Đề tài Đánh giá đa dạng tập đoàn giống lúa có tính kháng khác nhau với bệnh bạc lá vi khuẩn Xanthomonas oryzae bằng kỹ thuật RAPD

µi tõ mÐp l¸ c¸ch ®Ønh vµi cm. Trªn phiÕn l¸, vÕt bÖnh lan réng theo c¶ chiÒu dµi vµ réng, cã mÐp viÒn h×nh sãng råi trë nªn vµng sau vµi ngµy. Khi bÖnh tiÕn triÓn, vÕt bÖnh lan réng phñ kÝn c¶ mÆt l¸, chuyÓn tõ tr¾ng sang x¸m nh¹t do sù sinh tr­ëng cña c¸c nÊm ho¹i sinh. §èi víi c¸c gièng c¶m nhiÔm, vÕt bÖnh lan réng tíi bÑ l¸ vµ cã thÓ ph¸t triÓn xuèng tËn phÇn d­íi cña bÑ l¸, lµm phiÕn l¸ bÞ hÐo vµ cuén l¹i trong khi l¸ vÉn cßn xanh, sau ®ã toµn bé phiÕn l¸ cã thÓ bÞ hÐo råi kh« ®i. ë c¸c ruéng lóa bÞ bÖnh nghiªm träng, h¹t còng cã thÓ bÞ nhiÔm bÖnh. Trªn vá h¹t xuÊt hiÖn c¸c ®èm mµu nh¹t, xung quanh cã mÐp viÒn d¹ng giät dÇu. Khi h¹t cßn non vµ xanh c¸c vÕt bÖnh lé râ, khi b«ng chÝn vÕt bÖnh sÏ cã mµu x¸m,, hoÆc tr¾ng hoÆc vµng nh¹t [6], [19]. 1.2.3. c¸c yÕu tè ¶nh h­ëng ®Õn sù ph¸t triÓn cña bÖnh Trong dù b¸o bÖnh b¹c l¸, yÕu tè khÝ hËu lµ ®èi t­îng ®Ó ph©n tÝch. C¸c nhµ khoa häc ph¸t hiÖn thÊy r»ng møc ®é nhiÔm bÖnh t­¬ng quan víi tæng l­îng m­a, møc ®é ngËp lôt, giã m¹nh vµ ®é s©u n­íc t­íi. NhiÖt ®é t­¬ng ®èi cao trong thêi kú lóa sinh tr­ëng cã thÓ lµm t¨ng bÖnh, song mïa hÌ qu¸ nãng vµ kh« lµ ®iÒu kiÖn h¹n chÕ bÖnh. Kü thuËt trång trät còng lµ mét trong nh÷ng ®iÒu kiÖn quan träng ¶nh h­ëng ®Õn sù ph¸t sinh, ph¸t triÓn bÖnh, song còng rÊt phøc t¹p v× mét mÆt nã ¶nh h­ëng tíi sù ph¸t sinh ph¸t triÓn cña c©y lóa - lµm t¨ng hay lµm gi¶m tÝnh chèng chÞu, mÆt kh¸c nã ¶nh h­ëng tíi tiÓu khÝ hËu ®ång ruéng. Trong c¸c yÕu tè kü thuËt ch¨m sãc th× ph©n bãn cã ¶nh h­ëng râ rÖt nhÊt tíi sù ph¸t sinh, ph¸t triÓn cña bÖnh. Cô thÓ lµ bãn ®¹m qu¸ nhiÒu, bãn thóc muén, thiÕu l©n, kali vµ magie ®Òu lµm t¨ng bÖnh. ë nh÷ng n¬i ®Êt chua, óng ngËp ®Æc biÖt ë nh÷ng vïng ®Êt nhiÒu mïn, hµng lóa bÞ ch¾n n¾ng th× bÖnh b¹c l¸ cã thÓ ph¸t triÓn m¹nh h¬n [6]. Trong tÊt c¶ c¸c giai ®o¹n sinh tr­ëng, c©y ®Òu cã thÓ bÞ nhiÔm bÖnh nh­ng ë møc ®é kh¸c nhau tuú tõng giai ®o¹n sinh tr­ëng. Nãi chung, tõ thêi k× m¹ ®Õn khi lóa ®Î nh¸nh lµ thêi kú bÖnh t­¬ng ®èi Ýt h¬n so víi giai ®o¹n cuèi ®Î nh¸nh. Giai ®o¹n lóa lµm ®ßng - trç - chÝn s÷a lµ giai ®o¹n rÊt mÉn c¶m víi bÖnh, hiÖn t­îng nµy thÓ hiÖn kh¸ râ nÐt trªn c¸c gièng lóa ng¾n ngµy, chÞu ph©n, cã n¨ng suÊt cao, cÊy trong vô Chiªm xu©n vµ vô Mïa [11]. 1.2.4. T¸c h¹i cña bÖnh b¹c l¸ lóa vi khuÈn BÖnh b¹c l¸ vi khuÈn ®· lµm gi¶m n¨ng suÊt lóa g¹o h»ng n¨m ë Ch©u ¸ xuèng 60%. VÝ dô ë NhËt nh÷ng n¨m gÇn ®©y, cã kho¶ng 300.000 - 400.000 hecta lóa bÞ ¶nh h­ëng bëi bÖnh nµy vµ n¨ng suÊt gi¶m 20 - 50%. ë nh÷ng c¸nh ®ång nhiÔm bÖnh ngiªm träng ë Indonesia, s¶n l­îng lóa cßn thÊp h¬n so víi ë NhËt; cßn ë Ên ®é, hµng triÖu hecta lóa nhiÔm bÖnh nghiªm träng lµm cho n¨ng suÊt gi¶m tõ 6 - 60%. ë ViÖt Nam, bÖnh b¹c l¸ ®­îc ph¸t hiÖn tõ l©u trªn c¸c gièng lóa mïa cò, ®Æc biÖt tõ n¨m 1965 trë l¹i ®©y bÖnh th­êng xuyªn ph¸ ho¹i nghiªm träng ë c¸c vïng trång lóa [6], [19].th× sao? 1.2.5. C¸c biÖn ph¸p phßng trõ C¨n cø vµo ®Æc ®iÓm sinh häc cña vi khuÈn g©y bÖnh, c¸c nhµ khoa häc ®· ®­a ra nh÷ng biÖn ph¸p phßng trõ tæng hîp nh­: xö lý h¹t gièng tr­íc khi gieo nÕu l« h¹t bÞ nhiÔm bÖnh, bãn ph©n ®óng kü thuËt vµ ®óng giai ®o¹n, ruéng lóa cÇn ®iÒu chØnh møc n­íc thÝch hîp, chó ý vÖ sinh ®ång ruéng hoÆc cã thÓ sö dông thuèc hãa häc ®Ó h¹n chÕ sù ph¸t sinh, ph¸t triÓn cña bÖnh... [6]. Cho ®Õn nay, viÖc sö dông gièng chèng chÞu bÖnh vÉn lµ biÖn ph¸p cã hiÖu qu¶ nhÊt v× gi¶m ®­îc chi phÝ do sö dông thuèc hãa häc vµ b¶o vÖ m«i tr­êng tèt h¬n. ChÝnh v× vËy, viÖc chän t¹o ra nh÷ng gièng lóa kh¸ng bÖnh b¹c l¸ lu«n lµ môc tiªu hµng ®Çu cña c¸c nhµ t¹o gièng trªn thÕ giíi còng nh­ ë ViÖt Nam [24], [30]. Cïng víi sù ph¸t triÓn cña khoa häc hiÖn ®¹i c¸c nhµ nghiªn cøu t×m thÊy kho¶ng 24 gen kh¸ng bÖnh b¹c l¸ ë nhiÒu loµi lóa hoang d¹i vµ c¸c gièng lóa ®Þa ph­¬ng. Gen kh¸ng ®­îc thèng nhÊt cã tªn lµ Xa + sè thø tù, vÝ dô nh­ Xa1, Xa2... Trong sè ®ã, Xa21 cã phæ kh¸ng réng vµ ®­îc chó ý nhiÒu trong c«ng nghÖ chuyÓn gen hiÖn nay [20], [27]. 1.2.6. Mét sè thµnh tùu trong chän gièng lóa kh¸ng bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn Trong 50 n¨m gÇn ®©y, c¸c nhµ khoa häc ®· ph¸t triÓn nhiÒu kü thuËt thanh läc ng©n hµng gen ®èi víi tÝnh tr¹ng chèng chÞu vi khuÈn, c«n trïng g©y h¹i c©y trång, x¸c ®Þnh nguån cung cÊp gen kh¸ng. Víi ph­¬ng ph¸p chän gièng truyÒn thèng, c¸c nhµ khoa häc ®· t¹o ra nhiÒu gièng c©y trång kh¸ng bÖnh b¹c l¸ vµ ®­îc gieo trång víi diÖn tÝch hµng triÖu ha. Vµ chän gièng ngoµi ®ång ruéng, kh¶o nghiÖm vµ t¹o c¸c gièng lóa chèng chÞu bÖnh tõ l©u ®· ®­îc thùc hiÖn ë nhiÒu n­íc trªn thÕ giíi. Kh«ng hiÓu ý c©u nµy? ë NhËt B¶n, gÇn ®©y c¸c nhµ khoa häc ®· chän ®­îc nhiÒu gièng lóa kh¸ng bÖnh ®­îc sö dông ®Ó lai t¹o ra c¸c gièng míi nh­ gièng Sengoku 4, Magatama, Zensho 26, Norin 27... Tuy nhiªn, kÕt qu¶ kiÓm tra ngoµi ®ång ruéng cho thÊy ch­a chän ®­îc gièng cã tÝnh chèng chÞu cao víi c¸c nßi vi khuÈn g©y bÖnh b¹c l¸ míi ®­îc gi¸m ®Þnh gÇn ®©y. N¨m 1968, Sakaguchi vµ CS ®· kh¶o nghiÖm 863 gièng lóa ®­îc trång phæ biÕn ë nhiÒu n¬i trªn thÕ giíi vµ ph¸t hiÖn gièng lóa Lead cña MiÕn §iÖn, TKM6 vµ Nigeria 5 chèng chÞu kh¸ víi hÇu hÕt c¸c nhãm vi khuÈn g©y bÖnh b¹c l¸ thuéc c¸c nßi kh¸c nhau [9], [11]. ë viÖt Nam, ®· cã nhiÒu nghiªn cøu ®Ó chän t¹o gièng lóa mang gen kh¸ng bÖnh b¹c l¸. Nh­ ë ViÖn Lóa §ång b»ng s«ng Ccöu lLong, b»ng ph­¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ kiÓu gen nhê chØ thÞ ph©n tö ®èi víi 148 gièng lóa ®Þa ph­¬ng cã nguån gèc Duyªn h¶i Trung Bé cho thÊy c¸c gièng lóa: Cµ §ung, Ba Tóc, Th¬m Lung, VÖ PhÝch, Lóa Tr¾ng, NÕp Hoa Vµng, Lóa Th­íc, Quinkes 85 vµ Seraup kechil 30 cã gen kh¸ng Xa13; gen kh¸ng Xa5 ®­îc t×m thÊy trªn gièng Nµng Tri, Tr¾ng Lïn, Be Ren, Giµu Dumont; gièng Lóa Sãc, Lóa Mïa 2, Tr¾ng Qu·ng, Tr¾ng Ph­íc, Tµu H­¬ng, Nµng SËu cã gen kh¸ng Xa4 [4]. 