Đề tài Góp phần nghiên cứu tính đa hình của nhông cát Leiolepis belliana guttata Cuvier ở Thừa Thiên Huế

uanidae có cấu tạo giống Sphenodon. Còn cấu tạo của xương khẩu cái, xương hàm, xương lá mía và ống đổ của cơ quan Jacobson theo kiểu “lỗ khoan cổ” như nhiều loài thằn lằn khác. Về cấu trúc nhân có công trình nghiên cứu của A.KynpurHoBa, khi nghiên cứu kiểu nhân của ba loài thằn lằn họ Agamidae là Stellio chernovi, Stellio himalayanus và Leiolepis belliana belliana. Kết quả nghiên cứu này cho thấy các loài trên có bộ nhiễm sắc thể 2n = 36. Về số lượng loài của giống Leiolepis Cuvier, theo công trình của nhiều tác giả mà B.E.CokovoB làm chủ biên cho thấy có năm loài là L.belliana (Gray), L. guttata Cuvier, L. peugensis Peters, L.reevessi (Gray) và L.triploida Peters, tất cả đều sống ở châu Á. Năm 1993, Darevsky và Kupriyanova đã nghiên cứu phát hiện và mô tả loài nhông Leiolepis guentherpetersi (Theo Cuvier, 1829) là Leiolepis belliana guttata Cuvier). Các phân tích về hình thái, kiểu nhân và địa lý sinh vật học cho thấy rằng đây là loài tam bội có nguồn gốc từ sự lai tạo tự nhiên. Tuy nhiên chưa có nghiên cứu đánh giá ở mức phân tử đối với loài này [4]. 2. Ở Việt Nam Tài liệu đầu tiên nói đến nhông cát L.belliana (Gray) của R. Bourret. Trong đó tác giả mô tả đặc điểm của loài và hai phân loài của L.belliana là L.belliana belliana và L.belliana guttata khác nhau về số lượng lỗ đùi ở mỗi bên, Theo tác giả thì L.belliana phân bố ở Nam Miến Điện, Thái Lan, Đông Dương, đảo Hải Nam, Nam Trung Quốc, Malaysia và Sumatra. Ở Việt Nam đã gặp ở Cù Lao Chàm, Nha Trang và Quảng Trị. Căn cứ vào các mẫu vật đã thu được và các công trình đã công bố, Đào Văn Tiến đã công bố danh sách 77 loài thằn lằn hiện có ở Việt Nam cùng với đặc điểm hình thái dùng trong phân loại cũng như khoá định loại các loài thằn lằn đó. Trong số 17 loài thằn lằn thuộc họ Agamidae của danh sách này có hai phân loài của L.belliana là nhông thường L.belliana belliana và nhông gutta L.bellana guttata Cuvier. Năm 1981, trong “Kết quả điều tra cơ bản động vật miền Bắc Việt Nam” của Uỷ ban Khoa học và kĩ thuật Nhà nước do tác giả Trần Kiên, Nguyễn Văn Sáng và Hồ Thu Cúc thực hiện đã thu mẫu và xác định L.belliana phân bố ở Hà Tĩnh và Vĩnh Linh (Quảng Trị). Gần đây, theo kết quả điều tra về khi hệ động vật các đảo có nguồn gốc lục địa của Viện Địa lý (Viện HLKH Viễn Đông – Liên Xô) cho thấy có L.belliana ở Cù Lao Chàm trong số các đảo đã khảo sát từ vịnh Bắc Bộ đến vịnh Thái Lan [4]. Năm 1991, Trong luận án phó tiến sĩ của mình, Ngô Đắc Chứng đã nghiên cứu về các đặc điểm về hình thái và sinh thái của hai phân loài L.belliana belliana và L.belliana guttata Cuvier ở Thừa Thiên Huế. Về đặc điểm hình thái của phân loài L.belliana belliana, tác giả đã mô tả như sau: “Thân dẹp theo hướng lưng bụng, không có mào lưng, không có gai trên đầu. Vảy nhỏ, phần lớn hoá sừng. Có một hoặc hai nếp họng nhỏ nằm ngang. Lỗ đùi làm thành hai dãy ở vùng mu hai bên lỗ huyệt. Đuôi dày lên ở gốc. Mỗi bàn chân có 5 ngón, các ngón chân dài và có móng nhọn. Bề rộng và bề dài của mõm gần bằng nhau. Bờ mõm được giới hạn bởi hai vảy môi và sáu tấm vảy sau mõm. Lỗ mũi mở trực tiếp ra ngoài, trán và vùng gian ổ mắt đôi khi to; các vảy trên ổ mắt là các vảy chấm rất nhỏ. Màng nhĩ rộng và nông, đường kính của nó gần bằng chiều dài lỗ mắt. Hai bên cổ có những nếp da nằm ngang kéo ngang qua phần gáy. Vẩy lưng nhỏ, hoá sừng; vẩy mặt bụng lớn hơn ở mặt lưng”. Đặc điểm hình thái của con cái tương tự như con đực, chỉ khác ở một số điểm sau: Con cái da ở hai bên sườn không thể bạnh ra khi ở tư thế dọa nạt; ở con đực mặt lưng từ đầu đến đuôi màu phân ngựa với những vùng sẫm ở hai bên, riêng mặt lưng phần thân có những chấm màu vàng viền đen hình mạng lưới, mặt bụng từ đầu đến đuôi màu trắng đục, đặc biệt hai bên thân có hai dải chấm màu da cam thể hiện khá rõ khi nhông bạnh nếp da hai bên sườn, còn con cái các chấm vàng viền đen ở mặt lưng sắp thành bốn dãy dài chạy dọc lưng từ sau gáy tới gốc đuôi, ngoài ra ở hai bên sườn không có các dãy chấm màu da cam. Về tính trạng khối lượng cơ thể, chiều dài thân thì cá thể đực thường lớn hơn cá thể cái (cá thể đực có khối lượng trung bình là 41,17 g và chiều dài thân trung bình là 114,0 mm; trong khi con cái là 30,52 g và 107,4 mm). Số lượng lỗ đùi trung bình của cá thể đực ít hơn cá thể cái (con đực là 17 và con cái là 18). Đặc điểm hình thái của phân loài L.belliana guttata Cuvier cũng tương tự như ở phân loài L.belliana belliana, chỉ khác ở một số tính trạng sau: Mặt lưng của L.belliana guttata Cuvier không có các chấm vàng viền đen mà có các chấm màu phân ngựa hình lục giác, có bốn sọc dài màu vàng nhạt rộng trung bình 3 mm: hai sọc chạy từ sau tai đến gốc đuôi, hai sọc chạy từ gốc chân trước đến gốc chân sau. Mặt bụng màu trắng đục, không có các chấm màu da cam hai bên thân và không có khả năng bạnh da hai bên sườn. L.belliana guttata Cuvier có khối lượng cơ thể trung bình là 56,0g và chiều dài thân trung bình là 120,83 mm. Số lượng lỗ đùi là 20 – 23 Ở Thừa Thiên Huế, nhông cát sinh sống ở hai vùng sinh cảnh khác nhau là vùng cát ven biển và vùng nương rẫy ở đồng bằng