Đánh giá biến lượng di truyền quần thể con lai cây cao su của tổ hợp lai PB260 x RO44/268 bằng kỹ thuật RAPD

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ------- o0o ------- KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ BIẾN LƢỢNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ CON LAI CÂY CAO SU CỦA TỔ HỢP LAI PB260 X RO44/268 BẰNG KỸ THUẬT RAPD Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: PHẠM NGỌC CHINH Tháng 08/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************** ĐÁNH GIÁ BIẾN LƢỢNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ CON LAI CÂY CAO SU CỦA TỔ HỢP LAI PB260 X RO44/268 BẰNG KỸ THUẬT RAPD Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. BÙI MINH TRÍ PHẠM NGỌC CHINH ThS. LẠI VĂN LÂM Khóa: 2003-2007 KS. TRẦN THANH Tháng 08/2007 iii LỜI CẢM TẠ Chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trường. Ban giám đốc Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực tập và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp . TS. Bùi Minh Trí, ThS. Lại Văn Lâm và KS. Trần Thanh đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận. KS. Vũ Thị Quỳnh Chi đã có những chỉ dẫn, động viên giúp tôi thực hiện tốt khóa luận này. ThS. Lê Mậu Túy/ Trưởng Bộ Môn Giống Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam cùng các cô chú, anh chị là cán bộ công nhân viên Bộ Môn Giống/Viện Nghiên Cứu Cao Su đã nhiệt tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực tập tại Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam. Những người bạn đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt những năm học cũng như thời gian thực tập tốt nghiệp. Và con xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ đã sinh thành, dưỡng dục con nên người, để con được như ngày hôm nay. iv TÓM TẮT PHẠM NGỌC CHINH, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2007. “ĐÁNH GIÁ BIẾN LƢỢNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ CON LAI CÂY CAO SU CỦA TỔ HỢP LAI PB260 x RO44/268 BẰNG KỸ THUẬT RAPD “ Giáo viên hƣớng dẫn: TS. BÙI MINH TRÍ ThS. LẠI VĂN LÂM KS. TRẦN THANH Cây cao su là cây công nghiệp cây có hiệu quả kinh tế cao, ổn định và góp phần cải thiện kinh tế, xã hội và môi trƣờng. Chính vì vậy, công tác cải tiến giống để phục vụ nhu cầu phát triển cây cao su là rất quan trọng. Tuy nhiên, sự giới hạn về nguồn gen ở các nƣớc châu Á đã gây trở ngại cho công tác chọn tạo giống cao su. Để khắc phục trở ngại này hiện nay, Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã đƣa nguồn gen cây cao su từ vùng bản địa Amazon vào các chƣơng trình lai tạo giống. Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu biến lƣợng, đặc điểm di truyền của các con lai để tạo nguồn tƣ liệu giúp cải tiến chƣơng trình tạo tuyển giống cao su với nguồn di truyền cao su hoang dại Amazon. Những kết quả đạt đƣợc: - Kết quả thí nghiệm trên 2 primer cho quy trình phản ứng RAPD nhận thấy Primer A18 có 10 băng đa hình (chiếm 83,33%) trong tổng số 12 băng đƣợc khuếch đại, primer OPB12 có 11 băng đa hình (chiếm 91,67%) trong tổng số 12 băng đƣợc khuếch đại - Kết quả phân tích hệ số tƣơng đồng di truyền dựa trên chỉ số DICE của 20 con lai của tổ hợp PB260 x RO44/268 có giá trị từ 0,522 đến 0,976. Giá trị này cũng có nghĩa là khoảng cách di truyền giữa các con lai trong quần thể biến thiên từ 0,024 v đến 0,478. Kết quả này cho thấy quần thể con lai của tổ hợp PB260 x RO44/268 có biến lƣợng di truyền khá rộng. - Kết quả phân nhóm di truyền dựa trên dữ liệu RAPD cho thấy chƣa có mối liên hệ nào đƣợc phát hiện giữa các đặc tính nông học (sinh trƣởng hoặc sản lƣợng) và marker RAPD thông qua 2 primer A18 và OPB12. Qua kết quả trên, bƣớc đầu cho thấy marker RAPD đã phản ánh đƣợc biến lƣợng di truyền trong quần thể con lai của tổ hợp PB260 x RO44/268. Kết quả đề tài góp phần tạo tƣ liệu nghiên cứu di truyền nhằm nhằm sử dụng hiệu quả nguồn di truyền Amazone vào chƣơng trình cải tiến giống cây cao su Hevea. vi MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ ....................................................................................................... iii TÓM TẮT ............................................................................................................. iv MỤC LỤC ............................................................................................................. vi DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................... ix DANH SÁCH CÁC BẢNG ................................................................................... x DANH SÁCH CÁC HÌNH ................................................................................... xi CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU ......................................................................................... 1 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 1.2 MỤC TIÊU – YÊU CẦU ................................................................................. 2 1.2.1 Mục tiêu ..................................................................................................... 2 1.2.2 Yêu cầu ...................................................................................................... 2 1.3 GIỚI HẠN ĐỀ TÀI .......................................................................................... 3 CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 4 2.1 GIỚI THIỆU TỔNG QUÁT VỀ CÂY CAO SU ............................................. 4 2.1.1 Nguồn gốc và phân bố tự nhiên ................................................................. 4 2.1.2 Sự phân bố và sản xuất cao su trên thế giới .............................................. 4 2.1.3 Đặc điểm sinh học của cây cao su ............................................................. 5 2.1.4 Một số đặc điểm di truyền của cây cao su ................................................. 8 2.1.5 Quá trình cải tiến giống cao su .................................................................. 9 2.2 NGUYÊN TẮC VÀ ỨNG DỤNG CỦA MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN PHÂN TỬ ............................................. 11 2.2.1 Chỉ thị hình thái ....................................................................................... 