1.3. øng dông kü thuËt RAPD - PCR trong nghiªn cøu ®a h×nh ADN 1.3.1. Ph¶n øng PCR Kü thuËt nh©n b¶n ADN ®Æc hiÖu dùa vµo ph¶n øng chuçi trïng hîp (Polymerase Chain Reaction) ®­îc Karry Mullis hoµn thiÖn vµo gi÷a nh÷ng n¨m 80 ®· gãp phÇn t¹o ra mét cuéc c¸ch m¹ng trong sinh häc ph©n tö. Kü thuËt PCR lµ mét ph­¬ng ph¸p hoµn toµn míi trong viÖc nghiªn cøu vµ ph©n tÝch c¸c gen. Sö dông kü thuËt PCR cã thÓ t¹o ra mét sè l­îng lín c¸c b¶n sao cña ®o¹n ADN cÇn tæng hîp mµ kh«ng ph¶i t¸ch vµ nh©n dßng. Thùc chÊt PCR lµ mét ph­¬ng ph¸p in vitro vitro cho phÐp nh©n b¶n nhanh mét ®o¹n ADN nµo ®ã mµ chØ cÇn mét khèi l­îng mÉu ban ®Çu h¹n chÕ [8], [5]. Ph¶n øng PCR lµ mét chuçi ph¶n øng gåm nhiÒu chu kú lÆp l¹i, mçi chu kú gåm 3 giai ®o¹n: + Giai ®o¹n 1 (BiÕn biÕn tÝnh): ADN ®­îc biÕn tÝnh ë nhiÖt ®é kho¶ng 950C trong thêi gian kho¶ng 1 phót, khi ®ã c¸c liªn kÕt hidro bÞ ®øt vµ sîi ADN kÐp t¸ch thµnh hai sîi ®¬n. + Giai ®o¹n 2 (Gg¾n måi): ë nhiÖt ®é tõ 300C ®Õn 650C trong kho¶ng 30 gi©y ®Õn 1 phót th× c¸c måi b¾t cÆp víi sîi ADN khu«n theo nguyªn t¾c bæ sung ë hai ®Çu ®o¹n ADN cÇn nh©n. NhiÖt ®é cña b­íc g¾n måi tïy thuéc vµo tõng lo¹i måi cô thÓ, ®­îc tÝnh to¸n dùa trªn nhiÖt ®é nãng ch¶y (Tm) cña ®o¹n måi [3], [5]. C«ng thøc tÝnh nhiÖt ®é nãng ch¶y (Tm) cña ®o¹n måi: Tm = 81,5 + 16,6(log10 {J+}) + 0,41(%G + C) - (600/I) - 0,63(%FA) Trong ®ã: {J+}: nång ®é cña c¸c cation hãa trÞ I FA: chÊt dïng ®Ó g©y biÕn tÝnh ADN I: chiÒu dµi cña måi + Giai ®o¹n 3 (tæng hîp ADN): ë nhiÖt ®é kho¶ng 720C, trong kho¶ng thêi gian tõ 30 gi©y ®Õn nhiÒu phót (tuú thuéc vµo chiÒu dµi ®o¹n ADN cÇn tæng hîp), khi ®ã, enzym Taq polymerase ho¹t ®éng vµ qu¸ tr×nh tæng hîp ADN diÔn ra trªn nh÷ng ®o¹n gi÷a cÆp måi theo chiÒu tõ 5’- 3’. Mét chu kú gåm 3 b­íc trªn ®­îc lÆp ®i lÆp l¹i nhiÒu lÇn vµ qua mçi lÇn lµm t¨ng gÊp ®«i sè mÉu lÇn tr­íc. Sù t¨ng l­îng mÉu nµy theo cÊp sè nh©n, nªn sau n chu k× sè mÉu thu ®­îc lµ: A = x.2n Trong ®ã A: Tæng sè b¶n sao ADN x: Sè l­îng ph©n tö ADN lµm khu«n ban ®Çu n: Sè chu kú C¸c thµnh phÇn c¬ b¶n cña mét ph¶n øng PCR gåm: ADN khu«n, hai ®o¹n måi ®Ó x¸c ®Þnh c¸c ®iÓm b¾t ®Çu tæng hîp ADN, Taq polymerase, hçn hîp bèn tiÒn chÊt deoxynucleotit, dung dÞch ®Öm chøa mét sè cation hãa trÞ 1, ion Mg2+ vµ dung m«i (n­íc khö ion khö trïng). - Enzym Taq polymerase: Enzym Taq polymerase lµ enzym chÞu nhiÖt, ®­îc t¸ch tõ vi khuÈn suèi n­íc nãng Thermus aquaticus. Enzym Taq cã träng l­îng ph©n tö lµ 94 kDa vµ kh«ng mÊt ho¹t tÝnh ë nhiÖt ®é cao trong giai ®o¹n g©y biÕn tÝnh ADN, nh­ng ho¹t tÝnh cña enzym Taq gi¶m 50% sau 150 phót ë nhiÖt ®é 92,50C; sau 40 phót ë nhiÖt ®é 950C vµ sau 5 - 6 phót ë nhiÖt ®é 970C. NÕu nhiÖt ®é t¨ng lªn tíi 950C trong 20 gi©y ®Ó biÕn tÝnh ADN kÐp thµnh sîi ®¬n th× ho¹t tÝnh enzym Taq cßn l¹i 65% sau 50 chu k× ph¶n øng. Nång ®é enzym Taq tèi ­u cho ph¶n øng PCR lµ 0,5 - 2,5 ®¬n vÞ; nh­ng nÕu nång ®é enzym qu¸ cao sÏ lµm gi¶m hiÖu xuÊt xóc t¸c cña ph¶n øng. Ngoµi ra, nång ®é Mg2+ vµ dNTP còng ¶nh h­ëng ®Õn ho¹t tÝnh cña enzym. HiÖn nay, cã nhiÒu lo¹i polymerase chÞu nhiÖt kh¸c cã chøc n¨ng riªng biÖt vµ hoµn thiÖn h¬n nh­ Tth polymerase t¸ch chiÕt tõ Thermus thermophilus, cã kh¶ n¨ng ho¹t ®éng nh­ mét enzym phiªn m· ng­îc khi cã mÆt cña ARN khu«n vµ ion Mn2+. - ADN khu«n (template): ADN khu«n lµ vËt liÖu khëi ®Çu cho ph¶n øng PCR nªn ®ßi hái ph¶i cã ®é tinh s¹ch cao. ADN khu«n cã thÓ lµ sîi ®¬n hoÆc sîi ®«i cña chuçi ADN hayARN ®­îc biÕt tr­íc tr×nh tù ë hai ®Çu ®Ó thiÕt kÕ måi. Th«ng th­êng, nång ®é cña ADN khu«n ®­îc ®­a vµo ph¶n øng PCR kho¶ng 10 - 500 ng. - §o¹n måi (primer): C¸c ®o¹n måi thùc chÊt lµ c¸c oligonucleotit dµi kho¶ng 4 - 10 baz¬ (®èi víi måi ngÉu nhiªn) hoÆc kho¶ng 12 - 24 baz¬ (®èi víi måi ®Æc tr­ng). Nång ®é måi thÝch hîp ®Ó tiÕn hµnh ph¶n øng PCR lµ tõ 0,1 - 0,5 mM. L­îng måi ®­a vµo ph¶n øng PCR ph¶i phï hîp víi l­îng ADN cÇn tæng hîp (th­êng 106 ph©n tö ADN cÇn 108 ph©n tö primer). NÕu nång ®é måi qu¸ thÊp th× måi sÏ hÕt tr­íc khi sè chu k× kÕt thóc, cßn nång ®é måi qu¸ cao th× sÏ dÔ lµm t¨ng s¶n phÈm kh«ng ®Æc hiÖu. C¸c ®o¹n måi cÇn cã tÝnh ®Æc thï ®Ó lµm t¨ng tÝnh ®Æc hiÖu cña ph¶n øng. Måi ph¶i ®­îc thiÕt kÕ sao cho kh«ng ®­îc bæ trî lÉn nhau, sè l­îng 4 lo¹i baz¬ nit¬ trong måi nªn xÊp xØ nhau, l­îng G - C gi÷a hai måi ph¶i b»ng nhau, tr¸nh nh÷ng vïng tr×nh tù kh«ng b×nh th­êng nh­ polypurin hoÆc polyprimidine hay c¸c tr×nh tù lÆp. - C¸c nucleotit (dNTPs): Lµ hçn hîp cña bèn lo¹i deoxyribonucleotit (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) lµm nguyªn liÖu cho ph¶n øng tæng hîp ADN. Tuú thuéc vµo môc ®Ých nghiªn cøu, c¸c nhµ khoa häc cßn cã thÓ sö dông mét sè nucleotit ®· ®­îc thay ®æi nh­ g¾n thªm biotin hoÆc digoxigenin... Nång ®é ph¶n øng cña c¸c dNTP th­êng dïng vµo kho¶ng 200 mM mçi lo¹i, tuy nhiªn ë nång ®é dNTP thÊp (10 - 100 mM) Taq ADN polymerase ho¹t ®éng chÝnh x¸c h¬n. H¬n n÷a, nång ®é tèi ­u cña chóng phô thuéc vµo rÊt nhiÒu yÕu tè nh­: + Nång ®é Mg2+ + Nång ®é chÊt måi + §é dµi cña s¶n phÈm ®­îc khuyÕch ®¹i + Sè chu kú cña ph¶n øng - Dung dÞch ®Öm (buffer) Thµnh phÇn cña dung dÞch ®Öm phô thuéc vµo lo¹i enzym polymerase ®­îc sö dông. Trong dung dÞch ®Öm quan träng nhÊt lµ ion Mg2+. Ion Mg2+ lµm t¨ng nhiÖt ®é nãng ch¶y (Tm) cña ADN m¹ch ®«i, t¹o ra phøc chÊt tan víi dNTPs ®Ó h×nh thµnh c¬ chÊt mµ enzym polymerase cã thÓ nhËn ra, ®iÒu nµy rÊt cÇn thiÕt cho qu¸ tr×nh liªn kÕt cña c¸c dNTP. Nång ®é Mg2+ trong hçn hîp ph¶n øng cuèi cïng biÕn ®æi tõ 0,5 - 5,0 mM (nång ®é nµy cã thÓ thay ®æi khi cÇn thiÕt). Nång ®é ion Mg2+ qu¸ thÊp sÏ lµm gi¶m kh¶ n¨ng tæng hîp cña enzym polymerase, cßn nÕu nång ®é qu¸ cao sÏ t¹o ra nh÷ng ph©n ®o¹n kh«ng ®Æc hiÖu. Nh×n chung nång ®é MgCl2 cã ¶nh h­ëng nhiÒu tíi hiÖu qu¶ vµ tÝnh ®Æc thï cña ph¶n øng. Ngoµi Mg2+ cßn mét sè chÊt kh¸c trong dung dÞch ®Öm nh­ AMSO, DMSO, formamide ®­îc thªm vµo nh­ c¸c chÊt phô gia nh»m t¹o ra c¸c s¶n phÈm PCR cã kÝnh th­íc lín [3]. Kü thuËt PCR lµ mét c«ng cô h÷u hiÖu cho viÖc ph©n tÝch hÖ gen cña sinh vËt v× nã cã kh¶ n¨ng t¹o ra mét l­îng lín tr×nh tù ANDN ®Æc hiÖu tõ bÊt cø c¬ thÓ nµo. PCR ®­îc sö dông vµo nhiÒu môc ®Ých kh¸c nhau nh­: x¸c ®Þnh tr×nh tù trùc tiÕp tõ ®o¹n ®­îc nh©n, nh©n b¶n quÇn thÓ mARN ®Ó lµm mÉu lai, x¸c ®Þnh c¸c tr×nh tù ®Æc hiÖu tõ cADN hay th­ viÖn gen, x¸c ®Þnh sinh vËt chuyÓn gen, t¹o ®ét biÕn ®Þnh h­íng [1]. 