Công nghệ sản xuất chất kháng sinh Penicilin

ĐẠI HỌC BC TÔN ĐỨC THẮNG TP. HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG LỚP 08SH1N ♠♣♥♦ Đề tài: COÂNG NGHEÄ SAÛN XUAÁT CHAÁT KHAÙNG SINH PENICILLIN GV Hướng dẫn: Kỹ sư Nguyễn Thị Cẩm Vy Sinh viên thực hiện: Lý Vũ Quốc Bảo Nguyễn Duy Hà Nguyễn Vũ Duy Khanh Phạm Hoàng Minh Nguyễn Thị Tươi LỜI MỞ ĐẦU Từ thế kỷ XIX người ta đã biết các vi sinh vật có thể sống cộng sinh, cũng như có tác dụng đối kháng giữa chúng với nhau. Đến năm 1929, A.Fleming quan sát thấy những khuẩn lạc của mốc penicillin notatum ức chế sinh trưởng tụ cầu khuẩn Staphylococus. Chất có tác dụng ức chế do mốc này tiết ra được gọi là penicillin. Từ đó đến nay việc nghiên cứu chất có hoạt tính kháng sinh được chú trọng rất nhiều và đạt được nhiều kết quả rực rỡ. Ngày nay người ta đã biết trên 2000 chất kháng sinh, nhưng chỉ mới có khoảng 50 chất được dùng vào tư liệu hóa học chữa các bệnh nhiễm vi sinh vật trong y học và một số ngành khác. Một trong những chế phẩm chất kháng sinh phổ biến là penicillin. Penicillin là chất kháng sinh được tìm ra đầu tiên và được sản xuất sớm nhất dùng chữa một số bệnh do vi khuẩn vào những năm đầu của chiến tranh thế giới thứ hai. Ngày nay chất kháng sinh này được sản xuất với một lượng rất lớn và được dùng khá phổ biến trong y học. Trong đề tài này, chúng tôi đã nêu ra những tìm hiểu của mình về lịch sử phát hiện và sản xuất penicillin, các nguyên liệu sản xuất, công nghệ sản xuất penicillin cũng như các chế phẩm của loại thuốc kháng sinh này. Chúng tôi xin chân thành cảm ơn GV hướng dẫn, Kỹ sư Nguyễn Thị Cẩm Vi, người đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ chúng tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Đề tài của chúng tôi chắc chắn còn nhiều thiếu sót, có thể do nguồn tài liệu còn hạn chế cộng với khả năng làm việc của các thành viên trong nhóm thực hiện chưa cao. Chúng tôi rất mong được sự đóng góp ý kiến của GV hướng dẫn cùng tất cả các bạn. Nhóm thực hiện đề tài. PHAÀN I TOÅNG QUAN I.Lịch sử phát hiện và sản xuất penicillin: Chất kháng sinh penicillin được phát hiện tình cờ vào năm 1928: trong khi làm vệ sinh phòng thí nghiệm của mình, Alexander Fleming đã chú ý đến một hộp petri nuôi Staphylococcus bị nhiễm nấm mốc Penicillium notatum có xuất hiện hiện tượng vòng vi khuẩn bị tan xung quanh khuẩn lạc nấm. Khi ông cấy nấm mốc trên thử nghiệm lại trên một số vi khuẩn gây bệnh khác thì vẫn thấy hiện tượng tương tự xảy ra. Từ đó ông kết luận là nấm mốc đã tiết ra môi trường một chất nhất định làm tan vi khuẩn và ông đã sử dụng ngay giống nấm penicillin để đặt tên cho kháng sinh này (1929). Công trình khoa học của Fleming ngay lập tức thu hút sự quan tâm chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Gần như đồng thời, nhiều phòng thí nghiệm ở các nước đều triển khai nghiên cứu thu nhận penicillin và chỉ sau khoảng thời gian ngắn các nhà khoa học Mỹ đã triển khai lên men thành công penicillin bằng phương pháp lên men bề mặt (1931). Tuy nhiên cũng trong khoảng thời gian đó mọi nổ lực nhằm tách và tinh chế penicillin từ dịch lên men đều thất bại do không bảo vệ được hoạt tính kháng sinh của chế phẩm tinh chế, do đó vấn đề penicillin tạm thời bị lãng quên. Năm 1938 ở Oxford, khi tìm lại các tài liệu đã được công bố. Ernst Boris Chain lại để tâm đến phát minh của Fleming và ông đã đề nghị Howara walter Florey cho tiếp tục triển khai nghiên cứu này. Chỉ sau hai năm, phòng thí nghiệm của ông đã tinh chế được một lượng lớn penicillin, đủ để thí nghiệm trên các loại động vật thí nghiệm và kết quả điều