Đề tài Đánh giá tính đa hình ADN và khả năng chọn dòng tế bào đột biến ở một số giống lúa đặc sản

iÕn ho¸, ph©n tÝch sù ®a d¹ng di truyÒn ë møc ®é ADN trong vµ gi÷a c¸c quÇn thÓ. HiÖn nay PCR ®­îc xem lµ mét ph­¬ng ph¸p nhanh vµ t­¬ng ®èi ®¬n gi¶n ®Ó ®¸nh gi¸ c©y ®­îc chuyÓn gen [1, 26]. 1.1.2. Kü thuËt RAPD vµ øng dông §Ó thùc hiÖn ph¶n øng PCR cÇn ph¶i x¸c ®Þnh tr×nh tù nucleotit ë hai ®Çu cña ®o¹n gen cÇn nh©n b¶n, ®Ó thiÕt kÕ ®o¹n måi. Tr­íc khi xuÊt hiÖn m¸y ®äc tr×nh tù ADN tù ®éng th× vÊn ®Ò nµy g©y nhiÒu khã kh¨n cho c«ng t¸c nghiªn cøu. Do ®ã, c¸c nhµ nghiªn cøu nhanh chãng ñng hé kü thuËt PCR sö dông ®o¹n måi cã tr×nh tù ngÉu nhiªn. §­îc sö dông réng r·i nhÊt trong c¸c kü thuËt ®ã lµ kü thuËt RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA = TÝnh ®a h×nh c¸c ®o¹n ADN ®­îc nh©n b¶n ngÉu nhiªn). Kü thuËt nµy ®­îc hai nhãm nghiªn cøu (Williams vµ CS, 1990) [37], (Welsh vµ CS, 1990) [36] ®ång thêi x©y dùng mét c¸ch ®éc lËp. Nã lµ mét kü cho phÐp ph¸t hiÖn tÝnh ®a h×nh c¸c ®o¹n ADN ®­îc nh©n b¶n ngÉu nhiªn b»ng viÖc dïng mét måi ®¬n chøa mét trËt tù nucleotit ngÉu nhiªn. Th­êng måi nµy chøa tõ 9 ®Õn 12 nucleotit tèi thiÓu lµ 4 nucleotit. Cã hµng ngµn lo¹i måi chøa kho¶ng 10 nucleotit nh­ng sè l­îng måi ®­îc dïng trong nghiªn cøu lµ mét con sè h¹n chÕ. Trong ph¶n øng RAPD, c¸c måi ®¬n g¾n vµo hai ®iÓm kh¸c nhau ë hai m¹ch ®¬n ®èi diÖn cña ®o¹n ADN khu«n. NÕu c¸c ®iÓm b¾n måi n»m trong kho¶ng c¸ch cã thÓ nh©n b¶n ®­îc (th­êng tõ 200 ®Õn 2000 nucleotit) th× ®o¹n ADN ®ã ®­îc nh©n lªn. Sù cã mÆt cña s¶n phÈm nµy chøng tá ®· cã sù t­¬ng ®ång hoµn toµn hay mét phÇn gi÷a ADN genom víi c¸c måi oligonucleotit. Tõ nh÷ng nghiªn cøu nµy, ngµy nay kü thuËt RAPD ®· ®­îc thèng nhÊt theo ph­¬ng ph¸p cña Williams vµ CS (1990) [37] lµ sö dông c¸c ®o¹n måi ngÉu nhiªn cã chiÒu dµi 10 nucleotit víi thµnh phÇn G + C cao (60%) ®Ó b¸m chÆt vµo ADN khu«n. §iÓm kh¸c gi÷a RAPD so víi PCR lµ nã chØ sö dông mét måi ngÉu nhiªn dµi 10 nucleotit, qu¸ tr×nh nh©n b¶n ADN lµ ngÉu nhiªn. §o¹n måi nµy cã thÓ b¸m vµo bÊt kú vÞ trÝ nµo trong bé genom khi t×m ®­îc vÞ trÝ bæ sung. Víi chiÒu dµi ng¾n nªn kh¶ n¨ng ®o¹n måi t×m ®­îc c¸c ®o¹n t­¬ng ®ång trªn c¸c m¹ch ®¬n cña ADN trong genom kh«ng qu¸ khã kh¨n. V× thÕ RAPD lµ mét ph­¬ng ph¸p cã hiÖu qu¶ ®Ó x¸c ®Þnh tÝnh ®a h×nh vÒ trËt tù nucleotit gi÷a c¸c c¸ thÓ. Tïy vµo tõng nhãm lo¹i thùc vËt hay vi sinh vËt cô thÓ mµ c¸c ®o¹n måi ngÉu nhiªn ®­îc thiÕt kÕ ®Æc dông. Theo lý thuyÕt, sè l­îng c¸c ®o¹n ADN ®­îc nh©n b¶n phô thuéc vµo ®é dµi vµ vÞ trÝ g¾n cña c¸c ®o¹n måi, kÝch th­íc vµ møc ®é phøc t¹p cña cÊu tróc genom. KÕt qu¶ lµ sau khi ®iÖn di s¶n phÈm RAPD sÏ xuÊt hiÖn nhiÒu ph©n ®o¹n kh¸c nhau. Sù kh¸c nhau ®ã gäi lµ tÝnh ®a h×nh. Sù ®a h×nh cña s¶n phÈm RAPD lµ do møc ®é t­¬ng ®ång cña tr×nh tù ADN trong genom víi tr×nh tù måi vµ kÝch th­íc cña bé genom. §é t­¬ng ®ång cµng cao th× ph©n ®o¹n cµng nhiÒu. Kü thuËt RAPD còng gièng PCR gåm ba giai ®o¹n nh­ng ®iÓm kh¸c lµ trong giai ®o¹n g¾n måi RAPD cã nhiÖt ®é b¾t måi thÊp h¬n (tõ 350C - 450C). §©y còng lµ mét nguyªn nh©n dÉn ®Õn cã nhiÒu ph©n ®o¹n ADN ®­îc nh©n b¶n ngÉu nhiªn [2]. RAPD lµ mét ph­¬ng ph¸p cã hiÖu qu¶ trong viÖc x¸c ®Þnh kiÓu gen, ph©n tÝch quÇn thÓ vµ nguån gèc loµi, nghiªn cøu di truyÒn loµi, lËp b¶n ®å di truyÒn. Kü thuËt RAPD ®­îc sö dông ®Ó nhËn biÕt vµ ph©n lo¹i c¸c gièng c©y trång kh¸c nhau, sù ®a d¹ng di truyÒn trong c¸c kiÓu gen lóa n­íc vµ lóa n­¬ng, sù ®a d¹ng di truyÒn gi÷a lóa Indica vµ Japonica, x¸c ®Þnh sù ®a h×nh cña c¸c gièng. Yang vµ Quiros ®· sö dông 28 ®o¹n måi cã tr×nh tù 10 nucleotit ®Ó nghiªn cøu sù kh¸c biÖt cña 23 gièng cÇn t©y vµ ®­îc chia lµm ba nhãm. KÕt qu¶ thu ®­îc còng trïng hîp khi sö dông 6 chØ thÞ protein ®Ó ph©n lo¹i c¸c gièng cÇn t©y trªn (Yang vµ Quiros, 1993) [38]. T­¬ng tù nh­ vËy nhiÒu t¸c gi¶ ®· sö dông RAPD ®Ó lËp c©y chñng lo¹i ph¸t sinh cña c¸c loµi c©y nh­: ng«, lóa g¹o, lóa m×,... [24, 29, 32]. Orozco vµ CS, (1994) [31] ®· øng dông kü thuËt RAPD ®Ó kh¶o s¸t mèi quan hÖ di truyÒn vµ tiÕn ho¸ cña c¸c gièng cµ phª ®­îc tai t¹o tõ c¸c loµi bè, mÑ ë c¸c vïng sinh th¸i kh¸c nhau lµm c¬ së cho viÖc ghÐp cÆp lai víi môc ®Ých t¹o con lai cã ®Æc ®iÓm quý ®Ó lai t¹o gièng cµ phª míi. Bïi M¹nh C­êng vµ CS, (2000) [6] còng cho biÕt khi sö dông kü thuËt RAPD ®· ph©n biÖt ®­îc hai gièng ®Ëu Vetch vµ lentil, gièng nhau vÒ h×nh th¸i (träng l­îng1000 h¹t, mµu s¾c, kÝch th­íc...). §iÒu nµy cã mét ý nghÜa lín trong viÖc x¸c ®Þnh ®é thuÇn di truyÒn còng nh­ møc ®é lÉn t¹p c¬ giíi cña c¸c lo¹i gièng c©y trång. Trong qu¸ tr×nh thiÕt lËp mèi quan hÖ gi÷a c¸c loµi hay nhãm loµi (Apostol vµ CS, 1993) ®· x©y dùng kü thuËt ph©n nhãm th«ng qua c¸c biÓu ®å RAPD. Thùc chÊt cña kü thuËt nµy gåm ba b­íc: B­íc 1: So s¸nh tõng cÆp ®èi t­îng trong nghiªn cøu b»ng c¸ch tÝnh to¸n kho¶ng c¸ch quan hÖ gi÷a chóng. B­íc 2: LËp ma trËn gåm tÊt c¶ nh÷ng gi¸ trÞ tÝnh ®­îc tr­íc ®ã. 2NAB NA + NB B­íc 3: Gi¶i ma trËn vµ biÓu diÔn thµnh mét biÓu ®å ®Æc tr­ng. C¸c gi¸ trÞ biÓu diÔn kho¶ng c¸ch gi÷a c¸c c¸ thÓ ®­îc thiÕt lËp theo hÖ sè t­¬ng ®ång cña Nei vµ Li (1985). S = Trong ®ã NAB lµ sè b¨ng cã mÆt ë c¶ hai loµi A vµ B; NA lµ sè b¨ng chØ cã ë loµi A; NB lµ sè b¨ng chØ cã ë loµi B. Ngµy nay, c¸c nhµ nghiªn cøu ®· thiÕt lËp ®­îc phÇn mÒm m¸y tÝnh ®Ó tù ®éng vÏ nªn biÓu ®å mèi quan hÖ hay ®é t­¬ng ®ång di truyÒn cña c¸c ®èi t­îng nghiªn cøu sau khi nhËp d÷ liÖu vÒ c¸c b¨ng nh©n b¶n cña c¸c c¸ thÓ. NTSYSpc version 2.0 (Applied Biostatistics Inc., USA., 1998) lµ tªn cña mét tr­¬ng tr×nh thuéc kiÓu trªn ®Ó t¹o c¸c biÓu ®å h×nh c©y. BiÓu ®å thu ®­îc sÏ thÓ hiÖn møc ®é gÇn nhau cña c¸c c¸ thÓ cho phÐp ®¸nh gi¸ ®­îc mèi quan hÖ di truyÒn gi÷a c¸c c¸ thÓ ®­îc nghiªn cøu. Ch­¬ng tr×nh nµy cho phÐp gi¶m bít thêi gian nghiªn cøu vµ cã ®é chÝnh x¸c cao nªn nã lµ mét phÇn mÒm cã hiÖu qu¶ trong viÖc ph©n tÝch kü thuËt RAPD. 1.2. §Æc ®iÓm cña c¸c gièng lóa §Æc s¶n ë miÒn B¾c ViÖt Nam ë n­íc ta c©y lóa gi÷ vÞ trÝ träng yÕu trong hÖ thèng c©y l­¬ng thùc. Ngµy nay khi n¨ng suÊt lóa g¹o ®· ®¸p øng ®ñ nhu cÇu trong n­íc vµ cã d­ ®Ó xuÊt khÈu th× ng­êi ta quan t©m nhiÒu ®Õn chÊt l­îng g¹o. C¸c gièng lóa ®ang ®­îc s¶n xuÊt trªn diÖn tÝch lín mÆc dï cho n¨ng suÊt cao nh­ng