11 2.2.2 Chỉ thị isozyme ........................................................................................ 11 vii 2.2.3 Chỉ thị DNA ............................................................................................ 12 2.2.3.1 Kỹ Thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) .... 12 2.2.3.2 Kỹ thuật SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism) ...... 12 2.2.3.3 Kỹ thuật STS (Sequence - Tagged Sites) ......................................... 13 2.2.3.4 Kỹ thuật Microsatellites (SSR – Simple Sequences Repeat) ........... 13 2.2.3.5 Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) ........ 13 2.2.3.6 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ............... 14 2.2.4 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) .......................................... 14 2.3 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RAPD TRONG NGHIÊN CỨU CÂY CAO SU19 CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 21 3.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ........................................................................... 21 3.1.1 Vật liệu di truyền ..................................................................................... 21 3.1.2 Hóa chất thí nghiệm................................................................................. 21 3.1.2.1 Hoá chất ly trích DNA ...................................................................... 21 3.1.2.2 Hóa chất sử dụng trong kỹ thuật RAPD ........................................... 21 3.1.3 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm ................................................................... 22 3.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ............................................... 22 3.2.1 Thời gian nghiên cứu ............................................................................... 22 3.2.2 Địa điểm nghiên cứu ............................................................................... 22 3.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 22 3.3.1 Phƣơng pháp lấy mẫu và ly trích DNA ................................................... 22 3.3.2 Phƣơng pháp kiểm tra hàm lƣợng và độ tinh sạch của DNA mẫu .......... 23 3.3.3 Phƣơng pháp khuếch đại DNA ................................................................ 24 3.3.4 Phƣơng pháp điện di sản phẩm DNA sau khi khuếch đại ....................... 24 3.3.5 Phƣơng pháp phân tích kết quả ............................................................... 24 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN ........................................................... 25 4.1 LY TRÍCH DNA ............................................................................................ 25 viii 4.1.1 Định tính DNA mẫu bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose ........... 25 4.1.2 Định lƣợng DNA mẫu bằng phƣơng pháp đo mật độ quang (Optical Density) ............................................................................................................ 26 4.2 KHUẾCH ĐẠI DNA BẰNG KỸ THUẬT RAPD ........................................ 26 4.3 ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE ................................................................. 27 4.4 ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA HÌNH CỦA CÁC PRIMER ......................................... 29 4.5 ĐÁNH GIÁ BIẾN LƢỢNG DI TRUYỀN CỦA CÁC CON LAI ................ 29 4.6 PHÂN NHÓM DI TRUYỀN CÁC CON LAI ............................................... 34 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ ............................................................... 37 5.1 KẾT LUẬN .................................................................................................... 37 5.2 ĐỀ NGHỊ ....................................................................................................... 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 39 PHỤ LỤC ............................................................................................................. 43 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism bp: base pair Ctv: cộng tác viên DNA: Deoxyribonuleotide acid dNTP: 2’- dideoxynucleotide - 5’- triphosphate Kb: kilo base NTSYSpc: Numercial Taxonomy System OD: Optical density PCR: Polymerase Chain Reaction RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA SSR: Simple Sequence Repeat (microsatellite) STS: Sequence-Tagged Sites SSCP: Single – Strand Conformation Polymorphism Taq: Thermus aquaticus UPGMA: Unweighted pair group method using arithmetic average UV: Ultra violet VNCCSVN: Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam SALB: South American Leave Blight x DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 4.1: Tỷ lệ và nồng độ các hóa chất tham gia phản ứng RAPD ................... 27 Bảng 4.2: Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD ................................................. 27 Bảng 4.3: Số băng DNA đƣợc khuếch đại ở các primer ...................................... 29 Bảng 4.4: Số băng DNA đƣợc khuếch đại của các con lai nghiên cứu ............... 30 Bảng 4.5: Hệ số tƣơng đồng di truyền của các con lai nghiên cứu ...................... 31 Bảng 4.6: Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các con lai với mẹ (PB260) và bố (RO44/268) của chúng. ........................................................................................ 32 Bảng 4.7: Các băng DNA chỉ xuất hiện ở bố và các con lai. ............................... 33 Bảng 4.8: Các băng DNA chỉ xuất hiện ở mẹ và các con lai .............................. 33 Bảng 4.9: Phân nhóm thành tích sinh trƣởng và sản lƣợng của các con lai ....... 35 xi DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1: Mô tả phản ứng PCR ............................................................................. 16 Hình 4.1: DNA của các dòng vô tính cao su trên gel agarose 1% ........................ 25 Hình 4.2-A: Băng DNA của các con lai đƣợc khuếch đại với primer A18 .......... 28 Hình 4.2-B: Băng DNA của các con lai đƣợc khuếch đại với primer OPB12 ..... 