trị thử nghiệm đã cho kết quả mỹ mãn: ngày 25/5/1940 penicillin đã được thử nghiệm rất thành công trên chuột. Một thời gian ngắn sau đó, trong nỗ lực cuối cùng nhằm cứu sống các thương binh bị nhiễm khuẩn rất nặng và đang ở trong tình trạng không còn cơ may sống sót, lần đầu tiên kể từ khi phát hiện, penicillin đã được chỉ định điều trị cho người, và cũng thật bất ngờ, kết quả điều trị này đã thành công ngoài cả sự trông đợi: chỉ duy nhất một thương binh bị tử vong do lượng thuốc tại chỗ không còn đủ liều yêu cầu để điều trị cho thương binh đó (1941). Nhóm nghiên cứu của Chain đã báo cáo lên chính phủ Hoàng gia Anh, nhưng do chính phủ đang tập trung mọi nổ lực cho chiến tranh nên đã không tài trợ cho dự án. Vì vậy, đề xuất trên được chuyển sang triển khai tiếp ở Peoria (Illionis. Mỹ). Nhận thức được ý nghĩa to lớn của nghiên cứu này, chính quyền bang Illinois và cả chính quyền liên bang đã xếp chương trình penicillin vào loại đặc biệt ưu tiên và chính phủ trực tiếp đứng ra tổ chức triển khai. Nhờ vậy, chỉ sau một thời gian ngắn người ta đã triển khai thành công công nghệ lên men chìm sản xuất penicillin (1942); đã tuyển chọn được chủng công nghiệp Penicillium chrysogenum NRRL-1951 (1943) và sau đó đã tạo được biến chủng Penicillium chrysogenum Wis Q-176 (chủng này được xem là chủng gốc của hầu hết các chủng công nghiệp đang sử dụng hiện nay trên toàn thế giới); đã thành công trong việc điều chỉnh đường hướng quá trình lên men để lên men sản xuất penicillin G.

Thiết bị làm lạnh và bồn lên men được sử dụng năm 1945


  Các tác giả nhận được giải Nobel năm 1945 về công trình penicillin. Vài năm sau người ta thấy xuất hiện các trường hợp kháng thuốc và hiện tượng này ngày nay càng phổ biến hơn. Trên con đường nhằm vô hiệu hoá khả năng kháng thuốc của vi khuẩn và mở rộng thêm tính năng ứng dụng điều trị của penicillin, năm 1959, Batcherlor và đồng nghiệp đã tách ra được axit 6-aminopenicillanic. Về sau, axit này được sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất ra hàng loạt chế phẩm penicillin bán tổng hợp khác nhau. Nguyên lý sản xuất chế phẩm bán tổng hợp trên đã mở ra con đường mới rất hiệu quả và kinh tế để đấu tranh chống lại sự kháng thuốc. Ngày nay trên thế giới đã sản xuất được trên 500 chế phẩm penicillin (trong đó chỉ lên men trực tiếp hai sản phẩm là penicillin V và penicillin G) và xu thế nghiên cứu sản xuất các chế phẩm penicillin bán tổng hợp mới vẫn tiếp tục được triển khai. II. Những vi sinh vật sản sinh penicillin và đặc điểm dinh dưỡng của chúng: Những vi sinh vật sinh penicillin thuộc các giống nấm mốc penicillium và Aspergillus. Nhưng các chủng thuộc nhóm Penicillium notatum, Penicillium chrysogenum có hoạt lực cao và được dùng trong công nghiệp kháng sinh. Những chủng đầu tiên được nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt trên cơ sở chất tự nhiên tạo thành 10-15 đv/ml kháng sinh. Penicillium chrysogenum trên môi trường Raistrik tạo thành hai kiểu khuẩn lạc: Kiểu I: khuẩn lạc tròn trặn, các nếp nhăn rõ nét. Khuẩn ty khí sinh mọc tốt và có màu xanh; theo rìa khuẩn lạc có đường viền rộng 2-5 mm của những khuẩn ty bạc trắng không có bào tử; các khuẩn ty cơ chất màu nâu; chất màu không hoà vào môi trường. Kiểu II: khuẩn lạc có những khuẩn ty màu trắng, phát triển yếu; khuẩn ty cơ chất cũng có màu nâu. Khuẩn lạc kiểu I cho hoạt lự cao, kiểu II thường xuyên cho hoạt tính kháng sinh thấp. Vì vậy cần phải tách những khuẩn lạc kiểu I trên môi trường này và thường xuyên kiểm tra để chọn những khuẩn lạc có hoạt lực cao, giữ được đặc tính của giống.
