Đánh giá khả năng chịu mặn và tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu mặn từ các giống lúa OM4498, VND95-20, IR64, CR203 bằng công nghệ nuôi cấy in vitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU MẶN VÀ TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU CHO CHỌN DÒNG CHỊU MẶN TỪ CÁC GiỐNG LÚA OM4498, VND95-20, IR64, CR203 BẰNG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY IN VITRO Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Tâm Học viên : Nguyễn Thị Hồng Liên Thái Nguyên - 2010 MỞ ĐẦU Đánh giá khả năng chịu mặn và tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu mặn từ các giống lúa OM4498, VND95-20, IR64, CR203 bằng công nghệ nuôi cấy in vitro Mục tiêu nghiên cứu 1 2 - Nghiên cứu khả năng chịu mặn ở một số giống lúa. Tạo vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu mặn ở lúa bằng kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật. MỞ ĐẦU Tạo được vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu mặn bằng kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật - Sàng lọc dòng tế bào chịu mặn, tái sinh cây và tạo cây hoàn chỉnh. Phân tích đặc điểm nông học quần thể R0, thế hệ R1. - Tách chiết ADN tổng số từ lá lúa. Nhân gen liên quan đến khả năng chịu mặn từ các giống lúa nghiên cứu. Đánh giá được khả năng chịu mặn của một số giống lúa nghiên cứu - Đánh giá ở giai đoạn hạt nảy mầm thông qua xác định ảnh hưởng của NaCl đến hàm lượng đường tan và hoạt độ của α - amylase. - Đánh giá nhanh khả năng chịu mặn của các giống nghiên cứu ở giai đoạn mạ ba lá bằng phương pháp gây mặn nhân tạo. Xác định hàm lượng prolin sau khi xử lý mặn sinh lí cây mạ ba lá bằng dung dịch NaCl. - Đánh giá khả năng chịu mặn ở mức độ mô sẹo. Nội dung nghiên cứu MỞ ĐẦU TỔNG QUAN TÀI LIỆU Chúng tôi đã tham khảo 60 tài liệu tiếng Việt và tiếng Anh liên quan đến các vấn đề sau: - Giới thiệu về cây lúa - Đặc điểm sinh học cây lúa nước - Tính chịu mặn - Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật trong cải tiến giống cây trồng - Nghiên cứu gen chịu mặn ở cây trồng NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguyên liệu Vật liệu nghiên cứu là hạt của các giống lúa: OM4498, VND95-20, IR64 do sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn tỉnh Cần Thơ cung cấp, CR203 do sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn tỉnh Bắc Giang cung cấp. Phương pháp - Phương pháp nuôi cấy mô- tế bào - Phương pháp phân tích hoá sinh - Phương pháp phân tích sinh lý - Phương pháp nghiên cứu ngoài đồng ruộng - Phương pháp sinh học phân tử KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Ảnh hưởng của NaCl 0,1M đến hàm lượng đường tan ở giai đoạn hạt nảy mầm 2. Ảnh hưởng của NaCl 0,1M đến hoạt độ của α - amylase ở giai đoạn hạt nảy mầm Hình 3.2. Ảnh hưởng của NaCl 0,1M đến hoạt độ của α - amylase trong giai đoạn hạt nảy mầm KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Bảng 3.3. Tương quan giữa hoạt độ của α - amylase và hàm lượng đường tan ở giai đoạn hạt nảy mầm KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4. Ảnh hưởng của NaCl 0,1M đến tỉ lệ nảy mầm, chiều dài mầm và chiều dài rễ của cây mạ Bảng 3.4. Ảnh hưởng của NaCl 0,1M đến chiều dài mầm, chiều dài rễ và tỉ lệ nảy mầm của cây mạ KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 5. Đánh giá khả năng chịu mặn của các giống lúa bằng phương pháp gây mặn nhân tạo KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Xác định chỉ số chịu mặn tương đối ở mức độ cây mạ các giống lúa KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 7. Đánh giá khả năng chịu mặn thông qua xác định hàm lượng prolin Bảng 3.7. Hàm lượng prolin của các giống lúa nghiên cứu sau khi xử lí NaCl 0,1M ở giai đoạn mạ 3 lá (µM/g khối lượng tươi) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 8. Thăm dò khả năng tạo mô sẹo, tốc độ sinh trưởng và khả năng tái sinh cây của mô sẹo các giống lúa nghiên cứu Bảng 3.8. Khả năng tạo mô sẹo, tốc độ sinh trưởng và khả năng tái sinh cây của các giống lúa nghiên cứu KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 9. Ảnh hưởng của NaCl đến tỷ lệ sống sót của mô sẹo Bảng 3.9. Tỷ lệ sống sót của mô sẹo sau 3 tuần nuôi phục hồi KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 10. Ảnh hưởng