28 Hình 4.2-C: Băng DNA của các con lai còn lại đƣợc khuếch đại với cả 2 primer ............................................................................................................................... 29 Hình 4.3: Cây phân nhóm di truyền của các con lai đƣợc thiết lập dựa trên cơ sở dữ liệu phân tích RAPD, sử dụng phƣơng pháp phân tích cluster UPGMA ............. 36 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Cây cao su, Hevea brasiliensis Muell. Arg thuộc chi Hevea, họ Euphorbiaceae có nguồn gốc từ vùng rừng thuộc lƣu vực sông Amazon, Nam Mỹ. Vùng sinh thái tự nhiên của cây cao su thuộc khí hậu nhiệt đới ẩm. (Trần Thị Thúy Hoa, 1998). Cây cao su là cây công nghiệp có hiệu quả kinh tế cao, ổn định và góp phần cải thiện kinh tế, xã hội và môi trƣờng. Cây cao su là loài cây cung cấp nguồn nguyên liệu quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp, đƣợc xếp sau dầu hỏa, than đá và gang thép. Bên cạnh các sản phẩm truyền thống từ mủ cao su, cây cao su còn có khả năng cung cấp một khối lƣợng gỗ có giá trị kinh tế cao sau chu kỳ kinh doanh. Mặt khác, hiện nay cây cao su còn đƣợc xem là thành phần trong cơ cấu cây trồng có thể đáp ứng chủ trƣơng phủ xanh đất trống, đồi trọc, tái tạo rừng, cải tạo môi sinh. Tuy nhiên, sự giới hạn nguồn gen ở các nƣớc châu Á là yếu tố quan trọng nhất gây trở ngại cho công tác chọn tạo giống cao su (Lại Văn Lâm và ctv, 2006). Chính vì vậy, các nƣớc trồng cao su trên thế giới đã cố gắng giải quyết vấn đề này bằng cách di nhập bổ sung nguồn vật liệu giống hoang dại của các loài trong chi Hevea từ vùng nguyên quán Amazon. Tại Việt Nam từ năm 1997, một số kiểu di truyền Amazon triển vọng đã đƣợc đƣa vào các chƣơng trình lai tạo giống nhằm mở rộng nguồn gen trong công tác chọn tạo giống cao su (Lại Văn Lâm và ctv, 2006). 2 Những nghiên cứu về di truyền trên cây cao su có thể giúp cho các nhà chọn giống trong việc chọn bố mẹ, định hƣớng chƣơng trình cải tiến giống và khả năng sử dụng các chỉ tiêu tuyển non cho nghiên cứu di truyền để phát hiện ngay ở giai đoạn non những dòng vô tính có thể làm bố mẹ tốt (Sherpherd, 1969; Simmonds, 1969; Gilbert và ctv, 1973; Nga và Subramaniam, 1976; Tan, 1987; Tan và ctv, 1979; Kavitha K. M. và ctv, 1990; Licy J., 1992; Lê M. T., 1998; Goncalve và ctv, 1998, 2004; Lại Văn Lâm và ctv trích dẫn, 2006). Bên cạnh đó, một số nghiên cứu di truyền đã đƣợc tiến hành trên nguồn gen Amazon để ƣớc lƣợng các thông số di truyền, đánh giá độ lớn và bản chất của các biến lƣợng di truyền, định lƣợng tiến bộ di truyền và dự đoán phƣơng pháp chọn giống tốt nhất (Lại Văn Lâm và ctv trích dẫn, 2006). Hiện nay, Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã đƣa nguồn gen Amazon vào các chƣơng trình lai tạo giống. Do đó, vấn đề đặt ra là cần nghiên cứu biến lƣợng, đặc điểm di truyền của các con lai để tạo nguồn tƣ liệu giúp cải tiến chƣơng trình tạo tuyển giống cao su với nguồn di truyền cao su hoang dại Amazon. Từ thực tế đó chúng tôi tiến hành thực hiên đề tài “Đánh giá biến lƣợng di truyền quần thể con lai cây cao su của tổ hợp lai PB260 x RO44/268 bằng kỹ thuật RAPD”. 1.2 MỤC TIÊU – YÊU CẦU 1.2.1 Mục tiêu Đánh giá biến lƣợng di truyền của các con lai của tổ hợp PB260 x RO44/268 bằng marker RAPD. Qua đó cung cấp tƣ liệu cho chƣơng trình tạo tuyển giống cao su với nguồn di truyền Amazon. 1.2.2 Yêu cầu - Ly trích DNA của các con lai, đảm bảo hàm lƣợng và độ tinh sạch cao, làm nguyên liệu cho phản ứng RAPD. - Đánh giá đƣợc biến lƣợng di truyền của các con lai của tổ hợp PB260 x RO44/268 qua việc phân tích RAPD. 3 - Đánh giá mối liên hệ giữa marker RAPD và các đặc tính sinh trƣởng hoặc sản lƣợng của các con lai. - Nắm vững kỹ thuật PCR, thao tác chính xác, hạn chế sai sót trong quá trình thực hiện. - Sử sụng thành thạo các phần mềm xử lý thống kê sinh học nhƣ: NTSYS-pc, Excel. 1.3 GIỚI HẠN ĐỀ TÀI Do giới hạn về thời gian nên các nghiên cứu của đề tài chỉ phân tích RAPD dựa trên 2 primer A18 và OPB12. 4 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 GIỚI THIỆU TỔNG QUÁT VỀ CÂY CAO SU 2.1.1 Nguồn gốc và phân bố tự nhiên Cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg) là một loài thuộc chi Hevea, họ Euphorbiaceae. Trong chi Hevea, còn có 9 loài Hevea khác: H. benthamiana, H. camargona, H. camporum, H. guianensis, H. nitida, H. microphylla, H. pauciflora, H. rigidifolia và H. spruceana. Mặc dù tất cả các loài Hevea đều có mủ cao su nhƣng chỉ có loài Hevea brasiliensis là có ý nghĩa về kinh tế và đựợc trồng rộng rãi nhất. Cây cao su mọc tự nhiên ở vùng rừng thuộc lƣu vực sông Amazon, Nam Mỹ, trải rộng từ vĩ tuyến 150 Nam đến vĩ tuyến 60 Bắc và kinh tuyến 460 - 770 Tây, bao gồm các nƣớc: Brazil, Bolivia, Colombia, Peru, Ecuador, Venezuela, French Guiana, Surinam và Guyana (Trần Thị Thuý Hoa, 1998). Ngoài vùng xuất xứ trên, ngƣời ta không thấy cây cao su mọc tự nhiên ở nơi nào khác trên thế giới (Trần Thị Thuý Hoa, 1998). Vùng sinh thái của cây cao su thuộc khí hậu nhiệt đới ẩm, khá đa dạng với lƣợng mƣa trung bình từ 1.500 - 2.000 mm/năm, không có mùa khô hoặc mùa khô từ 1 đến 5 tháng, nhiệt độ trung bình 280C. Trong vùng Amazon, cây cao su phát triển chủ yếu trên nền đất sét giàu dinh dƣỡng, có độ pH dao động từ 4,5 - 5,5 với tầng đất canh tác sâu, thoát nƣớc trung bình (Nguyễn Thị Huệ, 1997). 2.1.2 Sự phân bố và sản xuất cao su trên thế giới Năm 1876 đã mở đầu cho công cuộc phát triển cao su trồng với sự thành công trong việc đƣa hạt cao su từ Brazil sang các nƣớc châu Á của Henry Wickham. 