Chủng penicillium được nuôi cấy trên đĩa petri
Các chủng penicillium ở các giai đoạn phát triển khác nhau Những chủng Penicillium thường có hoạt lực cao lại kém ổn định. Đặc tính này đặt cho những nhà vi sinh vật một nhiệm vụ khó khăn: tạo được khả năng sinh kháng sinh cao nhất, giữ được ổn định trong quá trình nghiên cứu và sản xuất. Nhiệm vụ này có một ý nghĩa rất lớn trong công nghiệp .các giống này bảo vệ ở kệ, ở trạng thái đông khô có thể tới ba năm, ở đất vô trùng là hai năm. Ngày nay nhờ di truyền học đã tạo được những giống ổn định, ít nhất sau sáu thế hệ không giảm hoạt tính kháng sinh. Chúng ta cần phải nhận thức rằng các nấm penicillium thường dễ biến đổi về hình thái và giảm khả năng sinh kháng sinh. Khi xảy ra biến đổi thì sẽ sinh ra hàng loạt những chủng mới từ giống cơ bản và nhiệm vụ của các nhà vi sinh vật lúc này là phải chọn lại những khuẩn lạc khoẻ có nhiều ưu điểm, tiếp theo cần phải tiến hành những biện pháp bảo quản thích hợp. Trong quá trình nuôi cấy chìm nấm Penicillium chrysogenum trải qua sáu giai đoạn phát triển: Giai đoạn I: Các bào tử nấm mốc nảy mầm, phát triển thành chồi nhỏ, tế bào chất chưa phân hoá. Thỉnh thoảng không bào có những hạt nhỏ bắt màu đỏ trung tính. Giai đoạn II: Khuẩn ty phát triển, tế bào chất ưa kiềm, những hạt nhỏ trong không bào dần dần biến mất. Ở cuối giai đoạn này xuất hiện những giọt chất béo nhỏ. Giai đoạn III: Tạo thành những giọt chất béo to, không còn không bào, tế bào chất rất ưa kiềm. Giai đoạn IV: Xuất hiện không bào với những hạt dễ bắt màu đỏ trung tính, những hạt chất béo nhỏ hơn ở giai đoạn III, tính ưa kiềm giảm. Giai đoạn V: Khuẩn ty có hình trống và có chứa những không bào,ở giữa có một hoặc một vài hạt lớn. Các hạt chất béo biến mất. Tính ưa kiềm tiếp tục giảm. Giai đoạn VI: Khuẩn ty vẫn giữ được dạng hình trống nhưng không còn những hạt bắt màu trung tính, các không bào bắt màu da cam hoặc màu hồng đồng đều. Các hạt chất béo không còn. Xuất hiện những tế bào riêng biệt bắt đầu tự phân. Quá trình lên men penicillin cũng thuộc vào loại lên men hai pha: pha sinh trưởng (ứng với những giai đoạn phát triển I, II, III) và pha sinh penicillin (ứng với những giai đoạn IV, V, VI). Nguồn carbon trong lên men penicillin bằng nấm Penicillium chrysogenum có thể là glucoza, sacaroza, lactoza, tinh bột, dextrin, các axit hữu cơ (lactic, axetic, formic), các axit amin…đường lactoza cho hiệu suất penicillin cao nhất và thường được dùng trong công nghiệp. Nấm thường sử dụng đường lactoza chậm. Vì vậy, trong thực tế lactoza được dùng phối hợp cùng đường khác (glucoza, sacaroza…) trong môi trường dinh dưỡng. Trong pha lên men thứ nhất giống phát triển mạnh, sử dụng glucoza và axit lactic của cao ngô. Sa đó lactoza mới được sử dụng (chủ yếu trong pha tạo penicillin). Khi trong môi trường cạn lactoza và không bổ sung các chất dinh dưỡng, hệ sợi nấm bắt đầu tự phân, nếu tiếp tục lên men nồng độ penicillin sẽ giảm, trong thực tế sản xuất cần phải kết thúc lên men trước thời điểm này. Nguồn nitơ dùng trong sinh tổng hợp penicillin có thể là những hợp chất hữu cơ (axit amin, pepton, protein) và vô cơ (amoniac, các muối amon và nitrat).Amoniac được nấm penicillium chrysogenum đồng hoá nhanh hơn cả. Trong quá trình nuôi cấy N-NH3 được tạo thành từ cao ngô do phản ứng khử amin các hợp chất nitơ. Nấm mốc sử dụng N-NH3 trước tiên và nồng độ của chất này trong thời gian đầu tăng lên, vì tốc độ tạo thành nó nhanh hơn tốc độ sử dụng, tiếp theo đó được giảm rất nhanh cùng với tốc độ sinh trưởng, phát triển của nấm mốc và tiếp tục giảm cho đến khi hệ sợi của mốc bị tự phân. Tốc độ sử dụng amoniac phụ thuộc vào nguồn