Công nghệ sinh học - Đề tài: Test kit

 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG TIỂU LUẬN MÔN: NHẬP MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Đề tài: Test Kit Nhóm 8 Chiều thứ 6, tiết 11-12 GVHD: Trần Hoàng Ngâu Tp Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2016 DANH SÁCH THÀNH VIÊN VÀ PHÂN CÔNG NHIỆM VỤ Họ và tên MSSV Nhiệm vụ Ghi chú Phan Thị Băng Trâm 2008130142 -Tìm phần khái niệm và phương pháp miễn dịch -Tổng hợp Nhóm trưởng Hoàn thành Trần Hoài Nam 2008130116 -Tìm phần phương pháp miễn dịch Hoàn thành Nguyễn Cao Thủy Tiên 2008140314 -Tìm phần phương pháp phân tử Hoàn thành Vũ Thị Xuân Hiền 2008140083 -Tìm phần phương pháp phân tử Hoàn thành MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU Trong cuộc sống hiện đại, việc bảo vệ sức khỏe đang là một vấn đề hết sức được quan tâm. Vì thế việc sử dụng một công cụ để có thể dễ dàng hơn trong việc dự đoán về những căn bệnh hay vấn đề thường gặp là rất cần thiết. Test kit là bộ công cụ như thế. Thuật ngữ “test kit” không được dùng phổ biến, thế nhưng khi nhắc tới những sản phẩm của nó thì lại rất quen thuộc. Test kit được dùng trong rất nhiều lĩnh vực trong cả công nghiệp hay nông nghiệp. Ngoài những loại test kit gần gũi mà ta đã biết thì bài viết này sẽ trình bày thêm một số loại mới. Hơn nữa, bài viết còn đề cập tới cơ chế hoạt động chung của một số loại test kit - những loại liên quan tới ngành công nghệ sinh học và y dược. Bài viết sẽ làm rõ những một số vấn đề liên quan tới test kit để ta có thể hiểu rõ hơn về công dụng và cơ chế của chúng. Qua đó, chúng ta có thể chọn cho mình bộ test phù hợp để sử dụng. Bài viết bao gồm các phần: Khái niệm và phân loại. Sự phát triển của test kit. Cơ chế chẩn đoán miễn dịch và ứng dụng Cơ chế chẩn đoán phân tử và ứng dung Bài viết tham khảo nhiều tài liệu khác nhau nên chắc chắn sẽ có thiếu sót. Mong nhận được sự thông cảm và góp ý. Xin cảm ơn! NỘI DUNG Khái niệm và phân loại: Khái niệm: Test kit được hiểu nôm na là bộ kiểm tra. Nó là một bộ công cụ để kiểm tra một vấn đề cụ thể nào đó bằng cách lấy một lượng nhỏ mẫu và chờ xem kết quả trong một thời gian ngắn. Tesst kit không chỉ là những sản phẩm nhỏ gọn được bán ra ngoài thị trường như ta đã thấy mà những bộ kiểm tra/chẩn đoán trong bệnh viện hay phòng thí nghiệm cũng gọi là test kit. Hiện nay chúng được thiết kế nhỏ gọn, dễ sử dụng, độ chính xác khá cao. Những sản phẩm đưa ra thị trường nước ta chỉ là một phần nhỏ và thông dụng như que thử thai, đo pH, test nhóm máu, test nước, hóa chất trong thực phẩm Nhưng ở các nước phát triển thì còn có các loại test kit phát hiện một số bệnh như tiểu đường, viêm gan B/C, test vi khuẩn, test DNA, thuốcthậm chí là test HIV. Phân loại: Có nhiều phương pháp sử dụng trong test kit, nhưng phương pháp phổ biến sử dụng trong ngành công nghệ sinh học và y dược cũng như các ngành khác là phương pháp chẩn đoán phân tử và phương pháp chẩn đoán miễn dịch Phân lập Phương pháp phân tử hoặc miễn dịch Xết nghiệm phân tử: tìm gen gây nguồn bệnh chính,lai hóa nucleic acid, PCR Lấy mẫu máu, phân, nước tiểu, sinh thiết Tăng sinh vi sinh vật Bổ sung môi trường phù hợp Người bị nghi nhiễm bệnh Nhận dạng thông qua sự phụ thuộc tăng trương, miễn dịch hoăc phân tử Xét nghiệm kháng thể: tìm kháng nguyên của vi sinh vật/virus, sử dụng kháng thể huỳnh quang, EIA Phương pháp chẩn đoán miễn dịch, điển hình là ELISA: Test kit ELISA giúp cung cấp kết quả chính xác, nhạy cảm và nhất quán. Mỗi đầu dò protein được nghiên cứu và các bộ dụng cụ được điều chỉnh để cung cấp đọ nhạy cảm về mặt sinh lý có liên quan. Ngoài ra, bộ dụng cụ được xác nhận sử dụng các loại mẫu phổ biến, bao gồm huyết thanh, huyết tương và dịch nổi nuôi cấy tế bào. Lysates (dịch phân giải) di động được sử dụng để xác nhận bộ dụng cụ phát hiện các protein truyền tín hiệu hoặc phosphoryl hóa. Ưu điểm của những bộ kit ELISA: Dùng trên 800 đối tượng khác nhau. Tối ưu hóa