Đề tài Đánh giá hiệu quả diệt khuẩn của bình sữa nano bạc đối với các loại vi khuẩn - Vi khuẩn hiếu khí, Coliform, Escheria coli trong sữa bò tươi

loại. Ngay tử thời xa xưa, Hipocrat đã công nhận bạc có tính chất ngăn chặn được một số bếnh cho con người. Bạc được sử dụng như một kháng sinh tự nhiên dưới dạng muối bạc nitrat trước khi con người phát minh ra các kháng sinh như hiện nay. Do bạc có tính sát khuẩn tự nhiên đặc biệt khi sử dụng như một chất sát khuẩn thì bạc không có tác dụng phụ khi nó không tác dụng với các enzyme hay các vi khuẩn có lợi, chính vì đặc điểm này mà nano bạc được sử dụng rất nhiều trong y học. Các sản phẩm như bột bạc kháng khuẩn, khẩu trang ngừa cúm... hay một loạt các sản phẩm vô trùng tuyệt đối khi được phủ lên bề mặt lớp hạt nano bạc như bông gạc vệ sinh, dao kéo phẫu thuật, ...tất cả những sản phẩm này hiện đang rất phổ biền ở các bệnh viện lớn trên thế giới. 2.3 HIỂU BIẾT VỀ BÌNH SỮA NANO BẠC 2.3.1.Giới thiệu về bình sữa Hiện nay trên thị trường có rất nhiều loại bình sữa khác nhau dành cho trẻ em. Công dụng chung của nhưng bình này là dùng để pha các loại sữa cho trẻ em bú bình. Do người dùng là trẻ em, là đối tượng mà hệ miễn dịch chưa hoàn thiện mẫn cảm với các loại vi khuẩn gây bệnh thông thường đặc biệt là các vi khuẩn đường ruột. Theo kết quả điểu tra thì hàng năm Việt Nam có một lượng lớn trẻ em nhập viện do các bệnh tiêu chảy, mà nguyên nhân trực tiếp là do sự nhiễm khuẩn từ dụng cụ vào trong thực phẩm. Để hạn chế các bệnh đường ruột từ việc sử dụng các sản phẩm từ sữa thì bình sữa tiệt trùng đóng vai trò rất quan trọng. Bình sữa nano ra đời nhằm cung cấp cho các bà mẹ sản phẩm có khả năng tiệt trùng cao giúp các bà mẹ tốn ít công vệ sinh mà vẫn đảm bảo vô trùng. 2.3.2. Cơ chế kháng khuẩn của bình sữa nano bạc Hiệu quả kháng khuẩn của bình sữa đạt được là do 2 tác dụng: Tác dụng ngay trên bề mặt của các hạt nano được gắn trên bề mặt trong của bình sữa. Tác dụng thứ 2 có được do các ion bạc được giải phóng trong môi trường có nước. Cơ chế kháng khuẩn của hạt nano : Cơ chế gây ức chế sinh trưởng của các hạt nano đối với các vi sinh vật chưa được hiểu rõ. Một khả năng có thể xảy ra đó là sự ức chế sinh trưởng của vi khuẩn có liên quan đến sự hình thành các điện tử tự do trên bề mặt của bạc. Các điện tử tự do được sinh ra một cách không kiểm soát có thể tấn công các phân tử lipid màng và dẫn tới sự phá hủy các chức năng của màng tế bào. Tác dụng của hạt nano đối với vi khuẩn E.coli: Các vi khuẩn có cấu trúc màng khác nhau, đó là cơ sở để phân ra hai nhóm vi khuẩn gram (-) và (+). Sự khác nhau về cấu trúc nằm trong sự tổ chức các nhóm peptidoglycan (là các trùng hợp chứa các acidamin và các nhóm đường nằm bên ngoài màng sinh chất và tạo nên cấu tạo thành tế bào), là yếu tố quan trọng tạo nên cấu trúc màng tế bào. Các vi khuẩn gram (-) chứa một lớp peptidoglycan mỏng (2-3nm), chiếm 5-20% khối lượng khô của thành tế bào, nằm giữa màng tế bào chất và thành tế bào bên ngoài. Lớp màng ngoài của tế bào vi khuẩn E.coli được tạo nên chủ yếu từ tập hợp các phân tử Lipopolysaccharride (LPS) xếp sát lại với nhau, tạo ra một lớp màng có hiệu quả thấm. Nguồn: HYPERLINK "" . Tổng điện tích tế bào vi khuẩn ở giá trị pH sinh học là âm do sự thừa các nhóm carboxylic, chúng phân ly tạo ra bề mắt tích điện âm của tế bào. Sự trái ngược về điện tích làm cho vi khuẩn và các hạt nano dính chặt vào nhau và có tác dụng sinh học do có lực hút tĩnh điện. Điều này phù hợp với trạng thái gắn chặt của các hạt nano với tế bào vi khuẩn phụ thuộc vào diện tích bề mặt có hiệu lực tác dụng. Hạt nano bạc có diện tích bề mặt có hiệu quả phản ứng lớn nên nó tăng hiệu quả kháng khuẩn so với các hạt có kích cỡ lớn hơn, vì vậy mà chúng tác dụng độc với các vi sinh vật. Mặt khác do tế bào vi khuẩn gram (+) có lớp peptidolycan dày hơn ở tế bào vi khuẩn gram(-) nên nó cho phép các hạt bạc xâm nhập ít hơn, theo đó các vi khuẩn gram (+) cũng ít nhạy cảm hơn các vi khuẩn gram (+).Cơ chế diệt khuẩn do sự xâm nhập của các hạt nano vào bên trong tế bào vẫn chưa được hiểu hoàn toàn. Nhưng các nghiên cứu chỉ ra rằng: Khi E.coli được xử lý với bạc có sự thay đổi cấu trúc hình thái học trên màng tế bào và nó gây ra sự tăng tính thấm qua màng một cách đáng kể, điều này ảnh hưởng đến sự vận chuyển chính xác các chất qua màng tương bào, các tế bào mất khả năng tự điều chỉnh sự vận chuyển các chất qua màng, kết quả dẫn đến sự chết của tế bào. Nghiên cứu này còn nhận xét rằng các hạt nano đã xâm nhập vào bên trong tế bào và người ta cho rằng nó phá hủy tế bào bằng việc kết hợp với các hợp chất chứa phosphor và sulfur chẳng hạn như DNA. Bạc có khuynh hướng có ái lực cao để phản ứng với những hợp chất như vậy. Và như thế, người ta cho rằng khi hạt nano tác dụng vơi DNA nó làm mất khả năng tự nhân lên của DNA và các protein tế bào sẽ trở nên vô hoạt. Tác dụng do ion bạc: Trong môi trường nước một lượng ion bạc (Ag+) nhất định luôn được giải phóng ra, hàm lượng các ion được giải phóng phụ thuộc vào nguồn chứa ion đó và môi trường nó giải phóng. Trong bề mặt bình sữa, một lượng ion bạc nhất định luôn được giải phóng. Các ion này góp phần làm tăng hiệu quả kháng khuẩn của các hạt nano. Cơ chế kháng khuẩn của ion bạc: Cơ chế tác động kháng khuẩn của ion bạc có liên quan chặt chẽ tới tương tác của chúng với nhóm thiol (sulfhydryl) cho dù vùng đích khác vẫn duy trì được chức năng...Acid amino, chẳng hạn như cystein, các hợp chất chứa nhóm thiol như Natri thiolglycolate bị trung hoà bởi tác dụng kháng khuẩn của bạc. Ngược lại, các axit amin có chứa liên kết disulfide, không chứa nhóm sulfur,và có chứa nhóm sulfur như cystathiol, acid cysteic, L- methionine, taurinem natri bisulfate và natri thiolsulfate đều không thể làm mất hiệu lực kháng khuẩn của các ion bạc. Những phát hiện này và những phát hiện khác đã gợi ý rằng tương tác của các ion bạc với nhóm thiol trong enzyme và protein đóng 1 vai trò vô cùng quan trọng trong tác dụng kháng khuẩn của nó, mặc dù những thành phần khác của tế bào như cầu nối hydrogen cũng có thể liên quan đến. Ngoài ra các ion bạc có xu hướng tác dụng thông qua sự liên kết với các nhóm chức chức năng của các enzyme. Các ion bạc gây ra sự giải phóng các ion K+ từ vi khuẩn. Vì vậy, tương bào hay màng tương bào là nơi liên quan đến nhiều enzyme quan trọng là vùng đích tác dụng quan trọng của các ion bạc. Các ion bạc