cacbon trong môi trường. Trong trường hợp nguồn cacbon là glucoza, sacaroza hoặc các nguồn cacbon dễ tiêu hoá khác, amoniac được sử dụng nhanh hơn khi môi trường có lactoza. Nitrat được nấm mốc đồng hoá khi trong môi trường không có nguồn nitơ hữu cơ. Lưu huỳnh có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp của nấm mốc. Nguồn lưu huỳnh thường dùng là muối sunfat của kali, natri và amon. Các chất này tham gia vào tổng hợp metionin, sixtin, biotin, tiamin…hoặc trạng thái liên kết yếu là tốt hơn cả. Nhiều công trình nghiên cứu cho biết, khi trong môi trường có mặt đồng thời L-sixtin và sunfat thì lưu huỳnh của axit amin này dễ đi vào phân tử penicillin hơn lưu huỳnh của các gốc sunfat. Song, dùng axit amin trong sản xuất không kinh tế cho nên người ta thường dùng tiosunfat natri (Na2S2O3). Lưu huỳnh của chất này rất dễ di động. Trong môi trường dinh dưỡng có tiosunfat cùng với cao ngô hiệu suất penicillin có thể tăng hai lần. Cơ chế biến đổi các hợp chất lưu huỳnh từ dạng oxy hoá sang dạng khử có thể theo sơ đồ của Arnstein (1954) như sau: Sunfat Sunfit Tiosunfit sixtin Trong tế bào sixtin dễ biến thành sixtein và ngược lại. Sixtein có một ý nhĩa lớn như một tác nhân khử nhờ nhóm sunfuhydrin ( -SH ). pH môi trường thích hợp cho penicillium chrysogenum phát triển nằm trong khoảng 6 - 6.5. Môi trường kiềm hoặc axit hơn đều làm cho mốc phát triển chậm. Trong quá trình lên men pH môi trường thay đổi tuỳ thuộc vào tốc độ sử dụng các hợp chất cacbon và N-NH3. III. Một số quá trình tổng hợp penicillin:
Sự tổng hợp và biến dưỡng penicillin
Sự tổng hợp penicillin N và deasetoxycephalosporin C PHAÀN II COÂNGNGHEÄ SAÛN XUAÁT I.Đặc điểm chung : Công nghệ lên men sản xuất penicillin mang nét đặc thù riêng của từng cơ sở sản xuất và các thông tin này rất hạn chế cung cấp công khai. Ngay cả bằng sáng chế cũng có giới hạn ở những công đoạn nhất định; vì vậy rất khó đưa ra công nghệ sản xuất công nghiệp. Theo hãng gist-brocades, tòan bộ dây chuyền chia làm 4 công đọan chính: Lên men sản xuất penicillin tự nhiên (thừơng thu penicillin V hay penicillin G). Xử lý dịch lên men tinh chế thu bán thành phẩm penicillin tự nhiên. Sản xuất các penicillin bán tổng hợp. Pha chế các loại thuốc kháng sinh. Quy trình lên men sản xuất penicillin II.Công nghệ sản xuất : Hiện nay người ta sản xuất penicillin theo hai phương pháp: Phương pháp lên men bề mặt. Phương pháp lên men chìm. 1. Phương pháp lên men bề mặt: Trong những năm 30 đến những năm 50 của thế kỷ XX, phương pháp nuôi cấy bề mặt được áp dụng rộng rãi để sản xuất kháng sinh từ nấm penicillin chrysogenum… a) Giống Penicillin chrysogenum: là nấm sợi đơn bào hở. Khi mới phát triển trong môi trường đặt thì tạo ra 2 khuẩn ty: khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty dinh dưỡng màu trắng. Sau 1 ngày nuôi cấy, các khuẩn ty chuyển sang màu xanh sám và đính bào tử bắt đầu xuất hiện. Thời gian này cũng xuất hiện một ít bào tử trần từ tiền bào tử nằm trong các đính bào tử. Các bào tử lần lượt tạo thành theo thời gian nuôi cấy và cuối cùng nấm penicillin có màu sẫm hơn.
Nấm sợi penicillium chrysogenum. Nấm penicillin: thuộc họ hiếu khí bắt buộc, do đó trong quá trình nuôi phải cung cấp khí liên tục. Phương pháp bảo quản được dùng nhiều nhất là phương pháp cấy truyền định kì trên thạch hàng tháng kết hợp với bảo quản lạnh, phương pháp bảo quản bằng hạt ngũ cốc bảo quản theo phương pháp đông khô cũng được sử dụng. b)Nguyên liệu: Cám và hạt ngũ cốc các lọai, nguyên liệu được bổ sung nước sao cho độ ẩm đạt 55-60%W và được hấp thanh trùng ở 121oC trong 30-45 phút. Ngay sau khi kết thúc thanh trùng, chúng được tải