Đánh giá chất lượng hạt và nghiên cứu đặc điểm cấu trúc gen LTP ở đậu xanh (Vigna radiata L.Wilczek)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊNTRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠMPHẠM THỊ OANH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG HẠT VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC GEN LTP Ở ĐẬU XANH (Vigna radiata (L.) Wilczek) Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh  THÁI NGUYÊN - 2010 NỘI DUNG Mở đầu Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Kết quả và thảo luận Kết luận và đề nghị MỞ ĐẦU Lý do chọn đề tài Đậu xanh (Vigna radiata L.Wilczek) là một trong ba cây đậu đỗ chính trong nhóm các cây đậu ăn hạt, là cây trồng có vị trí quan trọng. Hiện nay, các giống đậu xanh trồng ở Việt Nam chủ yếu là các giống có khả năng chịu hạn kém và thường bị nhiễm một số bệnh như: sâu keo, sâu xanh… Trong những năm gần đây, một số nghiên cứu về khả năng chịu hạn đã được tiến hành. Các nghiên cứu đều thống nhất rằng đặc tính chịu hạn của cây trồng rất phức tạp do nhiều gen quy định, trong đó có gen LTP (Lipid Transfer Protein). LTP là gen liên quan đến sinh tổng hợp lớp biểu bì. Khi gặp stress hạn, LTP kích thích tăng tổng hợp ngoại bì làm thực vật có thể giảm mất nước nhờ tăng độ dày của lớp vỏ ngoài [36]. Tuy nhiên, các nghiên cứu về mối liên quan giữa đặc điểm sinh lí, hoá sinh và sinh học phân tử của gen LTP với khả năng chịu hạn của cây đậu xanh còn hạn chế. Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Đánh giá chất lượng hạt và nghiên cứu đặc điểm cấu trúc gen LTP ở đậu xanh (Vigna radiata L.Wilczek)” nhằm phục vụ việc thiết kế vector chuyển gen mang gen LTP góp phần tạo cây đậu xanh chịu hạn. MỞ ĐẦU 2. Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá chất lượng hạt của các giống đậu xanh nghiên cứu thông qua phân tích một số chỉ tiêu hoá sinh. Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non của một số giống đậu xanh. Phân lập và nghiên cứu cấu trúc của gen LTP liên quan đến tính chịu hạn. 3. Nội dung nghiên cứu Phân tích một số đặc điểm hình thái Phân tích các chỉ tiêu hoá sinh sau: hàm lượng lipid, protein tan tổng số của các giống đậu xanh thu thập được. Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu xanh ở giai đoạn cây non. Tách chiết DNA tổng số của 1 số giống đậu xanh. Nhân gen LTP bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction). Tách dòng gen LTP của giống đậu xanh chịu hạn tốt và chịu hạn kém nhất. Xác định trình tự gen LTP và phân tích cấu trúc gen LTP. 4. Ý nghĩa khoa học Là cơ sở cho việc thiết kết vector chuyển gen nhằm tạo cây đậu xanh mang gen LTP. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU Bảng 2.1. Các giống đậu xanh nghiên cứu VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU Hình 2.1. Hạt của các giống đậu xanh nghiên cứu VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Các loại hóa chất, máy móc phục vụ nghiên cứu phân lập gen. Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ gen - Viện KHSS - ĐHTN; Phòng thí nghiệm Di truyền và SHHĐ - Khoa Sinh - KTNN- Trường Đại học Sư phạm - ĐHTN và Phòng Miễn Dịch học - Viện CNSH. 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Phương pháp sinh lí, hoá sinh 2.3.1.1. Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn theo phương pháp của Lê Trần Bình và cs (1998) [1]. CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Phương pháp sinh lí, hoá sinh 2.3.1.2. Định lượng lipid tổng số. a: khối lượng mẫu trước khi chiết b: khối lượng mẫu sau khi chiết 2.3.1.3. Định lượng protein Định lượng protein tan trong hạt đậu xanh theo phương pháp Lowry. a: số đo trên máy quang phổ H : hệ số pha loãng G : số mg mẫu phân tích 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.2. Phương pháp sinh học phân tử PP tách chiết DNA tổng số (Gawel và Jarret, 1991) Định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của DNA tổng số Kỹ thuật PCR (Mullis và cs, 1985) Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR Phương pháp gắn gen vào vector tách dòng Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (clony-PCR) Tách chiết plasmid Phương pháp xác định trình tự nucleotide 2.3.3. Phương pháp xử lí số liệu Phương pháp thống kê bằng chương trình Excel Phương pháp xử lý trình tự gen CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. PHÂN TÍCH ĐĐ HÌNH THÁI, HOÁ SINH HẠT CỦA CÁC GIỐNG ĐXNC 3.1.1. Đặc điểm hình thái và khối lượng 1000 hạt của các giống đx Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái của các giống đậu xanh nghiên cứu KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1.2. Chiều dài rễ, thân của các giống đậu xanh ở giai đoạn cây non Bảng 3.2. Kích thước rễ, thân của các giống đậu xanh ở gđ cây non 3.1.3. Đặc điểm hoá sinh hạt của các giống đậu xanh Bảng 3.3. Hàm lượng lipid và protein của các giống đậu xanh KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Hình 3.1. Mối tương quan giữa hàm lượng lipid và protein của các giống đậu xanh nghiên cứu 3.2. KQ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÁC GIỐNG ĐXNC Bảng 3.4. Khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non của các giống đậu xanh KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Hình 3.2. Đồ thị hình rada biểu diễn khả năng chịu hạn KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN R=0,91 Hình 3.3. Mối tương quan giữa chỉ số chịu hạn và chiều dài rễ của các giống đậu xanh nghiên cứu Hình 3.4. Hình ảnh của 4 giống đậu xanh nghiên cứu sau 11 ngày gây hạn KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.3. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN LTP 3.3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Hình 3.5. DNA tổng số của giống đậu xanh 044/ĐX06 và HN 2 Ký hiệu : 1. 044/ĐX06; 2. HN 2 Bảng 3.5. Phổ hấp thụ DNA ở bước sóng 260nm và 280nm của giống đậu xanh 044/ĐX06 và BG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.3.2. Kết quả nhân gen LTP Hình 3.6. Hình ảnh điện di kết quả nhân gen LTP Kí hiệu: M. Marker 1 Kb; 1,2. 044/ĐX06; 3,4. HN 2 3.3.3. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR Hình 3.7. Kết quả điện di DNA thu được từ kỹ thuật thôi gel Kí hiệu: M. Marker 1 Kb; 1. 044/ĐX06; 2. HN 2. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.3.4. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α Hình 3.8. Hình ảnh khuẩn lạc 3.3.5. Kết quả chọn lọc plasmid tái tổ hợp bằng clony-PCR 500 bp 474 bp Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm clony-PCR Kí hiệu: M. Marker 1Kb; 1. 044/ĐX06; 2. HN 2 3.3.6. Kết quả tách plasmid từ các khuẩn lạc của 2 mẫu nghiên cứu KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm tách plasmid mang gen LTP của giống đậu xanh 044/ĐX06 và HN 2 Kí hiệu: 1. 