gây ức chế sự sinh trưởng của tế bào vi khuẩn một cách rõ rệt và được lắng đọng lại trong các không bào và vách tế bào giống như các hạt nhỏ. Chúng ức chế quá trình phân chia tế bào, phá hủy màng tế bào và các yếu tố bên trong tế bào. Kích thước các tế bào vi khuẩn tăng lên, màng tương cùng các thành phần của tương bào và lớp màng ngoài tế bào có cấu trúc không bình thường. Cuối cùng, các ion bạc tác dụng với các acid nucleic. Mặc dù ý nghĩa của sự tác dụng này đối với hoạt tính gây chết tế bào vi khuẩn của các ion bạc chưa được hiểu rõ nhưng các ion bạc ưu tiên tác dụng với các bazơ hơn là các nhóm phosphate trên các acid nucleic. Tác dụng này làm các DNA mất khả năng tự nhân lên dẫn đến không tạo vòng được. Mặt khác các ion bạc còn có thể tương tác với phospholipids ở các bơm proton trên màng tế bào vi khuẩn, điều này dẫn đến sự đình trệ các gradient proton trên màng và do đó gây ra ngưng trệ các cơ chế tổng hợp tế bào kết quả làm chết tế bào. Các ion bạc rõ ràng là không chỉ có một cơ chế tác động. Chúng tương tác với một lượng lớn các quá trình ở mức độ phân tử bên trong tế bào vi sinh vật và do đó gây ra rất nhiều hậu quả như từ giảm sinh trưởng phát triển, mất hiệu quả hoạt động cho tới gây chết tế bào. Các cơ chế này phụ thuộc vào cả nồng độ ion bạc hiện diện và tính mẫn cảm của loài vi sinh vật đối với bạc. Thời gian tiếp xúc, nhiệt độ, pH và cả sự hiện diện của nước tự do đều ảnh hưởng đến cả tốc độ và mức độ của tác dụng kháng khuẩn. 2.5. TÌM HIỂU CHUNG VỀ VI KHUẨN TRONG SỮA 2.5.1. Nguồn gốc gây nhiễm khuẩn vào sữa Sữa là môi trường giàu dinh dưỡng thuận lợi cho nhiều vi khuẩn tồn tại và phát triển. Những nguồn nhiễm vi khuẩn vào sữa thường là: 2.5.1.1. Nguồn gốc từ động vật Mọi cơ thể sống đều mang rất nhiều vi khuẩn, nhất là trên da, niêm mạc và các xoang tự nhiên ở đường hô hấp, đặc biệt vi khuẩn có nhiều trong ống tiêu hóa của cơ thể. Các giống vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm chủ yếu là: Staphylococcus, Escherichia coli, Salmonella, streptococcus, clostridium....(Nguyễn Vĩnh Phước, 1976). Các vi khuẩn này thải ra ngoài và có thể đi vào sữa bằng nhiều con đường khác nhau. Các vi khuẩn này có thể nhiễm vào sữa từ vú bò, trên vú bò có nhiều loại vi khuẩn khác nhau, nhưng trên 50% không có hại trong sữa tươi. Các vi khuẩn thường gặp ở vú bò là Micrococcus, ngoài ra còn thấy Streptococcus và những trực khuẩn đường ruột). Ngoài ra, trong quá trình vắt sữa hoặc bò cho bê con bú làm xây xát bầu vú tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể qua vết thương hở này, ở một số con bò sữa, cơ vòng núm vú không co thắt hoặc co thắt yếu làm núm vú hở, tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhập vào sữa (Nguyễn Thanh Tâm, 2003). 2.5.1.2. Nguồn gốc từ dụng cụ Các dụng cụ dùng để vắt sữa, dụng cụ đựng sữa là nguồn gây nhiễm trầm trọng vi khuẩn vào sữa nếu như không có biên pháp vệ sinh dụng cụ tốt. Do cặn của sữa còn lưu lại hoặc do nước rửa bẩn có nhiều vi khuẩn, khi đổ sữa vào vi khuẩn gặp ngay được môi trường thuận lợi nên phát triển rất nhanh và gây hư hỏng sữa dễ dàng. Kết cấu dụng cụ không đúng quy cách cũng là nguyên nhân dẫn đến ô nhiễm sữa như miệng thùng to hoặc không có nắp đậy. 2.5.1.3. Nguồn gốc từ chuồng trại Do quy trình chăn nuôi vệ sinh kém, chuồng trại không thoáng, thiếu ánh sáng, mật độ nuôi dày, dinh dưỡng kém... là nguyên nhân gây cảm nhiễm vi khuẩn từ chuồng trại vào sữa. Tuy nhiên môi trường trong chuồng trại có sự cảm nhiễm vi sinh vật không lớn. Bình thường 1m3 không khí có từ 20.000 – 50.000 tế bào, nhưng số lượng này có thể tăng 2 triệu lần nếu môi trường kém vệ sinh. Ngoài ra bãi căn thả không vệ sinh sát trùng và không kiểm soát được bò từ nơi khác đến, đem theo mầm bệnh, hay nền đất, sân vận độngcũng là những nơi mà vi sinh vật gây bệnh phát triển và xâm nhiễm vào sữa. Vì vậy vệ sinh chuồng trại không sạch, mùi hôi thồi sẽ hấp thu vào sữa cùng sự xâm nhập của nhiều vi khuẩn khác làm thay đổi chất lượng sữa. 2.5.1.4. Nguồn gốc từ công nhân nuôi dưỡng và chế biến sữa Bình thường sự cảm nhiễm vi sinh vật vào sữa từ công nhân là rất ít nếu thực hiện tốt quy định vệ sinh trong từng thao tác. Nhưng trong trường hợp không làm đúng thao tác vệ sinh như: mặc quần áo lao động, đeo khẩu trang, vệ sinh tay chân, kỹ thuật vắt ...thì sự cảm nhiễm vi sinh vật từ công nhân là đáng chú ý vì trong sữa có thể nhiễm trùng gây bệnh mạn tính của công nhân như: phó thương hàn, lao, lỵ, bạch hầu... Để hạn chế nguồn nhiễm khuẩn vào sữa, người vắt sữa trước khi vắt sữa cần phải rửa tay bằng xà phòng sạch sẽ, lau khô tay cẩn thận bằng khăn sạch, sát trùng bằng cồn 700 trước khi tiến hành vắt sữa, có 1 bộ quần áo sạch chỉ mặc khi vắt sữa, và phải giặt thường xuyên (Trần Thị Hạnh, Lưu Quỳnh Hương). 2.5.1.5. Nguồn gốc từ phương pháp xử lý sữa Thời gian, nhiệt độ bảo quản đòi hỏi phải rất nghiêm ngặt. Sữa sau khi vắt xong phải được lọc qua vải và phải được vận chuyển nhanh đến địa diểm bảo quản và chế biến. Ở nhiệt độ cao sữa chóng hỏng, nhưng nếu bảo quản ở nhiệt độ thấp lâu ngày sữa sẽ bị nhầy, vì vậy bảo quản sữa phải ở dưới 00C. Khâu khử trùng sữa cần được làm theo quy định. Thực hiện được như tránh được sự lây nhiễm vi sinh vật vào sữa và không làm tăng số lượng vi khuẩn trong sữa. 2.5.2. Một số vi khuẩn thường gặp trong sữa Bình thường trong sữa chứa 100 – 300 vi khuẩn/lít sữa, lượng vi khuẩn này không ngừng tăng lên trong quá trình vắt và chế biến sữa, tốc độ tăng của vi khuẩn phụ thuộc nhiều vào thành phần vi khuẩn ban đầu..Trong sữa có chứa một số vi sinh vật, bao gồm nấm men, nấm mốc. Trong số này vi khuẩn chiếm phần lớn, có tới vài chục loài như: vi khuẩn Lactic, vi khuẩn Butiric, propionic, vi khuẩn gây thối, nhóm trực khuẩn đường ruột... Hệ vi sinh vật trong sữa được người ta chia làm 3 nhóm: vi sinh vật bình thường, vi sinh vật không bình thường, vi sinh vật gây bệnh. sau đây là một số vi khuẩn thường gặp trong sữa: 2.5.2.1. Vi khuẩn Staphylococcus aureus Hình 3: Khuẩn lạc vi khuẩn Staphylococcus aureus Staphylococcus được Robet Kock (`1843-1910) phát hiện năm 1878 phân lập từ mủ ung nhọt và đến năm 1884 được Rosenbach nghiên cứu tỉ mỉ. Staphylococcus thuộc họ Micrococcaceae. Staphylococcus aureus là vi khuẩn hình cầu, bắt màu gram dương, trên tiêu bản xem trực tiếp các vi khuẩn đứng lẫn với các tế bào mủ, tập hợp thành hình chùm nho, cũng có khi