và sản xuất bột bào tử là cần thiết và quan trọng, phải được lưu ý và tiến hành chu đáo cẩn thận. Quá trình sinh lý sinh hóa chủ yếu trong giai đọan này là tạo điều kiện cho nấm mốc phát triển sinh sản, trên đậu hũ tổng hợp ra chủ yếu là enzyme protease đồng thời bắt đầu thủy phân protid đậu hũ. Ướp muối và rượu Sau khi mốc trắng mọc đều bề mặt miếng đậu hũ ta phải ướp muối để kìm hãm vi sinh vật gây thối và phun rượu nhẹ tạo ester thơm. Lượng muối 130 – 150g/kg đậu, xếp một lớp đậu một lớp muối, trên và dưới cùng là lớp muối hay nhúng đậu vào dung dịch NaCl 30 – 32% trong 6 – 7 giờ, vớt ra cho ráo cho vào phòng lên men. Lúc này cần phun ít rượu trắng vào đậu hũ hay pha vào dung dịch NaCl để nhúng đậu – tác dụng tạo ester thơm. (2kg đậu hũ cần 150cc rượu trắng). Làm chao bánh tiến hành như trên, nếu làm chao nước, thì cho dịch muối ngập miếng đậu phơi nắng 10 ngày là có chao. Tuy nhiên càng để lâu càng ngon. Giai đoạn lên men Đây là giai đoạn quan trọng quyết định chất lượng sản phẩm, là giai đoạn chính thủy phân protid của đậu hũ ra axit amin và ít peptid, phản ứng tạo esterthơm… xúc tác là enzye của nấm mốc. Tiến hành lên men chính ở nhiệt độ 35 – 36oC trong phòng nuôi nhiệt độ 37 – 38oC trong 6 – 7 ngày. Sau đó lên men phụ chủ yếu tạo hương ở nhiệt độ thường (25 – 30oC) trong 7 ngày. Chao thành phẩm thơm ngon, bổ, dễ tiêu hóa, bảo quản được khá lâu 4 – 5 tháng trong lọ thủy tinh với dung dịch NaCl ở nhiệt độ thường hoặc chao miếng gói trong giấy kim loại và bào quản lạnh. Hiện nay, người ta có thể sản xuất chao đỏ bằng cách cho thêm hồng cúc đỏ nhuộm màu, cho đậu hũ vào dung dịch NaCl ngập miếng chao. Chao còn có tên là đậu phụ nhự, đậu phụ lên men (đậu hũ lên men), người phương tây gọi là “pho mát Trung Quốc”, người Nhật gọi là Sufu. Protease trong công nghệ chế biến thịt và đồ hộp Trong công nghệ chế biến thịt Trong công nghiệp chế biến thịt, các enzyme phân giải protein cũng được sử dụng trong việc làm mềm thịt. Kết quả làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và có vị tốt hơn. Protease được sử dụng để làm mềm thịt và tăng hương vị thịt. Ngâm thịt vào dinh dưỡng protease ở pH và nhiệt độ xác định- phương pháp này phổ biến và thuận lợi nhất. Thịt thường giữ độ cứng khá lâu khi con vật chết. Để cho thịt có độ mềm cần thiết, thường phải xử lý trong điều kiện lạnh 0± 20C từ 10 đến 14 ngày. Trong điều kiện bảo quản như vậy cũng chỉ có 14 – 17% số thịt được đánh giá là thịt loại I. Một điều kiện quan trong nhất để làm xuất hiện những chất lượng cần thiết của thịt là làm phân giải một phần protein của thịt dưới tác dụng của enzyme proteinase. Ngày nay, papain và các enzyme proteolitic nguồn gốc vi khuẩn, nấm, thực vật được sử dụng phổ biến trong xử lý thịt bảo quản. chủ yếu bằng 3 phương pháp sau [3]: Ngâm trong dung dịch enzyme, Bôi bột làm mềm thịt có chứa enzyme cùng với mì chính, muối ăn, tinh bột… Bơm dung dịch enzyme vào mô thịt. Ưu điểm của việc thuỷ phân protease bởi enzyme là bảo toàn được vitamin của nguyên liệu, không tạo ra các sản phẩm phụ, không làm sẫm màu dịch thuỷ phân. Các enzyme papain, bromelin, pepsin hoặc các protease vi khuẩn từ Aspergillus, Bacillus…., được sử dụng làm mềm thịt, hòa tan các protein cá,…nói chung thủy phân bằng protease làm tăng khả năng tiêu hóa của protein nên đặc biệt có lợi cho những người bị mắc bệnh tiêu hóa kém hoặc làm mất tính mẫn cảm của người sử dụng với protein. Thủy phân protein trong điều kiện thích hợp lúc đầu thu được các peptid có kích thước nhỏ sau đó xảy ra hiện tượng plastein hóa như sắp xếp lại các peptid hoặc gắn thêm các acid amin không thay thế. Protease cũng được dùng để xử lý, tận dụng các phế liệu từ thịt, hoặc các nguyên liệu có nguồn