chÊt l­îng ch­a ®¸p øng ®­îc nhu cÇu cña thÞ tr­êng ®ßi hái. V× vËy vÞ trÝ c¸c gièng lóa ®Æc s¶n ngµy cµng quan träng trong viÖc n©ng cao chÊt l­îng g¹o ViÖt Nam. C¸c gièng lóa ®Æc s¶n cã chÊt g¹o tèt vµ cã mïi th¬m ngon thuéc nhãm lóa mïa chÝnh vô. §a sè c¸c gièng lóa nµy ®­îc trång ë mét sè tØnh thuéc khu vùc miÒn B¾c n­íc ta (Th¸i B×nh, Nam §Þnh, Hµ T©y, H¶i D­¬ng, H¶i Phßng...), nh­ T¸m Xoan H¶i HËu, T¸m Êp BÑ Xu©n §µi, T¸m Cæ Ngçng Nam §Þnh, Dù Th¬m, TÎ Di H­¬ng... Lµ nh÷ng gièng lóa cã tiÒm n¨ng xuÊt khÈu vµ ®¸p øng nhu cÇu thiÕt thùc trong n­íc [12]. Nh­ng c¸c gièng lóa nµy cã diÖn tÝch gieo trång Ýt, n¨ng suÊt cßn thÊp vµ kh«ng æn ®Þnh, do cã nhiÒu ®Æc ®iÓm yÕu nh­ c©y cao (tõ 145 -170 cm), th©n mÒm yÕu, chèng ®æ kÐm, l¸ dµi rñ, h¹t th­a, cæ b«ng dµi, kÐm chÞu ph©n, ph¶n øng chÆt chÏ víi ¸nh s¸ng ngµy ng¾n vµ cã thêi gian sinh tr­ëng kh¸ dµi (tõ 155-170 ngµy) cÇn kh¾c phôc nh÷ng nh­îc ®iÓm nãi trªn cho phï hîp víi ®iÒu kiÖn canh t¸c cña tõng vïng [11, 12]. V× vËy viÖc nghiªn cøu t¹o c¸c ®ét biÕn thùc nghiÖm kÕt hîp víi chän dßng tÕ bµo nh»m chän t¹o c¸c gièng lóa chÊt l­îng vµ n¨ng suÊt cao tõ c¸c gièng lóa ®Þa ph­¬ng cã mét ý nghÜa rÊt lín kh«ng chØ ®èi víi c©y lóa mµ cßn ®èi víi c¸c gièng c©y trång kh¸c. 1.3. nu«i cÊy m« sÑo vµ c¬ së chän dßng biÕn dÞ soma N¨m 1898, lÇn ®Çu tiªn, nhµ thùc vËt häc ng­êi §øc tªn lµ Haberlandt ®· nhËn xÐt: "Mçi mét tÕ bµo bÊt kú lÊy tõ c¬ thÓ thùc vËt ®a bµo ®Òu cã kh¶ n¨ng tiÒm tµng ®Ó ph¸t triÓn thµnh mét c¬ thÓ hoµn chØnh. §ã lµ tÝnh toµn n¨ng cña tÕ bµo" [1]. BÊt kú mét bé phËn nµo cña c©y (mÇm, rÔ, th©n, l¸, nhÞ...), ®Òu cã thÓ t¹o nªn c©y hoµn chØnh th«ng qua kü thuËt nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt. M« sÑo (callus) lµ mét khèi tÕ bµo m« mÒm, cã møc ®é cÊu tróc thÊp, ch­a ph©n ho¸, cã kh¶ n¨ng ph©n bµo liªn tôc vµ th­êng cã tÝnh biÕn ®éng di truyÒn cao. Trong nu«i cÊy in vitro m« sÑo ®­îc t¹o ra tõ nu«i cÊy c¸c c¬ quan cña thùc vËt (th©n, l¸, rÔ, h¹t, nhÞ...) ë c¸c m«i tr­êng nu«i cÊy thÝch hîp cã chøa c¸c chÊt ®iÒu khiÓn sinh tr­ëng cÇn thiÕt nh­ (auxin, cytokinin) vµ ®iÒu kiÖn nu«i cÊy (nhiÖt ®é, ¸nh s¸ng, ®é Èm...) tèi ­u. M« sÑo cã thÓ ®­îc duy tr× trªn m«i tr­êng nu«i cÊy b»ng c¸ch cÊy chuyÓn ®Þnh kú, tuy nhiªn trong thùc nghiÖm cho thÊy r»ng: m« sÑo qua cÊy chuyÓn nhiÒu lÇn th× kh¶ n¨ng t¸i sinh c©y gi¶m râ rÖt vµ t¨ng tÝnh biÕn ®éng di truyÒn cña m« [1, 9, 15]. C¸c tÕ bµo m« sÑo cã tÝnh æn ®Þnh di truyÒn thÊp. VËy muèn nh©n nhanh vµ duy tr× tÝnh ®ång nhÊt di truyÒn th«ng qua m« sÑo cña mét sè loµi thùc vËt cÇn sö dông m« sÑo s¬ cÊp ®Ó t¸i sinh c©y hoµn chØnh. Nh÷ng c©y t¸i sinh tõ m« sÑo th­êng cã nh÷ng biÕn ®æi di truyÒn phong phó (dÞ béi, ®a béi) vµ c¸c biÕn ®æi di truyÒn kh¸c, ®iÒu nµy cã ý nghÜa trong chän gièng (Lª TrÇn B×nh vµ CS, 1998) [2], (Oono, 1983) [30]. B»ng c¸ch nµy nhiÒu t¸c gi¶ ®· th«ng b¸o thu ®­îc nh÷ng gièng c©y trång míi [3, 15, 20, 33]. ThuËt ng÷ “ biÕn dÞ soma” ®­îc Larkin vµ Scowcroft (1982) [27] dïng ®Ó chØ tÊt c¶ c¸c biÕn dÞ x¶y ra trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy m« vµ tÕ bµo. BiÓu hiÖn cña biÕn dÞ soma ®­îc quan s¸t thÊy ë kiÓu h×nh cña nh÷ng c©y t¸i sinh tõ nu«i cÊy m« sÑo. Nguyªn lý chung cña viÖc chän dßng mang biÕn di soma lµ ë tÕ bµo nu«i cÊy in vitro tÇn suÊt biÕn ®éng di truyÒn dao ®éng tõ 10-5- 10-8 trong m«i tr­êng nu«i cÊy b×nh th­êng khi kh«ng xö lý ®ét biÕn, cßn nÕu kÕt hîp víi xö lý ®ét biÕn b»ng chÊt ho¸ häc (EMS, BU...) hoÆc c¸c lo¹i bøc x¹ (tia UV, tia gamma...) th× tÇn sè ®ét biÕn cã thÓ t¨ng lªn gÊp 10 - 100 lÇn, v× vËy cã thÓ chän ra c¸c c¸ thÓ ®ét biÕn nhanh h¬n vµ cã hiÖu qu¶ h¬n so víi c¸c biÖn ph¸p chän gièng th«ng th­êng kh¸c ¸p dông cho c©y nguyªn vÑn. ë møc ®é tÕ bµo, nhÊt lµ tÕ bµo ®¬n béi hÇu nh­ c¸c ®Æc ®iÓm ®ét biÕn ®­îc thÓ hiÖn ra ngay. Kü thuËt nu«i cÊy m« tÕ bµo cßn cho phÐp gi¶m bít ®¸ng kÓ thêi gian cÇn thiÕt ®Ó chän ®­îc nh÷ng tÝnh tr¹ng theo ý muèn [22]. Shepart vµ CS (1980) qua nu«i cÊy tÕ bµo trÇn cña khoai t©y ®· chän läc vµ ®· thu ®­îc gièng khoai t©y cã thêi gian sinh tr­ëng ng¾n, cñ ®Òu, h×nh d¹ng ®Ñp vµ chèng chÞu ®­îc mét ®iÒu kiÖn bÊt lîi cña m«i tr­êng tèt h¬n so víi gièng gèc [trÝch dÉn tõ 1]. Larkin vµ CS (1982) [27], Barwale vµ CS (1987) [19] còng cho r»ng biÕn dÞ soma th­êng xuÊt hiÖn ë c¸c c©y t¸i sinh ®­îc sau khi nu«i cÊy tÕ bµo qua giai ®o¹n m« sÑo. Cã nhiÒu kiÓu ®ét biÕn nh­: ®ét biÕn nh©n, ®ét biÕn tÕ bµo chÊt, ®a béi thÓ vµ c¸c bÊt th­êng kh¸c trong nhiÔm s¾c thÓ. Trong nghiªn cøu thùc nghiÖm Maliga (1984) [28] ®· tiÕn hµnh xö lý tia cùc tÝm ®èi víi tÕ bµo trÇn thuèc l¸ vµ xö lý tia gamma Co60 víi tÕ bµo thuèc l¸ cho thÊy tÇn sè ®ét biÕn t¨ng lªn 10 lÇn so víi ®èi chøng. Nh÷ng c©y t¸i sinh tõ m« sÑo xö lý ®ét biÕn dÔ mang nh÷ng biÕn ®éng di truyÒn vÒ nhiÔm s¾c thÓ (di béi, ®a béi) vµ c¸c biÕn ®æi di truyÒn kh¸c.VÊn ®Ò nµy ®· më ra mét triÓn väng lín trong viÖc c¶i tiÕn di truyÒn nh÷ng gièng c©y trång cã ý nghÜa kinh tÕ, t¹o gièng míi cho n¨ng suÊt cao, chèng chÞu ®­îc c¸c ®iÒu kiÖn ngo¹i c¶nh bÊt lîi, chÊt l­îng tèt vµ æn ®Þnh. NhiÒu c«ng tr×nh nghiªn cøu ®· thµnh c«ng trong viÖc chän dßng mang biÕn di soma trªn c¸c ®èi t­îng c©y trång kh¸c nhau ®Æc biÖt lµ c©y l­¬ng thùc. Theo Lª TrÇn B×nh vµ CS (1997) [1] b¶n chÊt vµ c¬ chÕ cña biÕn dÞ soma liªn quan mËt thiÕt ®Õn nh÷ng thay ®æi trong genom cña tÕ bµo nu«i cÊy. Do nhiÒu nguyªn nh©n nh­ t¸c ®éng cña hoocm«n sinh tr­ëng trong thêi gian dµi vµ c¸c yÕu tè kh¸c lµm cho nhiÔm s¾c thÓ trong tÕ bµo nu«i cÊy t¨ng lªn t¹o ra c¸c d¹ng ®a béi lÖch vµ møc béi thÓ cao. NhiÒu tr­êng hîp kh¸c, c¸c ®o¹n nhiÔm s¾c thÓ cã thÓ bÞ chuyÓn ®æi hoÆc ®¶o ng­îc. CÊu tróc cña ph©n tö ADN cã thÓ bÞ thay ®æi dÉn ®Õn thay ®æi kiÓu h×nh thùc sù. Adkins vµ CS (1995) [18] th«ng b¸o ®· chän ®­îc dßng lóa chÞu h¹n tõ m« sÑo gièng lóa Khao Dawk Mali 105 b»ng viÖc bæ sung vµo m«i tr­êng nu«i cÊy PEG 8000. C¸c tÝnh tr¹ng n«ng sinh häc quan träng vµ kh¶ n¨ng chÞu h¹n ®· duy tr× vµ æn ®Þnh ë thÕ hÖ R2. T­¬ng tù mét sè t¸c gi¶ còng thu ®­îc c¸c dßng c©y chÞu mÊt n­íc nh­ c©y anh ®µo, c©y cao l­¬ng... Sö dông c«ng nghÖ tÕ bµo thùc vËt kÕt hîp víi kü thuËt thæi kh« m« sÑo (§inh Thi Phßng vµ CS, 2001) [15] ®· chän t¹o thµnh c«ng ba gièng lóa