cầu khuẩn đừng riêng rẽ. Đưỡng kính trung bình 0.8-1µ. Vi khuẩn không có giáp mô, không hình thành nha bào(Nguyễn Vĩnh Phước 1976). Tụ cầu sống hiếu khí hoặc kỵ khí tùy tiện, nhiệt độ phù hợp 32oc – 37oc, PH khoảng 7.2 -7.6. Các thực phẩm giàu đạm, đường bột là môi trường tốt cho tụ cầu phát triển và tích lũy độc tố. Staphylococcus areus sản sinh 6 độc tố ruột (Enterotoxin): A, B, C1, C2, D và E, chúng khác nhau về độc tính. Độc tố ruột của tụ cầu la loại protein đơn giản, khối lượng phân tử khoảng 26.000 – 30.000 Dalton. Phần lớn ngộ độc thực phẩm là do type A và D. Nguồn nhiễm tụ cầu cho thực phẩm đa phần là do người và động vật. Tụ cầu rải kháp nơi trong tự nhiên: Đất, nước, không khí, da, niêm mạc mũi họng của người bình thường, sữa của bò viêm vú.... Điều này làm thức ăn rất dễ nhiễm bởi vi khuẩn này. Mặt khác công nhân khi tham gia chế biến thực phẩm, giết mổ, vắt sữa... khi mắc bệnh ở đường hô hấp trên, đau răng hay bị viêm da do vi trùng gây mủ chính là nguồn gây nhiễm cho thực phẩm. Trong các loại thực phẩm, thông thường nhất là sữa và các sản phẩm từ sữa như kem sữa, bánh sữa, các đồ ngọt khác, kem đá là những thức ăn thuận lợi cho tụ trùng phát triển, ngoài ra thịt cá cũng là môi trường thuận lợi cho tụ cầu phát triển sinh độc tố và gây bệnh. Theo Nguyễn Ngọc Nhiên và Cù Hữu Phú (1977), nguyên nhân chính gây viêm vú bò do Staphylococcus aureus và tỉ lệ đã phân lập được Staphylococus aureus chiếm 33.74% các mẫu sữa kiểm tra. Bệnh viêm vú ở bò đã gây nhiều thiệt hại về kinh tế do sữa bị hủy bỏ vì sự có mặt của Staphylococcus aureus. Sự có mặt của Staphylococus aureus trong thực phẩm chỉ ra rằng có sự nhiễm khuẩn từ da, miệng mũi và tay chân của công nhân làm công tác thu gom, vắt sữa hoăc phân phối sữa. Số lượng vi khuẩn này trong thực phẩm phản ánh tình trạng vệ sinh, nhiệt độ của quá trình sử lý không đạt yêu cấu. Tuy nhiên sự có mặt của Staphylococus aureus trong thực phẩm không phải là bằng chứng của các vụ ngộ độc mà phải phát hiện ra khả năng sinh ra độc tố của những vi khuẩn này (Andrew. w,1992). 2.5.2.2. Coliform và Escherichia coli Hình 4: Khuẩn lạc E.coli trên môi trường MacConkey Hình 5: Khuẩn lạc E.coli trên môi trường EMBColiforms bao gồm ca vi khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện, có hình gậy, bắt màu gram âm, không sinh nha bào và có đặc tính lên men đường Lactose trong môi trường lỏng BLGB (Brilliant Green Lactose Bile) ở nhiệt độ 35oc trong vòng 48 giờ.Nhóm vi khuẩn Colifrom có nhiều nguồn gốc khác nhau: - Từ phân(nhóm Feacal Colifrom) - Từ đất (nhóm Aerobacter) - Từ cây cối (nhóm Intermediate). Chúng được phân biệt theo các đặc tính sinh hóa. Việc xác định chỉ số Colifrom có thể cho đánh giá sơ bộ tình trạng, mức độ vệ sinh của sản phẩm kiểm tra.Nhóm Colifrom được các nhà khoa học trên thế giới công nhận là một chỉ tiêu vệ sinh của nước so với các vi khuẩn gây bệnh khác. Nhóm Colifrom bao gồm các loài: E.coli, Citrobacter, Enterobacter, klebsiella, Serati ... có nguồn gốc thiên nhiên. E.coli là vi khuẩn đường ruột chủ yếu ở bộ phận ruột già của người và gia súc. Sự có mặt của E.coli trong nước chứng tỏ nguồn nước bị nhiễm bẩn từ phân (Vệ sinh dịch tễ, tập 1). Dựa vào triệu chứng và tính chất gây bệnh của E.coli người ta chia thành 5 nhóm: - EaggE (Entero aggregative Ecoli = E.coli tập kết ở ruột) - EEHC (Enterohemorrhagic E.coli = E.coli gây xuất huyết ở ruột) - EIEC (Entero invasive E.coli = E.coli gây bệnh đường ruột) - EPEC (Entero pathogenic E.coli = E.coli gây bệnh đường ruột) - ETEC (Entero toxingenic E.coli = E.co li sinh độc tố ruột). Triệu chứng người ngộ độc bởi E.coli: Người bị ngộ độc đau bụng dữ dội, rất ít nôn mửa, đi phân loãng khoảng 1-15 lần/ngày, nhiệt độ cơ thể bình thường hoặc tăng nhẹ. Bệnh kéo dài 1-3 ngày rồi khỏi. Trường hợp nặng cơ thể sốt cao, mệt mỏi, chân tay co quắp, bệnh khỏi sau 10 ngày. Người già và trẻ em dễ nguy hiểm đến tính mạng, tỷ lệ tử vong lên tớ 3-5% (WHO – Fact sheet No 125 – July 1996). Do vậy, kiểm tra vi khuẩn E.coli là việc làm bắt buộc với thực phẩm tươi sống có nguồn gốc động vật và là chỉ tiêu đánh giá tình trạng vệ sinh thực phẩm. 3 / Vi khuẩn Salmonella. Là loại trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, kích thước 0,4-0,6 x 1-3 µm không hình thành nha bào và giáp mô. Đa số các loài Salmonella đều có khả năng di động mạnh (trừ Salmonella galinarum – pullorum). Vi khuẩn Salmonella bắt màu Gram âm. Hình 6: Vi khuẩn Salmonella Khi nhộm vi khuẩn bắt màu toàn thân hoặc đậm hai đầu. Salmonella vừa hiếu khí và kỵ khí không bắt buộc, nhiệt độ nuôi cấy 37oc, ở PH =7,6. Salmonella có hàng ngàn serotype nhưng chỉ có một lượng rất ít các sẻotype có khả năng gây bệnh cho người và động vật. Sự có mặt của Salmonella trong thực phẩm thể hiện sự không an toàn đối với sức khỏe con người.Cho đến nay, nhười ta đã phát hiện được 2.324 serotype Salmonella và xếp chúng thành 66 nhóm căn cứ vào kháng nguyên O và H do Kaufman White thiết lập. Các nhóm đặc biệt có khả năng gây bệnh là: A, B, C1, C2, D1, E1 trong đó phải kể đến các serotype Salmonella typhi và Salmonella paratyphy A, B. Con người rất nhạy cảm với Salmonella. Thời kỳ ủ bệnh thường từ 12 -24 giờ, nhưng có thể kéo dài vài ngày. Khi phát hiện bệnh, dấu hiệu đầu tiên là buồn nôn, nhức đầu, choáng váng, khó chịu, sốt, đau bụng. Sau đó xuất hiện nôn mửa và tiêu chảy nhiều lần, phân toàn nước, đôi khi có lẫn máu đó là triệu chứng viêm ruột cấp tính. Đại đa số bệnh nhân trở lại bình thường sau 1-2 ngày và không để lại di chứng. Ngoài ra cá biệt có bệnh nhân biểu hiện giống bệnh thương hàn, cảm cúm nghĩa là sốt rất cao 390 - 40oC, mệt mỏi toàn thân, đau ở vùng thắt lưng và cơ bắp. Các triệu chứng rối loạn tiêu hóa biểu hiện rất nhẹ hoặc không có, vì vậy rất dễ chuẩn đoán nhầm. Bệnh thương hàn ở người gây ra chủ yếu do ăn thực phảm chưa nấu kỹ, xuất hiện các triệu chứng như đau bụng, nôn mửa, ỉa chảy và có thể gây viêm dạ dày sau khi ăn thực phẩm nhiễm Salmonella từ 12h – 24h. Thực phẩm bị nhiễm Salmonella thì tính chất của thực phẩm không bị thay đổi rõ rệt, do đó để phòng chống bệnh do Salmonella người ta khuyến cáo không nên sử dụng thịt sống, thịt tái, sữa tươi chưa được sử lý kỹ hay thức ăn chín sử lý nhiệt không đúng cách. Do Salmonella có đặc tính gây bệnh nguy hiểm nên TCVN 5153-90 quy định không có mặt của vi khuẩn này trong 25 gam mẫu thực phẩm được kiểm tra. 