các xã Thuỷ Phù, Thuận An và Lộc Hải. Quan sát và theo dõi hoạt động của nhông cát ngoài tự nhiên, tác giả thấy rằng nhông hoa hoạt động ban ngày những hôm trời nắng với nhiệt độ không khí từ 30 – 38oC, nhiệt độ mặt đất từ 33 – 40oC và độ ẩm từ 30 – 78 %. Nhông sọc hoạt động ở nhiệt độ không khí từ 27 – 38oC, nhiệt độ mặt đất từ 27 – 59oC và độ ẩm 30 – 64 %. Chúng hoàn toàn không hoạt động vào những ngày mưa, trời âm u hoặc trước lúc bắt đầu mưa và về mùa đông (từ tháng XI – tháng III) khi nhiệt độ không khí nhỏ hơn 25oC và độ ẩm trên 90 %. Vào những ngày nắng nóng (nhiệt độ tren 38oC) chúng vẫn hoạt động với điều kiện là độ ẩm thấp. Ngoài ra vào những ngày nắng nóng nhiệt độ mặt đất tăng lên quá cao có thể trên 50oC, nhông cát vẫn hoạt động. Lúc đó chúng kiếm ăn trong các bóng râm hoặc chạy rất nhanh trên cát hoặc các cây cỏ khác. Từ tháng XI đến tháng III nhông cát trú đông trong hang. Vào thời kì này nhiệt độ trung bình trong hang xuống thấp từ 18,5 – 24,4oC, độ ẩm trung bình từ 83 – 92oC Về vấn đề sinh sản của nhông cát, tác giả lưu ý một số vấn đề sau: “Đối với loài nhông hoa, kích thước và khối lượng của tinh hoàn và của buồng trứng vào các tháng IV và VI lớn hơn các tháng còn lại. Trong khi đó khối lượng thể mỡ lại bé vào các tháng IV, V và VI và lớn hơn vào các tháng khác. Đối với nhông sọc, khối lượng của buồng trứng vào các tháng IV, VI và VII, trong khi khối lượng thể mỡ lại bé vào các tháng này và lớn hơn vào các tháng khác. Trứng có kích thước lớn hơn 4 mm chỉ thấy xuất hiện vào tháng IV và VI ở phân loài nhông hoa và vào tháng IV, VI và VII ở phân loài nhông sọc. Như vậy mùa sinh sản của nhông hoa là từ tháng IV đến tháng VI, của nhông sọc là từ tháng IV đến tháng VII hàng năm. Đặc biệt, trong tất cả những mẫu vật thu được ở Thuỷ Phù và Lộc Hải không có cá thể nào là đực nên đưa đến khả năng nhông sọc là loài thằn lằn trinh sinh, tức là trứng phát triển không có sự thụ tinh [4]. Tuy nhiên, tác giả cũng nhấn mạnh đây có phải là loài trinh sinh hay không vẫn còn là vấn đề nghi vấn và cần tiếp tục theo dõi. II. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ 1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước. Trong những thập kỷ qua, nhờ sự phát triển của các kỹ thuật phân tử, phân loại học phân tử đã có những bước tiến bộ đáng kể. Đã có nhiều công trình nghiên cứu về lĩnh vực này trên các đối tượng động vật, thực vật và vi sinh vật. Những thành tựu này đặc biệt có ý nghĩa đối với những loài mới được phát hiện hay với những loài đã bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên. Việc nghiên cứu tính đa hình các cá thể trong một quần đàn, các quần đàn trong một giống, các giống với nhau, các họ với nhau hoặc các bộ với nhau nhằm mục đích cải biến di truyền, chọn giống, hoàn thiện cây tiến hóa, tìm hiểu lịch sử di cư liên quan tới địa lý, nghiên cứu sự liên quan giữa tính đa hình và khả năng chống chịu bệnh tật hoặc dễ nhiễm bệnh và pháp y hình sự. Để nghiên cứu tính đa hình và phân loài người ta thường sử dụng các phương pháp sinh hóa cổ điển như isoenzyme đa hình, hay các phương pháp chỉ thị phân tử hiện đại như ADN đa hình khuếch đại ngẫu nhiên (RADP), ADN đa hình chiều dài các phân đoạn được cắt giới hạn (RELP), ADN đa hình độ dài các phân đoạn được khuếch đại (AFLP), vi vệ tinh, đa hình nucleotide đơn (SNP) hay đọc trình tự rồi trực tiếp so sánh các trình tự ADN với nhau. Mỗi phương pháp đều có những ưu điểm và nhược điểm nhất định, không giống nhau nhưng có thể bổ sung cho nhau đêr hoàn thiện kết quả nghiên cứu. Đặc biệt khi các phương pháp phân loại hình thái đã bão hòa không thể đi sâu được nữa, thì các phương pháp sinh học phân tử sẽ trợ giúp một cách có hiệu quả. Năm 1993, Darevsky và Kupriyanova đã nghiên cứu phát hiện và mô tả một loài nhông mới thuộc giống Leiolepis CUVIER, 1829 có nguồn gốc từ Việt Nam là Leiolepis guentherpetersi. Đây là một trong hai loài nhông có mặt ở Thừa Thiên Huế. Các phân tích về hình thái, kiểu nhân và địa lý sinh vật học cho thấy rằng đây là loài tam bội có nguồn gốc từ sự lai tạo tự nhiên. Tuy nhiên chưa có nghiên cứu đánh giá ở mức độ phân tử đối với loài này. Turbeville et a. (1991) dựa trên sự phân tích 18S rRNA để nghiên cứu sự phát sinh chủng loại của chân khớp. Cũng bằng phương pháp này, Passhley et al. (1993) đã phân loại Bộ côn trùng biến thái hoàn toàn. Miya và Nishida (1998) đã nghiên cứu sự phát sinh chủng loại và tiến hóa ở mức độ phân tử của các loài cá sống ở vùng biển sâu thuộc giống Sternoptyx dựa trên phân tích gen mã hóa 12S – rRNA và 16S – rRNA ở ty thể. Boyce et al. (1999) nghiên cứu cấp phân loại phụ của quần thể cừu sừng lớn (Ovis canadensis) dựa trên phân tích 515 bp đầu tiên của vùng khởi động ADN ty thể. Nhiều nghiên cứu theo hướng đa dạng di truyền và nhận dạng các loài ở mức phân tử cũng đã được tiến hành (Carvalho et al. 2001; Garrjardo et al. 2002) 2.Tình hình nghiên cứu trong nước Ở Việt Nam, cũng đã có một số công trình nghiên cứu về hai loài nhông cát ở Thừa Thiên Huế. Tuy nhiên các công trình này chỉ nghiên cứu về hình thái, đặc điểm sinh học, đặc điểm quần thể, sinh thái học cũng như hoạt động ngày đêm của chúng (Ngô