DR1, DR2 vµ DR3 c¶ ba gièng lóa ®Òu thÊp c©y, ng¾n ngµy, chÞu nãng h¹n, chÞu l¹nh kh¸, chèng ®æ, ®Î nh¸nh vµ sinh tr­ëng khoÎ, cho n¨ng suÊt v­ît gièng gèc CR 203. Trong ®ã DR2 ®· ®­îc c«ng nhËn lµ gièng lóa Quèc gia 1998 vµ hiÖn nay DR2 kh«ng chØ ®­îc gieo trång ë 12 tØnh miÒn nói phÝa B¾c mµ cßn c¶ ë miÒn Trung (Kontum). Gièng lóa DR3 ®· qua ba vô kh¶o nghiÖm c¬ b¶n vµ hiÖn ®ang ®­îc triÓn khai më réng s¶n xuÊt ë c¸c vïng sinh th¸i khã kh¨n. T­¬ng tù nh­ vËy ViÖn lóa ®ång B»ng s«ng Cöu Long còng ®· chän t¹o thµnh c«ng dßng lóa Khao 105 cã tÝnh øng dông vµ c¸c dßng chÞu muèi triÓn väng tõ gièng lóa Mét Bôi (Bïi B¸ Bæng, 1997) [3] vµ hiÖn nay gièng Khao 105 ®· ®­îc c«ng nhËn lµ gièng Quèc gia. Phßng Di truyÒn TÕ bµo Thùc vËt, ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc còng ®· chän t¹o thµnh c«ng gièng lóa BR12 kh¸ng bÖnh ®¹o «n, cã nguån gèc tõ gièng lóa CR203. ViÖc chän ®­îc nh÷ng dßng tÕ bµo kh¸ng nÊm bÖnh, kh¸ng chÊt diÖt cá, kh¸ng kh¸ng sinh, kh¸ng kim lo¹i nÆng, thÝch nghi tèt víi c¸c yÕu tè bÊt lîi cña m«i tr­êng (nãng, l¹nh, kh«, h¹n, chua, mÆn...), trªn nhiÒu ®èi t­îng c©y trång kh¸c nhau cã mét ý nghÜa to lín trong n«ng nghiÖp. 1.4. §ét biÕn thùc nghiÖm vµ øng dông trong chän t¹o gièng c©y trång VËt chÊt di truyÒn ®­îc duy tr× æn ®Þnh tõ thÕ hÖ nµy sang thÕ hÖ kh¸c, nh­ng kh«ng ph¶i lµ tuyÖt ®èi, cã thÓ bÞ biÕn ®æi bëi t¸c nh©n tù nhiªn hoÆc g©y t¹o nh­ t¸c nh©n g©y ®ét biÕn vËt lý vµ ho¸ häc. Ng­êi ta gäi nh÷ng biÕn ®æi dï lµ nhá nhÊt trong cÊu tróc gen hoÆc nhiÔm s¾c thÓ lµ ®ét biÕn [16]. Trong chän gièng cæ ®iÓn ®Ó chän ®­îc mét gièng tèt, æn ®Þnh ng­êi ta ph¶i cÇn Ýt nhÊt tõ 6 ®Õn 10 thÕ hÖ v× nh÷ng ®ét biÕn trong tù nhiªn suÊt hiÖn víi tÇn sè rÊt thÊp. Trong khi ®ã b»ng ph­¬ng ph¸p ®ét biÕn nh©n t¹o (®ét biÕn thùc nghiÖm), chØ cÇn tõ 3 ®Õn 6 thÕ hÖ, thËm chÝ c¸ biÖt chØ cã tr­êng hîp cÇn 2-3 thÕ hÖ (NguyÔn H÷u §èng, 2000) [10]. Víi ph­¬ng ph¸p ®ét biÕn nh©n t¹o, sö dông c¸c t¸c nh©n g©y ®ét biÕn lý ho¸ cã thÓ lµm t¨ng nguån ®a d¹ng di truyÒn trong quÇn thÓ. Trong hµng lo¹t c¸c ®ét biÕn xuÊt hiÖn, nh÷ng ®ét biÕn cã lîi cã thÓ nh©n trùc tiÕp thµnh gièng míi hoÆc ®­îc sö dông lµm vËt liÖu khëi ®Çu cho c«ng t¸c chän gièng. Trong nhiÒu t¸c nh©n g©y ®ét biÕn th× c¸c t¸c nh©n vËt lý (tia R¬nghen, tia gamma, bøc x¹ n¬tron...) hiÖn lµ nh÷ng t¸c nh©n g©y ®ét biÕn cã hiÖu qu¶, gióp chän t¹o ra c¸c gièng c©y trång cã nh÷ng tÝnh tr¹ng tèt (chÞu h¹n, kh¸ng nÊm, n¨ng suÊt cao, chÊt l­îng tèt, thêi sinh tr­ëng ng¾n...). NhiÒu t¸c gi¶ xö dông ph­¬ng ph¸p g©y ®ét biÕn thùc nghiÖm b»ng tia gamma ®· chän t¹o ®­îc nhiÒu gièng c©y trång míi, ®Æc biÖt lµ c¸c c©y l­¬ng thùc. §èi víi chiÕu x¹ tia gamma tõ nguån Co60 hoÆc Cs137 cã ho¹t tÝnh phãng x¹, tuú tõng tr­êng hîp cô thÓ cã thÓ sö dông hai c¸ch chiÕu x¹: chiÕu x¹ trong thêi gian ng¾n víi liÒu l­îng cao hoÆc chiÕu x¹ trong thêi gian dµi víi liÒu l­îng thÊp [7]. Bøc x¹ ion ho¸ gåm tia R¬nghen (tia X), tia gamma (tia g) vµ c¸c h¹t vÒ bøc x¹ do c¸c nguyªn tè phãng x¹ gi¶i phãng ra (c¸c h¹t a, b , proton, n¬tron). ThuËt ng÷ ion ho¸ hµm ý muèn nãi r»ng n¨ng l­îng cña chóng lín tíi møc c¸c ph©n tö n­íc vµ c¸c ph©n tö kh¸c khi bi t¸c dông sÏ bÞ ph¸ vì thµnh nh÷ng ph©n tö tÝch ®iÖn. Mäi d¹ng bøc x¹ ion ho¸ ®Òu cã hiÖu øng g©y chÕt vµ ®ét biÕn cho mäi tÕ bµo vµ virut. Khi cã mÆt «xy, bøc x¹ ion ho¸ s¶n sinh ra c¸c gèc hydro peroxit vµ nhiÒu c¸c chÊt cã ph¶n øng m¹nh. C¸c chÊt nµy sÏ t¸c ®éng trùc tiÕp ®Õn c¸c ph©n tö sinh häc g©y tæn th­¬ng chóng, ®Æc biÖt lµ nh÷ng t¸c ®éng lªn bé genom lµm biÕn ®æi vËt chÊt di truyÒn, t¹o ra c¸c ®ét biÕn gen vµ ®ét biÕn nhiÔm s¾c thÓ, cã thÓ ®­îc di truyÒn l¹i cho c¸c thÕ hÖ sau [17]. C¸c ph©n tö sinh häc nh­ ADN d­íi t¸c dông cña bøc x¹ ion ho¸ cã thÓ bÞ ba d¹ng tæn th­¬ng sau: ®øt g·y mét m¹ch ®¬n (®øt g·y khung ®­êng - photphat), ®øt g·y m¹ch kÐp vµ thay thÕ baz¬ nucleotit, ¶nh h­ëng ®Õn qua tr×nh sao chÐp ADN - ARN vµ tæng hîp protein. CÇn nhÊn m¹nh r»ng chØ cÇn mét sai lÖch nhá cña ph©n tö axÝt nucleic cã thÓ dÉn ®Õn nh÷ng thay ®æi lín v× c¬ chÕ ho¸ sinh cña tÕ bµo khuÕch ®¹i nã lªn mét c¸ch ®¸ng kÓ. NhiÔm s¾c thÓ còng cã thÓ bÞ biÕn ®æi cÊu tróc (mÊt ®o¹n, lÆp ®o¹n, ®¶o ®o¹n, chuyÓn ®o¹n), hoÆc thay ®æi sè l­îng nhiÔm s¾c thÓ (dÞ béi, ®a béi). Khi chiÕu x¹ b»ng tia gamma tõ nguån Co60 lªn tÕ bµo hoÆc m« th× c¸c ph©n tö sinh häc chÞu t¸c dông trùc tiÕp vµ gi¸n tiÕp cña bøc x¹ ion ho¸: - T¸c dông trùc tiÕp: bøc x¹ trùc tiÕp ion hãa vµ kÝch thÝch c¸c ph©n tö sinh häc lµm tæn th­¬ng c¸c ph©n tö ®ã. - T¸c dông gi¸n tiÕp: bøc x¹ ion ho¸ t¸c dông lªn c¸c ph©n tö n­íc (chiÕm 85 - 95% träng l­îng tÕ bµo) víi ion H+, OH-, t¹o ra c¸c gèc tù do OH·, H· vµ c¸c s¶n phÈm oxy ho¸ m¹nh nh­ H2O2 chóng cã kh¶ n¨ng ho¹t ®éng rÊt m¹nh vÒ mÆt ho¸ häc, do ®ã nã c«ng ph¸ c¸c ph©n tö sinh häc lµm thay ®æi cÊu tróc chøc n¨ng cña chóng. NÕu nh÷ng tæn th­¬ng ho¸ sinh kh«ng phôc håi ®­îc sÏ kÐo theo nh÷ng tæn th­¬ng chuyÓn ho¸ dÉn ®Õn nh÷ng tæn th­¬ng h×nh th¸i vµ chøc n¨ng [7]. C«ng t¸c chän gièng vµ t¹o gièng míi cã vai trß hÕt søc quan träng trong viÖc n©ng cao n¨ng suÊt vµ chÊt l­îng c©y trång ®Æc biÖt lµ c©y l­¬ng thùc. ChÝnh c«ng t¸c nµy ®· ®ãng vai trß quyÕt ®Þnh trong cuéc c¸ch m¹ng xanh trong nh÷ng n¨m 1960 ë Ên §é vµ nhiÒu n­íc kh¸c trªn thÕ giíi [7]. Mét trong nh÷ng thµnh tùu næi bËt nhÊt cña thÕ kû 20 lµ kh¸m ph¸ ra ph­¬ng ph¸p t¹o gièng b»ng c¸ch g©y ®ét biÕn thùc nghiÖm. Víi kÕt qu¶ cña h¬n 60 n­íc ®· thu ®­îc chøng tá ®©y lµ mét ph­¬ng ph¸p cã hiÖu qu¶ ®Ó t¹o gièng míi. Theo thèng kª cña tæ chøc l­¬ng thùc vµ tæ chøc n¨ng l­îng nguyªn tö thÕ giíi (FAO/IAEA) n¨m 1960 chØ cã 7 gièng c©y trång ®ét biÕn, n¨m 1975 cã 145 gièng, n¨m 1992 cã 1330 gièng, n¨m 1997 cã 1870 gièng. Trung Quèc, NhËt B¶n, Ên §é, Liªn X« cò... lµ nh÷ng n­íc t¹o ra nhiÒu gièng b»ng ph­¬ng ph¸p ®ét biÕn thùc nghiÖm. Trong ®ã chñ yÕu lµ c©y l­¬ng thùc nh­, lóa m¹ch kh«ng ®æ “Pallas”; lóa m¹ch thÊp c©y, chÝn sím “Mari” (Thuþ §iÓn); lóa m¹ch “Vena” chèng bÖnh gØ s¾t (¸o); lóa m× “Inta” s¶n l­îng cao, chÞu rÐt, r¬m ng¾n (§øc); lóa cho n¨ng suÊt cao (Ên §é, NhËt B¶n); lóa chèng s©u bÖnh, chÞu th©m canh (A20, DT10, xu©n sè 5 - ViÖt Nam); gièng Tµi nguyªn §B - 100 kh«ng mÉn c¶m víi quang chu kú, thêi gian sinh tr­ëng ng¾n , n¨ng suÊt vµ chÊt l­îng cao (ViÖt Nam); gièng ®Ëu Hµ Lan “Strol” n¨ng suÊt cao (Thuþ §iÓn); gièng ®Ëu t­¬ng “Sanilak”, “Xiuei”, “Gretiot” chÝn sím, chèng nÊm, chèng bÖnh ®èm l¸, kh«ng ®æ (Mü); gièng ®Ëu t­¬ng chÝn sím, chèng nÊm, hµm l­îng protit, lipit cao (Nga, §øc, Mü); gièng b«ng ®ét biÕn No.108 cã bôi dµy, l¸ xanh ®Ëm, chèng ®æ, chèng bÖnh giái, n¨ng suÊt vµ chÊt l­îng b«ng cao - nhê viÖc xö lý tia g tõ nguån Co60 víi liÒu l­îng 2000rad (Nga)...