2.5.2.4. Vi khuẩn Clostridium perfingens Clostridium pefringens (Cl.perfringens) còn có tên là Clostridium welchii được Oen và Natan phân lập năm 1982 trong tổ chức xác người chết. Vi khuẩn Cl. perfingens thuộc họ Bacillaceae, giống Clostridia là vi khuẩn yếm khí sinh nha bào và sinh H2S. Vi khuẩn này phân bố rộng rãi trong tự nhiên (đất, nước, phân, không khí...) do đó rất dễ nhiễm vào thức ăn gây ngộ độc. Cloctridium perfingens là loại trực khuẩn thẳng, hai đầu hơi tròn, kích thước 0,8 -1,5 x 3 - 8µm. . Vi khuẩn không có lông, không di động, hình thành giáp mô trong cơ thể bệnh, có khả năng hình thành nha bào trong môi trường trung tính hoăc kiềm. Hình 7: Vi khuẩn Clostridium perfingens Nha bào to hơn chiều ngang thân vi khuẩn.và thường nằm ở giữa hoặc nằm gần một đầu của vi khuẩn. Vi khuẩn bắt màu gram dương, trong canh khuẩn nuôi cấy lâu thể bắt màu Gram âm (Nguyễn Như Thanh và cộng sự, 1997). Độc tố của Clostridium perfingens gây ngộ độc với người thuộc ngoại độc tố. Trong 6 type Clostridium perfingens chỉ có hai type có khả năng gây ngộ độc thực phẩm cho người đó là A và C. Ở những type có khả năng sinh độc tố người ta quan tâm đến tác động của độc tố α. Người bị ngộ độc thực phẩm nhiễm Clostridium perfingens type A, bệnh xuất hiện với triệu chứng viêm ruột, dạ dày, đau bụng, ỉa chảy, phân lỏng toàn nước có khi lẫn máu, thỉnh thoảng có trường hợp nôn mửa, cá biệt có nhức đầu, sốt. Thời gian mắc bệnh ngắn, thường vài ngày là khỏi. Bệnh diễn ra hầu hết ở thể cấp tính, bệnh súc chết sau 24 - 48 giờ sau khi có triệu chứng tiêu chảy phân có máu, con vật biểu hiện đau đớn, vật vã. Bệnh tích điển hình: ruột non xuất huyết nặng có khi xuất hiện cả ở ruột già, dịch ruột màu đỏ thẫm, thành ruột phù nặng, phổi xung huyết, tim rải rác các châm xuất huyết, gan, lách xung huyết. Cl. Perfingens có sẵn trong đường tiêu hóa hoặc từ ngoài vào, gặp điều kiện thuận lợi chúng tăng nhanh về số lượng và sinh nhiều độc tố, độc tố xuyên qua thành mạch vào máu gây trúng độc toàn thân và giết chết con vật. Chúng sinh độc tố thần kinh gây bại liệt và co giật, độc tố dung huyết gây hoại tử và chết. 2.5.2.5. Vi khuẩn Streptococcus Vi khuẩn Streptococcus là vi khuẩn hình cầu, bắt màu gram dương, đường kính từ 0,6 - 1µm, thường xếp thành chuỗi dài hoặc ngắn, nhưng cũng cũng có thể có dạng song cầu tùy thuộc loài. Không hình thành nha bào, một số giáp mô, cũng có ít loài có tiên mao.Hình 8: Vi khuẩn Streptococcus Streptococcus là những vi khuẩn hiếu khí tùy tiện, phát triển tốt ở môi trường thạch máu, môi trường có huyết thanh nhưng đòi hỏi chất dinh dưỡng nghiêm ngặt, phát triển rất kém trên môi trường thạch thường, không phát triển ở môi trường có thêm 6,5% NaCl. Phản ứng catalase âm tính, lên men glucose. Có loại tạo vòng dung huyết đặc hữu xung quanh khuẩn lạc khi phát triển trên môi trường thạch máu. Tính dung huyết khác nhau tùy từng chủng. Trong các khuẩn lạc gây viêm vú ở bò sữa, liên cầu khuẩn Streptococcus chiếm 86%, trong đó chủ yếu la Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae và Streptococcus uberis (Phạm Bảo Ngọc, 2002). Streptococcus dysgalactiaelae nguyên nhân chính gây viêm vú ở thời kỳ cạn sữa. Streptococcus uberis cư trú ở họng, da, âm đạo chúng gây viêm vú dạng cấp tính và có thể gây viêm vú thờ kỳ cạn sữa. Streptococus agalactiae gây viêm vú dạng cấp tính, mạn tính với triệu chứng lâm sàng rất rõ ràng, vi khuẩn này cư trú ở trong ống sữa và trên bề mặt ống dẫn sữa, chúng phát triển nhanh làm tăng số lượng bạch cầu, gây tắc ống dẫn sữa làm sưng vú và tách biệt các nang sữa. Bệnh lây lan chủ yếu qua người vắt sữa, dụng cụ vắt sữa và ruồi. Vắt sữa không hoàn chỉnh có thể làm tăng mức độ trầm trọng của bệnh viêm vú do Steptococcus trong đàn bò. Ngoài ra, khi xác định vi khuẩn trong sữa tươi thấy tồn tại Streptococcus pyogenes với tỷ lệ 33,33% ở các mẫu sữa thu gom. Qua đó ta thấy tỷ lệ nhiễm Streptococus trong sữa là khá cao, do đó cần có quy dịnh vệ sinh trong khâu thu gom, bảo quản... để hạn chế ô nhiễm sữa. Đảm bảo nguồn sữa sạch, an toàn vệ sinh cho người tiêu dùng là việc hết sức cần thiết. Ngoài những vi khuẩn nêu trên trong sữa còn có nhiều vi khuẩn có mặt thường xuyên trong sưã như: vi khuẩn Lactic, các vi khuẩn sinh hương, các liên cầu lactic (Streptococcus lactic), các trực khuẩn Lactic (Lactobacillus)... 2.5.3. Sự phát triển của vi sinh vật trong môi trường. Trong môi trường dinh dưỡng mỗi loài vi sinh vật đều phát triển theo các giai đoạn nhất định, có tính quy luật rõ rệt. Nghiên cứu quá trình này sẽ giúp ta có đủ cơ sở khoa học để điều khiển quá trình này theo hướng ta mong muốn. Có thể chia quá trình phát triển của vi sinh vật trong môi trường làm các giai đoạn hay các pha như sau: 2.5.3.1. Pha tiềm phát Vi sinh vật mới được cấy vào môi trường chưa tăng về mặt số lượng. Nguyên nhân chủ yếu của hiện tượng này gồm hai loại : - Nguyên nhân bên trong là điều kiện của bản thân loại vi sinh vật được cấy vào trong môi trường. Nếu giống ở dạng bào tử thì bào tử cần một thời gian thấm nước trương lên, các hệ enzyme chuyển từ trạng thái không hoạt động sang hoạt động, bào tử nảy mầm và sinh trưởng. Nếu giống còn non sẽ tiếp tục sinh trưởng đến khi đạt kích thước tối đa và đến tuổi sinh lý trưởng thành. Còn tế bào đã trưởng thành cũng không thể sinh sản ngay được mà còn phải có thời gian làm quen với môi trường đồng thời tiến hành tích lũy năng lượng chuẩn bị cho giai đoạn sinh sản. Đặc điểm của từng loại vi sinh vật, khả năng thích nghi của chúng cũng là những yếu tố quan trọng. - Nguyên nhân bên ngoài là điều kiện môi trường gồm có chất dinh dưỡng, độ pH môi trường, độ ẩm, nhiệt độ, thể oxy hóa – khử ... Những yếu tố của môi trường bên ngoài như nhiệt độ, độ ẩm, pH môi trường, đặc biệt là chất dinh dưỡng có ảnh hưởng rất nhiều đến pha tiềm phát. Nếu môi trường nôi cấy cũ thì thời gian làm quen với môi trường được rút ngắn – pha tiềm phát ngắn. Ngoài ra, vấn đề chủng loại vi sinh vật cũng liên quan đến thời gian của pha tiềm phát. Có loại vi khuẩn trong điều kiện thuận lợi, pha này chỉ kéo dài trong vài phút đến vài chục phút, ở loại khác thì hàng giờ. 2.5.3.2. Pha logarit (pha chỉ số) Trong pha này số lượng vi sinh vật tăng lên với tốc độ rất nhanh vì sau khi làm quen với môi trường và sinh trưởng mạnh vi sinh vật bắt đầu tiến hành sinh sản với tốc độ khá cao. Thời gian sinh sản của thế hệ phụ thuộc