cho hiệu suất nhạy, chính xác và nhất quán. Kết quả có trong 2,5 - 4h. Xác định với nhiều loại mẫu. Phương pháp chẩn đoán phân tử, điển hình là PCR và RT-PCR: Từ một khuôn DNA rất nhỏ như giot máu, sợi tóc hay một tế báo người ta có thể khuếch đại chính xác, trật tự lớn lên đến hàng triệu bản nhằm phục vụ cho quá trình khảo sát trong phản ứng PCR được ứng dụng rất rộng rãi trong y học : chẩn đoán bệnh ung thư (tìm HPV trong ung thư cổ tử cung, gen APC trong ung thư đại tràng, gen BRC1 – BRCA2 trong ung thư vú, gen TPMT trong bệnh bạch cầu trẻ em, gen NF-1,2 trong u xơ thần kinh), nghiên cứu kháng nguyên bạch cầu người. Trong vi sinh vật thì PCR là một phương tiên hưu dụng để phát hiện tác nhân gây bệnh. Sự phát triển của test kit: 1960s and earlier Phát hiện nhiều dấu ấn sinh học và xét nghiệm chẩn đoán bệnh hoặc mầm bệnh. Xét nghiệm miễn dịch phát triển 1980’s to 1990’s Những công ty dược bán và mua những công ty chẩn đoán, hơp nhất thành những đối thủ lớn 1983 Công nghệ PCR sử dụng nhiệt và Tag polymerase enzyme để khuếch đại đoạn DNA, đây là công cụ chính trong nghiên cứu công nghệ sinh học và phát triển trên toàn thế giới 1991 Ra những sản phẩm microarray 1997 FDA phê chuẩn việc bán các thuốc thử cần phân tích cho các phòng thí nghiệm được ủy quyền 2000 Hoàn thành công trình nghiên cứu bộ gen người. Phòng thí nghiệm tự động, công nghệ microaray tăng, được thương mại hóa 2002 Khởi động đề án bản đồ haplotype (SNPs)(dự án HAPMAP) 2003 FDA tổng hợp những hướng dẫn để sử dụng markers sinh học trong những thử nghiệm lâm sàng. Biểu đồ về sự phát triển của thị trường chẩn đoán trong ống nghiệm (IDV) toàn cầu năm 2012, tỉ lệ các nhu cầu cầu chẩn đoán (theo Genetic Engineering News) Top 10 công ty IVD (in vitro diagnostics) có doanh thu lớn năm 2007(theo top 10 Global In-vitro Diagnostics của Business Insights) Cơ chế chẩn đoán miễn dịch: Bản chất của sự kết hợp của kháng nguyên và kháng thể: Sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể phụ thuộc vào cấu trúc bề mặt của kháng nguyên và kháng thể. Sự kết hợp này xảy ra giữa một phần rất giwois hạn giữa phần tử kháng nguyên (nhóm quyết định) và một phần rất giới hạn của phần tử kháng thể (trung tâm hoạt động). Theo Pauling, phẩn tử kháng thể thường hóa tri hai, nghĩa cùng một lúc có thể kết hợp với hai phần tử kháng nguyên. Còn kháng nguyên đa hóa trị nên cùng lúc có thể kết hợp với rất nhiều phần tử kháng thể. Cho nên kháng nguyên và kháng thể có thể kết hợp với nhau tạo thành một phức hợp hình mạng lưới trong khong gian ba chiều. Vì kích thước quá lớn nên phức hợp kết tủa hoặc ngưng kết. Kháng nguyên và kháng thể có thể kết hợp với nhau theo bất cứ tỉ lệ nào nhưng phản ứng yếu đi nếu thừa hoăc thiếu kháng nguyên hoặc kháng thể. Phản ứng rõ rệt nhất lúc số phân tử kháng nguyên tương đương với phân tử kháng thể. Sự kết hợp giữa phần tử kháng nguyên và kháng thể xảy ra nhờ các lực như: lực liên kết ion giữa các nguyên tử hoặc các nhóm hóa học mang điện tích trái dấu; lực liên kết của các cầu nối hydro giữa các nguyên tử hydro mang điện tích dương với các nguyên tử mang điện tích âm, lực Van der Walls giữa hai phân tử phụ thuôc vào tương tác giữa các đám mây điện tử ở mặt ngoài và lực ố thủy nếu diện tiếp xúc cả phía kháng nguyên và kháng thể đều có các acid amine ố thủy thì kháng nguyên và kháng thể kết hợp, nước sẽ bị đẩy ra tạo nên lưc gắn kết giữa các acid amine ố thủy đó, sự kết hợp này không phải là một phản ứng hóa học. Phản ứng kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể rất đặc hiệu. Một kháng nguyên chỉ kết hợp với kháng thể do nó kích thích cơ thể tạo thành. Do đó phản ứng kết hợp kháng nguyên và kháng thể được sử dụng để xác định kháng nguyên hoặc kháng thể nếu một trong hai phân tử đã biết. Hiệu giá của kháng thể trong huyết thành người hoặc động vật có thể xác định nhờ kháng nguyên đã biết và do đó cho biết sự tiếp xúc trước đó với kháng nguyên. Ngược lại nhờ kháng thể đã biết những kháng nguyên khác nhau của một vi sinh vật có thể nhận mặt. Mặt khác sự hiểu biết cấu tạo kháng nguyên cho phép lựa chọn thích đáng vi sinh vật dùng để làm vaccine phòng ngừa bệnh nhiễm trùng. Phương pháp ELISA: ELISA (Enzyme – Linked ImmunoSorbent Assay) là một kỹ thuật sinh hóa dùng để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫ cần phân tích. Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm thực phẩm. Nguyên tắc: Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện. Phương pháp này được thiết kế cho việc phát hiện và định lượng vật chất như peptides, protein, antibodies, hormone, Đôi khi nó còn được gọi bởi một tên gọi khác là EIA (Enzyme ImmunoAssay) Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml). So với kĩ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA- Radio Immuno Assay) thì kĩ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn mà vẫn đảm bảo độ chính xác như nhau. ELISA được dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh như virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh. Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên, kháng thể và chất tạo màu; thực hiện qua hai bước: - Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể - Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng oxy nguyên tử [O] từ H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm. (Trích  từ Chemicon International) Phân loại ELISA: Direct ELISA (ELISA trực tiếp)  Direct ELISA: Đây là dạng đơn giản nhất của phương pháp ELISA. Trong đó, kháng nguyên cần phát hiện sẽ được gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể và sẽ được phát hiện bằng một kháng thể duy nhất (kháng thể này đã được gắn enzyme). Sơ đồ: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA trực tiếp - Ưu điểm: Đơn giản nhất - Nhược điểm: + Độ đặc hiệu bị giới hạn vì thường thì kháng nguyên có ít nhất là 2 epitope (trình diện kháng nguyên) mà phương pháp này chỉ sử dụng 1 kháng thể gắn vào một epitope. + Phải đánh dấu cho từng kháng thể chuyên biệt với từng đối tượng. ELISA gián tiếp  Indirect ELISA: Phương pháp này khác Direct ELISA ở chỗ kháng thể bắt kháng nguyên không được gắn enzyme mà nó là mục tiêu gắn đặc hiệu của một kháng thể khác (kháng thể này mới là kháng thể được gắn với enzyme). Sơ đồ : Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA gián tiếp - Ưu điểm: Kháng thể gắn enzyme có thể sử dụng để đánh dấu cho nhiều loại kháng nguyên nên tiện lợi và kinh tế hơn, dễ dàng thương mại hóa. - Nhược điểm: Độ đặc hiệu của từng kháng huyết thanh là khác nhau. Điều này dẫn đến kết quả khác nhau giữa các thí nghiệm và do đó cần phải thử nghiệm với nhiều kháng huyết thanh khác nhau để kết quả có thể tin tưởng được. 3.3. Sandwich ELISA Đây là một dạng ELISA được sử dụng phổ biến nhất trong thực tiễn do nó cho phản ứng mạnh và nhạy. Được gọi là “sandwich” là do kết quả thí nghiệm được đánh giá thông qua sự kết hợp của hai loại kháng thể là kháng thể bắt (capture antibodies) và kháng thể phát hiện (detection antibodies).  Kỹ thuật này cũng được phân làm hai dạng là Direct sandwich ELISA (DAS-ELISA - Double antibody sandwich) và Indirect sandwich ELISA (TAS-ELISA – Triple antibody sandwich). DAS ELISA gồm sự dính thụ động của kháng thể vào pha rắn (đáy giếng). Những kháng thể này sau đó kết hợp với các kháng nguyên được thêm vào. Những kháng nguyên được pha loãng trong blocking buffer nhằm ngăn sự dính không chuyên biệt của chúng vào pha rắn. Ở đây, những phần của blocking buffer không nên chứa bất kỳ kháng nguyên nào mà có thể kết hợp với kháng thể bắt. Sau khi ủ và rửa, chỉ còn phức hợp kháng nguyên - kháng thể dính vào pha rắn.  