5 Từ đó cây cao su đã phát triển rộng rãi ở nhiều vùng nhiệt đới châu Á, châu Phi và một phần nhỏ ở châu Mỹ La tinh (Võ Thị Thu Hà, 1996). Sau năm 1889, các vƣờn cao su châu Á bắt đầu sản xuất mủ, sản lƣợng mủ cao su ở các nƣớc này nhanh chóng giữ vị trí chủ đạo, đứng đầu là Thái Lan. Theo thống kê năm 2002, tổng diện tích cao su trên toàn thế giới khoảng 9 triệu ha và sản lƣợng khoảng 7,4 triệu tấn, trong đó các nƣớc châu Á chiếm khoảng 94% tổng sản lƣợng, gồm các nƣớc: Thái Lan (28,7%), Indonesia (24,9%), Malaysia (16,9%), Ấn Độ (10%), Trung Quốc (6,1%), Việt Nam (3,3%), Srilanka (2,1%), các nƣớc châu Á khác (2,1%), châu Phi chiếm khoảng 4,4% và châu Mỹ là 1% tổng sản lƣợng cao su trên thế giới. Năng suất cao su trung bình biến thiên từ 1.500 - 1.800 kg/ha/năm tuỳ thuộc vào trình độ ứng dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật và quản lý của từng quốc gia trồng cao su (Phạm Hải Dƣơng, 2002). Đến năm 2005, tổng diện tích cao su Việt Nam đạt khoảng 480.200 ha, tổng sản lƣợng đạt 468.600 tấn, năng suất bình quân đạt 1.480 kg/ha/năm, trong đó bình quân năng suất của Tổng Công ty Cao su Việt Nam là 1.728 kg/ha (Trần Thị Thúy Hoa, 2006) 2.1.3 Đặc điểm sinh học của cây cao su Cây cao su là loài đại mộc, trong tự nhiên có thể sống đến 100 năm và cao từ 30 – 50 m, chiếm diện tích từ 20 – 40 m2, vòng thân có thể đạt 3 – 5 m, thƣờng là 1,5 m. Tuy nhiên, trên các vƣờn sản xuất, mức độ sinh trƣởng của cây cao su bị hạn chế, ít khi cao hơn 25 m, vòng thân khoảng 1 - 1,2 m do mật độ trồng dày, lại bị khai thác mủ liên tục và thƣờng bị cƣa đốn để tái canh sau 25 - 30 năm. Cây cao su có 3 lá chét, hoa nhỏ màu vàng, đơn tính đồng chu với tỷ lệ hoa đực gấp 60 lần hoa cái, thụ phấn chéo và tự thụ đều có thể xảy ra, quả có 3 mảnh vỏ chứa 3 hạt, quả tự khai, hạt khá lớn với kích thƣớc khoảng 2 cm, trong hạt có chứa nhiều dầu, dễ mất sức nẩy mầm. Khi trên 4 - 5 tuổi, cây cao su bắt đầu ra hoa sau thời kỳ thay lá. Ở Việt Nam, vụ hoa vào khoảng tháng 2 – 3 hàng năm, có khi rải rác trong tháng 4 – 6. Trong tự nhiên, cây cao su thụ phấn nhờ gió và côn trùng. Tỷ 6 lệ đậu trái trong tự nhiên rất thấp – dƣới 3%, có thể sự cạnh tranh dinh dƣỡng và nƣớc làm trái non rụng nhiều (Võ Thị Thu Hà, 1996; Trần Thị Thuý Hoa, 1998). Cây cao su có thời kỳ qua đông, lá rụng hoàn toàn sau đó nảy lộc phát triển bộ lá mới. Cây thay lá sớm hay muộn, từng phần hay toàn phần phụ thuộc vào đặc tính của giống và điều kiện môi trƣờng. Trong điều kiện Việt Nam, cây rụng lá qua đông vào khoảng giữa tháng 12 và tháng 2, ở Tây Nguyên và Miền Trung cây rụng lá qua đông sớm hơn. Sau đó cây ra hoa vào tháng 3, trái rụng trong tháng 8 - 9 hàng năm. Ở độ tuổi 7 – 8, rễ cọc phát triển sâu đến 2,4 m, rễ hút tập trung chủ yếu ở tầng đất từ 0 – 30 cm; rễ bàng cao su phát triển rất rộng, tối đa lên đến 10 – 15 m; ở cây trƣởng thành, bộ rễ có thể chiếm đến 15% tổng sinh khối của cây (Võ Thị Thu Hà, 1996; Nguyễn Thị Huệ, 1997). Cây cao su phát triển thích hợp ở nhiệt độ trung bình 250C - 280C. Nếu trong điều kiện nhiệt độ thấp hơn sẽ làm cho cây phát triển chậm, thời gian kiến thiết cơ bản kéo dài. Khi nhiệt độ xuống đến 40C - 50C cây bắt đầu bị tổn hại vì lạnh, cây bị khô lá và chết chồi non, trong trƣờng hợp nghiêm trọng cây có thể chết hoàn toàn. Lƣợng mƣa tối thiểu cần cho cây sinh trƣởng và phát triển bình thƣờng là 1.500 mm/năm, lƣợng mƣa phân bố đều trong năm thì cây sẽ phát triển tốt nhất; ngƣợc lại, lƣợng mƣa phân bố không đều trong năm sẽ ảnh hƣởng lớn đến sản lƣợng. Bên cạnh đó, điều kiện khô hạn sẽ gây tác hại rất lớn đối với cây cao su ở giai đoạn non. Tuy nhiên, sức chịu đựng khô hạn ở cây cao su sẽ tốt hơn khi cây ở giai đoạn trƣởng thành. Mặt khác, độ cao cũng có ảnh hƣởng rất lớn đến sự sinh trƣởng và phát triển của cây cao su. Thông thƣờng, cây cao su sẽ phát triển tốt ở độ cao dƣới 200 m, độ cao càng lớn cây càng chậm sinh trƣởng phát triển, thời gian kiến thiết cơ bản kéo dài hơn. Cây cao su ƣa đất hơi chua (pH đất thích hợp từ 4,5 - 5,5). Yêu cầu hóa tính đất cho việc trồng cao su không khắt khe nhƣng lý tính đòi hỏi phải tốt, tầng đất dày, không úng và địa hình ít dốc là tốt nhất. Cây cao su phát triển bình thƣờng ở nơi có tối thiểu 1600 giờ nắng/năm, phát triển tốt ở điều kiện gió nhẹ (vận tốc gió khoảng 3 m/s), nếu vận tốc gió lớn hơn 17 m/s cây bị gãy thân, cành. Nếu tốc độ gió lớn hơn 25 m/s cây sẽ gãy thân và lật gốc. Mức độ thiệt hại do 7 gió phụ thuộc vào đặc tính di truyền giống và kỹ thuật canh tác. Tuy nhiên, nhờ những thành công trong công tác tuyển chọn giống và các biện pháp nông học, hiện nay cây cao su đã và đang phát triển ra ngoài vùng truyền thống với độ cao lớn, vĩ độ lớn. Mủ cao su là sản phẩm chính đƣợc thu hoạch, hình thành từ các sản phẩm của quang hợp. Mủ cao su hiện diện trong nhiều bộ phận của cây, nhƣng quan trọng nhất là ở các vòng ống mủ nằm trong vỏ thân. Khi khai thác, các vết cắt làm đứt hệ thống ống mủ và cao su chảy ra ngoài, sau vài giờ sẽ ngƣng lại. Dòng mủ sẽ tiếp tục chảy với sản lƣợng tƣơng đƣơng ở lần cạo kế tiếp cách ít nhất một ngày đến vài ngày. Khả năng tái sinh mủ cao su phụ thuộc chủ yếu vào đặc tính di truyền giống. Chu kỳ sinh trƣởng và phát triển của cây cao su đƣợc chia làm 2 giai đoạn chính: - Thời kỳ chƣa trƣởng thành (giai đoạn kiến thiết cơ bản): giai đoạn này bắt đầu từ khi trồng đến khi khai thác mủ (vòng thân đo cách mặt đất 1m đạt khoảng 50 cm). Tốc độ sinh trƣởng của cây trong giai đoạn này là rất nhanh, kích thƣớc vòng thân có thể tăng 7 – 10 cm/năm. Cây chuyển sang thời kỳ trƣởng thành khi hoa xuất hiện sau 5 - 6 tuổi. Thông thƣờng, giai đoạn kiến thiết cơ bản của cây cao su từ 5 - 7 năm, tùy thuộc vào đặc tính của giống, điều kiện chăm sóc và điều kiện môi trƣờng. - Thời kỳ trƣởng thành (giai đoạn kinh doanh): là giai đoạn khai thác mủ, thông thƣờng giai đoạn này kéo dài khoảng 20 - 30 năm cho đến khi cƣa đốn do hiệu quả kinh tế giảm. Diễn biến sản lƣợng mủ tùy thuộc vào đặc tính giống và điều kiện canh tác, phần lớn các giống sẽ cho năng suất cao nhất ở tuổi trung niên khi cây ở độ tuổi từ 15 – 30, sau đó năng suất giảm rất nhanh do mật độ cây khai thác giảm vì bệnh, gãy đổ, sức sản xuất kém, vỏ khó cạo. Trong giai đoạn này, tốc độ sinh trƣởng của cây cao su chậm lại, vanh thân chỉ tăng 2 – 5 cm/năm. Ở cây cao su, hiện tƣợng thay lá xuất hiện hàng năm khi cây trên 4 tuổi, lá cũ rụng toàn bộ hoặc từng phần trong khoảng một tháng, sau đó lá mới xuất hiện và ổn định trong khoảng 8 1 - 1,5 tháng. Trong thời gian thay lá, sản lƣợng mủ sẽ giảm mạnh khi lá non mới mọc (Trần Thị Thúy Hoa,1998). Về bệnh hại, cây cao su bị trên 550 loài vi sinh vật tấn công, trong đó 24 loài có ảnh hƣởng nghiêm trọng về phƣơng diện kinh tế. Ngoại trừ bệnh cháy lá Nam Mỹ – SALB (South American Leave Blight) – do nấm Microcylus ulei gây ra chỉ xuất hiện ở Nam Mỹ, cây cao su Việt Nam bị gây hại bởi một số bệnh hại chính nhƣ bệnh phấn trắng, bệnh nấm hồng, bệnh héo đen đầu lá, bệnh rụng lá mùa mƣa, loét sọc miệng cạo.