1.3.2. Kü thuËt RAPD vµ øng dông Trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y, nhiÒu kü thuËt míi ra ®êi dùa trªn nguyªn t¾c cña PCR cho phÐp ta x¸c ®Þnh ®­îc tÝnh ®a d¹ng cña hÖ gen víi nhiÒu ­u ®iÓm nh­ kü thuËt AFLP, SSR, RFLP, RAPD..... - Kü thuËt AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) cho phÐp ta ph¸t hiÖn ®­îc tÝnh ®a d¹ng vÒ chiÒu dµi c¸c ®o¹n ADN ®­îc nh©n b¶n chän läc - c¾t ra bëi enzym giíi h¹n. Sö dông kü thuËt nµy cã thÓ nh©n cïng mét lóc mét c¸ch ®Æc tr­ng víi sè l­îng lín c¸c ®o¹n ADN cã kÝch th­íc giíi h¹n. Kü thuËt AFLP kÕt hîp ®­îc nh÷ng ­u ®iÓm cña RFLP vµ RAPD nªn nã cã hiÖu qu¶ trong viÖc ph¸t hiÖn ®a h×nh ADN. Ngoµi ra, kü thuËt nµy cã thÓ ph©n tÝch tÝnh ®a h×nh mét c¸ch nhanh chãng, æn ®Þnh vµ ®¸ng tin cËy [3]. - Kü thuËt RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphic ADN - ®a h×nh vÒ chiÒu dµi cña c¸c ®o¹n ADN ®­îc c¾t ngÉu nhiªn bëi c¸c enzym giíi h¹n): Sö dông kü thuËt RFLP cã thÓ t¹o nªn c¸c ®o¹n c¾t kh¸c nhau ®­îc ph©n biÖt b»ng ph­¬ng ph¸p ®iÖn di. Nh­îc ®iÓm cña kü thuËt nµy lµ quy tr×nh phøc t¹p, cång kÒnh, khã tù ®éng ho¸, tèn kÐm vµ sö dông chÊt ®ång vÞ phãng x¹ g©y nguy hiÓm cho ng­êi thao t¸c [3], [8]. - Kü thuËt SSR (Simple Sequence Repeats) hay cßn gäi lµ vi vÖ tinh (microsatellites), lµ mét ®o¹n ADN cã sù lÆp l¹i cña mét trËt tù nucleotit ®¬n gi¶n nµo ®ã. Kü thuËt SSR cho phÐp ph¸t hiÖn ®­îc tÝnh ®a h×nh vÒ ®é dµi c¸c trËt tù nucleotit ®¬n gi¶n. Nh­îc ®iÓm cña kü thuËt SSR lµ tèn kÐm vÒ tiÒn cña, c«ng søc trong viÖc x©y dùng cÆp måi ®Æc hiÖu cho mçi locus ®a h×nh (®Ó x©y dùng c¸c cÆp måi ®Æc hiÖu cÇn t¸ch dßng vµ ®äc tr×nh tù mét sè l­îng lín c¸c ®o¹n ADN hÖ gen chøa ®o¹n lÆp l¹i) [8], [3]. - Kü thuËt RAPD (cßn ®­îc gäi lµ kü thuËt ph©n lo¹i ph©n tö): ®­îc sö dông ®Ó ph©n tÝch vµ x¸c ®Þnh mèi quan hÖ th©n thuéc gi÷a c¸c gièng c©y trång hay gi÷a c¸c c¸ thÓ, phôc vô cho c«ng t¸c lai t¹o gièng hoÆc ph©n lo¹i. ¦u ®iÓm cña kü thuËt nµy lµ nhanh, rÎ, ®¬n gi¶n vµ gióp x¸c ®Þnh tÝnh ®a d¹ng sinh häc, nguån gèc di truyÒn cña c¸c gièng ®éng vËt, thùc vËt, vi sinh vËt. N¨m 1990, William vµ CS ®· ph¸t triÓn kü thuËt RAPD (Random Amplified Polymorphic ADN) trªn c¬ së PCR. VÒ c¬ b¶n, kü thuËt nµy sö dông nh÷ng ®o¹n måi ng¾n kho¶ng 4 - 10 nucleotit kh«ng ®Æc tr­ng ®Ó tiÕn hµnh ph¶n øng PCR. Nh­ng ®èi víi mçi ®èi t­îng, ta ph¶i tiÕn hµnh sµng läc ®Ó chän läc ®­îc mét sè måi thÝch hîp [1]. S¶n phÈm PCR khi dïng víi måi ngÉu nhiªn th­êng ®a d¹ng, cã chiÒu dµi tõ 100 - 5000 nucleotit vµ khi ®iÖn di trªn gel agarose ®­îc ph©n t¸ch thµnh c¸c ph©n ®o¹n kh¸c nhau. TÝnh ®a d¹ng thu ®­îc nhê kü thuËt RAPD lµ ®¸ng tin cËy v× khi cã sù thay ®æi mét baz¬ nit¬ nµo ®ã th× nã sÏ ng¨n c¶n sù tiÕp hîp cña måi víi ADN khu«n. sù mÊt ®o¹n nhiÔm s¾c thÓ hoÆc sù thªm bít ®iÓm g¾n måi còng nh­ sù xen vµo mét gen nµo ®ã sÏ lµm thay ®æi kÝch th­íc cña ®o¹n ADN ®­îc nh©n b¶n. mçi ®o¹n måi cã thÓ t¹o ra mét hoÆc mét vµi sù ®a d¹ng, cã thÓ ph¸t hiÖn ®­îc vµ cho ra phæ ®iÖn di ®Æc tr­ng. Kü thuËt RADP ®­îc sù dông trong c¸c môc ®Ých nghiªn cøu ®a h×nh di truyÒn, lËp b¶n ®å gen liªn kÕt vµ ph©n tÝch con lai F1. ­u ®iÓm cña kü thuËt RADP lµ kh«ng cÇn biÕt tr×nh tù ®o¹n ADN cÇn nghiªn cøu, quy tr×nh tiÕn hµnh nhanh, chØ cÇn mét l­îng nhá ADN khu«n. Bªn c¹nh ®ã, chØ cÇn mét bé måi ta cã thÓ sö dông ®­îc víi c¸c loµi kh¸c nhau trong khi c¸c mÉu dß RFLP chØ cã thÓ dïng ®­îc cho c¸c loµi cã quan hÖ gÇn gòi nhau. TÝnh ®a d¹ng thu ®­îc tõ c¸c chØ thÞ RAPD ®­îc ®¸nh gi¸ cao h¬n so víi kü thuËt RFLP vµ cho phÐp ph¸t hiÖn ®­îc tÝnh ®a d¹ng ngay c¶ trong c¸c ®o¹n chøa c¸c trËt tù nucleotit lÆp l¹i. Nh­îc ®iÓm cña chØ thÞ nµy lµ: chØ thÞ RAPD cã tÝnh chÊt tréi do ®ã nh÷ng gen ®iÒu khiÓn tÝnh tr¹ng nµo ®ã cã tÝnh lÆn sÏ khã t×m thÊy sù ®a h×nh trªn gel ®iÖn di. H¬n n÷a, RAPD cã tÝnh chÊt ngÉu nhiªn nªn viÖc lÆp l¹i ph©n tÝch ®iÖn di ®Ó t×m liªn kÕt gen th­êng kh«ng thèng nhÊt [3]. C¸c nghiªn cøu gÇn ®©y cho thÊy RAPD lµ mét kü thuËt cã hiÖu qu¶ trong viÖc x¸c dÞnh kiÓu gen, ph©n tÝch quÇn thÓ vµ nguån gèc loµi, nghiªn cøu di truyÒn loµi vµ lËp b¶n ®å di truyÒn. Kü thuËt RAPD ®­îc sö dông ®Ó nhËn biÕt vµ ph©n lo¹i c¸c gièng c©y kh¸c nhau, sù ®a d¹ng di truyÒn gi÷a lóa Indica vµ Japonica, x¸c ®Þnh sù ®a h×nh cña c¸c c©y t¸i sinh cã nguån gèc m« sÑo, tÕ bµo huyÒn phï vµ tÕ bµo trÇn... Yang vµ Quiros ®· sö dông 28 ®o¹n måi cã ®é dµi 10 bp ®Ó nghiªn cøu sù kh¸c biÖt cña 23 gièng cÇn t©y vµ chóng ®­îc chia thµnh 3 nhãm. KÕt qu¶ nµy còng phï hîp khi dïng 6 chØ thÞ protein ®Ó ph©n lo¹i c¸c gièng cÇn t©y trªn (Yang vµ Quiros, 1993). T­¬ng tù nh­ vËy, nhiÒu t¸c gi¶ ®· dïng RAPD ®Ó lËp c©y chñng lo¹i ph¸t sinh (phylogenic tree) cña c¸c loµi c©y nh­ ng«, ®u ®ñ, hµnh t©y, xoµi, cá ®inh l¨ng…[26], [31]. Dùa trªn sù xuÊt hiÖn hay biÕn mÊt cña c¸c ph©n ®o¹n ADN khi ®iÖn di s¶n phÈm RAPD ®­îc quan s¸t thÊy ë c¸c c¸ thÓ kh¸c nhau vµ ®­îc ®¸nh gi¸ theo qui ­íc 1 = xuÊt hiÖn vµ 0 = biÕn mÊt. Mét b¶ng gåm c¸c gi¸ trÞ 0 vµ 1 ®­îc thiÕt lËp tõ c¸c c¸ thÓ nghiªn cøu sÏ cho phÐp tÝnh ra hÖ sè t­¬ng ®ång di truyÒn cña c¸c cÆp theo Nei vµ Li. Trong qu¸ tr×nh thiÕt lËp mèi quan hÖ gi÷a c¸c loµi hay nhãm loµi, mét sè t¸c gi¶ (Apostol vµ CS, 1993) ®· x©y dùng kü thuËt ph©n nhãm th«ng qua c¸c biÓu ®å RAPD (RAPDLOT). Thùc chÊt kü thuËt nµy gåm 3 b­íc: + B­íc 1: So s¸nh tõng cÆp ®èi t­îng trong nghiªn cøu b»ng c¸ch tÝnh to¸n kho¶ng c¸ch quan hÖ gi÷a chóng + B­íc 2: LËp mét ma trËn gåm tÊt c¶ nh÷ng gi¸ trÞ tÝnh to¸n ®­îc tr­íc ®ã + B­íc 3: Gi¶i ma trËn vµ biÔu diÔn thµnh mét biÓu ®å ®Æc tr­ng [17] Ngµy nay, c¸c nhµ nghiªn cøu ®· thiÕt lËp ®­îc phÇn mÒm m¸y tÝnh ®Ó tù ®éng vÏ nªn biÓu ®å mèi quan hÖ hay ®é t­¬ng ®ång di truyÒn cña c¸c ®èi t­îng nghiªn cøu sau khi nhËp d÷ liÖu vÒ c¸c ph©n ®o¹n ®­îc nh©n b¶n cña c¸c c¸ thÓ. NTSYS pc version 2.0 (Applied Biostatistics Inc., USA., 1998) lµ tªn cña mét ch­¬ng tr×nh thuéc kiÓu trªn ®Ó lËp ra biÓu ®å h×nh c©y. BiÓu ®å h×nh c©y thu ®­îc sÏ thÓ hiÖn møc ®é gÇn nhau cña c¸c c¸ thÓ cho phÐp ®¸nh gi¸ ®­îc mèi quan hÖ di truyÒn gi÷a c¸c c¸ thÓ ®­îc nghiªn cøu. Ch­¬ng tr×nh nµy cho phÐp gi¶m bít thêi gian nghiªn cøu vµ cã ®é chÝnh x¸c cao nªn nã lµ mét phÇn mÒm cã hiÖu qu¶ trong viÖc ph©n tÝch kü thuËt RAPD. Ch­¬ng 2. §èi t­îng vµ ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu 2.1. §èi t­îng nghiªn cøu 2.1.1. §èi t­îng nghiªn cøu §èi t­îng nghiªn cøu tÝnh ®a d¹ng ADN lµ 36 gièng lóa cã nguån gèc, tÝnh kh¸ng kh¸c nhau víi kh¸ng bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn cã nguån gèc vµ tÝnh kh¸ng bÖnh kh¸c nhau do do Bé m«n Di truyÒn MiÔn dÞch, ViÖn Khoa häc Kkü thuËt Nn«ng nghiÖp ViÖt Nam cung cÊp (tr×nh bµy nh­ trong b¶ng 1, ®iÓm ®¸nh gi¸ tÝnh kh¸ngchØ míi d/nhiÔm cña c¸c gièng lóa chØ víi mét nßi vi khuÈn phæ biÕn ë vïng §ång b»ng s«ng Hång). B¶ng 1. Danh s¸ch tËp ®oµn gièng lóa kh¸ng bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn STT Tªn gièng Nguån gèc §iÓm STT Tªn gièng Nguån gèc §iÓm 1 OM3499-5 ViÖt Nam 4,0 19 IRRI346 IRRI 7,70 2 OM3242-50 ViÖt Nam 5,0 20 MILYANG23 Hµn Quèc 7,0 3 OM3496-9 ViÖt Nam 5,0 21 MILYANG42 Hµn Quèc 3,0 4 NTCD1-12 ViÖt Nam 5,0 22 SUWION290 Hµn Quèc 9,0 5 NTCD1-16 ViÖt Nam 5,0 23 BJ1 Ên ®é 7,70 6 T¸m tiªu ViÖt Nam 5,5 24 TÎ tÐp ViÖt Nam 7,70 7 T¸m Xu©n B¾c ViÖt Nam 5,5 25 BL89 ViÖt Nam 3,0 8 NÕp ®en ViÖt Nam 3,3 26 BL28 ViÖt Nam 3,0 9 NÕp c¸i hoa vµng ViÖt Nam 5,5 27 BL31-97 Ên ®é 1,0 10 NÕp sím ViÖt Nam 3,3 28 BBL72-99 Ên ®é 3,0 11 HT1 Trung Quèc 7,7 29 KBL75-99 Ên ®é 3,0 12 N87 §µi Loan 7,7 30 KBL53-99 Ên ®é 5,0 13 DV85 IRRI 1,0 31 Khang d©n Trung Quèc 57,0 14 IRRI1545 IRRI 3,0 32 Chiªm h­¬ng Trung Quèc 9,0 15 IRRI20 IRRI 5,0 33 Q5 Trung Quèc 7,70 16 IRRI8 IRRI 5,0 34 D¤115 ViÖt Nam 57,0 17 KUNTLAN §µi Loan 57,0 35 KB1 ViÖt Nam 7,70 18 ZENITH §µi Loan 57,0 36 TN1 ViÖt Nam 7,70 Ghi chó 1: Kh¸ng cao 3: Kh¸ng 5: Kh¸ng võa 7: NhiÔm võa 9: NhiÔm nÆng 2.1.2. Ho¸ chÊt vµ thiÕt bÞ sö dông: - Ho¸ chÊt vµ thiÕt bÞ m¸y mãc: Ho¸ chÊt vµ thiÕt bÞ sö dông ®­îc ghi kÌm tªn h·ng s¶n xuÊt cho tiÖn theo dâi: Taq ADN polymerase (Perkin-Elmer); M¸y tæng hîp oligonucleotit tù ®éng - Gene Assemble (Pharmacia, Thôy §iÓn); M¸y ®o quang phæ: Diode Array Spectrophotometer (Hewlett Parkard, Mü); M¸y ly t©m AvantiTM30 (Beckman, Mü)… - C¸c måi sö dông trong ph¶n øng RAPD: C¸c måi ngÉu nhiªn sö dông cho viÖc ph©n tÝch genom cña 36 gièng lóa kh¸ng bÖnh b¹c l¸ lóa vi khuÈn do Phßng C«ng nghÖ TÕ bµo Thùc vËt, ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc cung cÊp. Tr×nh tù c¸c måi dµi 10 nucleotit ®­îc thiÕt kÕ theo Monna vµ CS (1994). B¶ng 2: Danh s¸ch 21 måi ngÉu nhiªn dïng trong ph©n tÝch tËp ®oµn 36 gièng lóa kh¸ng bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn. 1. Måi RA31 5’AACCGACGGG 3’ 2. Måi RA32 5’GGGGGTCGTT 3’ 3. Måi RA36 5’TACCACCCCG 3’ 4. Måi RA40 5’GGCGGACTGT 3’ 5. Måi RA45 5’TACCACCCCG 3’ 6. Måi RA46 5’CCAGACCCTG 3’ 7. Måi RA50 5’ GCTGTGCAG 3’ 8. Måi RA142 5’CAATCGCCGT 3’ 9. Måi RA143 5’TCGGCGATAG 3’ 10. Måi RA159 5’GTCCACACGG 3’ 11. Måi OPA13 5’CAG CAC CCAC 3’ 12. Måi OPP19 5’GGGAAGGACA 3’ 13. Måi UBC391 5’GCGAACCTCG 3’ 14. Måi V8 5’GGACGGCGTT 3’ 15. Måi Q14 5’GGACGCTTCA 3’ 16. Måi GN38 17. Måi C19 5’GTTGCCAGCC 3’ 18. Måi O10 5’TCAGAGCGCC 3’ 19. MåiO13 5’GTCAGAGTCC 3’ 20. Måi O18 5’CTCGCTATCC 3’ 21. Måi I13 5’CTGGGGCTGA 3’ M¸y ly t©m l¹nh (Sigma), m¸y PCR (Thermal Cycler PTC 100 h·ng MJ), m¸y ®iÖn di (Biorad), m¸y ®o quang phæ Model 8425A (Hewlett Packard), m¸y chôp ¶nh Gel Doc (Pharmacia)…. 2.2. Ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu 2.2.1. Kü thuËt t¹o c©y con vµ thu l¸ (theo ph­¬ng ph¸p cña phßng C«ng nghÖ tÕ bµo thùc vËt)§inh ThÞ Phßng, (2001) [7].(LuËna C ChuÈn bÞ c©y m¹: H¹t lóa ®­îc ng©m, ñ cho n¶y mÇm. C¸c mÇm m¹ cã ®é dµi 1,5 - 2,0 cm ®­îc ®Æt vµo cèc nu«i c©y cã ®­êng kÝnh 7 cm, cao 6 cm, d­íi ®¸y cèc cã lãt giÊy läc. Mçi cèc ®Æt 15 - 20 mÇm. Nu«i mÇm m¹ trong dung dÞch MS pha lo·ng 10 lÇn ë ®iÒu kiÖn ¸nh s¸ng b×nh th­êng, hai ngµy thay dung dÞch mét lÇn. Khi c©y m¹ ®­îc 3 - 5 l¸ thËt th× tiÕn hµnh thu l¸ ®Ó dïng ngay hoÆc b¶o qu¶n ë tñ l¹nh s©u - 800C. Ta thu l¸ non v× l¸ non cã Ýt s¶n phÈm trao ®æi chÊt g©y trë ng¹i cho kh¶ n¨ng hoµ tan cña ADN thu ®­îc. 2.2.2. T¸ch chiÕt ADN tæng sè tõ l¸ lóa Quy tr×nh t¸ch chiÕt ADN tæng sè tõ l¸ lóa theo ph­¬ng ph¸p cña Egnin vµ CS (1998). a) Ho¸ chÊt sö dông Tris - HCl 1M, pH = 8,0; 5M NaCl; 0,5 EDTA; PVP; 5% SDS; RNase 10mg/ml; 3M CH3COONa, pH 5,3 hoÆc pH 7,0; TE (10mM Tris, pH = 8,0 + 1 mM EDTA, pH = 8,0); Isopropanol: Phenol: Chlorofom: Isoamin (25:24:1); cån 80%. b) Pha ®Öm t¸ch chiÕt ADN B¶ng 3. Nång ®é cña ho¸ chÊt t¸ch ADN tæng sè. Nång ®é dung dÞch stock chuÈn Nång ®é cÇn pha Trong 50ml 1M Tris-HCl, pH = 8,0 50 mM 2,5 ml 5M NaCl 300 mM 3 ml 0,5M EDTA 20 mM 2 ml Polyvinylpyrrolidone 2% 1 g 10% Sodium Ascorbate 0,1% 0,5 ml 20% Saccosine 1,5% 3,75 ml Sodium Metabisulfite 1% 0,5 g H2O cÊt khö ion v« trïng 38,5 ml c) Quy tr×nh t¸ch chiÕt ADN tæng sè tõ l¸ lóa - Thu 0,1 - 0,2 g l¸ lóa non, nghiÒn nhanh trong nit¬ láng b»ng cèi chµy sø cho ®Õn khi mÉu cã d¹ng bét mÞn. NghiÒn trong nit¬ láng ®¶m b¶o mÉu ®­îc nghiÒn triÖt ®Ó, ADN thu ®­îc cã d¹ng søa, cã ph©n tö l­îng cao, kh«ng ®øt ®o¹n. - Thªm 0,8 - 1,0 ml dung dÞch ®Öm t¸ch ADN vµo mÉu l¸ ®· nghiÒn, trén ®Òu b»ng c¸ch ®¶o ng­îc nhÑ. - Gi÷ trong ®¸ 5 phót, thªm 0,8 - 1,0 ml dung dÞch Phenol: Chlorofom: Isoamin = 25: 24: 1, ®¶o ®Òu cho ®Õn khi dung dÞch cã mµu tr¾ng s÷a, ñ trong ®¸ 5 phót. - Ly t©m víi tèc ®é 13.000 vßng/phót ë 40C trong 15 phót. - ChuyÓn 0,8 ml dÞch næi phÝa trªn sang èng eppendorf míi ®· cã s½n 0,8 ml dung dÞch isopropanol l¹nh. - §¶o ®Òu, gi÷ ë nhiÖt ®é 40C trong 10 - 30 phót. - Ly t©m 10.000 vßng/phót ë 40C trong 5 phót. - Lo¹i bá phÇn dÞch næi phÝa trªn, lµm kh« phÇn kÕt tña b»ng m¸y Speed - Vac. - Hoµ tan phÇn kÕt tña trong 150 ml ®Öm TE, ®Ó qua ®ªm ë 40C cho ADN tan hÕt. - Thªm 1,5 ml RNase, trén ®Òu vµ ñ ë 370C trong 30 phót . - Ly t©m 13.000 vßng/phót, chuyÓn dÞch ë phÝa trªn sang mét èng eppendorf 1,5 ml míi, b­íc chuyÓn ph¶i nhÑ nhµng tr¸nh khuÊy cÆn. - Thªm 20 ml CH3COONa 3M, l¾c ®Òu, thªm 400 ml Isopropanol ®Ó tña l¹i. - Ly t©m 10.000 vßng/phót trong 5 phót ë 40C, lo¹i bá dÞch næi vµ thªm 0,5 ml cån 70%. - Ly t©m 13.000 vßng/phót, bá phÇn dÞch næi vµ lµm kh« b»ng m¸y Speed - Vac. - Hoµ tan l¹i ADN trong 100 ml TE, ®Ó qua ®ªm ë 40C. - B¶o qu¶n ADN ë - 200C. 2.2.3. Ph­¬ng ph¸p x¸c ®Þnh hµm l­îng vµ ®é s¹ch cña ADN a) §iÖn di trªn gel agarose - Pha agarose 0,8% trong TAE 1X, ®un nãng, ®Ó nhiÖt ®é h¹ xuèng kho¶ng 600C, ®æ vµo khu«n gel cã cµi l­îc. - Sau 30 phót rót l­îc ra, ®æ ®Öm ch¹y ®iÖn di TAE 1X ngËp b¶n gel 1- 2 mm. - LÊy 2 ml ADN mÉu + 1 ml thuèc nhuém + 7 ml H2O trén ®Òu, dïng pipet tra hçn hîp mÉu vµo giÕng. - Ch¹y ®iÖn di ë 80V trong 30 phót. - Nhuém gel: b¶n gel ch¹y xong ®­îc nhuém trong Ethidium bromide 0,5 mg/ml trong 10 phót, röa s¹ch b»ng n­íc. - Soi gel trªn ®Ìn UV vµ chôp ¶nh. b) §o b»ng m¸y ®o quang phæ hÊp thô §o trªn m¸y ®o quang phæ cã ch­¬ng tr×nh xö lý trªn m¸y vi tÝnh - §o mÉu ë b­íc sãng l = 260 nm. - §o mÉu ë b­íc sãng l = 280 nm. - ChØnh c©n b»ng m¸y: dïng n­íc khö ion v« trïng ®Ó lµm chuÈn. - KiÓm tra m¸y: ®o mét mÉu ADN cã nång ®é chuÈn ®· biÕt