Kháng thể bắt sau đó được thêm vào. Do vậy, đây là sự kết hợp trực tiếp với kháng nguyên đích và kháng thể bắt. Kháng thể thứ hai này có thể giống kháng thể một hoặc khác về nguồn động vật hay loài động vật sản xuất kháng thể. Sau khi ủ, rửa, thêm cơ chất vào và đọc trên máy đo quang phổ. Vì sử dụng một kháng thể gắn kết với enzyme nên hệ thống bị giới hạn về tính chuyên biệt và những thành phần gắn liền với kháng thể chuyên biệt. Điều này giới hạn sự linh hoạt của phương pháp, ví dụ như mỗi kháng thể được sử dụng phải được đánh dấu riêng (cho những kháng nguyên khác nhau). Theo cách này, direct ELISA bị giới hạn về sự chuẩn bị kháng thể. Hệ thống cũng bị giới hạn ở chỗ kháng nguyên phải có ít nhất hai epitope vì cả hai kháng thể bắt và phát hiện đều kết hợp trực tiếp với kháng nguyên. Kháng thể bắt trên pha rắn và kháng thể phát hiện có thể chống lại những epitope khác nhau trên phức hợp kháng nguyên. Do đó, thuận lợi khi khảo sát sự khác biệt nhỏ giữa những kháng nguyên nếu sử dụng kháng thể phát hiện và kháng thể bắt khác nhau. Việc sử dụng cùng một kháng thể bắt và phát hiện có thể dẫn đến vấn đề khi có giới hạn về vị trí gắn kết sẵn có cho sự phát hiện. Kích thước và mối quan hệ không gian của các epitope trên kháng nguyên đích là rất quan trọng và có thể ảnh hưởng mạnh đến thử nghiệm. Sandwich ELISA có thể được chia làm hai hệ thống: 3.3.1 Sandwich ELISA trực tiếp Sơ đồ :Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp - Ưu điểm: Có thể phát hiện sự khác biệt nhỏ giữa các kháng nguyên nếu sử dụng kháng thể bắt và kháng thể phát hiện khác nhau. - Vì phương pháp này có ưu điểm hơn hẳn những phương pháp khác mà chúng tôi chọn phương pháp này để chẩn đoán bệnh virus đang nghiên cứu. Chú ý: nếu sử dụng kháng thể bắt và kháng thể phát hiện giống nhau có thể dẫn đến vấn đề nếu có sự giới hạn vị trí kết hợp sẵn có để phát hiện. Mối quan hệ về kích thước và vị trí không gian của các epitope cũng có ảnh hưởng đến thử nghiệm. 3.3.2 Sandwich ELISA gián tiếp Sơ đồ: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA Sandwich gián tiếp Chuyên biệt hơn Direct sanwich ELISA do antispecies kháng thể được gắn enzyme không phản ứng với kháng thể bắt kháng nguyên. 3.4. Phản ứng ức chế /cạnh tranh Phản ứng cạnh tranh mang nghĩa là hai chất tham gia phản ứng cùng ái lực bắt cặp với chất thứ ba. Phản ứng cạnh tranh đúng đắn thì hai chất cạnh tranh phải được đưa vào đồng thời. Sự khác biệt giữa ức chế và cạnh tranh. Cả hai phản ứng đều có sự tham gia của hai kháng thể phản ứng với kháng nguyên. Nếu một kháng thể được ủ trước phản ứng đó được gọi là ức chế (blocking/ inhibition assays). Phản ứng cạnh tranh mang nghĩa cả hai kháng thể được thêm vàođồng thời với nhau (hình 1). Sự khác biệt giữa ức chế và cạnh tranh 3.4.1. Direct C-Elisa: Kiểm tra kháng nguyên Trong hệ thống trực tiếp, lượng kháng nguyên trên bề mặt đĩa và lượng kháng thể gắn enzyme đã được chuẩn độ để tối ưu. Kháng nguyên và kháng thể gắn enzyme được thêm vào đĩa cùng một lúc để tạo ưu thế cạnh tranh. Nếu kháng nguyên tương tự hoặc cùng như kháng nguyên đã được gắn trên đĩa thì kháng thể gắn enzyme sẽ gắn lên kháng nguyên này. Khi nồng độ của kháng nguyên cạnh tranh cao sẽ ngăn cản bất kỳ sự kết hợp của kháng thể gắn enzyme với kháng nguyên trên bề mặt đĩa (cạnh tranh 100%). Nếu nồng độ kháng nguyên cạnh tranh giảm (ví dụ : pha loãng) sự cạnh tranh sẽ giảm. Như vậy nồng độ kháng nguyên cạnh tranh càng cao thì độ hấp thu màu càng giảm. Kháng nguyên cạnh tranh có thể được thêm trực tiếp vào đĩa nếu nó được pha loãng trong blocking buffer trước khi thêm kháng thể gắn enzyme. Mức độ cạnh tranh theo thời gian phụ thuộc vào mối tương quan của nồng độ phân tử cần kiểm tra và kháng nguyên trên bề mặt đĩa (và mức độ tương đồng của kháng nguyên). Sau khi ủ và rửa, lượng kháng thể được đánh dấu được định lượng sau khi thêm cơ chất. khi không có kháng nguyên trong mẫu kiểm tra hay không có sự tương đồng của kháng nguyên thì không có sự gắn kết với kháng nguyên được đánh dấu và không có sự cạnh tranh với kháng nguyên này. Kết quả là mẫu có chứa kháng nguyên thì sự cạnh tranh làm giảm cường độ màu còn đối chứng âm thì không. Sơ đồ : Direct C-ELISA kiểm tra kháng nguyên 3.4.2. Direct C-Elisa: Kiểm tra kháng thể Direct C-ELISA kiểm tra kháng thể tương tự với Direct C-ELISA kiểm tra kháng thể. Sự cạnh tranh ở đây là giữa kháng thể trong mẫu và kháng thể được đánh dẫu với các vị trí trên kháng nguyên trên đĩa. Mẫu và kháng thể đánh dấu được trộn với nhau trước khi thêm vào đĩa. Sơ đồ : Direct C-ELISA kiểm tra kháng thể 4. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả ELISA  Nếu các đối chứng âm cho kết quả dương tính thì có thể do sự nhiễm từ chất tạo màu hoặc từ kháng thể được đánh dấu hoặc chính các đối chứng bị nhiễm. Nếu màu không xuất hiện đối với đối chứng dương hoặc đối với mẫu thì phải kiểm tra lại tất cả hoá chất bao gồm: hạn sử dụng, nồng độ, điều kiện bảo quản Nếu màu xuất hiện quá thấp đối với đối chứng dương và cả mẫu kiểm tra thì phải kiểm tra lại kháng thể được gắn enzyme và nồng độ của chất tạo màu. Nếu có tạo màu đối với mẫu nhưng không tạo màu với đối chứng dương thì có thể kiểm tra lại nguồn gốc đối chứng, hạn sử dụng và điều kiện bảo quản. Khi chạy lại một thử nghiệm trong điều kiện đang gặp sự cố thì chỉ nên thay đổi một yếu tố thí nghiệm. Kỹ thuật sắc kỹ miễn dịch: rất nhiều các test kit về bệnh hoặc dấu hiệu trong người hều hết đều cùng phương pháp này. Nguyên tắc: Phức hợp kháng kháng thể (KKT) gắn chất màu được phân bố đều trên bản giấy sắc ký. Kháng nguyên (KN) đặc thù của vi sinh vật được gắn cố định tại “vạch phản ứng”. Khi nhỏ huyết thanh cần xác định kháng thể (KT) lên bản sắc ký, KT đặc hiệu (nếu có) trong huyết thanh sẽ kết hợp với KKT gắn màu, phức hợp miễn dịch KT-KKT gắn màu này di chuyển trên giấy sắc ký sẽ bị giữ lại tại “vạch phản ứng” do KT kết hợp với KN vi sinh vật, kết quả “vạch phản ứng” hiện màu. Nếu trong huyết thanh không có KT đặc hiệu, ở “vạch phản ứng” KN không thể giữ được KKT gắn màu, vì vậy không hiện màu. Giới thiệu bộ test kit xét nghiệm chẩn đoán viêm gan B (HbsAg) bằng phương pháp sắc ký miễn dịch: + Nguyên lý: Kit thử chẩn đoán Viêm gan B (HBsAg) là dụng cụ xét nghiệm sắc ký miễn dịch định tính bằng phương pháp dòng chảy một chiều để phát hiện sự có mặt của kháng nguyên vi rút Viêm gan B trong huyết thanh hoặc huyết tương. Màng kit thử được phủ một lớp kháng thể kháng HBsAg ở vùng kết quả. Trong quá trình làm xét nghiệm, mẫu huyết thanh hoặc huyết tương phản ứng với các phần tử mang theo kháng thể kháng HBsAg. Hỗn hợp tạo thành thấm theo màng di chuyển hướng lên nhờ các mao dẫn, gặp và phản ứng kết tủa màu với các kháng thể kháng HBsAg trên lớp màng và tạo ra vạch màu. Sự có mặt của vạch màu ở vùng kết quả trên kit thử cho biết kết quả dương tính, ngược lại trong trường hợp không có vạch màu là kết quả âm tính. Nhằm mục đích kiểm tra quy trình thao tác xét nghiệm, một vạch màu luôn luôn xuất hiện tại vùng chứng (gọi là vạch chứng) để khẳng định rằng lượng mẫu đã đủ và lớp màng đã thấm tốt. + Kết quả: Dương tính: xuất hiện hai vạch đỏ rõ rệt: một ở vùng chứng gọi là vạch chứng (C), vạch kia ở vùng kết quả gọi là vạch kết quả (T). Lưu ý: độ đậm màu đỏ của vạch kết quả (T) sẽ khác nhau phụ thuộc vào nồng độ của HBsAg có trong mẫu phẩm. Vì vậy, bất cứ độ mờ nào ở vạch kết quả (T) cũng đều được coi là dương tính. Âm tính: xuất hiện chỉ một vạch chứng (C) . Không thấy xuất hiện vạch kết quả (T) dù đậm hay mờ. Kết qủa không có giá trị: không thấy xuất hiện vạch chứng (C). Nguyên nhân thường gặp là do lượng mẫu phẩm không đủ hoặc thao tác xét nghiệm sai. Đọc lại hướng dẫn và làm lại xét nghiệm bằng kit thử mới khác. Nếu như tình trạng vẫn như cũ, hãy liên lạc với đại lý phân phối để được giải đáp. Giới thiệu bộ test kit chẩn đoán HIV : + Nguyên lý: dựa trên nguyên tắc thử nghiệm sắc ký miễn dịch in vitro để xác định định tính kháng thể kháng HIV tuýp 1 và 2 trong huyết thanh, huyết tương hoặc máu toàn phần người. Khi thêm mẫu thử và mẫu pha loãng vào “sample pad”, mẫu sẽ di chuyển đến “conjugate pad” và