vào loài vi sinh vật. Vi sinh vật sinh sản theo cấp số nhân, nên số lượng tăng ngày càng nhanh. Thời gian tăng gấp đôi lượng tế bào gọi là thời gian thế hệ. Số lượng ban đầu càng lớn thì tốc độ phát triển trong pha này ngày càng nhanh và thời gian tăng đến số lượng cực đại càng ngắn. Một tế bào vi khuẩn chỉ sau 48 giờ đã sinh được 171 thế hệ. Trong pha này vi sinh vật đã thích nghi với môi trường bên ngoài, quá trình trao đổi chất tiến hành rất nhanh. Đặc tính sinh hóa đặc trưng cho loài vi sinh vật thường biểu hiện rõ rệt trong pha này. Sau một thời gian nuôi cấy, ở cuối pha logarit điều kiện sinh trưởng trong môi trường thay đổi nhiều, chất dự trữ trong môi trường cạn dần, một số sản phẩm của sự trao đổi chất có tính độc tích tụ lại, pH môi trường thay đổi. Các chất khử hydro bị hao phí. Sự chuyển hóa năng lượng bị chậm lại. Những cá thể bắt đầu gây trở ngại cho nhau. Tốc độ sinh sản giảm, số tế bào chết xuất hiện. Sự tăng tổng số tế bào sống chậm lại và dẫn tới các tế bào mới hình thành bằng số lượng tế bào chết. Sinh trưởng và phát triển bước vào pha cân bằng. 2.5.3.3. Pha cân bằng Tiếp theo pha sinh trưởng logarit là pha cân bằng. Trong pha này tổng số tế bào gần như không thay đổi. Hiện tượng này không có ý nghĩa là vi sinh vật ngừng sinh sản, mà thực ra vi sinh vật sản sinh tiếp tục, nhưng trong một đơn vị thời gian số tế bào sinh ra bằng số tế bào chết đi. Có thể nói đây là trạng thái cân bằng động. Chính trong pha này số lượng tế bào chứa trong một đơn vị thể tích cũng đạt tới mức tối đa. Số lượng tối đa của vi sinh vật trong môi trường là đặc trưng quan trọng của mỗi loài vi sinh vật. Nó phụ thuộc nhiều vào môi trường ngoài. Trong pha này chất dinh dưỡng trong môi trường giảm nhiều. Điều này dẫn đến kết quả là số tế bào sinh sản giảm, tế bào chết ngày càng tăng. Đặc biệt trong các quá trình lên men ở pha này vi sinh vật tích tụ nhiều sản phẩm trong môi trường nuôi cấy. 2.5.3.4. Pha suy vong Trong pha này tổng số tế bào giảm dần, số vi sinh vật chết tăng nhanh hơn số vi sinh vật sinh ra. Điều này xảy ra là do điều kiện sống tạo nên, chủ yếu là các chất dinh dưỡng đã cạn kiệt trong môi trường nuôi cấy. 2.5.4 . Sự thay đổi hệ vi sinh vật của sữa trong quá trình bảo quản. Bảng 2 Sự biến đổi tổn số vi sinh vật trong sữa phụ thuộc vào mức độ nhiễm ban đầu, nhiệt độ và thời gian bảo quản. MẫuĐiều kiện vệ sinhNhiệt độ bảo quản (oC)Tổng số vi sinh vật (1000 tế bào/ml)Ban đầuSau 24hSau 48h1 Tốt4,5 10,0 15,54 4 44 14 16004,6 128 33.0002Bình thường4,5 10,0 15,539 39 3988 180 4500122 832 991003Kém4,5 10,0 15,5136 136 136282 1200 24700540 13.700 640.000Nguồn: giáo trình công nghệ chế biến sữa và sản phẩm từ sữa Trong quá trình bảo quản sữa từ sau khi vắt đến khi sử dụng hoặc chế biến, hệ vi sinh vật thay đổi về số lượng, thành phần các nhóm trong đó. Sự thay đổi này phụ thuộc vào nhiệt độ, thời gian bảo quản và thành phần ban đầu của hệ vi sinh vật. Theo nhiều nghiên cứu cho thấy: Trong 12h đầu, trong sữa có nhiều loại vi khuẩn, trong đó vi khuẩn gây thối và vi khuẩn gây kiềm hóa chiếm ưu thế. Sau 24 h nhóm vi khuẩn trên sẽ bị vi khuẩn lên men(vi khuẩn Lactic) sữa chua kiềm chế. Sau 72 h cầu khuẩn Lactic bị nhóm vi khuẩn hình que chụi acid kiềm chế. Sau cùng là các nấm men, nấm mốc xuất hiện gây hư hỏng thực phẩm. Quá trình thay đổi này có thể chia thành các pha sau: - Pha 1:Pha ức chế vi khuẩn: Trong sữa tươi có một khoảng thời gian vi khuẩn không phát triển, thậm chí đôi khi còn giảm về số lượng. Trong sữa tim thấy hai chất có tác dụng ức chế vi khuẩn là lactenin-1 và lactanin-2. Dần dần độ axit tăng làm giảm độ tươi của sữa và vi khuẩn phát triển. - Pha2: pha phát triển hỗn hợp. Sau khi các chất ức chế hết tác dụng, hệ vi sinh vạt trong sữa phát triển. Cuối pha này (độ axit tăng đáng kể), các vi khuẩn lactic sinh sản mạnh mẽ. - Pha 3: pha phát triển của vi khuẩn Lactic. Ở pha này các vi khuẩn lactic chiếm ưu thế trong sữa, axit lactic và các sản phảm lên mem được tạo thành. Lúc đầu nhóm cầu khuẩn phát triển, sau bị chết dần do chính các sản phẩm do chúng tao thành và nhường chỗ cho trực khuẩn chịu axit. - Pha 4: pha phát triển của nấm men và nấm mốc. Vi khuẩn lactic phát triển làm cho độ axit trong sữa được nâng cao chính vì thế làm kìm hãm sự phát triển của nhiều vi khuẩn hoặc giết chết chúng, cũng vì thế mà các vi khuẩn này dần dần cũng bị chết để cho các vi sinh vật có khả năng phát triển ở môi trường có độ axit cao, như nấm men và nấm mốc. Nấm men và nấm mốc phát triển làm giảm chua cho sữa, chuyển môi trường dần dần từ axit sang kiềm, tạo điều kiện cho vi khuẩn gây thối phát triển. Ở pha cuối này sữa vị biến chất và hư hỏng. Như vậy trong sữa tươi mới vắt ra, có một khoảng thời gian vi khuẩn không phát triển, thậm chí có thể giảm và được gọi là giai đoạn tự kháng. Biện pháp hữu hiệu để đảm bảo độ tươi của sữa là phải làm lạnh càng sớm càng tốt vì nhiệt độ bảo quản thấp có thể kéo dài giai đoạn tự kháng này. Song khi sữa đã qua giai đoạn này thì nhiệt độ thấp cũng không thể làm số lượng vi sinh vật giảm xuống, bảo quản bằng phương pháp: Phương pháp Nanosilver đảm bảo số lượng vi sinh vật giảm xuống và không vượt quá giới hạn cho phép, đây chính là một ưu điểm của sản phẩm này. Phần III ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỐI TƯỢNG - Sữa bò tươi. - Bình sữa Nanosilver. 3.2. NỘI DUNG - Tìm hiểu chung về vi khuẩn trong sữa bò tươi. - Kiểm tra sự thay đổi về số lượng vi khuẩn hiếu khí, Colifrom, E.coli, theo thời gian trong sữa bò tươi được bảo quản bằng bình Nanosilver, bảo quản lạnh, không bảo quản. Thí nghiệm được tiến hành tại: Phòng thí nghiệm bộ môn thú y cộng đồng, khoa thú y, trường Đại Học Nông nghiệp Hà Nội. 3.3. NGUYÊN LIỆU. 3.3.1. Mẫu sữa. - Mẫu sữa chưa sử lý tại nông hộ. - Mẫu sữa chưa sử lý tại các cơ sở thu gom. 3.3.2. Các loại môi trường sử dụng. - Môi trường thạch: MacConkey, Brilliant green agar, PCA, EMB, TSI, Endo. - Thuốc thử: dung dịch Kowacs, dung dịch nước pepton, Indol. 3.3.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất trong thí nghiệm. - Máy móc phòng thí nghiệm: Tủ ấm, tủ lạnh, tủ sấy, nồi hấp khử trùng, buồng cấy vô trùng, cân, bếp từ... - Dụng cụ: Đĩa lồng, ống nghiệm, pipet, đèn cồn.... - Hóa chất: Cồn, nước cất, nước sinh lý... - Các dụng cụ nuôi cấy vi khuẩn: Que cấy, đèn cồn, lam kính, giá đựng ông nghiệm... 