Đắc Chứng 1986, 1992, 1993, 1994). Ở Việt Nam nói chúng phân loại phân tử vẫn còn là một lĩnh vực mới mẻ. Gần đây một số công trình nghiên cứu theo hướng sử dụng các phương pháp sinh học phân tử để phân tích đa hình di truyền, xác định quan hệ họ hàng của một số loài đã được công bố. Quyền Đình Thi và cộng sự (2003) đã sử dụng các kỹ thuật microsatellite, mtRFLP, RAPD để phân tích đa hình của các quần thể đàn tôm sú, cá tra nuôi ở Việt Nam. Nhóm nghiên cứu đã tìm được nhiều chỉ thị phân tử đặc trưng như RAPD để phân biệt các quần đàn cá tra nuôi trong các trại cá khác nhau. Những chỉ thị này có thể được nghiên cứu tiếp phục vụ công tác chọn giống [13]. Nguyễn Thị Thanh Bình và cộng sự (2005) đã nghiên cứu đa dạng phân tử của các giống tằm sử dụng trong sản xuất bằng PCR – RAPD. Cũng bằng kĩ thuật này, Đinh Thị Phương Anh (2005) đã nghiên cứu tính đa dạng của thạch sùng vùng núi Bà Nà, Đà Nẵng [1,3]. III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH Có nhiều phương pháp để nghiên cứu tính đa hình, mỗi phương pháp đều có những ưu điểm và nhược điểm nhất định, không giống nhau nhưng có thể bổ sung cho nhau để hoàn thiện kết quả nghiên cứu. 1. Phương pháp isoenzyme cổ điển Enzyme là những protein có khả năng xúc tác đặc biệt phản ứng hóa học và là chất xúc tác sinh học. Isoenzym là những dạng khác nhau của một enzyme có cùng hoạt tính cơ chất đặc hiệu nhưng lại khác nhau về phương diện di truyền tức là khác nhau về cấu trúc bậc một và do các locus gene khác nhau xác định. Còn allozyme lại là các dạng khác nhau của một isoenzym do chỉ một locus gene xác định (Prakash, 1969) [7,10]. Hiện tượng các phân tử enzym có nhiều biến dạng tồn tại trong quần đàn tự nhiên là kết quả của các đột biến gây ra sự thay thế các acid amin trong cấu trúc bậc một của chuỗi polypeptid. Chính vì vậy khi điện di trên gel agarose, tinh bột thuỷ phân, polyacrylamide cùng với việc phối hợp nhuộm tế bào cho phép ta phát hiện các biến dạng khác nhau của phân tử enzyme, phát hiện các isoenzyme và các allozyme. Các hệ thống isozyne đa hình là các mô hình rất thuận lợi cho việc nghiên cứu, do bản chất di truyền tương đối đơn giản và hầu hết được biểu hiện di truyền đồng trội. Do đó khi sử dụng các dữ kiện về đa hình isozyme không những biết kiểu gen của cá thể mà còn biết mức độ dị hợp của quần đàn. Mặt khác, mỗi biến dạng phân tử enzyme là một “chỉ thị” của gene, nghiên cứu quan hệ họ hàng, nguồn gốc của vật nuôi, gia súc. Dựa trên tần số allele, người ta xác định được khoảng cách di truyền giữa các quần đàn. Nhiều nghiên cứu trên động vật, côn trùng, sử dụng các phương pháp đánh giá trên cho thấy số đo khoảng cách di truyền có tương quan rõ rệt với các thứ hạng phân loại của nhóm sinh vật nghiên cứu (Manwell và Barker, 1970; Namikawa, 1972) [7,10]. Những chỉ thị isozyme chỉ thể hiện ở những giai đoạn khác nhau trong quá trình phát triển cá thể tuỳ thuộc vào cơ chế phức tạp của sự đóng mở gene. Mặt khác do có số lượng không nhiều mà sự biểu hiện lại phụ thuộc vào giai đoạn phát triển cá thể, không phản ánh chính xác bản chất di truyền của một tính trạng nên chỉ thị isozyme được sử dụng tương đối hạn chế. 2. Các phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử ADN Chỉ thị ADN là những chỉ thị dựa trên bản chất đa hình của ADN. Nó có thể là những dòng gene có sẵn hay dưới dạng những thông tin di truyền được lưu giữ và chuyển tải trong các file dữ liệu máy tính (ví dụ như trình tự các mồi SSR, RAPD, AFLP). Người ta chia chỉ thị ADN thành 3 loại chính: - Chỉ thị dựa trên các trình tự nhận biết enzyme hạn chế (RFLP và AFLP). - Chỉ thị dựa trên các trình tự nucleotide ngẫu nhiên (RAPD). - Chỉ thị dựa trên các trình tự ngắn lặp lại nhiều lần (tiểu vệ tinh) 2.1. Phương pháp RAPD RAPD (Ramdon Amplified Polymorphism DNA) là các phân đoạn DNA đa hình được khuếch đại ngẫu nhiên. Phương pháp này do William (1990). Welsh và cộng sự (1991) phát triển từ phương pháp PCR chuẩn nhưng với một mồi duy nhất có kích trước từ 5 đến 12 nucleotide. Do kích thước bộ gen của một cá thể là rất lớn từ vài trăm triệu với vài tỉ base, là những chuỗi được hình thành từ bốn base duy nhất là adenine, guanine, cytosine, và thymine cho nên sẽ tồn tại nhiều trình tự 5 đến 12 base bắt cặp với trình tự mồi ngẫu nhiên. Sản phẩm PCR với một mồi có trình tự ngẫu nhiên như vậy, ở những điều kiện PCR nhất định sẽ cho một (hoặc vài) phân đoạn DNA (khác nhau) trên điện di đồ. Các cá thể sinh vật cùng loài, giống, họ có bộ gene giống nhau hoàn toàn giống nhau. Kết quả điện di trên điện di đồ sẽ gồm những band vạch DNA có kích thước như nhau. Khi bộ gen của chúng có nhiều trình tự khác nhau, với một mồi ngẫu nhiên nào đó, các sản phẩm PCR của chúng sẽ cho một số band vạch DNA có kích thước khác nhau trên điện di đồ. Phương pháp RAPD cho phép phát hiện tính đa hình giữa các cá thể trong một quần đàn, giữa các quần đàn trong cùng một loài hoặc giữa các loài trong một giống, mà không cần biết trình tự sắp xếp các nucleotide ra sao. Mặt khác mồi RAPD sẽ chỉ ra một đa hình thường xuất hiện nhất [12]. Mồi ngẫu nhiên được thiết kế là những oligonucleotide có kích thước từ 5 đến 12 nucleotide, và được tổng hợp hóa học. Tuỳ theo hãng sản xuất, các mồi có kí hiệu, tên gọi cũng như trình tự rất khác nhau. Yêu cầu cơ bản là mồi phải bắt cặp và bám vào hai đầu của đoạn khuôn, để phân đoạn DNA nằm giữa có kích thước khoảng 50 đến 5000 nucleotide được nhân lên. Mồi càng ngắn thì khả năng bắt cặp càng cao, và do đó số sản phẩm PCR càng nhiều. Ngược lại mồi càng dài thì thì độ bắt cặp chính xác càng lớn, số phân đoạn PCR càng ít đi. Ưu điểm của phương pháp RAPD là thời gian thực hiện nhanh, dễ làm và ít tốn kém, giúp cho xác định tính đa dạng sinh học, nguồn gốc các giống động vật, thực vật và vi sinh vật, còn gọi là phân loại phân tử [12]. 2.2. Phương pháp RFLP RFLP (Restrition Fragment Length Polymorphism DNA) là DNA đa hình chiều dài các phân đoạn DNA được cắt giới hạn. Chỉ thị này lần đầu tiên được biết đến khi Botstein sử dụng nó để lập bản đồ các gen có liên quan đến bệnh ở người. Các RFLD được sinh ra bởi những điểm cắt enzyme giới hạn trong DNA hệ gen. Nó biểu thị sự khác nhau giữa các loại DNA, do những đột biến tự nhiên gây ra như đột biến gene tạo ra đặc điểm riêng biệt ở mọi giống, loài thậm chí mỗi cá thể. Bởi vậy khi sử dụng các enzyme hạn chế để cắt các phân đoạn DNA có kích thước gần như nhau không thể phân biệt được trên điện di đồ, thành các phân đoạn có nhỏ hơn có kích thước khác nhau thì có thể phân biệt được trên điện di đồ. Nếu hai trình tự phân đoạn DNA gần giống nhau hoàn toàn, tức là có một vài nucleotide khác nhau trong trình tự, thì thực sự rất khó phát hiện ra sự khác nhau giữa chúng trên điện di đồ nhưng chúng lại không đồng nhất với nhau khi so sánh sơ đồ cắt enzyme hạn chế. Khi người ta xử lý các mẫu DNA với cùng một enzyme giới hạn nào đó sẽ tạo ra các phân đoạn cắt có kích thước khác nhau. Các phân đoạn cắt này được coi là các “điểm chỉ” đặc trưng cho từng loại DNA. Ví dụ: Nếu chúng ta có hai phân tử DNA gần giống nhau về trình tự base, dài 1000 bp, ngoại trừ sự đa hình sau: DNA1 có trình tự GGATCC tại vị trí bắt đầu với base 324, trong khi DNA2 có trình tự GGTTCC đã bị thay thế bởi GGTTCC cùng vị trí. Khi xử lý mỗi DNA đó với cùng một enzyme giới hạn BamHI thì điều gì sẽ xảy ra với GGATCC? Kết quả điện di đoạn DNA chỉ ra một sự khác nhau: với DNA1 cho hai band vạch DNA, trong khi đó DNA2 chỉ cho một band vạch, BamHI không cắt DNA2 do trình tự GGATCC đã bị thay thế bởi GGTTCC. Vì vậy band chính khác từ một sự đa hình di truyền rất nhỏ. Đó gọi là sự đa hình RFLP. Khác với phương pháp RAPD, phương pháp RFLP phải dùng hai mồi có những trìn tự nhất định để khuếch đại một phân đoạn DNA nào đó. 2.3. Phương pháp AFLP AFLP là DNA đa hình phân đoạn được khuếch đại do Vos và cộng sự tìm ra vào năm 1993. Là một kỹ thuật khuếch đại ngẫu nhiên mà thực hiện trong điều kiện phản ứng PCR nghiêm ngặt. Các mồi thường dài khoảng 17 – 21 nucleotide và có đầu mút giống nhau hoàn toàn. AFLP không bị ảnh hưởng bởi các thông số khuếch đại (chu kỳ, nhiệt độ, nồng độ khuôn, chu kỳ PCR) [12]. 2.4. Microsatellite Microsatellite hoặc SSR (Simple Sequênc Repeats) là những trình tự nucleotide đặc biệt được tạo thành lặp lại nhiều lần từ một phân đoạn oligonucleotide ngắn, đơn giản, còn gọi là vi vệ tinh hay tiểu vệ tinh. Phương pháp truy tìm các phân đoạn ADN đơn giản lặp đi lặp lại được gọi là phương pháp vi vệ tinh. Bộ gene sinh vật nhân thực có nhiều đoạn ADN lặp lại, các đoạn dài ngắn khác nhau tuỳ theo từng loài [12]. Các chuỗi lặp lại này thường từ 1- 6 nucleotide. SSR được phát hiện và sử dụng đầu tiên ở người, hiện nay được sử dụng để lập bản đồ phân tử người, động vật và một số thực vật. SSR cũng được sử dụng để nghiên cứu đa dạng di truyền ở động vật và thực vật. Bản chất đa hình của SSR là ở chỗ nó có thể được sinh ra đa hình từ rất nhiều vùng tương ứng, bao phủ khắp hệ gene và có bản chất đồng trội, dễ dàng phát hiện bằng PCR. 2.5. Đọc trình tự ADN Có lẽ kỹ thuật quan trọng nhất có thể có được cho các nhà Sinh học phân tử là đọc trình tự ADN, mà trong đó các vị trí nucleotide của phân đoạn ADN được xác định một cách chính xác. Các phương pháp xác định tình tự trở thành nhanh chóng và có hiệu quả từ cuối thập kỷ 70 của thế kỷ trước. Phân tử ADN đầu tiên được xác định trình tự là hệ gene của bacteriophage oX174 (5386 bp) được hoàn thành vào năm 1975. Tiếp theo là các đoạn trình tự của virus SV40 (5243 bp) vào năm 1977 và pBR322 (4363 bp) vào năm 1978. Dần dần đọc trình tự được áp dụng cho các trình tự dài hơn. Có hai kỹ thuật khác nhau được phát triển đồng thời, phương pháp xác định trình tự của F. Sanger và A. R. Coulson (Anh) và phương pháp phân huỷ hóa học của A. Maxam và W. Gilbert (Mỹ). Cả hai phương pháp đều cho phép đọc trình tự với chiều dài hàng vài kb trong thời gian ngắn nhất. Trong phân tích đa hình, tiến hóa, người ta thường đọc trình tự những gene cấu trúc rồi đem so sánh với nhau tìm ra phần trăm đồng dạng và khác biệt. Phương pháp này có ưu điểm chính xác, nhưng không thực hiện được với số lượng mẫu lớn trong thời gian ngắn 2.6. Phân tích ADN ty thể Ty thể là bào quan có kích thước hiển vi phổ biến ở mọi sinh vật, cả vi sinh vật hiếu khí. Chức năng chủ yếu của ty thể là trung tâm giải phóng năng lượng