tái hỗn dịch với phức hợp kháng nguyên HIV tuýp 1 và 2 - vàng cộng hợp đã làm khô trên “conjugate pad”. Hỗn hợp sẽ di chuyển dọc theo màng bằng hiện tượng mao dẫn và phản ứng với kháng nguyên HIV tuýp 1 và 2 đã giữ cố định trên vùng phản ứng (ký hiệu T). Nếu kháng thể kháng HIV có mặt đủ trong mẫu thử, vạch màu trong vùng T sẽ xuất hiện. Nếu không có hoặc kháng thể kháng HIV không đủ trong mẫu thử thì vùng T sẽ vẫn không màu. Mẫu thử tiếp tục di chuyển đến vùng chứng (ký hiệu C) và tạo thành vạch có màu đỏ hoặc tím, cho thấy thử nghiệm đã được tiến hành đúng, thích hợp và kết quả là có giá trị.  + Kết quả: âm tính: Nếu chỉ có 1 vạch xuất hiện ở vùng C. Dương tính: Nếu xuất hiện vạch ở cả vùng C và vùng T (1 và hoặc 2) chứng tỏ thử nghiệm dương tính. Không có giá trị chẩn đoán: Vùng C không xuất hiện vạch nào trong cửa sổ kết quả sau khi tiến hành thử nghiệm, thử nghiệm được xem như không có giá trị. Nguyên nhân có thể do các bước tiến hành không đúng hoặc que thử đã bị hư. Khuyến cáo thử nghiệm lại mẫu trên 1 que thử mới. Cơ chế chẩn đoán phân tử: Kỹ thuật PCR: Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) là phương pháp khuếch đai nhanh nhiều bản sao các đoạn DNA mà không qua tạo dòng. Phương pháp được thực hiện trong các eppendoff và trong thời gian ngắn ta có thê thu được rất nhiều bản sao DNA. Kỹ thuật này có thể được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực : chẩn đoán, xét nghiệm các tác nhân vi sinh gây bệnh, giải mã di truyền, tạo giống mới và các đột biến định hướng, nghiên cứu tiến hóa của sinh vật ở mức độ phân tử. Nói đến chẩn đoán bệnh, kỹ thuật này chủ yếu dùng trong các phòng xét nghiệm chứ chưa thông dụng ngoài thị trường. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR: là tạo lượng lớn các đoạn DNA đặc thù từ DNA khuôn dựa trên cơ sở hoạt động của DNA-polymerase để tổng hợp sợi mới bổ sung. Các yếu tố cơ bản để thực hiện phản ứng PCR bao gồm: - Sợi khuôn DNA chỉ cần biết trình tự nucleotide của đoạn nhỏ nằm cạnh đoạn cần nhân để thiết kế hai mồi oligonucleotide. - Hai đoạn mồi ngắn để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp DNA. Là tín hiệu chỉ hướng đi (5’ → 3’) của enzyme DNA-polymerase. Mồi dài khoảng 20 nucleotide và các nucleotide ở hai đầu của mồi không tự kết hợp với nhau theo nguyên tắc bổ sung. - Có đầy đủ các loại nucleotide dATP, dTTP, dGTP, dCTP. - Môi trường đệm cung cấp ion Mg và nước tinh khiết không có enzyme RNase và DNase. - Enzyme chịu nhiệt Thermus aquaticus (Taq) Dung tích tổng số cho một phản ứng PCR khoảng từ 20 µl đến 50µl. Đặc điểm của phản ứng PCR là chọn lọc, nhạy và nhanh Quy trình kỹ thuật: Bước 1 - Thực hiện qúa trình biến tính DNA bằng nhiệt Đưa DNA vào dung dịch phản ứng (gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép), tăng nhiệt độ của dung dịch lên tới 90÷98°C, thời gian lưu tương ứng khoảng từ 30s÷1 phút. Tại nhiệt độ này, các phân tử DNA mạch kép bị tách ra (do liên kết hydrô bị đứt), tạo nên các sợi đơn dùng để làm khuôn tổng hợp sợi mới. Bước 2 - Thực hiện phản ứng lai Sau bước 1, ngay lập tức nhiệt độ được hạ xuống từ từ và nhỏ hơn nhiệt độ Tm của mồi, vào khoảng 37÷68°C và thời gian lưu 30s÷1 phút. Bổ sung mồi để mồi bắt cặp với sợi khuôn. Mồi được tổng hợp hóa học, có mồi ngược và xuôi. Người ta còn có thể dựa vào trình tự nucleotide ở đầu 3’ của khuôn để tổng hợp mồi. Sau đó bổ sung DNA-polymerase để kéo dài mồi. Bước 3 - Tổng hợp mạch mới hay còn gọi là kéo dài (extension) Nâng nhiệt phản ứng lên 72°C trong vài chục giây đến 1 phút để DNA- polymerase tổng hợp sợi mới. Trong thực tế, thời gian và nhiệt độ phản ứng phụ thuộc vào sợi DNA cần khuếch đại. Kết thúc một chu kỳ từ một DNA kép mẹ tổng hợp 2 sợi DNA kép con. Cứ như vậy, phản ứng xảy ra trong 25 đến 40 chu kỳ. Sau chu kỳ cuối, nhiệt độ được duy trì ở 72°C trong khoảng từ 5 đến 10 phút sao cho tất cả các sợi đơn xoắn lại và tạo nên sản phẩm của PCR. Sau đó