gốc từ protein (thịt vụn, xương, gelatin…) để tạo ra các sản phẩm có giá trị như dịch protein, chất tăng vị, chất cải thiện mùi… Enzyme Papain [5]: Papain là một protease điển hình được ứng dụng nhiều trong công nghệ chế biến thịt, có trong cây đu đủ và đu đủ núi. Cấu trúc: bao gồm 212 amino acid được ổn định bằng 3 cầu nối disulfide. Cấu trúc không gian gồm 2 phần rõ rệt với 1 khe ở giữa. Khe này chứa vùng hoạt động chứa đựng một “bộ ba xúc tác” được ví như chymotrypsin. Bộ 3 xúc tác được làm từ 3 amino acid: cystein - 25, histidine - 159 và asparagines - 158. Chức năng: Làm đứt liên kết peptit liên quan đến sự deproton của cys-25 bởi his-159. Asn-158 giúp định hướng nhóm imido của his-159 cho phép sự deproton diễn ra. Sau đó cys-25 thực hiện sự tấn công nucleophitic vào carbon carbonyl của 1 mạch peptid. Nhóm amino cuối cùng của mạch peptit được tự do acyl-enzyme đồng hóa trị ngay lập tức. Enzyme bị deacylated bởi phân tử nước, giải thoát carboxy cuối cùng của mạch peptid. Sử dụng: Ích lợi của nó là làm đứt những thớ thịt dai và đã được sử dụng hàng ngàn năm ở Nam Mỹ. Nó được bán như là 1 thành phần trong bột làm mềm thịt có sẵn ở hầu hết các siêu thị. Trong công nghệ đồ hộp [2][4] Hỗn hợp enzyme pectinase, protease, hemicellulase làm trong và tách dịch quả. (3 – 6g/l, giữ ở nhiệt độ 40 – 450C trong 2 – 4giờ). Trong công nghệ chế biến cá hộp, cần chú ý các điều kiện để ức chế các hoạt động của vi sinh vật nhằm ngăn cản quá trình sản xuất enzyme thủy phân hóa các protit có trong sản phẩm: - Ngâm giấm: Nồng độ H+ có tác dụng ức chế hệ vi sinh vật trong ruột cá. pH = 6: vi khuẩn gây thối rữa bị khống chế. pH = 4,5: vi khuẩn ngừng sinh sản. pH = 3: các enzyme bị kiềm hãm. - Ngâm dung dịch muối: Kiềm hãm sự tự phân của enzyme và vi khuẩn. Các loại enzyme có trong thịt cá có hoạt tính mạnh nhất trong nước muối loãng nhưng ở nồng độ cao chúng sẽ bị kiềm hãm. - Nhiệt độ: Trong quá trình ướp muối, nhiệt độ cao sẽ làm cho các loại enzyme và vi khuẩn hoạt động mạnh làm giảm chất lượng của cá. Cá sau khi tê cứng dần dần trở lại mềm nhờ sự phân giải của enzyme. Quá trình này do các loại enzyme có trong cá hoạt động phân giải. Trong quá trình này có nhiều loại men tham gia nhưng chủ yếu là men Cathepsin, nó phân giải protid thành pepton, peptid. Men trypsin, enterokinase tiếp tục phân giải thành acid amin. Trong quá trình tự phân giải tổ chức cơ thịt sản sinh ra nhiều biến đổi về lý hóa, cơ thịt mềm mại, hương vị thơm tươi, có độ ẩm lớn và dễ bị tác dụng của men tiêu hóa hơn. Giai đoạn đầu của quá trình tự chín liên quan với quá trình ngược của quá trình tê cứng vì lúc đó xuất hiện sự phân ly actomyosin phần nào thành actin và myosin. Sự phân ly này dẫn tới làm tăng số lượng trung tâm ưa nước của protein co rút làm tăng khả năng liên kết nước của mô cơ. Tiếp theo là quá trình phân giải protid của các enzyme làm cho mô cơ mềm dần ra. Quá trình chín sẽ làm tăng thêm hương vị của cơ thịt, để phát huy ưu điểm đó chúng ta cần tiến hành quá trình chín ở nhiệt độ thấp (khoảng từ 1 – 4oC) để hạn chế sự xâm nhập của vi khuẩn gây thối rữa. Những nhân tố ảnh hưởng đến quá trình phân giải : - Giống loài - Môi trường pH - Ảnh hưởng của các loại muối - Ảnh hưởng của nhiệt độ Một số ứng dụng khác của protease Trong sản xuất bánh mì [6] Trong hạt mì cũng có chứa các protease làm giảm chất lượng bột nhào do sự phân giải protein cấu trúc bậc ba khiến gluten bị vụn nát. Protease bột mì hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 45 – 47oC, pH = 4,5 – 5,6. Khi bổ sung chất khử thì hoạt độ của protease tăng nhưng với chất oxy hóa và muối ăn thì bị kìm hãm. Trong sản xuất bia [3] Thủy phân protein trong bia bằng protease trong các cột