tr­íc (ADN cña thùc khuÈn thÓ l). - §o mÉu: pha lo·ng 200 lÇn theo c«ng thøc: lÊy 995 ml n­íc cÊt + 5 ml ADN mÉu vµo cuvet l¾c ®Òu, ®Æt vµo m¸y ®o. - Sau mçi lÇn ®o ph¶i röa s¹ch cuvet b»ng n­íc cÊt. - In kÕt qu¶ ®o ®­îc. - Tõ ®ã, ta tÝnh ®­îc hµm l­îng vµ ®é s¹ch cña ADN + Hµm l­îng ADN (ng/ml) = 50 x HSPL x OD260 + §é s¹ch ADN = OD260/ OD280 Trong ®ã HSPL: hÖ sè pha lo·ng 50: h»ng sè OD260: chØ sè ®o ®­îc ë b­íc sãng 260 nm. OD280: chØ sè ®o ®­îc ë b­íc sãng 280 nm. NÕu ®é s¹ch ADN = 1,8 - 2,0 th× mÉu ®­îc coi lµ s¹ch. 2.2.4. Ph©n tÝch sè liÖu RAPD a) §o¹n måi §o¹n måi ngÉu nhiªn sö dông cho viÖc ph©n tÝch genome cña lóa trong nghiªn cøu nµy gåm 21 måi Operon. C¸c ®o¹n måi cã kÝ hiÖu vµ tr×nh tù lµ: B¶ng 2: Danh s¸ch 21 måi Operon dïng trong ph©n tÝch tËp ®oµn 36 gièng lóa kh¸ng bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn. 1. Måi RA31 5’AACCGACGGG 3’ 2. Måi RA32 5’GGGGGTCGTT 3’ 3. Måi RA36 5’TACCACCCCG 3’ 4. Måi RA40 5’GGCGGACTGT 3’ 5. Måi RA45 5’TACCACCCCG 3’ 6. Måi RA46 5’CCAGACCCTG 3’ 7. Måi RA50 5’ GCTGTGCAG 3’ 8. Måi RA142 5’CAATCGCCGT 3’ 9. Måi RA143 5’TCGGCGATAG 3’ 10. Måi RA159 5’GTCCACACGG 3’ 11. Måi OPA13 12. Måi OPP19 5’GGGAAGGACA 3’ 13. Måi UBC391 5’GCGAACCTCG 3’ 14. Måi V8 5’GGACGGCGTT 3’ 15. Måi Q14 5’GGACGCTTCA 3’ 16. Måi GrN38 17. Måi C19 5’GTTGCCAGCC 3’ 18. Måi O10 5’TCAGAGCGCC 3’ 19. MåiO13 5’GTCAGAGTCC 3’ 20. Måi O18 5’CTCGCTATCC 3’ 21. Måi I13 5’CTGGGGCTGA 3’ ba) Ph¶n øng PCR - RAPD - Mçi èng ph¶n øng PCR cã 25 ml dung dÞch chøa 1X ®Öm PCR; 2,5 mM MgCl2; 100 ml 4dNTPs; 200 nM ®o¹n måi; 0,125 ®¬n vÞ Taq polymerase vµ 10 - 100 ng ADN khu«n. - Trén ®Òu hçn hîp thu ®­îc (thao t¸c trong ®¸ ®Ó ®¶m b¶o c¸c hãa chÊt kh«ng bÞ mÊt ho¹t tÝnh). - TiÕn hµnh nh©n b¶n trong m¸y PCR - Thermal Cycler PTC 100 theo chu tr×nh: + B­íc 1: 940C trong 1 phót + B­íc 2: 920C trong 1 phót + B­íc 3: 350C trong 1 phót + B­íc 4: 720C trong 1 phót + B­íc 5: 720C trong 10 phót + B­íc 6: gi÷ ë 40C B­íc 2 - b­íc 4 lÆp l¹i 45 chu k× c) §iÖn di s¶n phÈm RAPD Pha agarose 1,8% trong TAE 1X ®un nãng, ®Ó nguéi kho¶ng 600C th× ®æ vµo khu«n gel cã cµi l­îc, sau 30 phót th× rót l­îc ra, ®æ ®Öm ch¹y ®iÖn di TAE 1X ngËp b¶n gel 1 mm. LÊy 3 ml thuèc nhuém cho vµo mçi èng s¶n phÈm, trén dÒu. Dïng pipet trén ®Òu, cho hçn hîp vµo giÕng vµ ch¹y ®iÖn di: 100V trong 120 phót. Nhuém gel b»ng Ethidium bromide 0,5 mg/ml trong 15 phót, röa s¹ch b»ng n­íc, soi gel trªn dÌn UV vµ chôp ¶nh. cb) Ph©n tÝch sè liÖu RAPD Tiªu chuÈn ho¸ s¶n phÈm RAPD theo quy ­íc: Sè 1: xuÊt hiÖn ph©n ®o¹n ADN. Sè 0: kh«ng xuÊt hiÖn ph©n ®o¹n ADN. Ph©n tÝch sè liÖu theo qui ­íc: 1 = ph©n ®o¹n ADN xuÊt hiÖn vµ 0 = ph©n ®o¹n ADN kh«ng xuÊt hiÖn, khi ®iÖn di s¶n phÈm RAPD víi c¸c ®o¹n måi ngÉu nhiªn. X¸c ®Þnh hÖ sè di truyÒn gièng nhau theo 3 ph­¬ng ph¸p [23]: + Theo Nei vµ Li, 1979 (hÖ sè Dice) + Theo Jaccard, 1908 (hÖ sè Jaccard) + Theo Sokal vµ Michener, 1958 (hÖ sè Simple Matching: SM) Trong ®ã Sij: hÖ sè gièng nhau gi÷a hai c¸ thÓ i vµ j a: sè ph©n ®o¹n ADN xuÊt hiÖn ë c¶ c¸ thÓ i vµ j b: sè ph©n ®o¹n ADN xuÊt hiÖn ë i vµ kh«ng xuÊt hiÖn ë j c: sè ph©n ®o¹n ADN xuÊt hiÖn ë j vµ kh«ng xuÊt hiÖn ë i d: sè ph©n ®o¹n ADN xuÊt hiÖn ë c¸ thÓ i vµ j So s¸nh hÖ sè t­¬ng quan kiÓu h×nh theo 3 ph­¬ng ph¸p: SM, Dice, Jaccard vµ 4 ph­¬ng ph¸p ph©n nhãm UPGMA (Ph©n tÝch c¸c nhãm ph©n tö kh«ng cïng trong l­îng, WPGMA (Ph©n tÝch c¸c nhãm ph©n tö cã cïng träng l­îng), liªn kÕt hoµn toµn, liªn kÕt ®¬n lÎ. LËp biÓu ®å h×nh c©y dùa vµo gi¸ trÞ t­¬ng quan kiÓu h×nh (r) cao nhÊt trong ch­¬ng tr×nh NTSYS 2.1 [15], [23]. Hµm l­îng th«ng tin tÝnh ®a h×nh (Polymorphism information content = PIC) cña mçi måi x¸c ®Þnh theo c«ng thøc PIC = 1- SPi2, trong ®ã Pi lµ tÇn sè cña allen i cña kiÓu gen ®­îc kiÓm tra. Ph¹m vi gi¸ trÞ PIC tõ 0 (kh«ng ®a h×nh) tíi 1 (®a h×nh hoµn toµn) [13]. §Ó kh¼ng ®Þnh kÕt qu¶ ph©n nhãm theo s¬ ®å h×nh c©y, chóng t«i biÓu diÔn kÕt qu¶ theo ph­¬ng ph¸p so s¸nh ®a chiÒu (MDS = multidimensional scaling, Kruskal & Wish, 1978) vµ biÓu ®å ph©n tÝch theo to¹ ®é chÝnh (PCA = principal co - ordinate analysis, Hauser & Crovello, 1982) [16], [29]. Ch­¬ng 3. KÕT QU¶ Vµ TH¶O LUËN 3.1. KÕt qu¶ t¸ch chiÕt ADN tæng sè §Ó thùc hiÖn ®­îc ph¶n øng RAPD th× ADN ph¶i s¹ch, kh«ng ®øt gÉy, ®ã lµ ®iÒu kiÖn ®Çu tiªn cho sù thµnh c«ng cña qu¸ tr×nh nghiªn cøu. KÕt qu¶ kiÓm tra cho thÊy chÊt l­îng vµ nång ®é ADN cña c¸c mÉu thu ®­îc ®Òu s¹ch. Cô thÓ lµ ®iÖn di trªn gen agarose cho thÊy ADN tËp trung ë mét b¨ng chÝnh, kh«ng ®øt gÉy (h×nh 2) vµ khi ®o OD ë b­íc sãng 260 nm - 280 nm th× phæ hÊp phô chØ cã mét ®Ønh hÊp phô duy nhÊt lµ 260 nm (h×nh 3). C¸c mÉu ADN thu ®­îc dÒu cã ®é tinh s¹ch cao cô thÓ lµ chØ sè tû lÖ OD260/ OD280 thÊp nhÊt lµ 1,80 cña gièng BL28; cao nhÊt lµ 1,95 cña gièng IRRI20 (b¶ng 4). Nh­ vËy kÕt qu¶ t¸ch chiÕt cña chóng t«i ®¹t ®ñ tiªu chuÈn ®Ó tiÕn hµnh c¸c thÝ nghiÖm tiÕp theo. B¶ng 4: Hµm l­îng vµ ®é tinh s¹ch cña tËp ®oµn 36 gièng cã tÝnh kh¸ng kh¸c nhau víi bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn. Tªn mÉu Hµm l­îng ADN(mg/ml) §é tinh s¹ch ADNTØ sè OD 260/280 Tªn mÉu Hµm l­îng ADN (mg/ml) TØ sè OD 260/280§é tinh s¹ch ADN OM 3499-5 1025,90 1,82 IRRI 346 810,00 1,81 OM 3242-50 673,30 1,87 MILYANG 23 519,30 1,85 OM 3496-9 1086,00 1,86 MILYANG 42 1035,80 1,87 NTCD 1-12 1850,40 1,82 SUWION 290 462,30 1,84 NTCD 1-16 1325,40 1,85 BJ1 891,00 1,82 T¸m tiªu 375,50 1,91 TÎ tÐp 2101,30 1,90 T¸m xu©n b¾c 850,00 1,89 BL 89 4251,30 1,85 NÕp ®en 454,80 1,90 BL 28 1935,60 1,80 NÕp c¸i hoa vµng vµng 1502,70 1,83 BL 31-97 1201,20 1,85 NÕp sím 2279,50 1,89 BBL 72-99 1209,70 1,81 HT 1 786,30 1,81 KBL 75-99 400,10 1,91 N 87 506,40 1,82 KBL 53-99 920,50 1,89 DV85 882,60 1,81 Khang d©n 1502,40 1,86 IRRI 1545 618,30 1,83 Chiªm h­¬ng 1091,80 1,90 IRRI 20 1500,20 1,95 Q 5 2341,20 1,87 IRRI 8 2145,20 1,86 D¤115 989,40 1,83 KUNTLAN 1045,30 1,87 KB 1 908,40 1,80 ZENITH 4912,10 1,92 TN 1 1978,10 1,87 l(25ng) 1 2 3 4 5 6 7 H×nh 2: KÕt qu¶ ®iÖn di kiÓm tra ADN tæng sè t¸ch tõ c¸c gièng lóa nghiªn cøu H×nh 3: Phæ hÊp phô ADN cña c¸c gièng lóa nghiªn cøu ®o ë b­íc sãng 260 nm - 280 nm 3.2. Ph©n tÝch ®a h×nh ADN b»ng kü thuËt RAPD Trong nghiªn cøu nµy chóng t«i sö dông 21 måi ngÉu nhiªn (ký hiÖu RA31, RA32, RA36, RA40, RA45, RA46, RA50, RA142, RA143, RA159, OPA13, OPP19, UBC391, V8, Q14, GN38, C19, O-10, O-13, O-18, I13) cã ®é dµi 10 nucleotit (do phßng C«ng nghÖ TÕ bµo Thùc vËt cung cÊp) ®Ó ph©n tÝch hÖ sè kh¸c nhau vÒ di truyÒn cña 36 gièng lóa cã tÝnh kh¸ng kh¸c nhau víi bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn. KÕt qu¶ ë b¶ng 5 cho thÊy tæng sè cã 392 allen ®­îc nh©n b¶n. Sè l­îng c¸c allen ®­îc nh©n b¶n víi mçi måi xª dÞch tõ 9 (RA45) ®Õn 28 (O-18), kÝch th­íc nh©n b¶n tõ 0,23 kb ®Õn 3 kb trong ph¹m vi quan s¸t. TÝnh ®a h×nh cña c¸c måi RAPD ®­îc ®¸nh gi¸ th«ng qua gi¸ trÞ PIC (polymorphism information content) - Gi¸ trÞ PIC cµng lín th× tÝnh ®a h×nh cµng cao vµ ng­îc l¹i. Tõ b¶ng 5 thÊy gi¸ trÞ PIC di dao ®éng tõ 0,2538 25 (RA143, OPA13) ®Õn 0,5809 58 (RA36). Trong ®ã, 3/21 cÆp måi RAPD (RA36, RA45, O-18) cho tÝnh ®a h×nh cao víi gi¸ trÞ PIC ³ 0,5. Tæng sè thu ®­îc 392 allen ®· ®­îc nh©n b¶n, trung b×nh sè allen lµ 18,67/locut. Sè l­îng c¸c ph©n ®o¹n ADN ®­îc nh©n b¶n víi mçi cÆp måi xª dÞch tõ 9 (RA45) ®Õn 28 (O-18) trong ph¹m vi quan s¸t (b¶ng 4). KÝch th­íc cña c¸c ph©n ®o¹n ADN nh©n b¶n tõ 0,23 Kb ®Õn 3 Kb. B¶ng 5: Hµm l­îng th«ng tin tÝnh ®a h×nh (PIC) cña tËp ®oµn 36 gièng lóa nghiªncøu STT Tªn måi SP§ ADN KÝch th­íc ®o¹n ADN (kb) PIC STT Tªn måi SP§ ADN KÝch th­íc ®o¹n ADN (kb) PIC 1 RA31 27 0,24 - 1,90 0,31 12 OPP19 25 0,24 - 2,90 0,290 2 RA32 16 0,30 - 2,40 0,312 13 UBC391 15 0,20 - 1,40 0,32833 3 RA36 16 0,30 - 1,70 0,581 14 V8 16 0,40 - 2,20 0,38639 4 RA40 14 0,25 - 2,00 0,372 15 Q14 17 0,35 - 1,70 0,42242 5 RA45 9 0,40 - 2,10 0,500 16 GrN38 22 0,28 - 1,60 0,30831 6 RA46 14 0,35 - 1,75 0,465 17 C19 18 0,60 - 3,00 0,37538 7 RA50 23 0,37 - 2,10 0,331 18 O10 22 0,25 - 1,65 0,40440 8 RA142 21 0,28 - 1,90 0,37 19 O13 16 0,23 - 1,80 0,35 9 RA143 16 0,25 - 1,70 0,254 20 O18 28 0,40 - 3,00 0,52954 10 RA159 19 0,24 - 2,40 0,31832 21 I13 17 0,30 - 1,90 0,43644 11 OPA13 21 0,25 - 1,70 0,25425 Tuy nhiªn, trong kÕt qu¶ nhËn ®­îc tÝnh ®a h×nh thÓ hiÖn ë gi¸ trÞ PIC kh«ng tØ lÖ thuËn víi sè l­îng c¸c ph©n ®o¹n nh©n b¶n. MÆc dï ®èi Ch¼ng h¹n, víi måi RA45 chØ cã 9 ph©n ®o¹n ADN ®­îc nh©n nh­ng l¹i cã gi¸ trÞ PIC kh¸ cao (PIC = 0,50)rÊt . Ng­îc l¹i, måi RA31 cã 27 ph©n ®o¹n ADN ®­îc nh©n b¶n nh­ng cã gi¸ trÞ PIC thÊp (PIC = 0,31)., chøng tá r»ng víi måi nµy th× c¸c gièng cã tÝnh ®a h×nh thÊp mÆc dï sè ph©n ®o¹n ®­îc nh©n kh¸ cao (21 ph©n ®o¹n) D­íi ®©y lµ kÕt qu¶ ph©n tÝch RAPD cña 3 måi RA31, RA36, C19. §©y lµ nh÷ng måi thÓ hiÖn t­¬ng ®èi râ tÝnh ®a h×nh khi ®iÖn di s¶n phÈm PCR - RAPD trªn gel agarose 1,8%. 3.2.1. Måi RA31 KÕt qu¶ ®iÖn di s¶n phÈm RAPD cña 36 gièng lóa víi måi RA31 cã tõ 7 ®Õn 15 ph©n ®o¹n ADN ®­îc nh©n b¶n ngÉu nhiªn. KÝch th­íc c¸c ph©n ®o¹n cã chiÒu dµi ­íc tÝnh tõ 0,24 - 1,90 kb. Trong ®ã gièng OM3499-5 cã sè ph©n ®o¹n ADN ®­îc nh©n b¶n nhiÒu nhÊt lµ 15; trong khi ®ã gièng NTCD1-12 chØ cã 7 ph©n ®o¹n ADN ®­îc nh©n b¶n. TÝnh ®a h×nh còng ®­îc thÓ hiÖn t­¬ng ®èi râ víi måi RA31. Ch¼ng h¹n t¹i vÞ trÝ 0,38 kb; 0,9 kb; 0,95 kb chØ cã 03 gièng lóa lµ cã ph©n ®o¹n ADN ®­îc nh©n b¶n (t­¬ng øng gièng KB1, SUWION290, Khang d©n). ë vÞ trÝ 0,85 kb th× cã gièng ZENITH lµ kh«ng xuÊt hiÖn ph©n ®o¹n ADN (h×nh 4). KÕt qu¶ ph©n tÝch cho phÐp ta nhËn xÐt c¸c gièng lóa b¹c l¸ nghiªn cøu ®· cã sù sai kh¸c nhau vÒ mÆt di truyÒn. 3.2.2. Måi RA 36 §iÖn di s¶n phÈm RAPD víi måi RA36 cña c¸c gièng lóa chóng t«i còng nhËn ®­îc kÕt qu¶ t­¬ng tù nh­ måi RA31. §©y lµ måi thÓ hiÖn tÝnh ®a h×nh râ nhÊt (víi gi¸ trÞ PIC = 0,58) mÆc dï chØ cã 9 ph©n ®o¹n ADN ®­îc nh©n b¶n. TÝnh ®a h×nh còng chØ ra rÊt râ khi so s¸nh gi÷a c¸c gièng. Ch¼ng h¹n t¹i vÞ trÝ 0,3 kb vµ 0,5 kb chØ cã gièng Q5 vµ gièng NÕp c¸i hoa vµng xuÊt hiÖn ph©n ®o¹n ADN. Trong khi ®ã gièng DV85, KUNTLAN vµ ZENITH ph©n ®o¹n ADN ®· kh«ng ®­îc nh©n b¶n ë vÞ trÝ 0,55 kb (h×nh 5). 3.2.3. Måi C19 H×nh 6 cho ta kÕt qu¶ ®iÖn di s¶n phÈm RAPD víi måi C19, thÊy cã tõ 1 dÕn 12 ph©n ®o¹n ADN ®­îc nh©n b¶n. C¸c ph©n ®o¹n ADN nh©n b¶n ngÉu nhiªn cã chiÒu dµi ­íc tÝnh tõ 0,6 kb ®Õn 3,0 kb. MÆc dï sè ph©n ®o¹n ADN ®­îc nh©n lªn kh«ng ph¶i lµ cao (12 ph©n do¹n) nh­ng tÝnh ®a h×nh cña c¸c gièng ®­îc thÓ hiÖn kh¸ râ. VÝ dô nh­ gièng NÕp c¸i hoa vµng chØ cã mét ph©n ®o¹n ADN duy nhÊt t¹i vÞ trÝ 1,45 kb; ë vÞ trÝ 2,0 kb vµ 1,95 kb tÊt c¶ c¸c gièng ®Òu xuÊt hiÖn ph©n ®o¹n ADN trõ gièng KB1. KÕt qu¶ nhËn ®­îc còng cho ta thÊy râ sù sai kh¸c vÒ mÆt di truyÒn gi÷a 36 gièng lóa nghiªn cøu. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 M 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 2kb 0,25kb 0,38 kb xuÊt hiÖn ph©n ®o¹n ADN; kh«ng xuÊt hiÖn ph©n ®o¹n ADN H×nh 4: KÕt qu¶ ®iÖn di s¶n phÈm RAPD cña 36 gièng lóa cã møc ®é kh¸ng kh¸c nhau víi bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn víi måi RA31 (Thø tù c¸c gièng nh­ trong b¶ng 1), M: Thang ADN chuÈn (l 1 kb) M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 M 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 1kb 0,5kb xuÊt hiÖn ph©n ®o¹n ADN; kh«ng xuÊt hiÖn ph©n ®o¹n ADN H×nh 5: KÕt qu¶ ®iÖn di s¶n phÈm RAPD cña 36 gièng lóa cã møc ®é kh¸ng kh¸c nhau víi bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn víi måi RA36 (Thø tù c¸c gièng nh­ trong b¶ng 1), M: Thang ADN chuÈn (l 1 kb) M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 M 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 3kb 0,5kb 2,0 kb 1,42 kb xuÊt hiÖn ph©n ®o¹n ADN; kh«ng xuÊt hiÖn ph©n ®o¹n ADN H×nh 6: KÕt qu¶ ®iÖn di s¶n phÈm RAPD cña 36 gièng lóa cã møc ®é kh¸ng kh¸c nhau víi bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn víi måi C19 (Thø tù c¸c gièng nh­ trong b¶ng 1), M: Thang ADN chuÈn (l 1 kb) 3.3. Mèi quan hÖ di truyÒn gi÷a c¸c gièng lóa trong tËp ®oµn kh¸ng bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn dùa trªn ph©n tÝch RAPD Dùa trªn sù xuÊt hiÖn hay kh«ng xuÊt hiÖn c¸c ph©n ®o¹n ADN cña c¸c gièng khi ®iÖn di s¶n phÈm RAPD, chóng t«i thiÕt lËp mèi liªn quan gi÷a c¸c gièng ë møc ®é ph©n tö. Sè liÖu ®­îc tÝnh to¸n vµ ph©n tÝch theo ch­¬ng tr×nh NTSYSpc version 2,0 (Applied Biostatistics Inc., USA., 1998) (theo quy ­íc 1 = xuÊt hiÖn; 0 = kh«ng xuÊt hiÖn) ®Ó t×m ra sù sai kh¸c gi÷a c¸c gièng lóa th«ng qua biÓu ®å h×nh c©y. Tr­íc khi lËp biÓu ®å h×nh c©y, chóng t«i tiÕn hµnh x¸c ®Þnh gi¸ trÞ t­¬ng quan kiÓu h×nh theo ba ph­¬ng ph¸p tÝnh hÖ sè di truyÒn gièng nhau (Dice, Jaccard, SM) vµ bèn kiÓu ph©n nhãm (UPGMA, WPGMA, liªn kÕt hoµn toµn vµ liªn kÕt ®¬n lÎ). BiÓu ®å h×nh c©y sÏ ®­îc thiÕt lËp dùa trªn gi¸ trÞ t­¬ng quan kiÓu h×nh cao nhÊt theo ba hÖ sè di truyÒn gièng nhau vµ bèn kiÓu ph©n nhãm. B¶ng 6: Gi¸ trÞ t­¬ng quan kiÓu h×nh (r) theo ba c¸ch tÝnh vÒ hÖ sè di truyÒn gièng nhau (Dice, Jaccard, SM) vµ bèn kiÓu ph©n nhãm (UPGMA, WPGMA, liªn kÕt hoµn toµn vµ liªn kÕt ®¬n lÎ) UPGMA WPGMA Complete linkage Single linkage SM 0,856 0,824 0,766 0,805 Dice 0,865 0,832 0,796 0,761 Jaccard 0,871 0,840 0,806 0,761 Ghi chó: r ³ 0,9 : t­¬ng quan rÊt chÆt; 0,8 £ r < 0,9: t­¬ng quan chÆt; 0,7 £ r < 0,8: t­¬ng quan t­¬ng ®èi chÆt; r < 0,7: t­¬ng quan kh«ng chÆt. KÕt qu¶ b¶ng 6 cho thÊy theo ba c¸ch tÝnh hÖ sè di truyÒn víi bèn kiÓu ph©n nhãm khi ph©n tÝch víi 21 måi RAPD cña tËp ®oµn 36 gièng lóa ®Òu ph¶n ¸nh mèi t­¬ng quan kiÓu h×nh t­¬ng quan chÆt (0,761 £ r < 0,871, b¶ng 6). Nh­ng trong ®ã r theo ph­¬ng ph¸p cña Jaccard vµ kiÓu ph©n nhãm UPGMA lµ cao nhÊt (r = 0,871). H¬n n÷a chØ thÞ RAPD lµ chØ thÞ tréi mµ hÖ sè gièng nhau Jaccard lµ c«ng thøc tÝnh ­u tiªn cho chØ thÞ tréi. V× thÕ, s¬ ®å h×nh c©y sÏ ®­îc lËp theo hÖ sè gièng nhau Jaccard vµ kiÓu ph©n nhãm UPGMA. §Ó kh¼ng ®Þnh kÕt qu¶ ph©n nhãm theo s¬ ®å h×nh c©y, chóng t«i kiÓm ®Þnh kÕt qu¶ ph©n nhãm theo kh«ng gian ®a chiÒu (MDS = multidimention scaling) vµ ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch theo to¹ ®é chÝnh (PCA = principal co-ordinate analysis). KÕt qu¶ nhËn ®­îc ë h×nh 8 vµ h×nh 9 ®Òu cho kÕt qu¶ t­¬ng tù: gièng KB1 ®øng riªng biÖt, 35 gièng cßn l¹i th× ®­îc ph©n lµm 3 nhãm (nh­ ®¸nh dÊu trªn biÓu ®å). HÖ sè t­¬ng ®ång di truyÒn tõng cÆp n»m ë kho¶ng tõ 0,31 ®Õn 0,81. Trong ®ã hÖ sè t­¬ng ®ång di truyÒn thÊp nhÊt lµ 0,31 khi so s¸nh gi÷a gièng KB1 vµ gièng T¸m tiªu; cao nhÊt lµ 0,81 khi so s¸nh gi÷a gièng T¸m xu©n b¾c vµ gièng T¸m tiªu (b¶ng 7). S¬ ®å h×nh c©y tÝnh theo hÖ sè Jaccard vµ ph©n nhãm UPGMA (h×nh 7) ®· chØ ra møc ®é sai kh¸c di truyÒn gi÷a 36 gièng lóa cã tÝnh kh¸ng kh¸c nhau víi bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn. Møc ®é kh¸c nhau ®­îc biÓu hiÖn b»ng hÖ sè sai kh¸c gi÷a c¸c gièng. C¸c gièng cã hÖ sè di truyÒn gièng nhau t­¬ng tù sÏ ®­îc xÕp vµo mét nhãm, gi÷a c¸c nhãm l¹i cã sù liªn hÖ víi nhau. Ph©n tÝch s¬ ®å h×nh c©y cho thÊy 36 gièng lóa ®­îc chia ra hai nhãm chÝnh: - Nhãm I (a) chØ cã mét gièng KB1 cã nguån gèc ViÖt Nam vµ nhiÔm víi bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn (®iÓm bÖnh 7,7), cã hÖ sè sai kh¸c so víi c¸c gièng lµ 64% (1- 0,36). §©y lµ gièng cã sù sai kh¸c nhiÒu nhÊt so víi c¸c gièng cßn l¹i. - Nhãm II gåm 35 gièng cßn l¹i vµ ®­îc chia lµm ba nh¸nh phô: + Nh¸nh phô 1 (b) gåm 9 gièng: ZENITH, KUNTLAN, DV85, T¸m Xu©n B¾c, T¸m tiªu, NÕp c¸i hoa vµng, NÕp sím, OM3496-9, NÕp ®en. Nh¸nh nµy chñ yÕu lµ c¸c gièng lóa ®Þa ph­¬ng, cã nguån gèc ë ViÖt Nam vµ cã møc ®é kh¸ng bÖnh trung b×nh (®iÓm bÖnh tõ 1 ®Õn 5,5) trõ gièng DV85 (®iÓm kh¸ng bÖnh 1). HÖ sai di truyÒn sai kh¸c tõ 18% ®Õn 46%. + Nh¸nh phô 2 (c) gåm 17 gièng vµ ®­îc chia lµm 6 nhãm nhá : Nhãm 1: chØ cã gièng TN1, cã nguån gèc ViÖt Nam vµ nhiÔm bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn, hÖ sè sai kh¸c so víi c¸c gièng lµ 45%. Nhãm 2 gåm hai gièng Q5, Chiªm h­¬ng. Cã nguån gèc Trung Quèc, nhiÔm bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn (®iÓm bÖnh tõ 7,7 ®Õn 9), hÖ sè sai kh¸c so víi c¸c gièng 33%. Nhãm 3 chØ cã gièng TÎ tÐp, cã nguån gèc ViÖt Nam vµ nhiÔm víi bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn. HÖ sè sai kh¸c so víi c¸c gièng lµ 40%. Nhãm 4 gåm 2 gièng lµ MILYANG42, BL89. Hai gièng nµy cã tÝnh kh¸ng víi bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn (®iÓm bÖnh 3) vµ cã hÖ sè sai kh¸c víi c¸c gièng lµ 38%. Nhãm 5 gåm 4 gièng BJ1, IRRI346, SUWION290, MILYANG23. C¸c gièng cã nguån gèc tõ Ên ®é, IRRI vµ Hµn Quèc, nhiÔm võa, nÆng víi bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn (®iÓm bÖnh tõ 7 ®Õn 9), hÖ sè sai kh¸c víi c¸c gièng kh¸c tõ 24% ®Õn 36%. Nhãm 6 gåm 7 gièng Khang d©n, D¤115, KBL53-99, KBL75-99, BBL72-99, BL31-97, BL28. C¸c gièng cã tÝnh kh¸ng ®èi víi bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn (®iÓm bÖnh tõ 1 ®Õn 5), hÖ sè sai kh¸c víi gièng kh¸c lµ 39%. + Nh¸nh phô 3 (d) gåm 9 gièng IRRI8, IRRI20, NTCD1-16, IRRI1545, N87, HT1, NTCD1-12, OM3242-50, OM3499-5. C¸c gièng nµy chñ yÕu cã nguån gèc ë ViÖt Nam (lµ c¸c gièng cã n¨ng suÊt vµ chÊt l­îng cao), kh¸ng võa víi bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn (®iÓm bÖnh tõ 3,0 ®Õn 5,0). Tuy nhiªn, trong ®ã cã hai gièng lµ N87, HT1 cã nguån gèc ë Trung Quèc, §µi Loan lµ nhiÔm bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn (®iÓm bÖnh 7,7) vµ h×nh thµnh mét nh¸nh phô. Hai gièng nµy cã hÖ sè di truyÒn kh¸c víi c¸c gièng kh¸c lµ 29% (1- 0,71). Tõ kÕt qu¶ ph©n nhãm trªn chóng t«i nhËn thÊy r»ng tÝnh ®a h×nh cña 36 gièng lóa cã tÝnh kh¸ng kh¸c nhau víi bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn khi ph©n tÝch víi 21 måi RAPD râ rµng cã sù sai kh¸c ë møc ®é ph©n tö. Ngay ë ViÖt Nam, Bïi V¨n Th¾ng (2002), Phan Träng Hoµng (2003) (ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc) ®· sö dông måi c¸c måi RA ®Ó ®¸nh gi¸ ®a d¹ng c¸c gièng lóa T¸m nh»m l­u gi÷, b¶o tån c¸c gièng lóa ®Æc s¶n vµ gãp phÇn t¹o ra c¸c gièng lóa míi. T­¬ng tù nh­ ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu cña chóng t«i, Sun vµ CS (2003) [29] ®· sö dông 160 måi RAPD ®Ó ph©n tÝch ®a d¹ng ADN cña 35 gièng lóa m× kh¸ng bÖnh FHB (Fusarium head blight) vµ ph¸t hiÖn ra ®­îc 3 chØ thÞ RAPD liªn quan ®Õn tÝnh kh¸ng bÖnh FHB. B¶ng 7: HÖ sè di truyÒn t­¬ng ®ång 1*: Sè thø tù c¸c gièng tõ 1- 36 gièng nh­ b¶ng 1 B¶ng 7: HÖ sè t­¬ng dång gi÷a c¸c gièng VN 4 Vn 5 Vn 5 Tq 7,7 ®l 7,7 Irri 3 Vn 5 Irri 5 Irri 5 Vn 3 Hq 3 Vn 3 ©® 1 ©® 3 ©® 3 ©® 5 Vn 5 Tq 5 Hq 7 Hq 9 Irri 7,7 ©® 7,7 Vn 7,7 Tq 9 Tq 7,7 Vn 7,7 Vn 3,3 Vn 5 Vn 3,3 Vn 5,5 Vn 5,5 Vn 5,5 Irri 1 ®l 5 ®l 5 Vn 7,7 d c b H×nh 7. So s¸nh sù kh¸c nhau cña c¸c gièng ë møc ®é ph©n tö a a b c d c H×nh 8: BiÓu ®å ®a chiÒu (MDS) cña tËp ®oµn kh¸ng/nhiÔm bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn a c d b H×nh 9: BiÓu ®å kh«ng gian PCA cña tËp ®oµn lóa kh¸ng/nhiÔm bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn KÕt luËn vµ ®Ò nghÞ 1. B»ng kü thuËt RAPD ®· nhËn ®­îc tæng sè 392 allen nh©n b¶n. TÊt c¶ 21 måi RAPD ®Òu cho tÝnh ®a h×nh víi gi¸ trÞ PIC tõ 0,25 (RA143, OPA13) ®Õn 0,58 (RA36) khi ph©n tÝch víi tËp ®oµn 36 gièng lóa cã tÝnh kh¸ng kh¸c nhau víi bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn. Trong ®ã 3/21 (RA36, RA45, O18) måi cho ®a h×nh phong phó nhÊt víi gi¸ trÞ PIC ³ 0,5. 