của NaCl đến tốc độ sinh trưởng của mô sẹo Bảng 3.11. Tốc độ sinh trưởng tương đối của mô sẹo sau xử lý NaCl 3 tuần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 11. Tỷ lệ tái sinh chồi từ mô sẹo sau khi xử lý NaCl Bảng 3.12. Tỷ lệ tái sinh chồi của mô sẹo sau khi xử lý NaCl 0,1M KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Hình 3.8. Một số hình ảnh trong nuôi cấy in vitro KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 12. Phân nhóm các giống lúa nghiên cứu dựa trên sự phản ứng với NaCl ở mức độ mô sẹo, giai đoạn hạt nảy mầm và giai đoạn cây non Bảng 3.13. Hệ số khác nhau về sự biểu hiện các tính trạng của các giống lúa đối với mặn KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Hình 3.9. Sơ đồ mô tả quan hệ giữa các giống lúa dựa trên sự biểu hiện kiểu hình của 14 tính trạng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 13. Kết quả sàng lọc dòng tế bào chịu mặn - Ngưỡng chọn dòng tế bào chịu mặn đối với các giống OM4498, VND95-20 là 0,1M, ngưỡng chọn dòng chịu NaCl của giống IR64, CR203 là 0,07M - Kết quả thu được 68 dòng mô có khả năng chịu NaCl và 180 dòng cây xanh của 4 giống lúa phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 14. Phân tích mức độ biến động di truyền quần thể R0 Bảng 3.14. Mức độ biến động một số chỉ tiêu nông học của quần thể R0 tái sinh từ mô sẹo chịu mặn của giống OM4498 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 15. Đánh giá mức độ ổn định một số đặc điểm nông học các dòng lúa chọn lọc thế hệ R1 Hình 3.10. Một số hình ảnh về các dòng tái sinh thế hệ R1 có nguồn gốc mô sẹo chịu mặn trồng ngoài đồng ruộng A: Biến dị về thời gian sinh trưởng của dòng R1.OM16; B: Biến dị về chiều cao cây ở dòng R1.VND8; C: Thế hệ R1 giống VND95-20. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN A B C 16. Kết quả tách chiết và tinh sạch ADN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17. Nhân gen NACx bằng kĩ thuật PCR Hình 3.11. Nhân gen từ các giống lúa bằng kĩ thuật PCR A: Phổ điện di ADN của 4 giống lúa; B: Hình ảnh điện di sản phẩm nhân gen NACx của 4 giống lúa với mồi DBF và DBMF ở nhiệt độ 450C và 460C KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN A B I. Kết luận 1. Ở giai đoạn hạt nảy mầm, hoạt độ của α - amylase, hàm lượng đường tan có xu hướng tăng từ 1 đến 3 ngày tuổi, bắt đầu giảm ở 5 ngày tuổi. Dưới tác động của NaCl 0,1M, tốc độ nảy mầm, chiều dài mầm và chiều dài rễ của các giống lúa đều giảm. Trong đó, giảm nhiều nhất là giống CR203, giảm ít nhất là giống OM4498. 2. Ở giai đoạn cây non 3 lá, các giống lúa phản ứng khác nhau đối với mặn. Khi tiến hành gây mặn nhân tạo ở giai đoạn cây non 3 lá, các giống lúa nghiên cứu đều tăng tổng hợp axit amin prolin. 3. Cả 4 giống lúa đều có khả năng tạo mô sẹo và khả năng tái sinh cây từ mô sẹo. Xử lý mô sẹo ở ngưỡng NaCl 0,03M không làm ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của mô sẹo, ngược lại còn kích thích sự sinh trưởng của mô sẹo. Tăng nồng độ xử lý NaCl lên 0,07M và 0,1M làm ức chế sự sinh trưởng của mô sẹo so với đối chứng. 4. Ngưỡng chọn dòng chịu mặn của các giống lúa phụ thuộc vào khả năng chịu mặn của từng giống. Kết quả đã tạo được 68 dòng mô và 180 dòng cây xanh. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5. Quần thể R0 có mức độ biến động di truyền cao ở nhiều tính trạng nông học, cho phép lựa chọn những dòng có tính trạng mong muốn. Qua 2 vụ theo dõi đã thu được một số dòng R1 có những đặc điểm nổi bật . 6. Đã nhân bản thành công gen liên quan đến khả năng chịu mặn của các giống lúa nghiên cứu từ ADN hệ gen, đó là gen NACx với kích thước khoảng 1kb. 7. Khả năng chịu mặn của các giống nghiên cứu được sắp xếp theo thứ tự sau: OM4498 >VND95-20 > IR64 > CR203. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ II. Đề nghị 1. Để có thể đưa ra kết luận đầy đủ và chính xác về cấu trúc và bản chất của gen chịu mặn NACx ở cây lúa cần phải xác định trình tự của các nucleotit của gen này. 2. Tiếp tục theo dõi các dòng thu được ở thế hệ tiếp theo, tiến hành phân tích sinh lý, hoá sinh và sinh học phân tử các dòng chọn lọc làm cơ sở tuyển chọn các dòng mang nhiều đặc điểm ưu việt để bồi dưỡng thành giống lúa có khả năng chịu mặn cao. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