chứa enzyme cố định tương ứng. - Proteinase: sẽ tấn công lên các phân tử protein nguyên thủy để tạo ra các sản phẩm trung gian như: pepton, peptid, polypeptid, với pHopt = 5.1, topt = 50 - 550C. - Peptidase: nó sẽ phân cắt các peptid có sẵn trong hạt đại mạch và những peptit trong malt do proteinase phân giải để tạo thành các acid amin trong hạt malt, với pHopt = 7.3 - 7.9, topt = 40 - 450C. - Amidase: chúng sẽ tấn công các muối amid để hình thành NH3 và acid amin, góp phần làm thay đổi tính chất và hàm lượng của protein trong hạt malt, các enzyme amidase có pHopt = 7.3 - 8.0, topt = 45 - 500C. 3. KẾT LUẬN Công nghệ enzyme nói chung và công nghệ protease nói riêng đã, đang và sẽ có những bước phát triển đáng kể, mang lại những ứng dụng to lớn cho đời sống con người. Trong đó thì công nghệ chế biến thực phẩm là lĩnh vực mà protease thể hiện nhiều ứng dụng đặc sắc. Thứ nhất: Nó khắc phục khiếm khuyết tự nhiên của nguyên liệu - chất lượng sản phẩm được tạo ra từ nguyên liệu dao động rất lớn. Thứ hai: Nâng cao giá trị thương phẩm của nguyên liệu. Thứ ba: Là công cụ trong quá trình chuyển hóa trong dây chuyền chế biến thực phẩm. Tham gia vào các giai đoạn chuyển hóa chính, các giai đoạn hoàn thiện sản phẩm, để làm tăng đáng kể chất lượng cảm quan của sản phẩm; nếu không có sự có mặt của nó thì quá trình chế biến không thành công. Với những vai trò trên thì rõ ràng việc ứng dụng protease trong công nghệ chế biến thực phẩm là không thể thiếu. Tuy nhiên nếu chỉ sử dụng protease thì hiệu suất không cao và việc sử dụng kết hợp một cách hợp lý và hiệu quả với các phương pháp khác là cần thiết để có hiệu suất cao, mở rộng quy mô sản xuất. TÀI LIỆU THAM KHẢO Sách: Đồng Thị Thanh Thu, Sinh hóa ứng dụng, NXB Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh, 2003, trang 117 - 145. Lê Mỹ Hồng, Giáo trình Công nghệ chế biến thực phẩm đóng hộp, Đại học Cần Thơ, 2005, trang 19, 101-102. Mai Xuân Lương, Giáo trình Enzym, Đại học Đà Lạt, 2005, trang 65-66, 75. Trần Xuân Hiển, Giáo trình điện tử Nguyên liệu trong bảo quản và chế biến nông sản thực phẩm, Đại học An Giang, 2005, chương 2, mục 2.5.3. Một số website:  HYPERLINK ""   HYPERLINK ""   HYPERLINK ""   HYPERLINK ""   HYPERLINK ""   HYPERLINK ""  MỤC LỤC Trang Lời mở đầu 3 Danh mục bảng, hình, sơ đồ 4 NỘI DUNG 5 1. TỔNG QUAN VỀ PROTEASE 5 1.1. Giới thiệu chung 5 1.2. Phân loại protease 7 1.3. Nguồn thu protease vi sinh vật 8 1.3.1. Vi khuẩn 8 1.3.2. Nấm mốc 9 1.3.3. Xạ khuẩn 9 1.4. Thu nhận protease từ vi sinh vật 10 1.4.1. Tuyển chọn chủng 11 1.4.2. Môi trường và phương pháp nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp Protease 11 1.4.3. Phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme 11 2. ỨNG DỤNG CỦA PROTEASE TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM 12 2.1. Ứng dụng trong công nghiệp chế biến sữa và các sản phẩm từ sữa 12 2.1.1. Ứng dụng trong công nghiệp chế biến sữa 12 2.1.2. Ứng dụng trong việc sản xuất fomat 13 2.2. Ứng dụng protease trong công nghệ sản xuất nước mắm 20 2.2.1. Các hệ enzyme trong sản xuất nước mắm 20 2.2.2. Quá trình sản xuất nước mắm xảy ra theo 3 pha 21 2.2.3. Nhân tố ảnh hưởng đến quá trình chế biến nước mắm 22 2.2.4. Các phương pháp chế biến nước mắm 24 2.3. Protease trong công nghệ sản xuất tương 28 2.3.1. Phương pháp lên men vi sinh vật 29 2.3.2. Phương pháp thuỷ phân (hoá giải) 30 2.4. Protease trong sản xuất Chao 31 2.5. Protease trong công nghệ chế biến thịt và đồ hộp 33 2.5.1. Trong công nghệ chế biến thịt 33 2.5.2. Trong công nghệ đồ hộp 35 2.6. Một số ứng dụng khác của protease 36 2.6.1. Trong sản xuất bánh mì 36 2.6.2. Trong sản xuất bia 36 3. KẾT LUẬN 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38