của tế bào. Ty thể có đầy đủ các thành phần quan trọng như: ADN, ARN, ATP và các hệ enzyme, do đó chúng có khả năng tự tổng hợp protein đặc thù, cùng với lục lạp góp phần qui định tính di truyền của tế bào chất [11]. mtDNA ở dạng chuỗi kép, trần, mạch vòng, kích thước khoảng 15-20 kb, trong đó bao gồm 13 gene mã hóa protein, 22 gene tRNA, 2 gen rRNA và vùng không mã hóa dài khoảng 1000bp gọi là vùng điều khiển (vùng giàu A-T ở động vật không xương sống và vùng D-loop ở động vật có xương sống, là vùng không mã hóa duy nhất với các promoter để tái bản và phiên mã mtDNA. mtDNA là vật chất di truyền nằm ngoài nhân, di truyền theo dòng mẹ. Sự đa dạng mtDNA có thể sử dụng rộng rãi trong phân loại phân tử bởi các đặc tính sau: (1) mtDNA có mặt ở hầu hết trong hệ gene động vật, (2) Tỷ lệ tiến hoá của chúng nhanh hơn 5-10 lần so với bất kì một gene nhân nào; hơn nữa vùng điều khiển tiến hóa nhanh hơn 5-10 lần so với các vùng khác của mtDNA. Vì vậy trình tự nucleotide của vùng điều khiển mtDNA là một công cụ rất hữu hiệu để nghiên cứu mối quan hệ trong và giữa các quần đàn cùng loài. Phần 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU I. NGUYÊN LIỆU 1. Nguyên liệu Nhông cát : Leiolepis belliana guttata Cuvier Loài Nhông cát : Leiolepis belliana Giống : Leiolepis Cuvier Họ : Agamidae Phân bộ Thằn lằn : Sauria Bộ có vảy : Squamata Lớp Bò sát : Reptilia - Nhông cát được thu ở Thủy Phù (Hương Thuỷ) và Lộc Hải (Phú Lộc) - Thừa Thiên Huế. - Enzym proteinase K (Hãng Sigma, Mỹ) - ADN chuẩn (Hãng Pharmacia, Thụy Ðiển). 2. Dụng cụ Để tiến hành xác định các đặc điểm hình thái, tách chiết, điện di và đánh giá độ tinh sạch của ADN nhông cát L.b.guttata Cuvier, chúng tôi đã sử dụng các trang thiết bị thể hiện ở bảng 1: Trang thiết bị Công ty sản xuất Bể ổn nhiệt Cân phân tích Hệ thống chớp ảnh gel tự động Máy đo quang phổ tự động Diode array spectrophotometer 8452A Máy li tâm lạnh 5415C Máy điện di Power Pac 300 Máy soi ADN Mini – Transilluminator Tủ lạnh sâu - 200C Tủ lạnh sâu - 700C Cân Thước đo mm Kính lúp, compa OSI, Đức Mettler Toledo 10-4g, Thụy Điển Pharmacia Biotech, Thụy Điển Hewlett Packard, Mỹ Eppendorf, Đức Bio Rad, Mỹ Bio Rad, Mỹ Sanyo, Nhật Bản Sanyo, Nhật Bản Bảng 1. Trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 3. Hóa chất - Agarose - Ethanol, phenol, cloroform, isoamyl. Các hoá chất trên được mua tại các hãng Sigma (Mỹ), Serva (Đức), Pharmacia (Thụy Điển). 4. Dung dịch và đệm - Đệm TE, pH 8.0 + 10 mM Tris – Cl, pH 8.0 + 1 mM EDTA, pH 8.0 - Đệm TAE + 40 mM Tris – Cl + 2 mM EDTA, pH 8.3 H2O đến 1 lít - Đệm cắt (Digestion buffer) + 100 mM NaCl + 10 mM Tris – Cl, pH 8.0 + 25 mM EDTA, pH 8.0 0,5 % (w/v) SDS 0,1 mg/ml proteinase K - Đệm tra mẫu (Loading buffer) 0,1 ml bromophenol blue 10% 0,3 ml glycerin 100% H2O đến 1ml II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Phương pháp nghiên cứu lí thuyết Thu thập và xử lý các tài liệu liên quan đến đề tài. 2. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm 2.1. Phương pháp thu mẫu Có nhiều cách để thu mẫu như: bắt bằng bẫy ống, bắt bằng thòng lọng, bắt bằng lưỡi câu, bắt bằng cách đào hang [4]. Ở đây chúng tôi tiến hành thu mẫu theo 2 cách chủ yếu: 2.1.1. Bắt bằng cách đào hang Khi quan sát thấy nhông chui vào hang hoặc quan sát miệng hang đúng là hang nhông, dùng que tre hoặc cành cây thọc vào hang để khỏi hất dấu hang rồi dùng cuốc hoặc xẻng để đào. Nhông thường có hang phụ nên trước khi đào phải bít miệng hang này lại đồng thời thường xuyên theo dõi vì nhông có thể theo vết đào chạy ngược ra để tẩu thoát. 2.1.2. Bắt bằng cách giăng lưới Khi quan sát miệng hang đúng là hang nhông thì dùng một miếng lưới rộng hơn miệng hang để bịt lại và dùng các que cây giữ lưới. Khi đó, nếu nhông chui ra khỏi hang hoặc chui vào hang đều bị mắc lại ở lưới. Cách này đơn giản hơn nhưng phải đợi tương đối lâu để bắt nhông. Mẫu sau khi bắt phải còn sống và được nhốt trong lồng để cân trọng lượng, đo các tính trạng kích thước của cơ thể và dùng trong thí nghiệm phân tích DNA . Một điểm thuận lợi là nhông cát có thể không ăn trong nhiều ngày mà vẫn sống, chỉ cần thỉnh thoảng vẩy nước cho chúng. 2.2. Phương pháp phân tích đặc điểm hình thái - Dùng cân để cân trọng lượng của mẫu vật. - Dùng thước và compa để đo các tính trạng: chiều dài thân, chiều dài đầu, khoảng cách từ mũi đến mõm, từ mắt đến mõm, khoảng cách giữa hai mắt, giữa hai mũi, khoảng cách từ tai đến mõm, từ mép miệng đến mõm, chiều dài mắt, chiều rộng đầu, chiều dài đùi, chiều dài ống chân. - Dùng kính lúp để đếm chính xác số vẩy môi trên, vẩy môi dưới và lỗ đùi. - Xử lý các số liệu thu được theo phương pháp thống kê sinh học. 2.3. Phương pháp định lượng ADN bằng quang phổ kế. * Nguyên tắc: Dựa vào sự hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base purine và pyrimidine, người ta sẽ đo được giá trị mật độ quang ở bước sóng260 nm (OD260nm – Optical Density 260nm) của các mẫu, và cho phép xác định nồng độ ADN trong mẫu dựa vào tương quan sau: một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ là: 50(mg/ml) cho một dung dịch ADN sợi đôi. Do đó nồng độ ADN trong mẫu được tính theo công thức sau: CADN (g/ml) = OD260 nm x 50 x Độ pha loãng Để kiểm tra độ sạch của dung dịch, người ta đo thêm giá trị OD ở 280 nm (OD 280). 