2. S¬ ®å h×nh c©y thu ®­îc chia lµm ba nhãm chÝnh, cã sù sai kh¸c vÒ hÖ sè t­¬ng ®ång di truyÒn tõ 22% (T¸m Tiªu vµ T¸m Xu©n B¾c) ®Õn 64% (KB1 víi 35 gièng cßn l¹i). Nhãm 1(b) gåm 9 gièng, c¸c gièng nµy hÇu hÕt ®Òu cã nguån gèc ViÖt Nam vµ ®Òu cã kh¶ n¨ng kh¸ng bÖnh (®iÓm bÖnh tõ 1 ®Õn 5,5). Nhãm 2(c) gåm 19 gièng cã nguån gèc ë nhiÒu n­íc kh¸c nhau. Trong ®ã c¸c gièng nhiÔm bÖnh n»m cïng mét nhãm. Nhãm 3 (d) gåm 9 gièng, chñ yÕu cã nguån gèc ViÖt Nam vµ lµ gièng n¨ng suÊt vµ chÊt l­îng. ChØ cã hai gièng cã nguån gèc Trung Quèc vµ §µi Loan lµ nhiÔm víi bÖnh vµ cã hÖ sè di truyÒn sai kh¸c víi c¸c gièng lµ 29%. §Ò nghÞ: 1. Sö dông gièng lóa kh¸ng bÖnh cao (DV85) lai víi gièng lóa n¨ng suÊt vµ chÊt l­îng (OM3499-5; OM3242-50) (hÖ sè t­¬ng ®ång kh¸c nhau t­¬ng øng lµ 50%, 49%)®Ó t¹o ra gièng lóa võa kh¸ng bÖnh, n¨ng suÊt, chÊt l­îng g¹o cao. 2. Sö dông c¸c gièng nh­ DV85 lai víi SUWION290, Chiªm h­¬ng (víi hÖ sè kh¸c nhau t­¬ng øng lµ 50%, 55%) lµm bè mÑ ®Ó t¹o quÇn thÓ mapping tÝnh kh¸ng bÖnh. TµI LIÖU THAM KH¶O Tµi liÖu tiÕng viÖt Lª TrÇn B×nh, Lª ThÞ Muéi (1998), Ph©n lËp gen vµ chän dßng chèng chÞu ngo¹i c¶nh bÊt lîi ë c©y lóa, Nxb §¹i Häc Quèc Gia, Hµ Néi. NguyÔn ThÞ Thu H»ng (2003), Ph©n tÝch c©y lóa C71 chuyÓn gen Xa21 vµ gen TPS, LuËn ¸n Th¹c sÜ Khoa häc, §¹i häc Khoa häc Tù nhiªn, Hµ néi. Phan Träng Hoµng (2003), §¸nh gi¸ sù ®a h×nh ADN cña mét sè gièng lóa T¸m, Kho¸ luËn Tèt nghiÖp §¹i häc, §¹i häc Khoa häc Tù nhiªn, Hµ Néi. Lª ThÞ ¸nh hång (2002), BÖnh häc ph©n tö, Nxb N«ng NghiÖp, Hµ Néi, tr. 163 - 168. NguyÔn ThÞ Lang, Bïi ChÝ Böu (2002), Genome häc vÒ chøc n¨ng vµ c«ng nghÖ gen, ViÖn lóa §ång b»ng s«ng Cöu Long. Lª §×nh L­¬ng, QuyÒn §×nh Thi (2002), Kü thuËt di truyÒn vµ øng dông, Nxb §¹i häc Quèc Gia Hµ Néi, Hµ Néi, tr 134 - 147. Vò triÖu M©n, Lª l­¬ng TÒ (2001), Gi¸o tr×nh bÖnh c©y n«ng nghiÖp, Nxb N«ng NghiÖp, Hµ Néi, tr. 183 - 187. §inh ThÞ Phßng (2001), Nghiªn cøu kh¶ n¨ng chÞu h¹n vµ chän dßng chÞu h¹n ë lóa b»ng c«ng nghÖ tÕ bµo thùc vËt, LuËn ¸n TiÕn sÜ Sinh häc, ViÖn C«ng nghÖ sinh häc, Hµ Néi. Lª Duy Thµnh (2001), C¬ së di truyÒn chän gièng thùc vËt, Nxb Khoa häc Kü thuËt, Hµ Néi. Bïi V¨n Th¾ng (2001), NguyÔn Quang Thä (1989), BÖnh th­êng gÆp ë lóa, Nxb N«ng NghiÖp, Hµ Néi. NguyÔn TrÞnh Toµn, NguyÔn ThÞ Kim Dung, NguyÔn ThÞ Ninh ThuËn, Vò §øc Quang, TrÇn Duy Quý (2001), “T×m chØ thÞ ph©n tö (marker) liªn kÕt víi gen kh¸ng bÖnh ®¹o «n ë c¸c gièng lóa ®Þa ph­¬ng cña ViÖt Nam”, KÕt qu¶ nghiªn cøu khoa häc 1999 - 2000, Nxb N«ng NghiÖp, Hµ Néi. Hµ Minh Trung (1983), BÖnh h¹i lóa, Nxb N«ng NghiÖp, Hµ Néi. XuÊt khÈu g¹o 2003, - tourism.com/vietnam_gov/ v_pages/Kinhte/nongnghiep & channuoi/nq_xkgao03.htm. Tµi liÖu tiÕng anh Anderson J. A., Churchill G. A., Autrique J. E., Tanksley S. D., Sorrells M. E. (1993), “Optimizing parental selection for genetic linkage maps”, Genome, Vol. 36, pp. 181 - 186. Bui Chi Buu, Nguyen Thi Lang (1999), “Using molecular marker in study of rice genetic diversity”, Omonrice, Vol. 7, pp. 17 - 25. Dinh Thi Phong, Emma Marce, Jonathan H. Crouch (2003), “Application of SSR in diversity analysis of groundnut genotypes resistant to early leaf spot”, T¹p chÝ sinh häc, TËp 1, Sè 3, tr. 333 - 346. Dwivedi S. L., Gurtu S., Chandra S., Yuejin W., Nigam S. N. (2001), “Assessment of genetic diversity among selected groundnut germplasm”, Plant Breeding, Vol. 120, pp. 345 - 394. Gamborg O. I., Philips G. C. (Eds) (1995), Plant Cell, Tissue and organ culture Springer verlag, Berlin - Heidelberg, pp. 281 - 296. Gupta V. S. and Ranjekar P. K. (1994), “Use of RFLP/RAPD approach in genetic diversity analysis, bacterial blight resistance gene tagging and DNA fringerprinting in rice”, 3rd Annual Meeting (3-5 March), India. Knowledgebank. irri. org/riceDoctor_MX/Fact_Sheets/Diseases/ Bacterial_Leaf_Blight. htm. Kinoshita T. (1995), “Report of committee on gene symbolization nomenclature and linkage groups”, Rice Genet Newls, Vol. 12, pp. 9 - 115. Khush G. S. (1997), “Oringin, dispersal, cultivation and variation of rice”, Plant Mol Biol, Vol. 35, pp. 25 - 34. Martin G. B., Williams J. G. K., Tanksley S. D. (1991), “Rapid identification of marker linked to a Pseudomonas resistance gene in tomato by using random primer and near - isogeniclines”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 88, pp. 2336 - 2340. Mace E. S., Lester R. N., Gebhardt C. G. (1999), “AFLP analysis of genetic relationships among the cultivated eggplant, Solanum melongena L., and wild relatives (Solanaceae)”, Theor. Appl. Genet, Vol. 99, pp. 626 - 633. Ogawa T. (1993), “Methods and strategy for monitoring race distribution and identification of resistance genes to bacterial leaf blight (Xanthomonas campestris pv. oryzae) in rice”, JARQ, Vol. 27, pp. 71 - 80. Renganayaki K., Rangasamy S. R., Jayparagasam M., Amudha J. (1994), “RFLP studies for BPH resistance in rice”, 3rd Annual Meeting (3-5 March), India. Rowland L. J., Levi A. (1994), “RAPD - based genetic linkage map of blueberry derived form a cross between diploid species (Vaccinium darrowi an V.elliottii)”, Theor. Appl. Genet, Vol. 87, pp. 863 - 868. Shanti M. L., George M. L. C., Vera Cruz C. M., Bernardo M. A., Nelson R. J., Leung H., Reddy J. N., Sridhar R. (2001), “Identification of resistance genes effective against rice bacterial blight pathogen in eastern Indica”, Plant Dis., Vol. 85, pp. 506 - 512. Subhash Chandra, Jonathan H Crouch, Hutokshi K Buhariwalla, C Tom Hash, Paula J Bramel (2001), Classification and Ordination Tools for Biodiversity Analysis, India. Sun G., bond M., Nass H., Martin R., Dong Z. (2003), “RAPD polymorphism in spring wheat cultivars and line with different level of Fusarium resistance”, Theor Appl Genet, Vol. 106, pp. 1059 - 1067. Tsuchiya K., Mew T. W., Wakimoto S. (1982), “Bacteriological and pathological characteristics of wild types and induced muntants of Xanthomonas oryzae pv. Oryzae”, Phytopathology, Vol. 72, pp. 43 - 46. Yang X., Quiros C. (1993), “Idetification and clasification of celery cultivars with RAPD marker”, Theo. Appl. Genet, Vol. 86, pp. 205 - 212.