[16, 17]. ë ViÖt Nam, c¸c nghiªn cøu vµ øng dông cña ph­¬ng ph¸p g©y ®ét biÕn thùc nghiÖm vµo chän gièng thùc vËt ®· ®­îc b¾t ®Çu kh¸ sím. §ã lµ vµo n¨m 1966, t¹i Bé m«n Di truyÒn häc, Tr­êng §¹i häc Tæng hîp Hµ Néi, víi c¸c nghiªn cøu trªn c©y lóa vµ c©y ®Ëu t­¬ng (Vò Nguyªn HiÒn, TrÞnh B¸ H÷u, Phan Ph¶i, TrÇn Minh Nam, Lª Duy Thµnh, Ph¹m Thµnh Hæ, Ph¹m B¸ Phong, 1970; 1978; 1986; 1990..). Sau ®ã h­íng nghiªn cøu ®· ®­îc triÓn khai ë nhiÒu c¬ së kh¸c nh­, ViÖn KHKTNN ViÖt Nam (TrÇn §×nh Long, NuyÔn H÷u NghÜa..), ViÖn di truyÒn n«ng nghiÖp ( Phan Ph¶i, TrÇn Duy Quý, NguyÔn H÷u §èng, Hoµng TuyÕt Minh..), Tr­êng §¹i häc S­ ph¹m I Hµ Néi (NguyÔn Minh C«ng, Lª §×nh Trung..), Tr­êng §¹i häc N«ng nghiÖp I (Lª Song Dù, TrÇn Tó Ngµ, §oµn ThÞ Thanh Nhµn..),... Vµ nhê vËy, cho ®Õn nay n­íc ta cã hµng chôc gièng míi ®­îc t¹o ra b»ng ph­¬ng ph¸p g©y ®ét biÕn thùc nghiÖm ë mét sè c©y chång, cho n¨ng suÊt cao, chÊt l­îng tèt vµ chèng chÞu ®­îc c¸c ®iÒu kiÖn bÊt lîi cña m«i tr­êng, nh­ gièng lóa (A- 20, DT10, DT11, DT13, DT33, Xu©n sè 5, Xu©n sè 6, TÐp hµnh ®ét biÕn), gièng l¹c (V79, 4329, A329, DT332..), gièng ng« (DT-6, DT-8..), ®Ëu t­¬ng ( M103, DT83, DT84, DT90, V48..), cµ chua (“Hång Lan”..)...[17, 25, 35]. GÇn ®©y NguyÔn Minh C«ng vµ CS (1999) [4] ®· t¹o ®­îc gièng T¸m Th¬m ®ét biÕn kh«ng c¶m quan, cã thÓ cÊy ®­îc c¶ hai vô. Ph¹m V¨n Ch­¬ng, 2001) [5] còng th«ng b¸o chän t¹o ®­îc ba gièng lóa BM9855, LT2 vµ Khao 85 ®ét biÕn kh«ng c¶m quang, gieo cÊy ®­îc c¶ hai vô, cã chÊt l­îng g¹o cao (h¹t g¹o trong, dµi, ngon c¬m...), n¨ng xuÊt kh¸. Riªng gièng Khao 85 hiÖn nay lµ gièng lóa duy nhÊt ë miÒn B¾c ViÖt Nam ®¹t tiªu chuÈn quèc tÕ vÒ g¹o xuÊt khÈu chÊt l­îng cao. Gièng LT2 ®­îc xÕp vµo lo¹i gièng lóa ®Æc s¶n cña ViÖt Nam . Ch­¬ng 2. ®èi t­îng vµ ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu 2.1. ®èi t­îng nghiªn cøu 1. §èi t­îng nghiªn cøu tÝnh ®a h×nh ADN lµ 20 gièng lóa T¸m cã nguån gèc kh¸c nhau ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 2. 2. §èi t­îng dïng nghiªn cøu chän dßng ®ét biÕn lµ 4 gièng lóa: T¸m Xoan, T¸m Êp BÑ, Dù Th¬m vµ TÎ Di H­¬ng. TÊt c¶ c¸c gièng lóa nµy ®­îc Trung t©m Tµi nguyªn di truyÒn thùc vËt thuéc ViÖn Khoa häc Kü ThuËt N«ng nghiÖp ViÖt Nam cung cÊp. - Nguån chiÕu x¹ tia gamma tõ nguån Co 60 ®­îc tiÕn hµnh t¹i Trung t©m chiÕu x¹ Quèc gia Tõ Liªm, Hµ Néi. - ThiÕt bÞ sö dông: m¸y ly t©m l¹nh (Sigma), m¸y PCR (Thermal Cycler PTC 100 h·ng MJ), m¸y ®iÖn di (Biorad), m¸y ®o quang phæ Model 8425A (Hewlett Packard), m¸y chôp ¶nh Gel Doc (Pharmacia), m¸y chôp ¶nh (Polaroid), dµn c©y, buång tèi vµ b×nh nu«i cÊy. B¶ng 1: §Æc ®iÓm n«ng häc cña c¸c gièng lóa nghiªn cøu chän dßng ®ét biÕn §Æc ®iÓm T¸m Xoan T¸m Êp BÑ Dù Th¬m TÎ Di H­¬ng Thêi gian sinh tr­ëng (ngµy) 160 - 165 165 - 168 155 – 158 142 - 145 ChiÒu cao c©y (cm) 140 - 145 137 - 140 140 – 145 125 - 130 Tæng sè h¹t/b«ng 130 - 135 150 100 – 110 110 - 115 P. 1000 h¹t (g) 20 - 21 21 - 22 24 – 25 21,2 N¨ng suÊt (t¹/ha) 30 -32 35 - 41 - - PhÈm chÊt g¹o vµ c¬m H¹t nhá, trong vµ ngon c¬m H¹t nhá, ngon vµ rÊt th¬m C¬m mÒm, dÎo vµ th¬m C¬m mÒm, dÎo vµ th¬m §Æc tÝnh chèng chÞu Th©n mÒm, chèng ®æ kÐm Th©n mÒm, chèng ®æ kÐm Chèng ®æ trung b×nh - B¶ng 2: Nguyªn liÖu 20 gièng lóa dïng ®Ó ph©n tÝch ®a h×nh ADN Sè thø tù Sè ®¨ng ký Tªn gièng 1 GB0310 T¸m Th¬m Hµ §«ng 2 GB0311 T¸m Xoan H¶i D­¬ng 3 GB0312 T¸m Xoan H¶i D­¬ng 4 GB0313 T¸m Xoan Cã R©u H¶i D­¬ng 5 GB0314 T¸m Xoan B¾c Ninh 6 GB0315 T¸m Xoan 7 GB0316 T¸m NghÖ H¹t §á 8 GB0317 T¸m Xoan VÜnh Phóc 9 GB0318 T¸m Nhì B¾c Ninh 10 GB0319 T¸m Nhì VÜnh Phóc 11 GB1048 T¸m Xoan H¶i HËu 12 GB1252 T¸m Chiªm Hµ Nam 13 GB1253 T¸m Th¬m 14 GB1254 T¸m Ngäc V¹ch 15 GB1381 T¸m Th¬m Hång Qu¶ng B 16 GB2365 T¸m Xoan 17 GB2373 T¸m xoan 18 GB2375 T¸m Th¬m Êp BÑ 19 GB5117 T¸m Xu©n §µi 20 GB5118 T¸m Tiªu 2.2. ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu Ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu theo s¬ ®å thÝ nghiÖm tæng qu¸t sau: H¹t c¸c gièng lóa T¹o c©y vµ thu l¸ T¸ch ADN Xö lý ®ét biÕn §¸nh gi¸ ®a h×nh ADN b»ng kü thuËt RAPD T¸i sinh c©y vµ x¸c ®Þnh ng­ìng xö lý ®ét biÕn T¹o m« sÑo H×nh 1: S¬ ®å thÝ nghiÖm tæng qu¸t 2.2.1. Nghiªn cøu tÝnh ®a h×nh ADN cña 20 gièng lóa T¸m 2.2.1.1. Kü thuËt thu vµ b¶o qu¶n l¸ H¹t lóa ®­îc bãc vá trÊu, chän nh÷ng h¹t s¹ch cho vµo lä thñy tinh cã nót nh¸m vµ khö trïng h¹t theo tr×nh tù sau: l¾c nhÑ trong cån 70% kho¶ng 1 phót, 15 - 20 phót trong n­íc javen 60%, röa s¹ch b»ng n­íc cÊt v« trïng 4 lÇn. Sau ®ã chuyÓn h¹t lªn ®Üa petri cã giÊy läc v« trïng. H¹t g¹o ®· khö trïng ®­îc cÊy lªn m«i tr­êng MS c¬ b¶n, cã bæ sung 1% saccharoza + 0.8% agaroza, pH = 5,8. MËt ®é cÊy 10-15 h¹t/b×nh. Nu«i ngoµi ¸nh s¸ng ®Ìn trong phßng cÊy víi c­êng ®é 2000 lux, thêi gian chiÕu s¸nh 10/24 giê, nhiÖt ®é nu«i cÊy 250C . Sau 2 tuÇn c¾t thu lÊy l¸ dïng ngay hoÆc b¶o qu¶n ë tñ l¹nh s©u - 200C. Thu l¸ non v× l¸ non cã Ýt s¶n phÈm cña trao ®æi chÊt g©y trë ng¹i cho kh¶ n¨ng hoµ tan cña ADN thu ®­îc. 2.2.1.2. T¸ch ADN tæng sè tõ l¸ lóa Quy tr×nh t¸ch chiÕt ADN tæng sè tõ l¸ lóa dùa theo ph­¬ng ph¸p t¸ch ADN cña Egnin, 1998. a) Ho¸ chÊt sö dông: 1M Tris-HCl, pH = 8.0; 5M NaCl; 0.5 EDTANa2; PVP; 5% SDS (Sodium dodecyl sulfate); RnazaA 10 mg/ml; 3M CH3C00Na, pH 5,3 or pH 7.0; TE (10 mM Tris, pH=8.0 + 1mM EDTA, pH=8.0); isopropanol; Phenol: Chlorofom: Isoamyl (25:24:1) vµ Cån 80%. b) Pha ®Öm t¸ch ADN: B¶ng 3: Nång ®é cña ho¸ chÊt t¸ch ADN tæng sè Nång ®é chuÈn Nång ®é cÇn pha Trong 50 ml 1M Tris - HCl, pH = 8.0 50mM 2.5ml 5M NaCl 300Mm 3ml 0.5M EDTA 20Mm 2ml Polyvinyl pyrolydine 2% 1g 10% Muèi natri ascobat 0,1% 0,5ml 20% Saccrosin 1,5% 3,75ml Metabisulfit 1% 0.5g H2O cÊt 38,5 ml c) Quy tr×nh t¸ch ADN tæng sè: - Thu 1-2 gam l¸ lóa non, nghiÒn