280 nm là bước sóng ở đó các protein có mức hấp thụ cao nhất, nhưng các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm như các nucleic acid và do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ nucleic acid. Một dung dịch nucleic acid được xem là sạch (không tạp nhiễm protein) khi tỉ số OD 260 nm/OD 280 nm nằm trong khoảng 1,8 – 2,0 * Các bước tiến hành: - Lấy 1 ml dung môi hòa tan ADN (TE pH 8.0 hoặc nước khử ion vô trùng) cho vào cuvette đo làm đối chứng. - Cho 5 m1 dung dịch ADN cần định lượng vào 995 m1 dung môi hòa tan ADN (pha loãng 200 lần). Sau đó cho vào cuvette và đo OD ở bước sóng 260 nm và 280 nm. - Từ kết quả thu được ta tính nồng độ ADN và độ tinh sạch của ADN theo công thức trên. 2.4. Phương pháp điện di trên gel agarose ADN được tách chiết sau phản ứng PCR, sau khi xử lý enzym giới hạn... đều được phân tích định tính nhờ phương pháp điện di trên gel agarose. Agarose là một loại polymer tách từ rong biển, được cấu tạo bởi 2 monomer là D-galactose và 3,6 - anhydro L–galactose. Gel agarose là loại gel thông dụng nhất do thao tác đơn giản. * Nguyên tắc: Nguyên tắc của phương pháp điện di là dựa vào đặc tính cấu trúc của các ADN. Ðó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường có hiệu điện thế và cường độ thích hợp, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Các đoạn ADN sẽ di chuyển trong điện trường trên bản gel, với tốc độ tương quan nghịch với kích thước của chúng. Trong cùng một thời gian nhất định (tùy thí nghiệm) các đoạn bé sẽ di chuyển xa hơn các đoạn lớn, từ đó mà ADN được tách thành các vạch trên bản gel. Việc chọn nồng độ gel tùy thuộc vào kích thước trung bình của các đoạn ADN cần phân tách. Ðoạn ADN có kích thước càng nhỏ đòi hỏi hàm lượng agarose trong gel càng lớn và ngược lại. Bảng 2 cho thấy mối tương quan giữa nồng độ agarose cần sử dụng để phân tách các trình tự ADN có kích thước xác định. Hàm lượng agarose trong gel (%w/v) Kích thước các đoạn ADNcần phân tách (kb) 0,3 5 – 60 0,6 1 -20 0,7 0,8 – 10 0,9 0,5 – 7 1,2 0,4 – 6 1,5 0,2 – 3 2,0 0,1 – 2 Bảng 2. Tương quan giữa nồng độ gel agarose và kích thước đoạn ADN cần phân tách (Nguồn: Sambrook J. và cộng sự, 1989) Trong điện di trên gel agarose, các đoạn ADN được hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) nhờ ethimidium bromide (EtBr) có khả năng gắn xen giữa các base của ADN phát huỳnh quang dưới tác dụng của UV. Sau điện di, gel được chiếu sáng bằng UV, các đoạn ADN hiện thành vạch đỏ da cam. Để ước lượng kích thước các trình tự ADN trong gel agarose, người ta dùng “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử” (molecular weight marker – MWM). Đó là một tập hợp nhiều trình tự ADN có kích thước đã biết (thang ADN). * Các bước tiến hành: - Chuẩn bị gel agarose 0,8 %: Cho 0,8g agarose vào 100 ml đệm TAE 1X, đem đun trên bếp cách thuỷ hoặc lò vi sóng cho đến khi agarose tan hoàn toàn. Hạn chế bay hơi nước khi đun để tránh tăng nồng độ agarose. Nếu quá trình đun mất nước quá nhiều thì phải thêm nước cho đủ 100ml. Để nguội đến khoảng 60oC thì đổ dung dịch agarose vào khuôn gel điện di đã cài lược sẵn. Chiều dày gel khoảng 5 mm là thích hợp. Sau 30 – 40 phút khi gel đã đông cứng thì cho vào máy điện di, đổ đệm TAE vào ngập khuôn cách mặt gel từ 1 – 2 mm, rồi gỡ lược ra. - Tra mẫu ADN vào giếng điện di: + Mẫu ADN được trộn với đệm tra mẫu (với tỉ lệ 1/10 đệm tra mẫu), sau đó tra vào giếng nhỏ trên gel. + Chạy điện di cùng với ADN chuẩn (Marker) để xác định kích thước phân tử của ADN. - Chạy điện di: Cho chạy máy điện di với chương trình: U = 30 – 40V, I = 60 – 80 mA. Phân tử ADN sẽ di chuyển từ cực âm đến cực dương. Quan sát sự di chuyển bằng màu bromophenol để biết lúc nào cần ngừng điện di. - Nhuộm ADN bằng ethimidium bromide (EtBr): Sau khi kết thúc điện di, bản gel được lấy ra nhẹ nhàng khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr có nồng độ 0,5 g/ml khoảng 10 – 15 phút trên máy lắc nhẹ. Sau đó lấy bản gel ra và rửa bằng cách ngâm trong nước sạch 2 lần, mỗi lần 5 – 10 phút. - Quan sát và chụp ảnh: Bản gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại 254 nm trên máy soi ADN, sau đó chụp ảnh bằng hệ thống chụp ảnh gel tự động (Pharmacia Biotech, Thụy Điển). 2.5. Phương pháp tách chiết ADN từ mô động vật Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận một lượng ADN đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm kế tiếp. Đã có rất nhiều phương pháp được áp dụng để tách chiết ADN từ nhiều đối tượng khác nhau, mỗi phương pháp đều có những ưu điểm phù hợp cho từng đối tượng. Vì vậy việc lựa chọn một phương pháp tách chiết ADN thích hợp nhất cho từng đối tượng và đạt hiệu suất, độ tinh sạch cao nhất để phục vụ cho những thí nghiệm sau là rất quan trọng. * Nguyên tắc: Màng tế bào và màng nhân phải được phá vỡ bằng các biện pháp cơ học (nghiền, lắc mạnh) và các chất tẩy mạnh (SDS...), ADN genom giải phóng ra được tách sạch protein nhờ proteinase K và hỗn hợp phenol, chloroform, izoamyl alcohol. Sau đó ADN genome được tủa bằng ethanol 100% ở 40oC và thu lại bằng