(Võ Thị Thu Hà trích dẫn, 1996). Trong tự nhiên cây cao su nhân giống bằng hạt. Trong điều kiện kinh doanh, cây cao su đƣợc nhân giống vô tính bằng phƣơng pháp ghép mắt cửa sổ. 2.1.4 Một số đặc điểm di truyền của cây cao su Đặc điểm chung của các loài thuộc chi Hevea là có cùng số nhiễm sắc thể 2n = 36. Một số tác giả cho rằng cây cao su là một dạng tứ bội với số lƣợng nhiễm sắc thể cơ bản n = 9 vì số nhiễm sắc thể của cây cao su gấp đôi các loài khác thuộc họ Euphorbiaceae. Các nghiên cứu điện di enzyme cho thấy cây cao su không phải là đồng tứ bội thể mà có lẽ là dị tứ bội thể có tính thích ứng gần giống dạng nhị bội (Trần Thị Thuý Hoa trích dẫn, 1998). Ở cây cao su, các tính trạng kinh tế chính nhƣ sinh trƣởng, sản lƣợng mủ, khả năng kháng bệnh… đều do những tính trạng đa gen qui định, di truyền theo phƣơng thức tác động cộng hợp. Cây cao su có hoa đơn tính đồng chu, hoa cái và hoa đực phân bố trên cùng một chùm hoa. Ở cây cao su, thụ phấn chéo chiếm ƣu thế hơn so với tự thụ, do đó tỷ lệ dị hợp tử cao hơn so với đồng hợp tử. Do là cây giao phấn chéo và nhân giống vô tính dễ dàng nên phƣơng pháp cơ bản để cải tiến giống cao su là cho lai giữa hai cha mẹ dị hợp tử để tạo ra các con lai F1, sau đó sẽ tiến hành chọn lọc một số cá thể F1 xuất sắc để tạo thành những dòng vô tính đồng đều về kiểu hình và cố định đƣợc kiểu gen. Cho đến nay, những thử nghiệm lai hoa nhân tạo giữa các loài cao su khác nhau cho thấy không có sự cản trở về di truyền. Trong thực tế, ngƣời ta đã tạo ra 9 nhiều tổ hợp lai khác loài cho mục đích nghiên cứu cũng nhƣ tìm thấy nhiều dạng lai khác loài Hevea trong tự nhiên (Trần Thị Thuý Hoa, 1998). 2.1.5 Quá trình cải tiến giống cao su Nguồn hạt do Wickham thu thập ở Brazil chuyển về trồng ở Singapore đƣợc xem là thủy tổ của hầu hết diện tích cao su của châu Á và châu Phi hiện nay. Trong thời kỳ này cao su đƣợc trồng bằng hạt thực sinh không chọn lọc nên sản lƣợng rất thấp dƣới 500 kg/ha (Võ Thị Thu Hà, 1996). Theo báo cáo của Cramer năm 1910, trong vƣờn cao su thực sinh có sự biến thiên rất lớn về sản lƣợng giữa các cá thể, qua phân tích sự biến thiên ông nhận thấy khoảng 70% sản lƣợng của cả vƣờn cây là từ khoảng 30% số cây trong vƣờn cung cấp. Từ đó ông khuyến cáo chọn lọc cây đầu dòng đƣợc trồng từ những hạt thực sinh của những cây cho năng suất cao trên vƣờn. Kết quả thu đƣợc từ vƣờn trồng có chọn lọc đã đƣa năng suất bình quân lên 630 – 704 kg/ha (Phạm Hải Dƣơng, 2002). Sau đó các nguyên tắc chọn lọc giống cao su lần đầu tiên đã đƣợc công bố tại hội nghị ở Batavia (Indonesia) vào năm 1914. Năm 1917, Van Helten đã thành công trong phƣơng pháp nhân giống vô tính cây cao su bằng kỹ thuật ghép mầm ngủ trên gốc thực sinh. Phƣơng pháp này đã mở ra một hƣớng đi mới trong tạo tuyển giống cao su là tạo các dòng vô tính. Qua các giai đoạn tuyển chọn, các dòng vô tính xuất sắc sẽ đƣợc khuyến cáo cho sản xuất đại trà. Mục tiêu chung của các nƣớc trồng cao su trong công tác chọn tạo giống là nâng cao sản lƣợng, đồng thời cải tiến những đặc tính có liên quan đến sản lƣợng nhƣ: sinh trƣởng, kháng bệnh, kháng gió,… Những phƣơng pháp cải tiến giống thƣờng đƣợc sử dụng trên thế giới bao gồm chọn lọc cây đầu dòng, lai hoa nhân tạo, lai hoa tự do, đột biến và đa bội hóa nhiễm sắc thể. Ngoài ra, kỹ thuật nuôi cấy in- vitro cũng đã đƣợc áp dụng trong việc nhân giống vô tính cây cao su. Bên cạnh đó, phƣơng pháp chuyển gen cũng đang đƣợc nghiên cúu và ứng dụng tại một số Viện Nghiên cứu Cao su trên thế giới. Tuy nhiên, cho đến nay phƣơng pháp lai hoa nhân 10 tạo vẫn là phƣơng pháp có hiệu quả nhất và đƣợc hầu hết các nƣớc trên thế giới áp dụng. Ở Việt Nam, vận dụng những kinh nghiệm nghiên cứu từ Viện Nghiên Cứu Cao su Malaysia, Viện Nghiên cứu Cao su Châu Phi kết hợp với những cải tiến, phƣơng pháp tạo tuyển giống cao su của Việt Nam là lai hoa hữu tính từ cha mẹ có chọn lọc, phƣơng pháp tuyển giống trải qua bốn giai đoạn bao gồm tuyển non, sơ tuyển, chung tuyển và sản xuất thử. Cho đến nay công tác cải tiến giống cao su tại Việt Nam đã đạt đƣợc nhiều thành tựu nhờ vào việc nghiên cứu, ứng dụng các tiến bộ kỹ thuật vào các chƣơng trình lai tạo giống mới cũng nhƣ bƣớc đầu ứng dụng có hiệu quả một số kỹ thuật sinh học phân tử trong việc hổ trợ công tác nghiên cứu, chọn tạo giống cao su. Tuy nhiên, công tác giống cao su trên thế giới vẫn còn tồn tại một số vấn đề. Nguồn vật liệu giống ban đầu do Wickham sƣu tập rất giới hạn về mặt di truyền vì chỉ xuất phát từ một vùng nhỏ so với diện tích phân bố tự nhiên của cây cao su, do đó không đại diện đầy đủ cho nguồn gen của cây cao su (Wycherley, P.R. 1968). Nguồn di truyền hạn hẹp này còn bị xói mòn nghiêm trọng vì mục tiêu cải tiến giống chỉ nhằm vào sản lƣợng mủ. Bên cạnh đó, sự cận thân giữa các dòng vô tính vẫn còn tồn tại, khó tránh khỏi giao phối cận huyết ở những chu kỳ kế tiếp. Chính vì vậy, việc mở rộng biến lƣợng di truyền con lai thông qua công tác lai tạo giữa nguồn gen Wickham với nguồn gen hoang dại Amazon cũng nhƣ việc tăng cƣờng các nghiên cứu về di truyền phân tử hỗ trợ trong công tác lai tạo giống đã và đang đƣợc các Viện Nghiên cứu Cao su thế giới tiến hành nhằm chọn lọc ra các tổ hợp lai tốt, có giá trị cao về mặt di truyền. 11 2.2 NGUYÊN TẮC VÀ ỨNG DỤNG CỦA MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN BẰNG CHỈ THỊ 2.2.1 Chỉ thị hình thái Về mặt nguyên tắc, một tính trạng hình thái nào đó do một locus kiểm soát mà sự biểu hiện của nó không bị ảnh hƣởng do tác động của môi trƣờng, có thể đƣợc dùng làm chỉ thị hình thái trong quá trình chọn lọc (Lê Duy Thành, 2000). Mặc dù chỉ thị hình thái rất tiện lợi, dễ xác định do đo trực tiếp trên kiểu hình nhƣng chúng lại có những hạn chế nhất định nhƣ cho kết quả sai lệch do tƣơng tác kiểu gen với môi trƣờng, số lƣợng marker có giới hạn, chỉ ở qui mô hình thái và chỉ thể hiện ở những giai đoạn nhất định của quá trình phát triển cá thể (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004). 