nhanh trong nit¬ láng b»ng cèi chµy sø. B­íc nghiÒn ph¶i lµm nhanh ®Ó thu ®­îc ADN cã ph©n tö l­îng lín. NghiÒn trong nit¬ láng ®¶m b¶o mÉu ®­îc nghiÒn triÖt ®Ó, ADN thu ®­îc cã d¹ng søa, cã ph©n tö l­îng cao, kh«ng ®øt ®o¹n. - ChuyÓn nhanh s¶n phÈm nghiÒn vµo èng eppendorf, gi÷a trong ®¸ hoÆc cho vµo tñ l¹nh s©u -20 cho ®Õn khi cÇn dïng. - Thªm 9-12 ml dung dÞch ®Öm t¸ch ADN trén ®Òu b»ng c¸ch ®¶o ng­îc nhÑ. NÕu dïng èng eppendorf 2 ml th× thªm 500 ml - 1ml ®Öm A trén ®Òu. - Gi÷ trong ®¸ 2-5 phót, Thªm 9 ml dung dÞch (Phenol: Chlorofom: Iso amin) (25: 24: 1) ®¶o ®Òu cho ®Õn khi cã mµu tr¾ng s÷a, cho vµo ®¸. - Ly t©m víi tèc ®é 10.000 - 12.000 vßng/phót, ë 40C trong 15 phót. - ChuyÓn dÞch trªn sang èng eppendorf míi, cã chøa 9ml dung dÞch Iso propanol (nhÑ nhµng kh«ng khuÊy cÆn). DÞch næi trªn cïng cã thÓ läc qua mét mµng läc v« trïng tr­íc khi thªm Iso propanol. - §¶o ®Òu ®Ó trong nhiÖt ®é 40C, 10-30 phót (hoÆc cho kÕt tña qua ®ªm ë nhiÖt ®é 4 0C). - Ly t©m víi tèc ®é 8.000 vßng/phót, ë 40C trong 3-5 phót nÕu ADN lµ lín cã thÓ thÊy l¬ löng, nÕu kh«ng ly t©m ë sè vßng lín h¬n 10.000 vßng/phót trong 5 phót. - Lo¹i bá phÇn dÞch næi ë trªn, lµm kh« phÇn kÕt tña (kh«ng lµm kh« qu¸ l©u) b»ng m¸y Speed-Vac. - Hoµ tan kÕt tña trong 500 ml TE, hoÆc Ýt h¬n nÕu vËt liÖu ban ®Çu dïng Ýt, ®Ó ë 40C qua ®ªm cho côc kÕt tña hÕt vµ ADN kh«ng bÞ g·y. - Thªm 3 -7 ml enzym RnazaA, trén ®Òu vµ ñ ë 370C trong 30 phót. - Ly t©m 14.000 vßng/phót chuyÓn dÞch trªn sang mét èng míi 1,5ml cÈn thËn kh«ng sÏ bÞ khuÊy cÆn. - Thªm 100ml CH3C00Na, l¾c ®Òu vµ thªm 1ml Isopropanol ®Ó kÕt tña l¹i. - Ly t©m 10.000 vßng/phót trong 5 phót ë 40C, lo¹i bá dÞch næi vµ thªm 1ml cån 80%. - Ly t©m14.000 vßng/phót, bá dÞch cån trªn vµ lµm kh« b»ng m¸y Speed-Vac (ADN ph¶i kh« míi cã thÓ hoµ tan hoµn toµn trong TE). - Hoµ tan l¹i trong 50 - 100 ml TE, ®Ó qua ®ªm , b¶o qu¶n ADN ë -200C. 2.2.1.3. Ph­¬ng ph¸p x¸c ®Þnh hµm l­îng vµ ®é s¹ch cña ADN a) §iÖn di trªn gel agaroza: - Pha agaroza 0.8% trong TBE 0.5X, ®un nãng, ®Ó nguéi kho¶ng 600C ®æ vµo khu«n gel 30ml cã cµi l­îc. - Sau 30 phót th¸o l­îc ra, ®æ ®Öm ch¹y ®iÖn di TBE 0.5X ngËp b¶ng gel 1mm. - LÊy 2ml DNA mÉu + 1ml Thuèc nhuém 10X + 7ml H2O trén ®Òu. Dïng pipet cho vµo giÕng. - Ch¹y ®iÖn di: 60V, 70 phót. - Nhuém gel: nhuém gel b»ng Ethidium bromid 0.5 mg/ml trong 10 phót, röa s¹ch b»ng n­íc. - Soi gel trªn ®Ìn UV vµ chôp ¶nh. b) §o b»ng m¸y ®o quang phæ hÊp thô: - §o trªn m¸y ®o quang phæ cã ch­¬ng tr×nh xö lý trªn m¸y vi tÝnh. - Vïng ®o ë b­íc sãng 260nm-280nm. - ChØnh c©n b»ng m¸y: dïng n­íc cÊt v« trïng ®Ó lµm chuÈn. - KiÓm tra m¸y: ®o mét mÉu ADN chuÈn ®· biÕt tr­íc nång ®é. - §o mÉu: cho 995ml n­íc cÊt vµ 5ml ADN mÉu vµo cuvet (hÖ sè pha lo·ng 200 lÇn), l¾c ®Òu ®Æt vµo m¸y ®o. - Sau mçi lÇn ®o ph¶i röa s¹ch cuvet. - In kÕt qu¶ ®o ®­îc. TÝnh to¸n hµm l­îng vµ ®é s¹ch ADN: Hµm l­îng ADN (ng/ml) = 50 ´ HSPL´OD260 §é s¹ch ADN = OD260/OD280 HSPL: hÖ sè pha lo·ng 50: h»ng sè OD260: chØ sè ®o ®­îc ë b­íc sãng 260nm OD280: chØ sè ®o ®­îc ë b­íc sãng 280nm NÕu ®é s¹ch ADN = 1,8 - 2,0 th× mÉu ®­îc coi lµ mÉu s¹ch. 2.2.1.4. So s¸nh RAPD a) §o¹n måi §o¹n måi ngÉu nhiªn sö dông cho viÖc ph©n tÝch bé genom ®­îc tæng hîp b»ng m¸y Gene assembler (Pharmacia) t¹i ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc. Tr×nh tù c¸c ®o¹n måi dµi 10 nucleotit ®­îc thiÕt kÕ dùa trªn tµi liÖu cña Monna vµ CS (1994). C¸c ®o¹n måi cã ký hiÖu vµ tr×nh tù lµ: 1. Måi RA31: 5’ AACCGACGGG 3’ 6. Måi RA46: 5’ CCAGACCCTG 3’ 2. Måi RA32: 5’ TGCCCTGCCT 3’ 7. Måi RA50: 5’ GCTGTGCAGC 3’ 3. Måi RA36: 5’ GGGGGTCGTT3’ 8. Måi RA142: 5’ CAATCGCCGT 3’ 4. Måi RA40: 5’ GGCGGACTGT 3’ 9. Måi RA143: 5’ TCGGCGATAG 3’ 5. Måi RA45: 5’ TACCACCCCG 3’ 10. Måi RA159: 5’ GTCCACACGG 3’ b) Ph¶n øng PCR-RAPD - Mçi èng ph¶n øng PCR cã 25 ml dung dÞch chøa: 1X ®Öm PCR; 2.5 mM MgCl2; 100 mM 4dNTP; 200 nM ®o¹n måi; 0,125 ®¬n vÞ Taq polymeraza vµ 50 - 100 ng ADN khu«n. - Trén ®Òu hçn hîp thu ®­îc (thao t¸c trong ®¸ ®Ó ®¶m b¶o c¸c ho¸ chÊt kh«ng mÊt ho¹t tÝnh). - TiÕn hµnh nh©n b¶n trong m¸y PCR-Thermal Cycler PTC100 theo chÕ ®é: B­íc 1: 940C 1 phót; b­íc 2: 920C 1 phót; b­íc 3: 350C 1 phót; b­íc 4: 720 1 phót; b­íc 5: 72 0C 10 phót; b­íc 6: l­u gi÷ ë 40C. Tõ b­íc 2 ®Õn b­íc 4 lÆp l¹i 45 chu kú. b) §iÖn di s¶n phÈm RAPD Pha agaroza 1,5% trong TBE 0,5X ®un nãng, ®Ó nguéi kho¶ng 600C th× ®æ vµo khu«n gel cã cµi l­îc, sau 30 phót th¸o l­îc ra, ®æ ®Öm ch¹y ®iÖn di TBE 0,5X ngËp b¶n gel 1 mm. LÊy 2,5 ml thuèc nhuém 10X cho vµo mçi èng s¶n phÈm, trén ®Òu. Dïng pipet cho hçn hîp vµo giÕng vµ ch¹y ®iÖn di: 80V, 150 phót. Nhuém gel b»ng Ethidium bromid 0,5 mg/ml trong 10 phót, röa s¹ch b»ng n­íc, soi gel trªn ®Ìn UV vµ chôp ¶nh. c) Ph©n tÝch sè liÖu RAPD Dùa trªn sù xuÊt hiÖn hay kh«ng xuÊt hiÖn cña c¸c ph©n ®o¹n ADN khi ®iÖn di s¶n phÈm RAPD víi c¸c ®o¹n måi ngÉu nhiªn cña 20 gièng lóa T¸m ®Ó lµm c¬ së cho viÖc ph©n tÝch sè liÖu. Tiªu chuÈn ho¸ s¶n phÈm RAPD theo qui ­íc: Sè 1: xuÊt hiÖn ph©n ®o¹n ADN Sè 0: kh«ng xuÊt hiÖn ph©n ®o¹n ADN C¸c sè liÖu ®­îc xö lý trªn m¸y vi tÝnh theo ch­¬ng tr×nh NTSYSpc version 2.0 (Applied Biostatistics Inc., USA., 1998) ®Ó lËp ra biÓu ®å so s¸nh hÖ sè t­¬ng ®ång di truyÒn gi÷a 20 gièng lóa T¸m ë møc ®é ph©n tö. 2.2.2. Ph­¬ng ph¸p chän dßng ®ét biÕn trong nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt 2.2.2.1. T¹o m« sÑo a) C¸c lo¹i m«i tr­êng dïng trong nu«i cÊy: - M«i tr­êng C1: MS + 3% saccharoza + 0,8% agaroza + 0,1 mg/l NAA + 0,2 mg/l BAP + 2 mg/l 2,4D. - M«i tr­êng C2: MS + 3% saccharoza + 0,8% agaroza + 2 mg/l 2,4D. - M«i tr­êng R: MS + 3% saccharoza + 0,8% agaroza + 0,2 mg/l NAA + 2 mg/l BAP, pH = 5,8. b) Kü thuËt t¹o m« sÑo lóa: H¹t lóa chÝn ®­îc bãc vá trÊu, chän nh÷ng h¹t s¹ch cho vµo lä thuû tinh cã nót nh¸m vµ khö trïng theo tr×nh tù sau: khö trïng trong cån 700 thêi gian 1 phót, javen 60% thêi gian tõ 15 - 20 phót (l¾c ®Òu), sau ®ã röa s¹ch b»ng n­íc cÊt v« trïng 4 - 5 lÇn. §Æt h¹t lªn ®Üa petri, cã lãt giÊy thÊm v« trïng, ®Ó h¹t kh«, h¹t lóa ®· ®­îc khö trïng ®em cÊy vµo m«i tr­êng t¹o m« sÑo C1 vµ C2 kho¶ng 15 - 20 h¹t/b×nh tam gi¸c 250 ml, ®Ó trong buång tèi ë nhiÖt ®é 250C, sau 1 tuÇn ®Ó ra ¸nh s¸ng víi c­êng ®é 2000 Lux, thêi gian chiÕu 10 giê/ngµy, ë 250C. Sau 2 -3 tuÇn khèi m« sÑo sÏ ®­îc t¹o thµnh vµ tiÕn hµnh ®¸nh gi¸ kh¶ n¨ng t¹o m« sÑo. 2.2.2.2. Xö lý m« sÑo b»ng tia gamma tõ nguån Co60. M« sÑo ®­îc t¹o ra sau 3 tuÇn, chän läc nh÷ng m« ®Ñp, ®­îc c¾t nhá kho¶ng 2 - 3 mm cÊy vµo m«i tr­êng nh©n m« sÑo vµ tiÕn hµnh xö lý chiÕu x¹ b»ng tia gamma tõ nguån Co60. ChiÕu x¹ m« sÑo víi liÒu l­îng lµ: 3Krad, 5Krad, 7Krad, 9Krad, 11Krad vµ 13Krad. M« sÑo ®· xö lý chiÕu x¹ ®­îc nu«i cÊy ngay lªn m«i tr­êng t¸i sinh c©y (R) sau 4 tuÇn ®¸nh gi¸ tû lÖ sèng chÕt cña m« sÑo tõng liÒu chiÕu. 