hạ xuống 4°C để bảo quản sản phẩm. Sản phẩm của PCR được kiểm tra bằng cách chạy điện di trên gel agarose nồng độ từ 0,8%÷2% để phát hiện sự đa hình của các đoạn DNA đặc thù, hoặc các đoạn DNA bị thay đổi do các tác nhân nào đó (đột biến, tái tổ hợp). Phương pháp RT-PCR (PCR ngược) Nguyên tắc cơ bản: Phản ứng RT-PCR thực chất là phản ứng nhân một đoạn giới hạn của khuôn RNA, theo nguyên lý của phản ứng PCR gồm có hai giai đoạn: Giai đoạn thứ nhất là sao chép RNA khuôn thành DNA sợi đôi nhờ hoạt động của enzyme sao chép ngược. Giai đoạn này được thực hiện ở 50÷55°C và thời gian là 30 phút. Giai đoạn 2 là dùng chính DNA vừa sao chép làm khuôn cho phản ứng PCR, quá trình được thực hiện theo ba bưóc như đã trình bày ở trên. Sau khi phản ứng kết thúc, sản phẩm của phản ứng PCR ngược được giảm xuống 4°C để bảo quản cho tới khi sử dụng. Để đánh giá và phát hiện sản phẩm PCR ngược người ta cũng điện di trên gel agarose 0,8÷1%. Và DNA chuẩn là DNA λ được cắt bởi enzyme HindIII có độ dài 23,1kb; 9,4kb; 6,5kb; 4,3kb. RT – PCR sử dụng đầu dò đánh dấu huỳnh quang (RT – PCR TaqMan) Sử dụng đầu dò mang chất huỳnh quang là một phương pháp chính xác và đáng tin cậy nhất, nhưng cũng đắt nhất. Nguyên lý của phương pháp này là các đầu dò chuyển năng lượng cộng hưởng huỳnh quang tới sản phẩm khuếch đại cần phát hiện (hiện tượng FRET). Đầu dò DNA hay RNA gắn đặc hiệu vào khu vực giữa hai đoạn mồi để định lượng chỉ những DNA chứa trình tự đầu dò, do vậy làm tăng đáng kể độ đặc hiệu, và thậm chí có thể cho phép định lượng khi có mặt cả một số sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu. Khả năng này còn cho phép làm thử nghiệm đa mồi khi sử dụng các đầu dò đặc hiệu đánh dấu các mầu khác nhau. Sơ đồ real-time PCR TaqMan Thông thường, đầu dò mang huỳnh quang ở một đầu (Reporter – 5’) và một chất chặn ở đầu kia (Quencher – 3’), vị trí gần nhau giữa chất mang và chất chặn làm thuốc nhuộm huỳnh quang truyền năng lượng tới chất chặn gần đó chứ không phát quang. Khi taq polymerase hoạt động, do enzyme này có hoạt tính 5’ – 3’ exonuclease nên đầu dò bị đánh bật khỏi khuôn mẫu, lúc này, trạng thái gần nhau giữa chất mang và chất chặn bị phá vỡ nên hiện tượng FRET không xảy ra nữa, chất huỳnh quang không còn bị chặn, ở trạng thái tự do nên phát quang và tín hiệu phát quang này sẽ được máy đo lạiỀ Sản phẩm đích tăng lên sau mỗi chu kỳ phản ứng thì lượng chất huỳnh quang tự do được giải phóng ra cũng tích tụ lại ngày càng nhiều. PCR được tiến hành bình thường, trừ việc thêm đầu dò có đánh dấu huỳnh quang; Khi phản ứng bắt đầu, ở giai đoạn gắn mồi của PCR, cả mồi và đầu dò đều gắn đặc hiệu vào DNA đích; Quá trình tổng hợp chuỗi được thực hiện từ vị trí các mồi, và khi taq polymerase chạm vào đầu dò thì hoạt tính 5’ – 3’ exonuclease của enzyme này phá hủy đầu dò, tách chất mang huỳnh quang khỏi chất chặn và do đó làm tăng lượng chất huỳnh quang ở dạng tự do. Chất huỳnh quang được đo bằng máy real-time PCR, lượng tăng trung bình nhân chất huỳnh quang tương ứng với lượng tăng cấp số mũ của sản phẩm và được sử dụng để xác định chu kỳ ngưỡng (Ct) của mỗi phản ứng. Một số phương pháp chẩn đoán phân tử khác: Phương pháp lai phân tử (Hydrid) Phương pháp lai là phương pháp khuếch đại tín hiệu được sử dụng phổ biến để phát hiện HPV (Human Papillomavirus), HCV (virus viêm gan C), trong bệnh phẩm, dựa sự phát quang bằng phản ứng hóa học của phức hợp gồm kháng thể bị bắt giữ -dung dịch lai và tín hiệu được khuếch đại. Hình phương pháp lai phân tử phát hiện HPV Ví dụ về các phương pháp lai trong các bộ test kit phát hiện HPV: Hệ xét nghiệm II bắt giữ thể lai (Hybrid Capture II Test System) Có nhiều phương pháp lai được ứng dụng phát hiện HPV nhưng kỹ thuật lai bắt giữ (Hybrid Capture technology) là kỹ thuật được ứng dụng phổ biến nhất. Kit ứng dụng kỹ thuật lai bắt giữ để phát hiện HPV thế hệ 2 (second-generation HPV detection kit-HCII) do tập đoàn Diegene công bố và