2.2.2 Chỉ thị isozyme Trong nghiên cứu di truyền học phân tử, isozyme là một trong hai loại marker cơ bản. Isozyme là chỉ thị sinh hoá, chúng là những enzyme có cùng chức năng xúc tác cho một phản ứng (hoạt tính xúc tác tƣơng tự hoặc giống nhau) nhƣng lại bị ức chế bởi những phân tử khác nhau. Hoạt tính của chúng đặc trƣng với một cơ chất và trợ enzyme nhất định. Về mặt di truyền có thể chia isozyme thành hai dạng (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1997): - Isozyme đơn gen: các isozyme này chịu sự kiểm soát của một gen, mặc dù chúng chúng đều đƣợc hình thành từ chuỗi polypeptide đơn nhƣng có thể có các kiểu phân tử khác nhau (do sự khác nhau về thành phần và trật tự các acid amin), và do vậy có thể phân tách chúng bằng điện di. - Isozyme đa gen: các isozyme này đƣợc mã hoá bởi hai hay nhiều gen và chúng có thể đƣợc phân biệt bằng các đặc điểm hoá miễn dịch hoặc bằng đặc tính enzyme (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1997). 12 2.2.3 Chỉ thị DNA Là những chỉ thị phân tử DNA đƣợc tạo ra nhờ những kỹ thuật sinh học phân tử. Ngày nay các kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc phát minh ngày càng nhiều và ngày càng tỏ ra là công cụ đắc lực cho công tác nghiên cứu di truyền học phân tử. Nó tạo ra số lƣợng chỉ thị nhiều hơn hẳn so với chỉ thị hình thái và chỉ thị isozyme, độ tin cậy cao hơn và thuận tiện hơn nhiều. Ngày càng có nhiều kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc ứng dụng trong các nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện các chỉ thị liên kết với tính trạng,… Các kỹ thuật này có thể chia ra làm 2 nhóm chính: - Những kỹ thuật dựa trên kỹ thuật PCR (PCR - based) nhƣ: RAPD, STS, SSR, SSCP, AFLP, (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). - Những kỹ thuật dựa trên kỹ thuật lai DNA – DNA (Non - PCR based): điển hình là RFLP (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). 2.2.3.1 Kỹ Thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) Đây là kỹ thuật sinh học phân tử nhằm phát hiện sự khác nhau về di truyền giữa các cá thể, giữa các giống trong cùng một loài dựa vào sự khác nhau về số lƣợng và kích thƣớc của những đoạn DNA đƣợc tạo ra do sử dụng những enzyme cắt giới hạn (restriction enzymes). Sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt toàn bộ bộ gen của những cá thể hay giống đƣợc nghiên cứu, sau đó sản phẩm cắt đƣợc nhận biết bằng cách lai với những probe phát huỳnh quang. Nguyên lý của kỹ thuật này dựa vào hiện tƣợng đột biến làm mất hay xuất hiện một vị trí cắt giới hạn, vì vậy kỹ thuật RFLP có thể phát hiện đột biến mặc dù mức độ tin cậy không cao (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). 2.2.3.2 Kỹ thuật SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism) Kỹ thuật này dựa trên giả thuyết: sự khác biệt giữa các DNA do sự thay đổi cấu trúc của dây đơn DNA có cấu trúc hình học khác nhau, làm cho DNA di chuyển trên gel với tốc độ và khoảng cách di chuyển khác nhau. Sau khi thực hiện phản ứng 13 PCR, làm biến tính DNA thành dây đơn, điện di và nhuộm bạc. Kỹ thuật SSCP có quy trình thực hiện khó nhƣng kết quả có độ tin cậy không cao (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). 2.2.3.3 Kỹ thuật STS (Sequence - Tagged Sites) Do Olson và ctv đề xuất năm 1989, STS là đoạn ngắn DNA giúp phân tích bộ gen thông qua kỹ thuật phân tích di truyền phân tử là PCR. Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý: trình tự một đoạn DNA chuyên biệt cho loài, thông qua kỹ thuật PCR nhân bản đoạn DNA đó lên hàng triệu lần và phát hiện qua điện di (Nguyễn Thị Lang, 2002). Kỹ thuật này có nhƣợc điểm là phải biết trình tự gen của đối tƣợng nghiên cứu. 2.2.3.4 Kỹ thuật Microsatellites (SSR – Simple Sequences Repeat) Nguyên lý của kỹ thuật này là giữa những giống khác nhau có một đoạn DNA ổn định và chuyên biệt có trình tự đơn giản gồm khoảng 2 – 6 nucleotides đƣợc lặp lại nhiều lần (simple sequence repeat), tiến hành phản ứng PCR sử dụng các primer chuyên biệt nhân bản đoạn DNA chuyên biệt này lên. Điều quan trọng là phải biết đƣợc những trình tự lặp lại chuyên biệt này để thiết kế primer cho từng giống. Kỹ thuật SSR có độ tin cậy cao, chủ yếu đƣợc dùng để định danh những giống hay những loài rất gần nhau về mặt di truyền (Nguyễn Thị Lang, 2002). 2.2.3.5 Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Kỹ thuật AFLP là kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại do Zebeau và Vos phát minh năm 1993, sau đó đƣợc Vos và ctv (1995), Vos và Kuiper (1997) tiếp tục phát triển. Kỹ thuật này dựa trên nền tảng kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những cặp primer đặc biệt đƣợc thiết kế sẵn, điều kiện phản ứng PCR đƣợc thiết lập nghiêm ngặt giúp nhân bản một cách có chọn lọc những đoạn DNA đƣợc cắt giới hạn từ bộ gen của đối tƣợng nghiên cứu. Những đoạn DNA đƣợc nhân bản có độ dài khoảng từ 60 – 500 basepairs. Kỹ thuật AFLP giúp đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể và phát hiện chỉ thị phân tử với độ tin cậy cao (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999; Nguyễn Thị Lang, 2002). 14 2.2.3.6 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) RAPD là đoạn trình tự DNA ngắn, do sự tổng hợp một cách ngẫu nhiên, giúp phân tích bộ gen thông qua kỹ thuật phân tích di truyền phân tử là PCR. Kỹ thuật RAPD sử dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trƣớc, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer. Theo nguyên tắc, khi 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng RAPD ở điều kiện nhƣ nhau sẽ tạo ra số lƣợng các đoạn bằng nhau và chiều dài các đoạn tƣơng ứng bằng nhau. Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lƣợng và chiếu dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể, vì vậy kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến. Kỹ thuật RAPD giúp nhận diện những chỉ thị phân tử trội (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999; Nguyễn Thị Lang, 2002). Kỹ thuật RAPD cho phép tiến hành nghiên cứu di truyền phân tử mà không cần biết trƣớc về trình tự của chuỗi mã di truyền cần nghiên cứu. Một số ƣu điểm khác của kỹ thuật RAPD là: cho kết qua nhanh,thời gian để thực hiện phản ứng RAPD chỉ khoảng 14 giờ, cần một số lƣợng DNA mẫu rất nhỏ (25 ng), Kỹ thuật RAPD có thể dùng để nghiên cứu những trình tự có kích thƣớc nhỏ (10 kb). Tuy nhiên kỹ thuật RAPD lại có nhƣợc điểm là độ chính xác không cao. 2.2.4 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) Kỹ thuật PCR do Kary Mullis và ctv phát minh năm 1990 đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong số các ứng dụng của sinh học phân tử. Về thực chất đây là phƣơng pháp tạo dòng in vitro không cần sự hiện diện của các tế bào (Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2000) Kỹ thuật PCR là một phƣơng pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lƣợng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này. Hiện nay, kỹ thuật này đƣợc sử dụng rộng rãi để phát hiện, 15 tạo ra các đột biến gen, chẩn đoán phát hiện mầm bệnh trên ngƣời, động vật, thực vật, thực phẩm…(Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2000) Tất cả các DNA polymerase đều cần những primer chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thƣờng là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trƣng cho loài sinh vật mục tiêu hoặc là gen quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật (Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2000). Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này đƣợc kéo dài để hình thành mạch mới. Phƣơng pháp PCR đƣợc hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ đƣợc khuếch đại thành số lƣợng lớn bản sao đến mức có thể thấy đƣợc sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích thao tác trên gel. Nhƣ vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2000). Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bƣớc nhƣ hình 2.1. 16 Hình 2.1: Mô tả phản ứng PCR. - Bƣớc 1 (tách sợi đôi DNA, denaturation): trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA đƣợc biến tính ở điều kiện nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử, ở điều kiện này phân tử DNA từ dạng sợi đôi sẽ tách thành dạng sợi đơn, thƣờng là ở nhiệt độ 94 - 95 C trong vòng 30 giây đến 1 phút. 17 - Bƣớc 2 (bắt cặp, annealation): trong bƣớc này ở nhiệt độ đƣợc hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 - 70 C. Tùy thuộc vào Tm của các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây. - Bƣớc 3 (kéo dài, elongation hay extension): dƣới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lƣợt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn. Mạch mới đƣợc tạo thành từ mạch đƣợc kéo dài. Nhiệt độ phù hợp cho enzyme polymerase hoạt động là 72 C và thƣờng kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút tuỳ thuộc vào kích thƣớc của DNA cần khuếch đại và nồng độ Mg2+. Trong phản ứng PCR, một chu kỳ gồm 3 bƣớc nhƣ trên đƣợc lặp đi lặp lại nhiều lần, làm số lƣợng DNA đƣợc gia tăng theo cấp số nhân. Theo tính toán, sau 30 – 40 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ cho ra 1012 bản sao. Sau phản ứng PCR, DNA sản phẩm đƣợc nhuộm bằng ethdium bromide sau khi thực hiện điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide, sau đó tiến hành quan sát dƣới tia UV (bƣớc sóng 312 nm). Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả của phản ứng PCR bao gồm: – DNA khuôn: DNA khuôn dùng trong phản ứng PCR phải thật tinh sạch, nhƣng đôi khi kỹ thuật này cũng cho phép khuếch đại từ dịch DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào mà vẫn cho kết quả tốt, thông thƣờng phƣơng pháp này đƣợc áp dụng trong chẩn đoán. Lƣợng DNA đƣợc dùng trong phản ứng PCR là một lƣợng cực nhỏ, khoảng 1 g, ngoài ra, nếu sử dụng các enzyme polymerase cho hiệu quả cao còn có thể giảm lƣợng DNA khuôn xuống còn 100 ng. Nếu lƣợng DNA khuôn quá cao có thể tạo ra những sản phẩm không nhƣ mong muốn hay còn gọi là dƣơng tính giả hay sản phẩm tạp nhiễm. Khuôn DNA có thể đƣợc thu nhận từ các mẫu không đƣợc bảo quản tốt, đã bị phân hủy từng phần – Enzyme: Thông thƣờng, DNA polymerase dùng trong phản ứng PCR phải là enzyme chịu nhiệt cao. Enzyme thƣờng đƣợc sử dụng hiện nay là Taq DNA 18 polymerase đƣợc tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus. Ngày nay, nhiều loại enzyme chịu nhiệt khác nhau đã đƣợc phát hiện và đƣa ra thị trƣờng với chức năng hoàn thiện hơn và chuyên biệt hơn nhƣ enzyme Tth polymerase từ Thermus thermophilus, enzyme này hoạt động nhƣ một enzyme phiên mã ngƣợc thông qua sự hình thành cDNA trong điều kiện RNA làm khuôn và ion Mn2+, nhƣng trong điều kiện DNA khuôn và ion Mg2+, Tth polymerase lại xúc tác phản ứng khuếch đại DNA. – Primer và nhiệt độ lai: Primer có vai trò rất quan trọng trong tiến trình khuếch đại của phản ứng PCR. Việc thiết kế và chọn primer phải đáp ứng đủ các yêu cầu sau: + Trình tự primer đƣợc chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa primer xuôi và primer ngƣợc, không có cấu trúc dimer primer do sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một primer. + Nhiệt độ nóng chảy của primer xuôi và primer ngƣợc không cách biệt quá xa. Thành phần nucleotide của các primer phải cân bằng, tránh các cặp GC lặp lại nhiều lần. + Các primer phải đặc trƣng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với trình tự lặp lại trên gen. + Trình tự nằm giữa hai primer xuôi và primer ngƣợc không đƣợc quá lớn, phản ứng PCR tối ƣu nhất cho những trình tự nhỏ hơn 1 kb. – Các thành phần khác trong phản ứng PCR: + Bốn loại nucleotide thƣờng đƣợc sử dụng với nồng độ 200 M/ mỗi loại nucleotide. Nếu nồng độ cao hơn sẽ dẫn đến sự khuếch đại sản phẩm dƣơng tính giả hay tạp nhiễm. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide làm tăng các lỗi sao chép của polymerase. 19 + Nồng độ Mg2+ cũng là một nhân tố ảnh hƣởng đến quá trình khuếch đại, nồng độ tối ƣu của ion này không tuân theo một quy luật chung, thông thƣờng nồng độ tối ƣu này phải đƣợc xác định riêng cho từng phản ứng. – Số lƣợng chu kỳ phản ứng: Số lƣợng chu kỳ trong một phản ứng PCR thông thƣờng không vƣợt quá 40 chu kỳ. Do phản ứng PCR diễn tiến qua hai giai đoạn, trong giai đoạn đầu số lƣợng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lƣợng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm vì những nguyên nhân nhƣ sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng khuếch đại, các bản sao vừa đƣợc tổng hợp không bắt cặp với primer mà chúng tự bắt cặp với nhau. Số chu kỳ còn tùy thuộc vào số lƣợng mẫu ban đầu. – Thiết bị và dụng cụ dùng trong phản ứng PCR: Thiết bị cho phản ứng PCR nhƣ máy luân nhiệt (thermocycler) cần đáp ứng đƣợc yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác, tránh tối đa sự bốc thoát hơi nƣớc trong quá trình phản ứng. Eppendorf sử dụng trong phản ứng PCR phải là loại có vách mỏng và có khả năng truyền nhiệt tốt (Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2000). 