3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Để thực hiện nội dung nghiên cứu đề tài, chúng tôi áp dụng phương pháp thực nghiệm và thống kê sinh học. 3.4.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm. Mẫu sữa tươi được lấy và bảo quản ở nhiệt độ thấp trong bình đá và đưa ngay về phòng thí nghiệm. Tại phòng thí nghiệm mẫu sẽ được chia ra làm 2 lô khác nhau: Lô đối chứng gồm: Sữa 1: Không được bảo quản (đựng trong bình nhựa sạch) Sữa 2: Được bảo quản lạnh 40C (trong tủ lạnh). Lô thí nghiệm: Sữa 3: Sữa được bảo quản bằng bình Nanosilver. Sữa khi mới lấy về phòng thí nghiệm sẽ được kiểm tra các chi tiêu ban đầu như: tổng số vi khuẩn hiếu khí, Colifrom, E.coli. Sau 5h; 10h; 24h lấy sữa 1, 2, 3 ở 2 lô trên để tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu : Tổng số vi khuẩn hiếu khí, Colifrom, E.coli. Kết quả thí nghiệm được thống kê ghi lại. 3.4.2. Phương pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trong mẫu sữa. Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy láng mẫu trên môi trường thạch PCA, sau đó đếm số lượng khuẩn lạc trên môi trường thạch sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 370C/24-48h. Số lượng vi khuẩn hiếu khí trong 1ml sữa được tính theo số khuẩn lạc đếm được từ các đĩa thạch nuôi cấy ở đậm độ pha loãng khác nhau. 3.4.2.1. Nguyên liệu. - Mẫu sữa. - Ống nghiệm, giá đựng ống nghiệm, micropipet. - Nước muối sinh lý, thạch PCA đã đổ vào các đĩa lồng. 3.4.2.2.Tiến hành. - Pha loãng mẫu theo cơ số 10 thành các nồng độ :10-1, 10-2,10-3 ... tới đậm độ không còn khả năng dương tính. - Lấy 2 nồng độ pha loãng liên tiếp. Mỗi nồng độ cấy trên 2 đĩa thạch theo phương pháp cấy láng. Để ở tủ ấm 370C/24h – 48h. Phương pháp cấy láng : Dùng pipet trộn đều mẫu đã pha loãng. Hút 0,1 ml dung dịch mẫu bằng micropipet, nhỏ đều mẫu trên mặt thạch, dùng đũa thủy tinh hoặc đáy ống nghiệm vô trùng láng đều mẫu trên mặt thạch. Kết quả được đọc sau 24h. Xử lý kết quả: Chọn những đĩa có từ 15 -300 khuẩn lạc ở các đĩa của 2 đậm độ pha loãng liên tiếp. Nếu chênh lệch các giá trị của hai đậm độ trên nhỏ hơn hoặc bằng 2 lần.Số lượng vi sinh vật trong 1 ml sữa được tính theo công thức: N =C(n1+ 0,1 .n2). d Trong đó: + N : là số vi khuẩn trong 1ml sữa + C: Số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn + n1, n2 : Số đĩa ở hai đậm độ pha loãng liên tiếp đã chọn. + d : Hệ số pha loãng của đậm độ thứ nhất. Nếu chênh lệch giữa các giá trị ở 2 đậm độ pha loãng lớn hơn 2 lần, thì lấy đậm độ pha loãng thấp hơn để tính kết quả. Nếu đậm độ pha loãng ban đầu ít hơn 15 khuẩn lạc. Tính kết quả theo trung bình cộng của khuẩn lạc đếm được ở cả hai đĩa tính ra cho 1 ml sản phẩm. Kết quả biểu diễn dưới dạng thạp phân giữa 1,0 - 9,9 nhân với 10n. 3.4.3. Phương pháp xác định Coliform. 3.4.3.1. Nguyên tắc Mẫu đã được đồng nhất hoá được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp có chứa lactose. Trên môi trường Endo có chứa Natri sulfit và fucsin, có khả năng ức chế các vi khuẩn Gram (+). Trong quá trình phát triển trên môi trường này, Coliform lên men đường lactose tạo thành aldehyt và acid, aldehyt tác động đến phức chất fucsin – sulfit và giải phóng fucsin. Fucsin nhuộm các khuẩn lạc từ màu hồng đến màu đỏ cánh sen, tròn, bờ đều, có thể có ánh kim hoặc không. 3.4.3.2. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất:        - Đĩa petri                              - Dụng cụ đồng nhất mẫu        - Ống nghiệm                        - Pipet        - Tủ sấy                                 - Cồn 700        - Tủ hấp                                - Tủ ấm        - Tủ lạnh                                - Kéo, kẹp         Tất cả các dụng cụ phải khử trùng trước khi tiến hành thí nghiệm. Môi trường đã được pha chế trước, cho vào các đĩa petri, làm khô bề mặt trong điều kiện vô trùng và được bảo quản trong tủ lạnh, tránh ánh sáng trước khi sử dụng. 3.4.3.3. Tiến hành Chuẩn bị dung dịch gốc và các dung dịch pha loãng: Pha loãng mẫu cho đến khi có nồng độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3,… - Cấy mẫu: Cấy 0.1 ml mẫu đã pha loãng ở các nồng độ vào các đĩa petri đã có chứa môi trường thạch MacConkey, mỗi độ pha loãng làm  đĩa lặp lại trên 2 đĩa. Tráng đều mẫu trên mặt thạch.   - Nuôi ủ: Đưa đĩa đã cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 370C trong thời gian 48h – 72h. Quan sát và ghi nhận các đĩa petri đã nuôi có các khuẩn lạc có màu hồng đến màu đỏ cánh sen, tròn, bờ đều, có thể có ánh kim. 3.4.3.4. Kết quả Đếm các khuẩn lạc có màu hồng đến đỏ trong các đĩa petri có trong khoảng 15 –150 khuẩn lạc Số lượng Coliforms có trong 1g mẫu được tính theo công thức: N =C(n1+ 0,1 .n2). dTrong đó:  C: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa                 n1: Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 1                 n2: Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 2                 d: Hệ số pha loãng của đĩa đếm thứ 1 Kết quả biểu diễn dưới dạng thập phân giữa 1,0 - 9,9 nhân với 10n. 3.4.4. Phương pháp phát hiện và tính số lượng E.coli trong mẫu sữa 3.4.4.1. Nguyên tắc: Mẫu đã được đồng nhất hoá được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp có chứa lactose. Trên môi trường Endo có chứa Natri sulfit và fucsin, có khả năng ức chế các vi khuẩn Gram (+). Trong quá trình phát triển trên môi trờng này, Coliforms lên men đường lactose tạo thành aldehyt và acid, aldehyt tác động đến phức chất fucsin – sulfit và giải phóng fucsin. Fucsin nhuộm các khuẩn lạc từ màu hồng đến màu đỏ cánh sen, tròn, bờ đều, có thể có ánh kim hoặc không. Nếu khuẩn lạc có màu hồng có ánh kim có thể giả định là E.Coli thì kiểm tra có sinh Indol hay không. 3.4.4.2. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất: - Đĩa petri                               - Dụng cụ chẩn bị mẫu - Ống nghiệm                         - Pipet - Tủ sấy                                  - Cồn 700 - Tủ hấp                                 - Tủ ấm - Tủ lạnh                                - Kéo, kẹp 3.4.4.3. Hoá chất, môi trường:    - Môi trường thạch MacConkey    - Môi trường EMB    - Môi trường Endo    - Môi trường nước pepton glucose.    - Dung dịch Trypton (pepton)    - Thuốc thử Indol    Tất cả các dụng cụ phải khử trùng trước khi tiến hành thí nghiệm. Môi trường đã đựoc pha chế trước, cho vào các đĩa petri, làm khô bề mặt trong điều kiện vô trùng và được bảo quản trong tủ lạnh, tránh ánh sáng trước khi sử dụng 3.4.4.4. Tiến hành:        Chuẩn bị dung dịch gốc và các dung dịch pha loãng: Pha loãng mẫu cho đến khi có nồng độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3...tới đậm độ không còn khả năng pha loãng.   - Cấy mẫu: Với mỗi mẫu nuôi cấy ít nhất ở 3 đậm độ liên tiếp. Mỗi đậm độ cấy vào 2 đĩa thạch MacConkey với 1 lượng mẫu bằng 0.1ml, bằng phương pháp cấy láng. - Nuôi ủ: Đưa đĩa đã cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 370C trong thời gian 48 – 72h. Quan sát và ghi nhận các đĩa petri đã nuôi có các khuẩn lạc có màu hồng đến màu đỏ cánh sen, tròn, bờ đều, có thể có ánh kim để tiến hành khẳng định đó là E.Coli. - Phép thử khẳng định Căn cứ vào hình dạng màu sắc khuẩn lạc mà đếm, chọn 5 khuẩn lạc điển hình để giám định tiếp tính chất sinh hóa bằng phản ứng IMVIC : + Phản ứng sinh Indole Nguyên lý: Trong môi trường không có đường mà chỉ có pepton thì một số vi khuẩn (trong đó có E.coli) hình thành men tryptophanaza phân giải tryptophan sinh Indol. Tiến hành: Cấy vi khuẩn cần giám định vào môi trường nước pepton, nhiệt độ 370C trong 1-2 ngày, rồi nhỏ vào môi trường nuôi cấy 4-5 giọt thuốc thử Kovac, lắc đều. Đọc kết quả: Nếu trên bề mặt môi trường có một vòng đỏ là phản ứng dương tính tức là sinh Indol, phản ứng âm tính nếu bề mặt môi trường không có vòng đỏ. + Phản ứng MR Nguyên lý: Trong môi trường có glucose, vi khuẩn lên mem đường tạo ra axit pyruvic rồi tiếp tục chuyển hóa thành ethanol, H2, CO2 và các axit như: axetic, lactic, succinic làm PH môi trường giảm xuống 4-5, nhỏ chỉ thị màu đỏ methyl vào, môi trường có màu đỏ là phản ứng dương tính. Tiến hành: Cấy vi khuẩn vào môi trường nước pepton glucose, ủ ở 37oC/ 2- 4 ngày,sau đó nhỏ 5 giọt thuốc thử Methyl red vào, độc kết quả. + Phản ứng VP(Voges Prokauer) Nguyên lý: Trong môi trường pepton có glucose vi khuẩn lên men tạo nên axetylmethylcacbinol hoặc axeton chất này oxi hóa tạo thành diaxetyl. Diaxetyl kết hợp với guanidin chứa trong acginin của pepton tạo thành hợp chất màu đỏ, phản ứng dương tính. Tiến hành: Cấy giống vi khuẩn cần giám định vào môi trường pepton, nuôi cấy 370C/ 2-4 ngày sau đó nhỏ vào môi trường 5 giọt dung dịch thử VP. Kết quả: Phản ứng dương tính nếu thấy xuất hiện hợp chất màu đỏ. Không biến màu hoặc màu vàng là phản ứng âm tính.(Phản ứng này diễn ra rất chậm, đọc kết quả sau 4-5 giờ). + Phản ứng thử Citrat Nguyên lý: trong môi trường thạch nghiêng Simmon,s citrat sau khi ria cấy khuẩn lạc vào, nuôi tủ ấm370C/ 24h -48h.Vi khuẩn sử dụng cacbon trong môi trường làm biến màu môi trường từ xanh lá cây sang xanh màu nước biển. Kết quả: Môi trường chuyển sang màu xanh nước biển là phản ứng dương tính. Âm tính nếu phản ứng không chuyển màu. Tính kết quả theo công thức : Trong đó: C: Tổng số khuẩn lạc đếm được ở các đĩa           n1: Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 1           n2: Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 2 d: Hệ số pha loãng của đĩa đếm thứ 1 R: Tỉ lệ số ống dương tính/số ống thử Kết quả biểu diễn dưới dạng thạp phân giữa 1,0 - 9,9 nhân với 10n * Tính hiệu suất kháng khuẩn của bình sữa nano: Các kết quả thu được khi bảo quản bằng bình sữa nano, sẽ cho phép đánh giá hiệu quả diệt khuẩn của bình theo các mốc thời gian làm thí nghiệm. * Hiệu suất sẽ được tính theo công thức sau: Ht = [(N0 - Nt)/N0] ×100 % Trong đó: N0: Số vi khuẩn kiểm tra tại thời điểm ban đầu Nt: Số vi khuẩn kiểm tra sau t giờ Phần IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN Sữa là thực phẩm giàu dinh dưỡng, nên hệ vi sinh vật ô nhiễm vào sữa rất phong phú và đa dạng.trong đó phải kể đến một số vi khuẩn điển hình khi xâm nhập vào sữa có khả năng gây ngộ độc thực phẩm : Clostridium perfringens, Salmonella, E.coli, Staphylococcus arueus, Streptococcus agalacriae, Campylobacter, tổng vi khuẩn hiếu khí... Do điều kiện thực tập có hạn, chúng tôi chỉ kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây ô nhiễm sữa như sau: tổng số vi khuẩn hiếu khí, E.coli, Colifrom. 4.1. KẾT QUẢ KIỂM TRA VI KHUẨN HIẾU KHÍ TRONG SỮA BÒ TƯƠI THEO THỜI GIAN VÀ PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN Trong vệ sinh an toàn thực phẩm, thuật ngữ “ vi khuẩn hiếu khí” bao gồm cả vi khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện. Việc xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trong thực phẩm được sử dụng như một yếu tố chỉ điểm về điều kiện vệ sinh, nhiệt độ và thời gian bảo quản của quá trình sản xuất cũng như vận chuyển thực phẩm (Phạm văn Tất, 2001). Sữa tươi là môi trường dinh dưỡng thuận lợi cho các vi khuẩn hiếu khí phát triển, việc xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trong sữa tươi là tiêu chuẩn đánh giá về điều kiện vệ sinh, nhiệt độ, thời gian bảo quản của sữa, để từ đó đánh giá chất lượng sữa. Tập đoàn vi khuẩn hiếu khí lớn sẽ làm giảm chất lượng sữa, ngoài ra, sự có mặt của một số vi khuẩn gây bệnh có thể gây hại tới sức khỏe người tiêu dùng. Vì vậy việc xác định vi khuẩn hiếu khí trong sữa tươi là một việc hết sức cần thiết, nó không những đánh giá được mức độ an toàn của sữa mà còn phản ánh được hiệu quả của phương pháp bảo quản sữa. Theo tiêu chuẩn Food Standard Code của Úc, tổng số vi khuẩn hiếu khí trong sữa tươi chưa qua xử lý là , truy cập ngày 15 tháng 4 năm 2010. - Tuấn Hà (2009), “Bạc trong y học ngày nay”, có thể download tại địa chỉ , truy cập ngày 21 tháng 3 năm 2010. - Nguyễn Lân Dũng (2005), “Cấu trúc tế bào vi khuẩn”. Download từ địa chỉ , truy cập ngày 06 tháng 03 năm 2010. - Thu Linh (2008),“Công nghệ Nanosilver hạn chế…bệnh tiêu chảy trẻ em”. Download tại , truy cập ngày 14 tháng 4 năm 2010. - Ngô Lợi (1976), “Kỹ thuật bào chế sữa”, Nhà xuất bản nông nghiệp Hà nội. - Phạm Bảo Ngọc (2002), “Xác định vi khuẩn chủ yếu gây bệnh viêm vú bó sữa, tính kháng thuốc của chúng và biện pháp phòng trị”, luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp, Nhà xuất bản nông nghiệp Hà nội. - PGS.TS. Lương Đức Phẩm (2002), “Vi sinh vật học và an toàn vệ sinh thực phẩm”, Nhà xuất bản nông nghiệp Hà nội. - Nguyễn Thanh Phong (2006), “Công nghệ nano thế giới năm 2005”.Từ: , truy cập ngày 13 tháng 4 năm 2010. - Nguyễn Vĩnh Phước (1976), “Các phương pháp bảo quản thú sản và bảo quản thực phẩm”, Vi sinh vật thú y, tập 3, Nhà xuất bản đại học và trung học chuyên nghiệp. - Trần Linh Phước (2002), “Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm”, Nhà xuất bản giáo dục thành phố Hồ Chí Minh. - Phú Quang (2006), “Công nghệ sẽ làm thay đổi thế giới trong thế kỉ 21?”