2.2.2.3. T¸i sinh c©y tõ m« sÑo sau khi xö lý ®ét biÕn M« sÑo sau khi xö lý ®ét biÕn ®­îc cÊy lªn m«i tr­êng t¸i sinh, ë nhiÖt ®é phßng 250C, d­íi ¸nh s¸ng ®Ìn neon víi c­êng ®é 2000 lux, thêi gian chiÕu s¸ng 10 giê/ngµy. Sau 4 tuÇn nu«i cÊy ®¸nh gi¸ vµ chän läc m« t¸i sinh, sè c©y t¸i sinh. C¸c dßng t¸i sinh ®­îc cÊy chuyÓn sang m«i tr­êg MS c¬ b¶n cã bæ sung 2% saccharoza + 0,8% agaroza. C¸c chåi lóa t¸i sinh ®­îc t¸ch thµnh c¸c dßng c©y vµ cÊy lªn m«i tr­êng t¹o c©y hoµn chØnh (MS cã bæ sung 0,2 mg/l NAA), nu«i cÊy trong ®iÒu kiÖn nh­ trªn. Tr­íc khi ®­a c©y ra ruéng, c©y ph¶i ®­îc cÊy chuyÓn mét vµi lÇn ®Ó c©y khoÎ h¬n cã kh¶ n¨ng thÝch nghi tèt víi ®iÒu kiÖn tù nhiªn. 2.2.2.4. Ph­¬ng ph¸p tÝnh to¸n sè liÖu C¸c phÐp tÝnh to¸n nµy ®­îc sö dông trªn ch­¬ng tr×nh phÇn mÒm excel. a) X¸c ®Þnh tû lÖ t¹o m« sÑo (Ci) CI = ´100% CI:: tû lÖ m« sÑo tÝnh theo % Ncf: sè h¹t t¹o m« sÑo Nt: tæng sè h¹t nu«i cÊy b) X¸c ®Þnh tû lÖ sèng sãt cña m« sÑo (SV) SV = ´100% SV: tû lÖ m« sèng sãt (%) NSV: sè m« sèng sãt Nt: tæng sè m« xö lý c) X¸c ®Þnh tû lÖ t¸i sinh c©y ( RC) RC = ´100% RC: tØ lÖ t¸i sinh (%) Nr : sè m« t¸i sinh NSV: sè m« sèng sãt Ch­¬ng 3. KÕt qu¶ vµ th¶o luËn 3.1. Ph©n tÝch tÝnh ®a h×nh ADN cña c¸c gièng lóa t¸m 3.1.1. kÕt qu¶ t¸ch chiÕt ADN tæng sè §Ó thùc hiÖn ®­îc ph¶n øng RAPD th× ADN s¹ch, kh«ng bÞ ®øt g·y lµ nguyªn liÖu ®Çu tiªn quyÕt ®Þnh ®Õn sù thµnh c«ng cho c¶ qu¸ tr×nh nghiªn cøu. KÕt qu¶ kiÓm tra chÊt l­îng vµ x¸c ®Þnh nång ®é ADN cho thÊy c¸c mÉu ADN thu ®­îc ®Òu cã chÊt l­îng tèt. Cô thÓ lµ ®iÖn di trªn gel agaroza cho thÊy ADN tËp trung mét b¨ng chÝnh, kh«ng bÞ ®øt g·y (h×nh 1) vµ khi ®o OD ë b­íc sãng 260 nm - 280 nm th× phæ hÊp thô chØ cã mét ®Ønh hÊp phô duy nhÊt lµ 260 nm (h×nh 2). C¸c mÉu ADN thu ®­îc ®Òu cã ®é tinh s¹ch cao cô thÓ lµ chØ sè tû lÖ OD260/OD280 thÊp nhÊt lµ 1,800 ë hai gièng GB0315, GB0319 vµ cao nhÊt lµ 1,913 ë gièng GB2375 (b¶ng 4). Nh­ vËy, kÕt qu¶ t¸ch chiÕt ADN tõ l¸ lóa cña chóng t«i ®· thu ®­îc c¸c mÉu ADN s¹ch vµ cã träng l­îng ph©n tö lín, ®ñ tiªu chuÈn ®Ó tiÕn hµnh c¸c ph¶n øng RAPD. B¶ng 4: hµm l­îng vµ ®é tinh s¹ch cña c¸c mÉu ADN Tªn mÉu Hµm l­îng AND (ng/ml) §é tinh s¹ch ADN Tªn mÉu Hµm l­îng ADN (ng/ml) §é tinh s¹ch ADN GB0310 1066,8 1,882 GB1048 978,63 1,863 GB0311 2280,7 1,880 GB1252 673,23 1,856 GB0312 1135,6 1,868 GB1253 825,47 1,828 GB0313 2279,5 1,882 GB1254 1056,7 1,889 GB0314 1062,9 1,803 GB1381 315,73 1,832 GB0315 1935,6 1,800 GB2365 1438,8 1,902 GB0316 1327,0 1,856 GB2373 373,23 1,808 GB0317 618.33 1,823 GB2375 1711,17 1,913 GB0318 671,5 1,812 GB5117 494,27 1,812 GB0319 1209,7 1,800 GB5118 920,6 1,904 ¶nh H×nh 2: KÕt qu¶ ®iÖn di kiÓm tra ADN tæng sè t¸ch tõ c¸c gièng lóa H×nh 3: Phæ hÊp phô ADN t¸ch tõ c¸c gièng lóa 3.1.2. Ph©n tÝch ®a h×nh ADN b»ng kü thuËt RAPD Trong nghiªn cøu nµy chóng t«i sö dông 10 måi ngÉu nhiªn (ký hiÖu RA31; RA32; RA36; RA40; RA45; RA46; RA50; RA142; RA143 vµ RA159) cã ®é dµi 10 nucleotit ®Ó ph©n tÝch tÝnh møc ®é kh¸c nhau vÒ di truyÒn cña 20 gièng lóa T¸m. KÕt qu¶ nhËn ®­îc c¶ 10 måi ®Òu biÓu hiÖn tÝnh ®a h×nh nh­ng chØ cã 6/10 måi lµ cho thÊy tÝnh ®a râ nhÊt ®ã lµ c¸c måi: RA31, RA36, RA45, RA46, RA142 vµ RA159. §iÖn di s¶n phÈm RAPD víi 10 måi cña 20 gièng lóa T¸m thu ®­îc 889 ph©n ®o¹n ADN. D­íi ®©y lµ kÕt qu¶ ph©n tÝch RAPD víi 3 måi RA36, RA46 vµ RA142: a) Måi RA36 ¶nh : xuÊt hiÖn ph©n ®o¹n ADN; kh«ng xuÊt hiÖn ph©n ®o¹n ADN H×nh 4: KÕt qu¶ ®iÖn di s¶n phÈm RAPD cña 20 gièng lóa víi måi RA31 (thø tù c¸c gièng nh­ trong b¶ng 5). M: Thang ADN chuÈn (ADN l c¾t b»ng Hind II + Ecol RI). Ghi chó: Sè 1: GB0310, 2: GB0311, 3: GB0312, 4: GB0313, 5: GB0314, 6: GB0315, 7: GB0316, 8: GB0317, 9: GB0318, 10: GB0319, 11: GB1048, 12: GB1252, 13: GB1253, 14: GB1254, 15: GB1381, 16: GB2365, 17: GB2373, 18: GB2375, 19: GB5117 vµ 20: GB5118. KÕt qu¶ ®iÖn di s¶n phÈm RAPD cña c¸c gièng víi måi RA36 cã tõ 4 ®Õn 12 ph©n ®o¹n ADN trong genom lóa ®­îc nh©n ngÉu nhiªn (b¶ng 5). KÝch th­íc c¸c ph©n ®o¹n cã chiÒu dµi ­íc t×nh tõ 0,46Kb ®Õn 2,5Kb. §©y lµ lo¹i måi t¹o ra sù ®a h×nh phong phó nhÊt (h×nh 4). Trong ®ã gièng GB0313 (cét 4) vµ GB0316 (cét 7) lµ cã sè ph©n ADN ®­îc nh©n ban nhiÒu nhÊt lµ 12 ph©n ®o¹n, gièng GB1381(cét 15) chØ cã 4 ph©n ®o¹n ®­îc nh©n b¶n. B¶ng 5: C¸c ph©n ®o¹n ADN ®­îc nh©n b¶n ngÉu nhiªn trong ph¶n øng RAPD víi måi RA36. CD¦T (Kb) § § N Sè thø tù c¸c gièng* 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 2.5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 2.0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1.62 3 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1.5 4 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1.4 5 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1.3 6 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1.2 7 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1.0 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0.95 9 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 1 1 0.9 10 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0.85 11 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0.8 12 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0.75 13 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0.7 14 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.6 15 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0.55 16 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0,46 17 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 TP§ 7 7 6 12 11 10 12 10 7 9 11 5 5 5 4 11 6 10 6 9 Ghi chó: * lµ sè thø tù c¸c gièng nh­ trong h×nh 4; CD¦T: chiÒu dµi ­íc tÝnh; §§N: §o¹n ®­îc nh©n; TP§: Tæng ph©n ®o¹n; Sè 1: ph©n ®o¹n ADN ®­îc