li tâm. * Các bước tiến hành: Phương pháp tách chiết ADN từ mô động vật được tiến hành theo Gross – Bellard và cộng sự, 1972. - Nghiền 200 mg – 1g mô bằng cồi chày sứ (cối chày sứ phải để lạnh trước trong tủ lạnh sâu -70oC) cho đến khi thành dạng bột mịn ở điều kiện 4oC - Hoà tan mẫu trong đệm cắt với tỉ lệ 1,2ml đệm cắt / 100mg mô - Ủ mẫu, lắc nhẹ trong bể ổn nhiệt ở 50oC từ 12 đến 18 tiếng. - Sau đó ủ mẫu được tách chiết với dung dịch phenol / chloroform / izoamyl alcohol theo tỉ lệ 1:1 về thể tích. Lắc mạnh, li tâm 14000 vòng/phút, 10 phút ở 4oC. Hút dịch phía trên chuyển sang Eppendorf mới. Nếu các pha không phân tách tốt thì ta thêm một thể tích đệm cắt không cần proteinase K và li tâm lại. Sau đó chiết pha ở trên có chứa ADN sang một Eppendorf mới. - Thêm vào ½ thể tích muối amonium acetat 7,5 M và 2 thể tích ethanol 100 %. Li tâm 14000 vòng/phút, 2 phút, 4oC để tủa ADN. - Rửa cặn tủa ADN trong ethanol 70 % để loại bỏ các muối còn dính lại trên mẫu, hong khô ở nhiệt độ phòng. Sau đó hòa tan lại trong đệm TE hoặc nước khử ion vô trùng với nồng độ 1mg/ml. 2.6. Phương pháp xử lý số liệu Các kết quả được xử lí theo phương pháp thống kê Sinh học 1. Trung bình cộng mẫu. = : Trung bình cộng của mẫu Xi : Giá trị từng lần nhắc lại N : Số lần lặp lại 2. Độ lệch chuẩn. = 3. Hệ số biến động. Cv% = 4. Sai số thực nghiệm. m = 5. Độ chính xác của thí nghiệm. m% = Phần 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU I. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI 1. Đặc điểm hình thái chung Nhông cát có thân dẹp theo hướng lưng bụng, không có mào lưng, không có gai trên đầu. Vảy nhỏ, phần lớn hoá sừng. Có một hoặc hai nếp họng nhỏ nằm ngang. Lỗ đùi làm thành hai dãy ở vùng mu hai bên lỗ huyệt. Đuôi dày lên ở gốc. Mỗi bàn chân có 5 ngón, các ngón chân dài và có móng nhọn. Bề rộng và bề dài của mõm gần bằng nhau. Bờ mõm được giới hạn bởi hai vảy môi và sáu tấm vảy sau mõm. Lỗ mũi mở trực tiếp ra ngoài, trán và vùng gian ổ mắt đôi khi to; các vảy trên ổ mắt là các vảy chấm rất nhỏ. Màng nhĩ rộng và nông, đường kính của nó gần bằng chiều dài lỗ mắt. Hai bên cổ có những nếp da nằm ngang kéo ngang qua phần gáy. Vẩy lưng nhỏ, hoá sừng; vẩy mặt bụng lớn hơn ở mặt lưng. Mặt lưng của L.belliana guttata Cuvier có các chấm màu phân ngựa hình lục giác, có bốn sọc dài màu vàng nhạt rộng trung bình 3 mm: hai sọc chạy từ sau tai đến gốc đuôi, hai sọc chạy từ gốc chân trước đến gốc chân sau. Mặt bụng màu trắng đục, không có các chấm màu da cam hai bên thân và không có khả năng bạnh da hai bên sườn. 2. Một số đặc điểm hình thái của nhông cát Leiolepis belliana guttata Cuvier Sau khi phân tích các mẫu vật thu ở Thuỷ Phù – Hương Thủy - Thừa Thiên Huế, chúng tôi đã thu được kết quả thể hiện ở bảng 3: STT Tính trạng S ố lượng mẫu (n) Cv% m m% 1 Khối lượng cơ thể (g) 30 38.94 2.13 5.43 0.43 1.1 2 Chiều dài thân (mm) 30 79.76 2.02 2.53 0.41 0.52 3 Chiều dài đầu (mm) 30 25.24 0.67 2.64 0.14 0.54 4 Vẩy môi trên 30 9.4 (8 – 11) 0.173 1.84 0.03 0.37 5 Vẩy môi dưới 30 9.68 (8 – 12) 0.19 1.95 0.04 0.39 6 Lỗ đùi 30 19.44 (15-23) 0.41 2.11 0.08 0.43 Bảng 3: Giá trị trung bình của chiều dài thân, chiều dài đầu, khối lượng cơ thể, số lượng vảy và lỗ đùi của L.b.guttata Cuvier Qua bảng 3 cho thấy khối lượng cơ thể trung bình là 38.94g (mẫu nhỏ nhất là 16,10g và lớn nhất là 50g), chiều dài thân trung bình là 79,76 mm (nhỏ nhất là 58 mm và lớn nhất là 95 mm). Như vậy khối lợng cơ thể trung bình và chiều dài thân trung bình của các mẫu vật chúng tôi phân tích nhỏ hơn kết quả nghiên cứu trước đây [4]: khối lượng cơ thể trung bình là 56,0g, chiều dài thân trung bình là 120,83 mm. Sai khác này có thể là do chúng tôi thu mẫu vào giai đoạn sớm hơn trong quá trình sinh trưởng của nhông cát, vì vậy mà cơ thể của chúng chưa đạt kích thước tối đa. Số lượng vảy môi trên, vảy môi dưới và lỗ đùi của các mẫu đem phân tích là: vảy môi trên trung bình là 9,40 (8 – 11), vảy môi dưới trung bình là 9,68 (8 – 12), lỗ đùi là 19,44 (15 – 23). Như vậy, kết quả nghiên cứu này phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Ngô Đắc Chứng (1991) [4]: vảy môi trên trung bình 9,33 (9 – 10), số vảy môi dưới trung bình là 10,00 (10 – 12), lỗ đùi trung bình 21,60 (20 – 23). Tần số gặp lỗ đùi, vảy môi trên và vảy môi dưới của các mẫu vật được trình bày thông qua bảng 4: Lỗ đùi Số lượng 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Tổng Tần số 1 2 2 5 3 6 7 3 1 30 Tần suất (%) 3,33 6,67 6,67 16,67 10 20 23,33 10 3,33 100 Vảy môi trên Số lượng 8 9 10 11 Tần số 5 8 14 3 30 Tần suất (%) 16,67 26,67 46,66 10 100 Vảy môi dưới Số lượng 8 9 10 11 12 Tần số 3 10 10 5 2 30 Tần suất (%) 10 33,33 33,33 16,67 6,67 100 Bảng 4: Tần số gặp lỗ đùi, vảy môi trên, vảy môi dưới của nhông cát L.b.guttata Cuvier Qua bảng 4 ta thấy số lỗ đùi dao động từ 15 – 23, trong đó tần số gặp cao nhất là 21 lỗ. Như vậy kết quả của chúng tôi có khác so với kết quả nghiên cứu trước đây [4]: số lỗ đùi dao động từ 20 – 23 lỗ. Sự khác nhau về số lượng lỗ đùi giữa các cá thể là tương đối lớn, cho ta thấy tính đa hình của loài nhông cát này. Số vảy môi trên dao động từ 8 – 11, trong đó tần số bắt gặp cao nhất là 