vào những khay hình chữ nhật có kích thước dài 1-1.2 m, rộng 0.6-0.8 m, cao 5-6 cm. Lớp môi trường cho vào đấy dày 2-3 cm để đảm bảo độ thóang khí trên tòan bộ bề mặt và mặt dưới của môi trường. Một số cơ sở dùng nguyên liệu là các hạt ngũ cốc thì lớp môi trường dày hơn (3-4 cm) do các hạt ngũ cốc tạo ra môi trường có độ thoáng khí hơn. Trong trường hợp cám quá mịn thì phải trộn thêm trấu xay nhỏ (thêm khoảng 20-25%) hoặc cùi bắp xay nhỏ trước khi thanh trùng. Để làm môi trường nhân giống, người ta cũng làm như trên. Chỉ có một điểm khác là sau khi làm ẩm môi trường đến độ ẩm nhất định, người ta phân phối chúng vào các dụng cụ thủy tinh (chai thủy tinh hay bình tam giác) với khối lượng bằng 1/5 hay 1/6 dung tích của dụng cụ, đậy kín bằng nút bông và thanh trùng ở 121oC(0.5 at) trong 30 phút rồi để nguội mới cấy giống. c)Quá trình nhân giống: bắt đầu từ giống có trong ống nghiệm. Trong các nhà máy, mỗi lần cấy truyền giống, người ta thường cấy làm 3 ống. Một ống dùng để kiểm tra trước khi sản xuất, một dùng để sản xuất và một dùng để bảo quản. Song song đó, người ta chuẩn bị một bình tam giác dung tích 200-250ml và chuẩn bị 50g môi trường. Môi trường được thanh trùng và làm nguội đến 30oC. Đổ 10ml đã thanh trùng và làm nguội vào ống giống, dùng que thủy tinh đánh cho bào tử hòa trộn vào nước. Bằng biện pháp vô trùng (thực hiện trong các tủ cấy vô trùng) chuyển toàn bộ vào bình tam giác trên, lắc cho thật đều rồi chuyển chúng sang tủ ấm30-37oc. Nuôi ở điều kiện này cho đến khi bào tử nấm xuất hiện và phát triển đều khắp môi trường. Ta gọi quá trình thực hiện như trên là quá trình nhân giống cấp 1.Cứ tiếp tục thực hiện ta có giống cấp 2, cấp 3 cho đến khi đủ 5-10% giống cho sản xuất. Cứ mỗi một cấp độ nhân giống từ cấp này sang cấp khác, khối lượng môi trường tăng từ 10-15 lần. Trong trường hợp vượt quá 1 ký người ta nuôi trên những khay. Trong công nghiệp sản xuất kháng sinh hiện nay, thường là dùng những chủng biến đổi gen. Công nghệ biến đổi gen đã tạo ra những chủng siêu tổng hợp kháng sinh. Theo Talaro (1993), từ chủng penicillin chrysogenum đầu tiên chỉ có khả năng sinh tổng hợp 6mg/l, hiện nay người ta đã có những chủng biến đổi gen từ chủng gốc có khả năng sinh tổng hợp 85000ng/l penicillin. d)Quá trình lên men: khi môi trường đã được khử trùng và làm nguội đến 30oC, tiến hành trộn giống với tỉ lệ 5-10%. Các khay được xếp chồng lên nhau trên những giá đỡ với khoảng cách nhất định để thoáng khí và thoáng nhiệt. Nấm penicillium trong quá trình phát triển thường tạo ít nhiệt hơn nấm Aspergillus. Tuy nhiên, để tăng cường khả năng phát triển và sinh tổng hợp, người ta thường thổi khí bằng quạt gió có lắp hệ thống làm sạch. Quá trình lên men kéo dài 6-7 ngày ở 24-28oC. Trong lên men bề mặt, người ta sử dụng môi trường lỏng. Môi trường lỏng dùng trong nuôi cấy bề mặt thu nhận penicillin bao gồm: Cao ngô (bắp) 50g Lactose 30g NaNO3 3g KH2PO4 0.5g MgSO4 0.25g C6H5CH2COOH 0.2g ZnSO4 0.044g Nước 1000ml  Dung dịch lên men được khử trùng ở 121oC (0.5 at) trong 30 phút, được phân khối vào các khay giống các khay nuôi cấy bề mặt với môi trường bán rắn. Ở đáy các khay này không được đục lỗ vì phải chứa môi trường lỏng. Chiều cao của dung dịch môi trường trong các khay là 3-4 cm. Người ta cũng tiến hành lên men trong khoảng thời gian là 6-7 ngày ở nhiệt độ lên men là 24-28oC. Váng nấm sợi được giữ lại sau khi đã rút hết dịch lên men, được tiếp tục sử dụng cho những lần lên men kế tiếp. Ở những lần lên mentiếp theo người ta chỉ đổ thêm dịch lên men vào. Các thí nghiệm cho thấy chỉ nên sử dụng lại 3-4 lần, vì những lần sau hiệu suất thu nhận kháng sinh sẽ giảm dần.