nh©n; sè 0 ph©n ®o¹n ADN kh«ng ®­îc nh©n . TÝnh ®a h×nh ®­îc thÓ hiÖn ë sù xuÊt hiÖn hay kh«ng xuÊt hiÖn ph©n ®o¹n ADN khi so s¸nh gi÷a c¸c gièng víi nhau. Trong 20 gièng lóa t¸m nghiªn cøu th× chØ cã gièng GB2373 (cét sè 17) xuÊt hiÖn ph©n ®o¹n ADN t¹i vÞ trÝ 0,46Kb vµ 1,0Kb (mòi tªn) hay t¹i vÞ trÝ 0,7Kb cét sè 7 gièng GB0316 xuÊt hiÖn ph©n ®o¹n ADN. Ng­îc l¹i t¹i vÞ trÝ 2,5Kb ba gièng GB2373 (cét sè 17), GB1381 (cét sè 15) vµ GB0318 (cét sè 9) kh«ng cã ph©n ®o¹n ADN ®­îc nh©n b¶n vµ t¹i vÞ trÝ 1,2 Kb còng cho thÊy gièng GB0312 (cét sè 3) kh«ng xuÊt hiÖn ph©n ®o¹n AND. Tõ kÕt qu¶ ph©n tÝch cho phÐp nhËn xÐt c¸c gièng lóa T¸m nghiªn cøu ®· cã sù sai kh¸c vÒ di truyÒn. b) Måi RA46 §iÖn di s¶n phÈm RAPD víi måi RA46 cña c¸c gièng lóa chóng t«i còng nhËn ®­îc kÕt qu¶ t­¬ng tù nh­ måi RA36. XuÊt hiÖn tõ 4 ®Õn 11 ph©n ®o¹n AND ®­îc nh©n b¶n ngÉu nhiªn cña c¸c gièng cã kÝch th­íc ­íc l­îng kho¶ng tõ 0,5Kb ®Õn 2,5Kb so víi thang ADN chuÈn (b¶ng 6). VÝ dô: t¹i vÞ trÝ 0,6Kb cã hai gièng GB0314 (cét sè 5) vµ gièng GB1254 (cét sè 14) ph©n ®o¹n ADN ®· kh«ng ®­îc nh©n b¶n, t­¬ng tù t¹i vÞ trÝ 1,4Kb hai gièng GB0318 (cét sè 9) vµ GB0319 (cét sè 10) ph©n ®o¹n còng kh«ng ®­îc nh©n b¶n (h×nh 5). Trong 20 gièng lóa nghiªn cøu th× chØ cã gièng GB5117 (cét sè 19) lµ xuÊt hiÖn ph©n ®o¹n ADN t¹i vÞ trÝ 0,8Kb. T¹i nhiÒu vÞ trÝ kh¸c cho thÊy mét sè gièng cã ph©n ®o¹n ADN ®­îc nh©n b¶n, mét sè gièng kh¸c ph©n ®o¹n ADN kh«ng ®­îc nh©n b¶n. Ph©n tÝch RAPD cña c¸c gièng lóa T¸m víi måi RA46 còng ®· chØ ra sù sai kh¸c di truyÒn gi÷a c¸c gièng. ¶nh : xuÊt hiÖn ph©n ®o¹n ADN; kh«ng xuÊt hiÖn ph©n ®o¹n ADN H×nh 5: KÕt qu¶ ®iÖn di s¶n phÈm RAPD cña 20 gièng lóa víi måi RA46 ( thø tù c¸c gièng nh­ trong h×nh 4). M: Thang ADN chuÈn (ADN l c¾t b»ng Hind II + Ecol RI). B¶ng 6: C¸c ph©n ®o¹n ADN ®­îc nh©n b¶n ngÉu nhiªn trong ph¶n øng RAPD víi måi RA46. CD¦T(Kb) § § N Sè thø tù c¸c gièng* 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 2.5 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 2.1 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1.95 3 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1.8 4 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1.7 5 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1.6 6 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1.4 7 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1.25 8 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1.15 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0.9 10 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0.8 11 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0.75 12 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0.65 13 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0.6 14 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0.5 15 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 TP§ 9 8 9 7 4 10 9 9 8 8 10 10 10 9 10 11 10 11 11 9 Ghi chó: * lµ sè thø tù c¸c gièng nh­ trong h×nh 4; CD¦T: chiÒu dµi ­íc tÝnh; §§N: §o¹n ®­îc nh©n; TP§: Tæng ph©n ®o¹n, Sè 1: ph©n ®o¹n ADN ®­îc nh©n; sè 0 ph©n ®o¹n ADN kh«ng ®­îc nh©n. c) Måi RA142 H×nh 6: KÕt qu¶ ®iÖn di s¶n phÈm RAPD cña 20 gièng lóa víi måi RA142 (thø tù c¸c gièng nh­ trong h×nh 4). M: Thang ADN chuÈn (ADN l c¾t b»ng Hind II + Ecol RI). : xuÊt hiÖn ph©n ®o¹n ADN; kh«ng xuÊt hiÖn ph©n ®o¹n ADN B¶ng 7 vµ h×nh 6 cho thÊy kÕt qu¶ ®iÖn di s¶n phÈm RAPD víi måi RA142 cã tõ 2 ®Õn 8 ph©n ®o¹n ADN cña c¸c gièng ®­îc nh©n b¶n. C¸c ph©n ®o¹n ADN nh©n b¶n cã chiÒu dµi ­íc tÝnh tõ 0,5Kb ®Õn 1,8Kb. MÆc dï sè ph©n ®o¹n ADN nh©n b¶n kh«ng nhiÒu nh­ng còng chØ ra tÝnh ®a h×nh ADN cña 20 gièng nghiªn cøu. VÝ du: vÞ trÝ 1,6Kb; 1,65Kb vµ 1,8Kb chØ cã hai gièng GB0312 (cét sè 3) vµ GB1381 (cét sè 15) cã ph©n ®o¹n ADN xuÊt hiÖn. T¹i vÞ trÝ 0,7Kb gièng GB1254 (cét sè 14) ph©n ®o¹n AND ®· kh«ng ®­îc nh©n b¶n so víi c¸c gièng kh¸c. KÕt qu¶ nhËn ®­îc cho phÐp kh¼ng ®Þnh cã hÖ sè sai kh¸c vÒ di truyÒn cña 20 gièng lóa T¸m. B¶ng 7: C¸c ph©n ®o¹n ADN ®­îc nh©n b¶n ngÉu nhiªn trong ph¶n øng RAPD víi måi RA142. CD¦T (Kb) §§ N Sè thø tù c¸c gièng* 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 1.8 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1.65 2 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1.6 3 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1.1 4 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0.9 5 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0.8 6 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.7 7 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0.65 8 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.5 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 TP§ 6 4 8 4 4 4 4 3 4 2 4 3 3 2 6 3 3 4 4 4 Ghi chó: * lµ sè thø tù c¸c gièng nh­ trong h×nh 4; CD¦T: chiÒu dµi ­íc tÝnh; §§N: §o¹n ®­îc nh©n; TP§: Tæng ph©n ®o¹n, Sè 1: ph©n ®o¹n ADN ®­îc nh©n; sè 0 ph©n ®o¹n ADN kh«ng ®­îc nh©n. KÕt qu¶ ®iÖn di s¶n phÈm RAPD cña 20 gièng lóa t¸m víi 10 ngÉu nhiÖn ®· thu ®­îc 889 ph©n ®o¹n ADN (b¶ng 8). B×nh qu©n mçi gièng xuÊt hiÖn 44,5 ph©n ®o¹n ADN. Trong ®ã gièng GB0316 (cét sè 7) cã sè ph©n ®o¹n ADN ®­îc nh©n b¶n nhiÒu nhÊt lµ 59, gièng GB1254 (cét sè 14) sè ph©n ®o¹n ADN ®­îc nh©n b¶n Ýt nhÊt lµ 36. Nh­ vËy viÖc sö dông 10 måi ngÉu nhiªn cã chiÒu dµi 10 nucleotit ®· chØ ra sù kh¸c nhau cña 20 gièng lóa t¸m ë møc ®é ph©n tö. Møc ®é t­¬ng ®ång di truyÒn cña c¸c gièng ®­îc ph©n tÝch ë phÇn sau. B¶ng 8: Tæng sè ph©n ®o¹n xuÊt hiÖn khi ®iÖn di s¶n phÈm RAPD víi 10 måi Gièng Måi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 RA31 4 4 5 3 4 4 3 3 6 4 3 4 5 4 4 4 4 4 4 5 RA32 2 2 1 1 1 1 2 1 1 2 3 1 2 3 2 2 2 2 1 1 RA36 7 7 6 12 11 10 12 10 7 9 11 5 5 5 4 11 6 10 6 9 RA40 1 2 1 1 2 2 2 1 3 1 2 2 2 3 3 1 2 1 2 2 RA45 2 3 3 3 3 3 3 3 1 3 3 2 2 2 2 2 3 2 3 3 RA46 9 8 9 7 4 10 9 9 8 8 10 10 10 9 10 11 10 11 11 9 RA50 6 7 6 2 7 7 13 7 5 5 6 7 6 2 8 3 3 2 2 4 RA142 6 4 8 4 4 4 4 3 4 2 4 3 3 2 6 3 3 4 4 4 RA143 3 2 4 6 4 6 6 5 6 5 4 3 5 3 6 4 6 4 3 2 RA159 3 3 3 4 3 4 5 5 4 3 4 3 4 3 2 3 4 2 4 5 TP§ 43 42 44 43 43 51 59 47 45 42 50 40 44 36 47 44 43 42 40 44 Ghi chó: Sè thø tù c¸c gièng tõ 1 - 20 nh­ h×nh 4; TP§: Tæng ph©n ®o¹n 3.1.3. So s¸nh sù sai kh¸c cña c¸c gièng lóa