. Có thể tải từ địa chỉ , truy cập ngày 17 tháng 4 năm 2010. - Nguyễn Thanh Tâm (2003), “Nghiên cứu sự ô nhiễm một số vi khuẩn ở sữa tươi có nguồn gốc từ bên ngoài và từ bệnh viêm vú bò sữa và một vài biện pháp phòng tránh thích hợp”, luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp, Viện khoa học kĩ thuật nông nghiệp Việt Nam, Hà nội. - Nguyễn Như Thanh (1974), “Giáo trình thực tập vi sinh vật thú y”, Nhà xuất bản nông nghiệp Hà nội. - Lâm xuân Thanh (2003), “Giáo trình công nghệ chế biến sữa và các sản phẩm từ sữa”, Nhà xuất bản nông nghiệp. - Trần Thị Hạnh, Lưu Quỳnh Hương (2004), “Một số biện pháp cải thiện vệ sinh vắt sữa bằng tay và kết quả thực hiện”,báo cáo khoa học kĩ thuật thú y, Viện thú y, 2003. - Trần Thị Hạnh, Lưu Quỳnh Hương,“Xác định một số vi khuẩn trong sữa và yếu tố gây độc của chúng”,báo cáo khoa học kĩ thuật thú y, Viện thú y, 4/2003. - Nguyễn Ngọc Nhiên, Cù Hữu Phú, “Kết quả phân lập, xác định một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn gây bệnh viêm vú bò sữa và biện pháp phòng trị”, tr. 161-171, Kết quả nghiên cứu khoa học kĩ thuật thú y 1996-2000. - Nguyễn như Thanh, Nguyễn Bá Hiên, Nguyễn thị lan Hương (1997), “Vi sinh vật thú y”, Nhà xuất bản nông nghiệp Hà nội. Tiếng Anh Adrew (1992), “Manual of food qualiy control microbiological analysis”, Fao, pp.1-47,131-138, 207-212. Industrial Microbiological Services Ltd (2005), “Technical White Paper: Antimicrobial Activity of Silver”. Có thể download tại địa chỉ , truy cập ngày 20 tháng 4 năm 2010. Richard P. Feynman (1959),“There is plenty of room at the bottom”.Có thể download tại truy cập ngày 20 tháng 5 năm 2010. Woo Kyung Jung (2008), “Antibacterial Activity and Mechanism of Action of the Silver Ion in Staphyloccocus aureus and Escheria coli”, tải từ , truy cập ngày 15 tháng 5 năm 2010. Kristen M Kulinowski (2008),“Environmental Impacts of nanosilver”, từ , truy cập 21 tháng 5 năm 2010. Muhammad Raffi (2007), “Synthesis and Characterization of metal nanoparticles”, tải từ , truy cập ngày 20 tháng 4 năm 2010. TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA THÚ Y ---------------- KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ DIỆT KHUẨN CỦA BÌNH SỮA NANO BẠC ĐỐI VỚI CÁC LOẠI VI KHUẨN: VI KHUẨN HIẾU KHÍ, COLIFORM, ESCHERIA COLI TRONG SỮA BÒ TƯƠI Người thực hiện :PHẠM THỊ BIỂNLớp :THÚ Y CKhoá : 50Ngành :THÚ Y Người hướng dẫn :ThS. PHẠM HỒNG NGÂNBộ môn: THÚ Y CỘNG ĐỒNG HÀ NỘI - 2010 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên chúng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ban giám hiệu Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội, ban chủ nhiệm khoa thú y, các thầy cô trong khoa, trong trường đã dìu dắt trên con đường học tập suốt 5 năm qua. Đặc biệt tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo Phạm Hồng Ngân – bộ môn thú y cộng đồng – khoa Thú y – trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – người đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho chúng tôi thực hiện đề tài. Qua đây tôi xin gửi lời cảm ơn bạn bè và những người thân đã động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập để hoàn thành đề tài tốt nghiệp này . Cuối cùng tôi xin chúc toàn thể thầy cô giáo trong khoa thú y cùng bạn bè và người thân sức khỏe và thành đạt. Hà nội, ngày 30 tháng 05 năm 2010 Sinh viên Phạm Thị Biển 0 DANH MỤC BẢNG  TOC \o "1-3" \h \z \t "5,5"  HYPERLINK \l "_Toc181758589" Bảng 2.1. Ước tính đầu tư vào nghiên cứu và phát triển (R&D) công nghệ nano giai đoạn 1997 - 2005 của các Chính phủ  PAGEREF _Toc181758589 \h 7  HYPERLINK \l "_Toc181758590" Bảng 2.2. Sự biến đổi tổn số vi sinh vật trong sữa phụ thuộc vào mức độ nhiễm ban đầu, nhiệt độ và thời gian bảo quản.  PAGEREF _Toc181758590 \h 28  HYPERLINK \l "_Toc181758591" Bảng 4.1. Sự biến đổi của tổng số vi khuẩn hiếu khí theo thời gian và từng phương pháp bảo quản khác nhau.  PAGEREF _Toc181758591 \h 41  HYPERLINK \l "_Toc181758592" Bảng 4. 2. Sự biến đổi của số lượng Coliform trong mẫu sữa theo thời gian theo từng phương pháp bảo quản khác nhau.  PAGEREF _Toc181758592 \h 44  HYPERLINK \l "_Toc181758594" Bảng 4.3. Sự biến đổi số lượng vi khuẩn E.coli trong mẫu sữa theo thời gian theo từng phương pháp bảo quản khác nhau.  PAGEREF _Toc181758594 \h 46  HYPERLINK \l "_Toc181758595" Bảng 4.4. Kết quả khả năng diệt khuẩn của bình Nanosilver theo thời gian bảo quản  PAGEREF _Toc181758595 \h 48  DANH MỤC ẢNH  TOC \o "1-3" \h \z \t "6,6"  HYPERLINK \l "_Toc181758615" Hình 1. Bản đồ phân bố công nghệ nano trên thế giới  PAGEREF _Toc181758615 \h 5  HYPERLINK \l "_Toc181758616" Hình 2. Tổng số vốn đầu tư vào công nghệ nano tại một số quốc gia trên thế giới năm 2003  PAGEREF _Toc181758616 \h 6  HYPERLINK \l "_Toc181758617" Hình 3: Khuẩn lạc vi khuẩn Staphylococcus aureus  PAGEREF _Toc181758617 \h 18  HYPERLINK \l "_Toc181758618" Hình 4: Khuẩn lạc E.coli trên môi trường MacConkey  PAGEREF _Toc181758618 \h 20  HYPERLINK \l "_Toc181758619" Hình 5: Khuẩn lạc E.coli trên môi trường EMB  PAGEREF _Toc181758619 \h 20  HYPERLINK \l "_Toc181758620" Hình 6: Vi khuẩn Salmonella  PAGEREF _Toc181758620 \h 21  HYPERLINK \l "_Toc181758621" Hình 7: Vi khuẩn Clostridium perfingens  PAGEREF _Toc181758621 \h 23  HYPERLINK \l "_Toc181758622" Hình 8: Vi khuẩn Streptococcus  PAGEREF _Toc181758622 \h 24  HYPERLINK \l "_Toc181758623" Hình 9: Kết quả diệt vi khuẩn vi khuẩn hiếu của bình Nanosilver  PAGEREF _Toc181758623 \h 42  HYPERLINK \l "_Toc181758624" Hình 10: Kết quả diệt vi khuẩn vi khuẩn hiếu của bình Nanosilver  PAGEREF _Toc181758624 \h 50  DANH MỤC BIỂU ĐỒ  TOC \o "1-3" \h \z \t "7,7"  HYPERLINK \l "_Toc181758639" Biểu đồ 4.1: Sự biến đổi của vi khuẩn tổng số trong sữa bò tươi theo thời gian và phương pháp bảo quản  PAGEREF _Toc181758639 \h 42  HYPERLINK \l "_Toc181758640" Biểu đồ 4.2: Sự biến đổi của Colifrom trong sữa bò tươi theo thời gian và phương pháp bảo quản  PAGEREF _Toc181758640 \h 44  HYPERLINK \l "_Toc181758641" Biểu đồ 4.3: Sự biến đổi của E.coli trong sữa bò tươi theo thời gian và phương pháp bảo quản  PAGEREF _Toc181758641 \h 46  HYPERLINK \l "_Toc181758642" Biểu đồ 4.4: Tốc độ diệt khuẩn của Bình Nanosilver theo thời gian và phương pháp bảo quản  PAGEREF _Toc181758642 \h 48