Khu vực lên men sản xuất penicillin. 2.Phương pháp lên men chìm: Phương pháp lên men chìm là phương pháp được áp dụng nhiều từ những năm 1950 trở lai đây, thay thế dần phương pháp nuôi cấy bề mặt (trong những năm gần đây thế giới lại quan tâm đến phương pháp nuôi cấy bề mặt vì nó có nhiều ưu điểm) Trong phương pháp nuôi cấy chìm hay lên men chìm, người ta thường sử dụng môi trường lỏng. Để làm môi trường lỏng, người ta dùng cao ngô, glucose, hydrol, lactose, các muối amon, thiosunfat, photphat kali hoặc natri, các muối sunfat magiê, natri, đồng… a)Quá trình nhân giống: quá trình lên men chìm người ta nhân giống trong môi trường lỏng. Mục tiêu của quá trình nhân giống là thu nhận được số lượng tế bào cao (thường tính tổng lượng tế bào/ml). Môi trường nhân giống trong lên men penicillin khác với môi trường sản xuất là chúng không chứa lactose (nếu có chỉ cần một lượng nhỏ ), một số khoáng chất và tiền chất. Người ta thường nhân giống penicillium trong môi trường có thành phần sau: Cao ngô 2% Glucose2% lactose 0.5% Nitrat amon 0.125% Sunfat magiê0.025 sunfat natri 0.05% Kaliphotphat monoboric 0.2% CaCO3 0.5% Môi trường được thanh trùng ở 121oC trong thời gian 30 phút, để nguội và nhân giống. Quá trình nhân giống được bắt đầu bằng việc chuyển giống từ ống nghiệm sang bình tam giác đã chứa sẵn môi trường nhân giống. Người ta nhân giống vào các bình lên men với dung tích từ 1lít cho đến hàng ngàn lít. Dung tích ở những cấp độ nhân giống lớn, thiết bị càng giống với thiết bị sản xuất công nghiệp. Nhiệt độ trong quá trình nhân giống duy trì khoảng 26 ± 1oC và thời gian nhân giống ở mỗi cấp độ khoảng 72 giờ. Tuy nhiên nhiệt độ này không hoàn toàn cố định mà có sự thay đổi theo giống vi sinh vật mà ta áp dụng vào sản xuất. Khi nào ta thấy tổng số lượng tế bào mới bắt đầu đạt được lớn nhất thì ta đưa chúng sang giai đoạn sản xuất. b) quá trình lên men: Quá trình lên men trong môi trường lỏng bằng phương pháp lên men chìm để sản xuất penicillin trải qua hai pha: Pha thứ nhất: hệ sợi phát triển rất mạnh, hay còn gọi là pha sinh khối. trong pha này các chất dinh dưỡng dễ đồng hóa sẽ được tế bào nấm hấp thu rất mạnh. Tốc độ sinh sản của nấm xảy ra rất nhanh. Sự tạo thành penicillin mới bắt đầu. Pha thứ hai: hệ sợi phát triển chậm lại, pH tăng dần và đạt đến giá trị khoảng 7-7.5. Trong pha này penicillin được tạo ra với mức độ cực đại. Giống nấm mốc penicillin chrysogenum là loại hiếu khí bắt buộc. Hơn thế nữa quá trình tổng hợp penicillin xảy ra trong điều kiện hiếu khí mạnh. Do đó trong suốt quá trình lên men, việc thổi khí là điều hết sức cần thiết. Nhiệt độ nên duy trì khoảng 26 ± 1oC. pH duy trì ở 7-7.5 Chế độ thổi khí 1.2-1.5 thể tích/lít/phút. Trong lên men để sản xuất penicillin hiện nay người ta sử dụng nhiều loại môi trường khác nhau, tùy theo giống penicilium được sử dụng. Một số môi trường thường được sử dụng: STT  Thành phần  Môi trường 1  Môi trường 2  Môi trường 3   1  Cao ngô  2.0-2.4  -  2.0-3.0   2  Khô hạt có dầu (lạc, đậu tương hứơng dương)  -  2.0-2.4    3  Lactose  5.0  5.0  1.0   4  Glucose hoặc hydol  1.0  1.0  1.0   5  Dầu thực vật  0.5-1.0  0.5-1.0  2.5-3.5   6  Amon nitrat  0.4  0.4  0.4   7  Sulfat natri  0.05  0.05  0.05   8  Kali photphat  0.4  0.4  0.4   9  Magie sulfat  0.025  0.025  0.25   10  Natri hyposunfit  0.2  0.2  0.2   11  Canxi cacbonat  0.5-1.0  0.5-1.0  0.5-1.0   12  Tiên chất  0.2-0.4  0.3-0.4  0.3-0.4   Môi trường được thanh trùng ở 121oC trong 30 phút, sau đó làm nguội và tiếp giống từ quá trình nhân giống vào. Quá trình này được đảm bảo ở tính vô trùng. Hiệu xuất thu nhận penicillin phụ thuộc vào lượng sinh khối có trong môi trường. Nhiều kết quả cho thấy khi penicillium phát triển mạnh, tạo nhiều sinh khối thì hàm lượng penicillin thu được sẽ nhiều. Do đó các muối dinh dưỡng phải được cung cấp đầy đủ. Mặt khác, còn cần cung cấp nhiều oxy vì nấm penicillin rất cần oxy ở dạng hòa tan để phát triển. Lượng oxy phụ thuộc rất nhiều vào lượng các chất dinh dưỡng. Mối quan hệ này thường tỷ lệ thuận với nhau. Để thu được 100 kg muối natri của penicillin G cần phải cung cấp: 1200 kg