được US FDA công nhận vào năm 1999 là kỹ thuật được sử dụng nhiều hơn trong lâm sàng. Nguyên tắc kỹ thuật dựa trên hiện tượng lai HPV DNA với đầu dò RNA đặc hiệu. Đầu dò RNA có thể được đánh dấu bằng phóng xạ hoặc không đánh dấu phóng xạ. Phức hợp lai DNA-RNA được phát hiện bởi kháng thể đặc hiệu đã gắn alkaline phosphatase trên máy miễn dịch huỳnh quang. Mỗi phức hợp lai sẽ phát một tín hiệu huỳnh quang (relative light unit - RLU), số lượng tín hiệu huỳnh quang tương ứng lượng DNA đích trong mẫu bệnh phẩm. Kit HCII sử dụng mồi DNA đặc hiệu 13 type HPV “nguy cơ cao”: HPV16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 59, 68 và 5 type HPV “nguy cơ thấp”: 6, 11, 42, 43, 44. Lai bắt giữ là xét nghiệm có độ nhạy cao và có khả năng phát hiện được 1pg/µl của DNA HPV16, tương ứng với 105 đoạn gen sao chép. Phương pháp lai Southern-blot Nguyên tắc lai Southern-blot dựa trên khả năng tiếp nhận DNA của màng lai nitrocellulose. Sự ra đời của phương pháp điện di trên gel đã cho phép phân tách các đoạn DNA được cắt bởi enzym cắt giới hạn dựa trên kích thước của chúng và phương pháp chuyển DNA từ gel sang màng lai nitrocellulose là cơ sở cho sự ra đời của phương pháp lai do E.M Southern mô tả năm 1975. Lai Southern-blot là phương pháp được ứng dụng sớm nhất trong phát hiện HPV. Đây là phương pháp có độ nhạy rất cao, cho phép phát hiện đoạn DNA đích sử dụng các mẫu dò được đánh dấu bằng phóng xạ (hệ thống phát hiện bằng enzym). Các điều kiện cho quá trình lai có thể được kiểm soát tại các thời điểm khác nhau trong hoặc sau quá trình lai bằng cách thay đổi nhiệt độ và nồng độ muối. Một số ứng dụng trong test kit: Bộ kit RT-PCR phát hiện virus gây bệnh đốm trắng ở tôm: người ta đã tách được một đoạn gen đặc hiệu của virus gây bệnh đốm trắng và thiết kế cặp mồi để nhân đoạn này lên. Sau đó điện di nếu thấy có băng thích hợp thì chắc chắn tôm đã bị nhiễm bệnh này. Bộ kit phát hiện virus zika: Kit có độ đặc hiệu cao, các mồi và trình tự bắt cặp có độ tương đồng 100% so với trình tự bộ gene của Virus Zika dựa trên sự phân tích kỹ lưỡng bộ gene của virus này. Bộ kit chẩn đoán virus HPV: có thể phát hiện 23 kiểu gen khác nhau của HPV thông qua phương pháp PCR kết hợp với phương pháp khác. KẾT LUẬN Sức khỏe ngày càng được quan tâm vì vậy sự phát triển của test kit là vô cùng cần thiết và quan trọng. Trên đây không phải là hầu hết các phương pháp dùng trong test kit, còn nhiều phương pháp khác, thậm chí là kết hợp nhiều phương pháp với nhau. Bài viết chỉ nêu được một phần trong số các phương pháp được sử dụng trong các quy trình hay trong các sản phẩm nhưng các phương pháp này là các phương pháp phổ biến dùng trong công nghệ sinh học và y dược. Có thể các phương pháp được nêu trên đây nêu chưa được đầy đủ nhưng cũng nói được phần quan trọng, giúp người đọc có thể hiểu được thế nào là test kit và chúng được sử dụng như thế nào, ở đâu. Ngoài ra, bài viết còn có một số sản phẩm cụ thể cho mỗi phương pháp, còn rất nhiều sản phẩm khác. Ở Việt Nam các loại test kit còn rất hạn chế về sản phẩm ra thị trường vì giá thành và cả nhu cầu kiểm tra sức khỏe của mọi người thường xuyên không cao bằng các nước phát triển. Hi vọng sẽ có những sản phẩm Test kit phù hợp với điều kiện nước ta hơn, cũng như mọi người có thể quan tâm hơn về những biến đổi trong cơ thể để nhanh chóng phát hiện và chữa trị. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Lê Văn Phùng (2001), Một số ứng dụng của PCR trong vi sinh vật. Tạp chí Y học thực hành 2011 2. Hoàng Văn Sơn (2002), Thành tự mới của sinh học phân tử trong ung thư học. Tạp chí Thông tin Y dược số 2. 3. Phạm Hùng Vân (1996), phản ứng chuỗi PCR, một cuộc cách mang trong sinh học phân tử 4. Nguyễn Lân Dũng, vi sinh vật học, NXB Giáo dục 1997 5. Genetic Engineering anh Biotechnology, ChoPra BL and Anwan N, 1990 6. Molecular Biotechnology, Glick BR and Jackj P, 1994 7. Phạm Thành Hổ, Di truyền học, NXB Giáo dục, 2000