2.3 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RAPD TRONG NGHIÊN CỨU CÂY CAO SU Marker phân tử dựa trên kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) đã đƣợc sử dụng rộng rãi trên cây cao su gồm có RAPD (Varghese và ctv, 1997; Venkatachalam và ctv, 2002), AFLP (Safiah, 2004) và microsatellites (Seguin và ctv, 2001; Lekawipat và ctv, 2003). Trong đó khả năng nhận dạng di truyền của microsatellites là mạnh nhất (Seguin và ctv, 2001). Tuy nhiên, chi phí cho phân tích microsatellites hiện nay còn khá đắt nên trong giai đoạn đầu nghiên cứu, ngƣời ta thƣờng sử dụng RAPD trong phân tích đa dạng di truyền và việc sử dụng nhiều primer đƣợc khuyến khích để tăng độ tin cậy khi phân tích RAPD. Do tính chất đồng trội nên các marker phân tử có thể sử dụng để kiểm tra phả hệ của con lai và thiết lập bản đồ gen cây cao su (Seguin và ctv, 2001). Bên cạnh đó, các marker phân tử còn là công cụ hỗ trợ thiết yếu trong việc phân tích QTL cho một số tính trạng nông sinh học trên cây cao su nhƣ: tính trạng kháng bệnh SALB 20 do nấm Microcyclus ulei (Lespinasse và ctv, 2000), tính trạng kháng bệnh rụng lá Corynespora do nấm Corynespora cassiicola (Sumarmadji and Darmono, 2004), tính trạng kháng bệnh rụng lá do nấm Phytophthora và tính trạng thấp cây (Venkatachalam và ctv, 2001 và 2004). RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) là các đoạn DNA đƣợc khuyếch đại bằng kỹ thuật PCR nhờ sử dụng các mồi (primer) ngẫu nhiên (Williams và ctv, 1990). Các giống của cùng một loài, nếu có kiểu gen hoàn toàn giống nhau sẽ đƣợc khuếch đại những đoạn DNA có kích thƣớc giống nhau khi sử dụng bất kỳ mồi ngẫu nhiên nào để chạy PCR. Ngƣợc lại, nếu có sự khác nhau về kiểu gen thì các đoạn DNA đƣợc khuếch đại sẽ cho kích thƣớc hoàn toàn khác nhau thể hiện trên các băng DNA thu đƣợc từ sản phẩm PCR sau khi điện di trên gel agarose. Marker RAPD có thể sử dụng rất hiệu quả trong nhận dạng di truyền cây cao su (Varghese và ctv, 1997; Venkatachalam và ctv, 2002) Năm 2001, Venkatachalam và ctv đã sử dụng thành công marker RAPD trong việc nhận dạng tính trạng lùn cây ở các con lai của RRII118 với các dòng vô tính mang tính trạng lùn tự nhiên (Venkatachalam và ctv, 2001). Năm 2005, An Zewei và ctv đã sử dụng marker RAPD để nghiên cứu đa dạng di truyền và nhận dạng 34 dòng vô tính cao su tại Trung Quốc (An Zewei và ctv, 2005). Năm 2006, Lại Văn Lâm và công sự cũng đã sử dụng marker RAPD để nghiên cứu đa dạng di truyền của 69 kiểu di truyền cao su trong quỹ gen tại Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam (Lại Văn Lâm và ctv, 2006). Viện Nghiên Cứu Cao su Indonesia (IRRI) cũng đang tiến hành thử nghiệm một số marker RAPD cho tính trạng kháng bệnh rụng lá Corynespora, đƣợc qui định bởi sự tƣơng tác át chế giữa 2 gen lặn (Sumarmadji và Darmono, 2004). Ngoài ra, các marker phân tử còn đƣợc sử dụng trong nghiên cứu sự biểu hiện gen và chức năng của bộ gen cây cao su. 21 22 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.1.1 Vật liệu di truyền DNA của 20 con lai giữa nguồn di truyền Wickham truyền thống và Amazon hoang dại (PB260 x RO44/268) trên vƣờn TNLK 04 đã đƣợc đánh giá phân nhóm thành tích sinh trƣởng (vanh thân) và sản lƣợng tuyển non năm 2006 (sau 28 tháng tuổi) theo bảng phân cấp của Bộ môn Giống, Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam. (Bảng 4.7). 3.1.2 Hóa chất thí nghiệm 3.1.2.1 Hoá chất ly trích DNA RNase (Invitrogen). Ethanol 70% và Ethanol 90% (Invitrogen). Sodium Acetate 3M (Invitrogen). TE 1X (Tris-HCl 1M + EDTA 0,5M). DNA extraction buffer. Phenol:chloroform:isoamyl ancohol (25:24:1) (Invitrogen). Isopropanol lạnh (Invitrogen). 3.1.2.2 Hóa chất sử dụng trong kỹ thuật RAPD 10X PCR buffer (Invitrogen). 50mM MgCl (Invitrogen). 10mM dNTP’s (Invitrogen). 23 9μM Primer (A18 và OPB12) (Invitrogen). Agarose (Invitrogen). TAE 0,5X (20mM Tris-HCl, 10mM Acetate, 1mM EDTA) (Invitrogen). Loading dye 6X (Promega). Ethidium bromide (Invitrogen). 3.1.3 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm Chày và cối nghiền mẫu. (Đức) Cân điện tử. Eppendorf các loại. Pipette các loại. Đầu típ các loại. Máy ly tâm lạnh. Tủ sấy. Tủ ủ mẫu. Tủ lạnh sâu. Tủ hút khí độc. Tủ cấy vô trùng. Máy điện di nằm. Máy vortex. Nồi hấp khử trùng. Máy đo mật độ quang. Máy khuếch đại DNA. Máy chụp ảnh kỹ thuật số. 3.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 3.2.1 Thời gian nghiên cứu Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 4/2007 đến tháng 7/2007. 3.2.2 Địa điểm nghiên cứu Đề tài đƣợc thực hiện tại Bộ môn Giống, Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam, xã Lai Hƣng, huyện Bến Cát, tỉnh Bình Dƣơng. 24 3.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1 Phƣơng pháp lấy mẫu và ly trích DNA - DNA của các con lai đƣợc tách chiết từ mẫu lá tƣơi (lá còn non, ở giai đoạn có màu xanh nhạt). Các mẫu lá đƣợc lấy trên vƣờn TNLK 04, ghi chú cẩn thận tên giống, ngày lấy mẫu và đƣợc lƣu giữ trong điều kiện lạnh. Quy trình tách chiết DNA tổng số từ lá tƣơi cây cao su dựa trên phƣơng pháp CTAB của Doyle và Doyle (1987) đã đƣợc Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam sửa đổi cho phù hợp với cây cao su đƣợc trồng trong điều kiện ở Việt Nam. 3.3.2 Phƣơng pháp kiểm tra hàm lƣợng và độ tinh sạch của DNA mẫu Sau khi ly trích DNA các con lai, tiến hành định tính và định lƣợng DNA mẫu để đánh giá hàm lƣợng cũng nhƣ độ tinh sạch của DNA mẫu nhằm đảm bảo cho việc thực hiện thành công phản ứng PCR. - Định tính DNA mẫu bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose: nucleic acid là các đại phân tử tích điện âm nên dƣới tác động của dòng điện một chiều, ch