đường  60 kg dầu mơ  770 kg cao ngô   220 kg axit phenylaxetic  100kg axitphennylaccetic    3000kw giờ điện  4000 m3 hơi nước  50000 m3 không khí   III. Thu nhận và tinh chế kháng sinh: Có ba phương pháp thu nhân và tinh chế kháng sinh penicillin từ môi trường nuôi cấy (cả phương pháp bề mặt và phương pháp chìm): Trích ly bằng dung môi hữa cơ. Hấp thu. Trao đổi ion. Trong ba phương pháp trên, phương pháp chiết bằng dung môi hữa cơ được sử dụng nhiều hơn cả. Phương pháp này dựa trên những đặc điểm sau: Muối của penicillin rất dễ tan trong nước Axit penicillin rất dễ tan trong dung môi hữa cơ. Quá trình chiết bằng dung môi hữa cơ được thực hiện qua hai giai đoạn: Giai đoạn thứ nhất: Trộn nước và dung môi để tăng bề mặt tiếp xúc. Làm như vậy để các phân tử kháng sinh tiếp xúc chặt chẽ với dung môi. Tiến hành khuấy liên tục để đảm bảo quá trình tiếp xúc này đạt được mức độ cao nhất. Giai đoạn thứ hai: Sau khi tiếp xúc giữa kháng sinh và dung môi sẽ tao ra kết tủa. Để tách kết tủa khỏi dung dịch người ta tiến hành ly tâm.Phương pháp ly tâm vừa nhanh vừa có hiệu quả nhất. Trong các phòng thí nghiệm và cả trong sản xuất công nghiệp, người ta thường dùng các dung môi sau để tiến hành thu nhân kháng sinh: Các ancol: butanol, isopropanol, propanol. Các ester: acetate etyl, butyl, amyl. Các ceton: metyl etyl aceton, metyl butyl ceton. Các ete: ete isopropylic, dioxan. Benzen, phenol, pyridin, dicloetan, clorofoc. Kỹ thuật thu nhận kháng sinh ngày càng được cải tiến nhờ vào nhunf74 tiến bộ không ngừng của kỹ thuật vật lý. Một trong những phương pháp được sử dụng rất hiệu quả là phương pháp phân tán tĩnh điện. Phương pháp phân tán tĩnh điện thay thế cho phương pháp trích ly bằng dung môi hữa cơ. Do thành phần môi trường rất phước tạp nên sự di chuyển các phân tử penicillin tới dung môi rất khó khăn và xảy ra rất chậm. Phương pháp phân tán tĩnh điện nghiên cứu sự trộn dung môi hữu cơ và dịch lên men bằng cách sử dụng phương pháp phun tĩnh điện. Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng hiệu điện thế cao (lên đến 25 kV) để tạo những vi giọt của dung dịch chứa penicillin. Một số lượng rất lớn các vi giọt chuyển động rất nhanh. Kết quả là tạo ra được vận tốc chuyển động vật chất và tốc độ trích ly sẽ tăng nhanh. Các giọt được tạo ra bằng phương pháp này sẽ được tăng tốc qua dung môi hữu cơ và kết quả là vận tốc sẽ cao hơn. Mặt khác, các giọt tạo thành sẽ được tích điện trường, chúng sẽ xếp thành hàng tùy theo sử phân cực và lực hấp dẫn giống như lực hấp dẫn giữa hai cực nam châm, do đó lam tăng khả năng hội tụ của các hạt và kết quả là rút ngắn thời gian tách dung môi ra khỏi dung dịch lên men sau khi trích ly hoàn toàn. Phương pháp này có những ưu điểm sau: Do thời gian thực hiện ngắn nên không làm thay đôi hoạt chất sinh hoc của vật chất cần thu nhận Giảm chi phí cho quá trình trích ly. PHAÀN III SAÛN PHAÅM Penicillin được xem là loại kháng sinh phổ thông, được sử dụng rộng rãi trong điều trị và được sản xuất ra với lượng lớn nhất trong số các kháng sinh đã biết hiện nay. Chúng tác dụng lên hầu hết các vi khuẩn Gram dương và thường được chỉ định điều trị trong các trường hợp viêm nhiễm do liên cầu khuẩn, tụ cầu khuẩn; thí dụ như viêm não, viêm tai-mũi-họng, viêm phế quản, viêm phổi, lậu cầu, nhiễm trùng máu… Hiện nay có nhiều penicillin. Một trong những loại kháng sinh sử dụng nhiều trong y học và được sản xuất nhiều là Benzylpenicillin (penicillin G) Kháng sinh Penicillin có công thức cấu tạo sau:
Trong công thức này, ta thấy Penicillin G được cấu tao bởi hai thành phần chính là vòng β-lactanithiazolidine kết hợp với phenylacetate. Kháng sinh penicillin có cấu trúc không gian như sau:
Hiện nay trên thị trường có bán các loại penicillin, bao gồm: Penicillin có nguồn gốc tự nhiên (do nấm sợi tạo ra). Penicillin tổng hợp. Penicillin bán tổng hợp. Penicillin G chỉ có khả năng chống vi khuẩn gram (+) và không chống được họ enterobacteriaceae và các chủng thuộc pseudomonas. I.Penicillin nhóm G: Đây là nhóm penicillin cổ điên, tìm thấy đầu tiên. Đa số trích từ nấm và một số bán tổng hợp. Các penicillin G có tác dụng với khuẩn gram dương và cầu khuẩn gram âm. Sau 60 năm sử dụng, penicillin G đã mất phần nào hiệu lực do tạo ra nhiều chủng lờn thuốc. Đa số penicillin G bị axit của dịch vị phá huỷ nên chỉ dùng để tiêm mà không uống. Thuốc chọn lọc để trị phế cầu, liên cầu, tụ cầu không tiết penicillinaz, clostridium, neisseria, khuẩn kỵ khí ở miệng, xoắn cầu. G.1 – Benzylpenicillin = Penicillin G: Bột màu trắng, mùi vị đặc biệt, dễ tan trong nước. Dung dịch thuốc dễ bị thuỷ phân. Chỉ pha khi dùng. Dược điển quy định dung dịch penicillin G chỉ được tồn trữ 3 ngày trong tủ lạnh.. Nhiệt độ càng cao càng dễ bị hỏng. G.2 –Penicillin G-procain: Đây là benzylpenicillin-procain có tac dụng chậm. Đặc chế: depocillin, allocillin, duracillin, hydracillin, luetopen, novocillin, solucillin. Bột trắng, không hút ẩm, ít tan trong nước. G.3 – Bipenicillin: Vì penicillin-procain khuếch tán chậm nên người ta kết hợp penicillin G với penicillin-procain để có tác dụng vừa tức thời vừa lâu bền. G.4 – Benzathin-penicillin: Benzathin-penicillin = benzathin-benzylpenicillin. Đặc chế: extencillin, benapen, leomypen, penadin, tardocillin. Kết hợp hai phân tử penicillin G với một phân tử dibenzyl-ethylen diamin. G.5 – Benethamin-penicillin. Bột kết tinh, ít tan trong nước. Tác dụng chậm trung bình. G.6 – Clemizol-penicillin: Đặc chế: largopenyl, neocural. Clemizol là chất kháng – histamin, nhưng muối clemizol của axit benzylpenicillinic là dạng thuốc tác dụng chậm. Sự hiện diện của clemizol làm giảm bớt dị ứng và ít nguy cơ gây tai biến. G.7 – penethacillin: Đặc chế: neopenyl, leocillin, estopen, bronchocillin. Bột trắng, ít tan trong nước. G.8 – Penicillin V = phenomycillin = phenoxymethyl-penicillin: Đặc chế: oracillin, alphacillin, berocilli, calciopen K, icipen, isocillin, oracil, oragen, penigen, sumagen, bantogen, calcipen V, penavlon V. G.9 – Phenethicillin=phenoxyethyl penicillin: Đặc chế: broxil, chemipen, maxipen, syncillin. G.10 – Propicillin=phenoxypropyl penicillin: Đặc chế: baycillin. G.11 – Clometocillin: Tác dụng lâu dài hơn các penicillin uống khác. II.Penicillin nhóm M (lấy meticillin làm căn bản). Năm 1957, J.C.Sheeham đã tổng hợp được penicillin. Năm 1959, Doyle và Robinson đã đưa vào sản xuất công nghiệp. Bằng cáhc thay đổ dây ngang R, người ta tìm được nhiều chất mới có hoạt phổ rộng, ít gây trở ngại khi dùng, ít tạo chủng đề kháng…Điều đáng chú ý nhất là tổng hợp được các chất kháng penicillinaz do tụ cầu tiết ra, và những penicillin uống tốt hơn penicillin V. Penicillin nhóm M có hai chất chính là meticillin và cloxalin. Chúng không bị hủy bởi penicillinaz. Do đó các chất này thường dùng để trị các bệnh tụ cầu. Tuy nhiên khoảng 20-25% chủng tụ cầu vẫn đề kháng với penicillin nhóm M, ấy là do đề kháng nhiễm thể. Do đó các penicillin này vẫn chưa có giá trị tuyệt đối với tụ cầu. Hiệu lực kháng khuẩn chỉ bằng 1/10 penicillin G với các khuẩn nhậy cảm penicillin Oxacillin, cloxacillin, dicloxacillin ít độc tính thận hơn meticillin. Meticillin chỉ dùng tiêm, các chất khác uống được. II.Penicillin nhóm A (lấy ampicillin làm căn bản). Đây là penicillin bán tổng hợp. Hoạt phổ rộng hơn các penicillin trước kia: diệt được các khuẩn gram dương và âm, cầu khuẩn gram âm, nhưng lại trị không hữu hiệu tụ cầu. Người ta chia làm ba nhóm nhỏ: Aminopenicillin: amicillin và dẫn chất. Carboxypenicillin: carbonicillin và dẫn chất. Ureidopenicillin và imidinopenicillin. Tài liệu tham khảo: Lương Đức Phẩm, Hồ Sưởng Vi Sinh tổng hợp Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật – 1978. Nguyễn Văn Lượng Công nghệ Vi Sinh Vật, tập 2. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia, 2002 Ds Bùi Kim Tùng Dùng thuốc kháng sinh-an toàn và cônh dụng. Nhà xuất bản Đại học y dược, 1998. J. Harvey and L Mason. The Use and Misuse of Antibiotics in Agriculture. Gray, William D. The Relation of Fungi to Human Affairs. Jacobs, Francine. Breakthrough: The True Story of Penicillin. Phát hành và chụi trách nhiệm: www.08sh1n.uni.cc Mọi chi tiết xin liên hệ: admin08sh1n@gmail.com www.08sh1n.uni.cc Công nghệ sản xuất Penicilin admin08sh1n@gmail.com