T¸m b»ng ph©n tÝch RAPD Dùa trªn sù xuÊt hiÖn hay kh«ng xuÊt hiÖn c¸c ph©n ®o¹n ADN cña c¸c gièng khi ®iÖn di s¶n phÈm RAPD, chóng t«i thiÕt lËp mèi liªn quan gi÷a c¸c gièng ë møc ®é ph©n tö. Sè liÖu nhËn ®­îc sÏ tÝnh to¸n vµ ph©n tÝch theo ch­¬ng tr×nh NTSYSpc version 2.0 (Applied Biostatistics Inc., USA., 1998) (theo quy ­íc 1 = xuÊt hiÖn; 0 = kh«ng xuÊt hiÖn). KÕt qu¶ nhËn ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 9 vÒ mèi t­¬ng quan di truyÒn tõng cÆp vµ h×nh 7 d­íi d¹ng mét s¬ ®å h×nh c©y (dendrogram). KÕt qu¶ nhËn ®­îc ë b¶ng 9 cho thÊy c¸c gièng cã hÖ sè t­¬ng ®ång di truyÒn tõng cÆp n»m ë kho¶ng tõ 0,53 ®Õn 0,93. Trong ®ã hÖ sè t­¬ng ®ång di truyÒn thÊp nhÊt lµ 0.526 khi so s¸nh gi÷a gièng GB0316 vµ gièng GB0318, cao nhÊt lµ hai gièng GB0310 vµ GB0311 cã hÖ sè t­¬ng ®ång di truyÒn lµ 0,926. H×nh 7 chØ ra møc ®é sai kh¸c gi÷a c¸c gièng lóa t¸m vÒ di truyÒn. Møc ®é kh¸c nhau ®­îc biÓu hiÖn b»ng hÖ sè sai gi÷a c¸c gièng. C¸c gièng cã hÖ sè t­¬ng ®ång di truyÒn cao sÏ ®­îc xÕp vµo mét nhãm. Gi÷a c¸c nhãm l¹i cã sù liªn hÖ vÒ møc ®é gièng nhau cña hÖ sè t­¬ng ®ång di truyÒn. KÕt qu¶ cho thÊy 20 gièng lóa t¸m ®Òu cã sù kh¸c nhau vÒ hÖ sè di truyÒn vµ ®­îc chia thµnh 2 nh¸nh c©y chÝnh: * Nh¸nh 1 chØ cã mét gièng GB0318 (T¸m Nhì B¾c Ninh) cã hÖ sè sai kh¸c so víi c¸c gièng kh¸c lµ 0,35 (1 - 0,65). §©y lµ gièng cã hÖ sè sai kh¸c víi c¸c gièng lµ nhiÒu nhÊt. * Nh¸nh 2 gåm 19 gièng ®­îc chia lµm 3 nh¸nh phô: + Nh¸nh phô 1 chØ cã mét gièng GB0316 (T¸m NghÖ h¹t ®á) cã hÖ sè sai kh¸c so víi 2 nhãm cßn l¹i lµ 0,343 (1 - 0,657). + Nh¸nh phô 2 l¹i ®­îc ph©n lµm 2 nhãm: - Nhãm 1 gåm 5 gièng GB0313, GB0315, GB0314, GB1048 vµ GB0317 c¶ 5 gièng nµy ®Òu lµ gièng T¸m Xoan vµ thuéc nhãm gièng Japonica. Chóng ®­îc thu mÉu ë c¸c ®Þa ph­¬ng kh¸c nhau nh­ng chóng vÉn thÓ hiÖn ®­îc mèi quan hÖ gÇn vÒ di truyÒn. - Nhãm 2 còng gåm 5 gièng GB2365 (T¸m Xoan), GB2375 (T¸m Th¬m Êp BÑ), GB5117 (T¸m Xu©n §µi), GB5118 (T¸m Tiªu) vµ GB2373 (T¸m Xoan). C¶ 5 gièng nµy ®Òu ®­îc thu mÉu ë Nam §Þnh. + Nh¸nh phô 3 ®­îc chia lµm 2 nhãm: - Nhãm 1 chØ cã mét gièng GB1381 (T¸m Th¬m Hång Qu¶ng B). - Nhãm 2 gåm 6 gièng GB0310 (T¸m Th¬m Hµ §«ng), GB0311 (T¸m Xoan H¶i D­¬ng), GB0312 (T¸m Xoan H¶i D­¬ng), GB0319 (T¸m Nhì VÜnh Phóc), GB1252 (T¸m Chiªm Hµ Nam) vµ GB1253 (T¸m Th¬m). §Æc biÖt cho thÊy hai gièng GB0310 vµ GB031 cã hÖ sè di truyÒn sai kh¸c lµ 0,07 (1 – 0.93). Lµ hai gièng cã nhiÒu ®Æc ®iÓm chung nhÊt, ®Òu thuéc nhãm gièng Indica, cã ®é phñ l«ng cña l¸ trung b×nh, cao c©y vµ g¹o tr¾ng. Môc lôc Trang Më ®Çu .........................................................................................................1 Ch­¬ng 1. tæng quan tµi liÖu ...................................................................2 1.1. øng dông kü thuËt RAPD – PCR trong nghiªn cøu ®a h×nh ADN ..........................2 1.1.1. Ph¶n øng chuçi trïng hîp (PCR) ....................................................................2 1.1.2. Kü ThuËt RAPD vµ øng dông ..........................................................................4 1.2. §Æc ®iÓm cña c¸c gièng lóa ®Æc s¶n ë miÒn B¾c ViÖt Nam .......................................6 1.3. Nu«i cÊy m« sÑo vµ c¬ së chän dßng biÕn dÞ soma .....................................................7 1.4. §ét biÕn thùc nghiÖm vµ øng dông trong chän t¹o gièng c©y trång ........................9 Ch­¬ng 2. §èi t­îng vµ ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu .....................13 2.1. §èi t­îng nghiªn cøu ......................................................................................13 2.2. Ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu ................................................................................15 2.2.1. Nghiªn cøu tÝnh ®a h×nh ADN cña 20 gièng lóa T¸m ...............................15 2.2.1.1. Kü thuËt thu vµ b¶o qu¶n l¸ .........................................................................15 2.2.1.2. T¸ch ADN tæng sè tõ l¸ lóa .........................................................................16 2.2.1.3. Ph­¬ng ph¸p x¸c ®Þnh hµm l­îng vµ ®é s¹ch cña ADN .............................18 2.2.1.4. So s¸nh RAPD .............................................................................................19 2.2.2. Ph­¬ng ph¸p chän dßng ®ét biÕn trong nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt .....20 2.2.2.1. T¹o m« sÑo ..................................................................................................20 2.2.2.2. Xö lý m« sÑo b»ng tia gamma tõ nguån Co60 ..............................................20 2.2.2.3. T¸i sinh c©y tõ m« sÑo sau khi xö lý ®ét biÕn .............................................21 2.2.2.4. Ph­¬ng ph¸p tÝnh to¸n sè liÖu .....................................................................21 Ch­¬ng 3. KÕt qu¶ vµ th¶o luËn ..........................................................22 3.1. Ph©n tÝch tÝnh ®a h×nh ADN cña c¸c gièng lóa T¸m ....................................22 3.1.1. KÕt qu¶ t¸ch ADN tæng sè .............................................................................22 3.1.2. Ph©n tÝch ®a h×nh ADN b»ng kü thuËt RAPD ...............................................24 3.1.3. So s¸nh sù sai kh¸c cña c¸c gièng b»ng ph©n tÝch RAPD ..............................30 3.2. Chän dßng tÕ bµo ®ét biÕn ..............................................................................33 3.2.1. Kh¶ n¨ng t¹o m« sÑo ......................................................................................33 3.2.2. Kh¶ n¨ng sèng sãt cña m« sÑo sau khi chiÕu x¹ tia gamma ..........................34 3.2.3. T¸i sinh c©y tõ m« sÑo sèng sãt sau khi chiÕu x¹ ë c¸c liÒu kh¸c nhau ........36 Ch­¬ng 4. KÕt luËn vµ ®Ò nghÞ ..............................................................39 Tµi liÖu tham kh¶o ...............................................................................40 HÖ sè H×nh 9: So s¸nh sù kh¸c nhau cña c¸c gièng ë møc ®é ph©n tö Nh­ vËy qua nghiªn cøu ®a h×nh ADN cña 20 gièng lóa t¸m b»ng kü thuËt RAPD ®· cho thÊy sù kh¸c nhau cña 20 gièng lóa t¸m ë møc ®é ph©n tö. Kh«ng cã gièng lóa nµo gièng nhau hoµn toµn khi ph©n tÝch víi 10 måi ngÉu nhiªn.