044/ĐX06; 2. HN 2 3.3.7. Kết quả xác định và so sánh trình tự nucleotide của gen LTP KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 10 20 30 40 50 044/ĐX06 ATGGCTAGCC TGAAGGTTGC ATGCATGGTT GCGGTGGTGT TCATGGTCGT HN 2 ATGGCTAGCC TGAAGGTTGC ATGCATGGTT GCGGTGGTGT TCATGGTCGT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 60 70 80 90 100 044/ĐX06 GGTGAGTGCA CATATGGCAC ATGCGATCAC GTGCGGGCAA GTGGCCTCTT HN 2 GGTGAGTGCA CATATGGCAC ATGCGATCAC GTGCGGGCAA GTGGCCTCTT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 110 120 130 140 150 044/ĐX06 CTTTGGCTCC ATGCATCTCC TACCTCCAAA AGGGCGGAGT TCCGTCGGCG HN 2 CTTTGGAATC ATCCATCTCC TACCTCCAAA AGGGCGGAGT TCCGTCGGCG ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 160 170 180 190 200 044/ĐX06 TCGTGTTGCA GCGGAGTGAA GGCCCTGAAC AGCGCCGCAA GTACCACCGC HN 2 TCGTGTTGCA GCGGAGTGAA GGCCCTGAAC AGCGCCGCAA GTACCACCGC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 210 220 230 240 250 044/ĐX06 TGACCGCAAA ACCGCGTGCA ACTGTCTGAA AAACCTTGCC GGTCCAAAGT HN 2 TGACCGCAAA ACCGCGTGCA ACTGTCTGAA AAACCTTGCC GGTCCAAAGT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 260 270 280 290 300 044/ĐX06 CGGGTATCAA CGAGGGCAAC GCCGCATCAC TCCCAGGCAA ATGTAAAGTC HN 2 CGGGTATCAA CGAGGGCAAC GCCGCTTCAC TCCCAGGCAA ATGTAAAGTC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 310 320 330 340 350 044/ĐX06 ATCGTGCCCT ACTGGATCAG CACCTTCACC AACTGCGCTA ACATCAAGTA HN 2 AACGTGCCCT ACAAGATCAG CACCTTCACC AACTGCGCTA ACATCAAGTA . 044/ĐX06 A HN 2 A Hình 3.11. Trình tự nucleotide của gen LTP ở 2 giống đậu xanh nghiên cứu Bảng 3.6. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của gen LTP ở giống đậu xanh 044/ĐX06, HN 2 3.3.7. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen LTP ở 2 mẫu đxnc với trình tự nucleotide công bố trên ngân hàng gen với mã số AY300807 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 10 20 30 40 50 AY300807 ATGGCTAGCC TGAAGGTTGC ATGCATGGTT GCGGTGGTGT TCATGGTCGT 044/ĐX06 ATGGCTAGCC TGAAGGTTGC ATGCATGGTT GCGGTGGTGT TCATGGTCGT HN 2 ATGGCTAGCC TGAAGGTTGC ATGCATGGTT GCGGTGGTGT TCATGGTCGT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 60 70 80 90 100 AY300807 GGTGAGTGCA CATATGGCAC ATGCGATCAC GTGCGGGCAA GTGGCCTCTT 044/ĐX06 GGTGAGTGCA CATATGGCAC ATGCGATCAC GTGCGGGCAA GTGGCCTCTT HN 2 GGTGAGTGCA CATATGGCAC ATGCGATCAC GTGCGGGCAA GTGGCCTCTT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 110 120 130 140 150 AY300807 CTTTGGCTCC ATGCATCTCC TACCTCCAAA AGGGCGGAGT TCCGTCGGCG 044/ĐX06 CTTTGGCTCC ATGCATCTCC TACCTCCAAA AGGGCGGAGT TCCGTCGGCG HN 2 CTTTGGAATC ATCCATCTCC TACCTCCAAA AGGGCGGAGT TCCGTCGGCG ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 160 170 180 190 200 AY300807 TCGTGTTGCA GCGGAGTGAA GGCCCTGAAC AGCGCCGCAA GTACCACCGC 044/ĐX06 TCGTGTTGCA GCGGAGTGAA GGCCCTGAAC AGCGCCGCAA GTACCACCGC HN 2 TCGTGTTGCA GCGGAGTGAA GGCCCTGAAC AGCGCCGCAA GTACCACCGC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 210 220 230 240 250 AY300807 TGACCGCAAA ACCGCGTGCA ACTGTCTGAA AAACCTTGCC GGTCCAAAGT 044/ĐX06 TGACCGCAAA ACCGCGTGCA ACTGTCTGAA AAACCTTGCC GGTCCAAAGT HN 2 TGACCGCAAA ACCGCGTGCA ACTGTCTGAA AAACCTTGCC GGTCCAAAGT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 260 270 280 290 300 AY300807 CGGGTATCAA CGAGGGCAAC GCCGCTTCAC TCCCAGGCAA ATGTAAAGTC 044/ĐX06 CGGGTATCAA CGAGGGCAAC GCCGCATCAC TCCCAGGCAA ATGTAAAGTC HN 2 CGGGTATCAA CGAGGGCAAC GCCGCTTCAC TCCCAGGCAA ATGTAAAGTC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 310 320 330 340 350 AY300807 AACGTGCCCT ACAAGATCAG CACCTTCACC AACTGCGCTA ACATCAAGTA 044/ĐX06 ATCGTGCCCT ACTGGATCAG CACCTTCACC AACTGCGCTA ACATCAAGTA HN 2 AACGTGCCCT ACAAGATCAG CACCTTCACC AACTGCGCTA ACATCAAGTA . AY300807 A 044/ĐX06 A HN 2 A Hình 3.12. So sánh trình tự nucleotide của gen LTP ở giống đx 044/ĐX06 và HN 2 với trình tự đã công bố AY300807 Bảng 3.7. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của gen LTP ở giống đậu xanh 044/ĐX06, HN 2 và AY300807 Kq so sánh trình tự amino acid trong protein của gen LTP ở giống đx 044/ĐX06 và HN2 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 10 20 30 40 50 044/ĐX06 MASLKVACMV AVVFMVVVSA HMAHAITCGQ VASSLAPCIS YLQKGGVPSA HN 2 MASLKVACMV AVVFMVVVSA HMAHAITCGQ VASSLESSIS YLQKGGVPSA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 60 70 80 90 100 044/ĐX06 SCCSGVKALN SAASTTADRK TACNCLKNLA GPKSGINEGN AASLPGKCKV HN 2 SCCSGVKALN SAASTTADRK TACNCLKNLA GPKSGINEGN AASLPGKCKV ....|....| ....|. 110 044/ĐX06 IVPYWISTFT NCANIK HN 2 NVPYKISTFT NCANIK Bảng 3.8. Vị trí sai khác về trình tự amino acid trong protein của gen LTP ở giống đậu xanh 044/ĐX06, HN 2 Hình 3.13. So sánh trình tự amino acid trong protein của gen LTP ở giống đậu xanh 044/ĐX06 và HN 2 Kq so sánh trình tự amino acid trong protein của gen LTP ở giống đậu xanh 044/ĐX06 và HN 2 với giống đậu xanh có mã số AY300807 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 10 20 30 40 50 AY300807 MASLKVACMV AVVFMVVVSA HMAHAITCGQ VASSLAPCIS YLQKGGVPSA 044/ĐX06 MASLKVACMV AVVFMVVVSA HMAHAITCGQ VASSLAPCIS YLQKGGVPSA HN 2 MASLKVACMV AVVFMVVVSA HMAHAITCGQ VASSLESSIS YLQKGGVPSA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 60 70 80 90 100 AY300807 SCCSGVKALN SAASTTADRK TACNCLKNLA GPKSGINEGN AASLPGKCKV 044/ĐX06 SCCSGVKALN SAASTTADRK TACNCLKNLA GPKSGINEGN AASLPGKCKV HN 2 SCCSGVKALN SAASTTADRK TACNCLKNLA GPKSGINEGN AASLPGKCKV ....|....| ....|. 110 AY300807 NVPYKISTFT NCANIK 044/ĐX06 IVPYWISTFT NCANIK HN 2 NVPYKISTFT NCANIK Hình 3.14. So sánh trình tự amino acid trong protein của gen LTP ở giống đậu xanh 044/ĐX06, HN 2 và AY300807 Bảng 3.9. Vị trí sai khác về trình tự amino acid trong protein của gen LTP ở giống đậu xanh 044/ĐX06, HN 2 và AY300807 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ I. KẾT LUẬN 13 giống đậu xanh có nguồn gốc khác nhau được sử dụng trong nghiên cứu có: khối lượng 1000 hạt dao dộng từ 46,40 g (ở giống 044/ĐX06) đến 58,00 g (ở giống BG 2), chiều dài thân ở giai đoạn cây non dao động từ 8,05cm (ở giống HN 2) đến14,12 cm (ở giống 044/ĐX06), chiều dài rễ ở giai đoạn cây non dao động từ 6,24 cm (ở giống HN 2) đến 11,45 cm (ở giống 044/ĐX06). Các giống đậu xanh nghiên cứu có hàm lượng lipid dao động từ 2,17 % (ở giống 044/ĐX06) đến 4,78 % (ở giống HN 2), hàm lượng protein dao động từ 18,54 % (HN 2) đến 28,78 % (ở giống 044/ĐX06). Khả năng chịu hạn của các giống đậu xanh nghiên cứu có sự khác biệt. Hai giống có khả năng chịu hạn cao nhất là 044/ĐX06 và BG 3 còn hai giống có khả năng chịu hạn kém nhất là HN 1 và HN 2. KẾT LUẬN 4. Đã nhân bản, chọn dòng và đọc trình tự gen LTP của giống chịu hạn tốt (044/ĐX06) và giống chịu hạn kém (HN 2) thành công. Chiều dài gen LTP ở hai giống đậu xanh trên có kích thước 351 nucleotide với độ tương đồng là 97,7 %. Độ tương đồng về trình tự amino acid trong protein của gen LTP ở hai giống đậu xanh trên đạt 95,6 %. 5. Độ tương đồng giữa trình tự gen LTP của hai giống đậu xanh nghiên cứu với trình tự gen LTP trên đậu xanh đã được công bố trong ngân hàng gen đều là 98,8 %. Độ tương đồng về trình tự amino acid trong protein của gen LTP ở giống đậu xanh có mã số AY300807 với giống đậu xanh 044/ĐX06 và HN 2 lần lượt là 98,2 % và 97,4 %. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ II. ĐỀ NGHỊ Cần tiếp tục nhân bản, chọn dòng và đọc trình tự gen LTP của nhiều giống đậu xanh khác nhau để tìm ra chỉ thị phân tử về tính chịu hạn của cây đậu xanh. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÔNG BỐ So sánh khả năng chịu hạn và phân lập gen LTP (Lipid Transfer Protein) liên quan đến khả năng chịu hạn của một số giống đậu xanh (Vigna radiata L. Wilczek).