10 lỗ; Số vảy môi dưới dao động từ 8 – 12, trong đó tần số bắt gặp cao nhất là 10 lỗ. Như vậy ta thấy số lượng vảy của nhông cát L.b.guttata Cuvier cũng biến thiên tương đối đa dạng. 3. Tính trạng kích thước khác Các tính trạng kích thước cơ thể của nhông cát được đem tính % so với chiều dài thân và chiều dài đầu. Kết quả được trình bày ở bảng 5: STT Tính trạng Số lượng mẫu Cv% m m% 1 Mũi – mõm / dài đầu 30 18.86 1.98 10.50 0.40 2.12 2 Mắt – mõm / dài đầu 30 69.92 5.47 7.82 1.12 1.60 3 Mắt / dài đầu 30 24.61 3.07 1.56 0.63 2.56 4 Rộng đầu / dài đầu 30 77.52 5.29 6.82 1.80 1.39 5 Mắt – mắt / dài đầu 30 55.43 3.13 5.65 0.64 1.15 6 Mũi – mũi / dài đầu 30 21.74 2.59 11.91 0.54 2.48 7 Tai – mõm / dài đầu 30 91.02 4.58 5.03 0.93 1.02 8 Mép miệng – mõm / dài đầu 30 67.28 6.73 10.00 1.37 2.04 9 Dài đầu / dài thân 30 31.40 2.29 7.29 0.47 1.50 10 Dài đùi / dài thân 30 23.88 2.62 10.97 0.53 2.22 11 Dài ống / dài thân 30 26.44 3.24 12.25 0.66 2.50 Bảng 5: Tỉ lệ % giữa các tính trạng kích thước so với chiều dài đầu và chiều dài thân của L.b.guttata Cuvier Qua bảng trên cho thấy tỷ lệ % kích thước so với chiều dài đầu và chiều dài thân giữa các cá thể khác nhau không chênh lệch nhiều, chỉ có tỷ lệ % của khoảng cách mắt – mõm / dài đầu, rộng đầu / dài đầu, tai – mõm /dài đầu, mép miệng – mõm / dài đầu là có sự chênh lệch lớn. II. PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG ADN MÔ NHÔNG CÁT 1. Tách chiết ADN ADN mô nhông cát được tách chiết theo phương pháp của Gross- Bellard và cộng sự như đã mô tả ở phần phương pháp. Nguyên liệu sử dụng để tách là các mẫu đuôi, gan, và cơ của nhông cát. Quá trình tách chiết ADN cơ bản gồm 3 bước: - Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân. - Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các protein. - Bước 3: Kết tủa ADN và thu nhận sản phẩm . Mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết ADN là thu nhận các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học (phân tử bị gẫy do nghiền, lắc mạnh) hay hóa học (phân tử bị cắt bởi enzym nội bào giải phóng ra môi trường khi tế bào bị phá vỡ). Các ADN cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzym nội bào (deoxyribonuclease, ribonuclease). Ðể đảm bảo điều kiện này, trước khi nghiền mẫu phải để lạnh cối, chày sứ trong tủ lạnh - 70oC. Sau khi nghiền mẫu, tế bào được hòa trong dung dịch đệm có chứa chất tẩy SDS và proteinase K. Hỗn hợp dung dịch đệm này sẽ phá hủy các protein liên kết với ADN. Ðể loại bỏ protein trong mẫu chúng tôi sử dụng phenol / chloroform/ isoamyl alcohol. Cuối cùng ADN được thu nhận bằng cách tủa trong ethanol 100% (2,5 thể tích ethanol/ 1 thể tích mẫu), để ở -20ºC. Với nồng độ ethanol cao và nhiệt độ thấp hầu như toàn bộ ADN đều tủa. 2. Điện di ADN Sau khi tách được ADN, chúng tôi tiến hành điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Sau khi nhuộm bằng EtBr, các vạch trong gel agarose phát quang dưới tia tử ngoại (UV). Kết quả điện di được thể hiện trên hình 1 bp 12216 8144 7126 M 1 2 3 4 5 6 Hình 1: Ðiện di đồ chế phẩm ADN tách chiết được từ đuôi, cơ và gan nhông cát L.b. guttata Cuvier M (Marker): Thang ADN chuẩn 1;4: ADN đuôi 2;5: ADN gan 3;6: ADN cơ Kết quả cho thấy các phân tử ADN mô nhông cát (đuôi, cơ, gan) có phân tử lượng lớn, tập trung thành một băng chính.Và ta thấy các phân tử ADN tách chiết từ các loại mô của nhông cát L.b.guttata Cuvier đều có kích thước lớn hơn 12216 bp. 3. Đánh giá độ tinh sạch và hàm lượng của chế phẩm ADN Sau khi điện di kiểm tra trên gel agarose, chúng tôi tiến hành đánh giá độ tinh sạch và hàm lượng của chế phẩm ADN bằng máy đo quang phổ 8425A (Hewlet Packard, Mỹ): Các chế phẩm ADN được kiểm tra ở các bước sóng 260nm và 280nm. Kết quả được thể hiện ở hình 2, bảng 6 và bảng 7 0,6 0,5 Độ hấp thụ AU 0,4 0,3 0,2 0,1 2 1 3 0 500 600 400 300 200 Độ dài bước sóng (nm) Hình 2: Phổ hấp thụ tử ngoại của chế phẩm ADN tách chiết từ đuôi, cơ và gan nhông cát L.b.guttata Cuvier 1. ADN đuôi 2. ADN gan 3. ADN cơ * Các kết quả bước sóng: thể hiện ở bảng 6: Bước sóng Mẫu 260 nm 280 nm 1. ADN đuôi 0,04121 0,02209 2.ADN gan 0,08969 0,04961 3. ADN cơ 0,07610 0,04187 Bảng 6: Phổ hấp thụ tử ngoại của ADN tách chiết từ đuôi, cơ, gan của nhông cát L. b.guttata Cuvier ở các bước sóng 260 nm và 280 nm. Qua hình và bảng cho thấy phổ hấp thụ tử ngoại của các chế phẩm ADN đều có đỉnh cực đại ở bước sóng 260nm. Kết quả định lượng ADN bằng phương pháp đo quang phổ được trình bày ở bảng 7: Mẫu Số mẫu tách ADN Nồng độ ADN (mg/ml) Tỉ số OD260nm/OD280nm Hàm lượng ADN (μg/mg mô) Ðuôi Gan Cơ 15 15 15 412,1 896,9 761,0 1,865 1,807 1,817 0,50 0,91 0,76 Bảng 7: Kết quả định lượng ADN trong mẫu tách chiết được từ đuôi, cơ và gan nhông cát L.b.guttata Cuvier bằng phương pháp đo quang phổ Qua kết quả trên ta thấy ADN tách chiết được từ gan có nồng độ và hàm lượng cao nhất (896,9 và 0,91 (mg/ml)) đồng thời độ tinh sạch cũng cao nhất (tỉ số OD260nm/OD280nm là 1,807); Tiếp theo là ADN tách chiết từ cơ: nồng độ ADN là 761, 00 (mg/ml), hàm lượng ADN là 0,76 (mg/ml), tỉ số OD260nm/OD280nm là 1,817; Cuối cùng là ADN tách chiết từ đuôi: nồng độ ADN là 412,1 (mg/ml), hàm lượng ADN là 0,50 (mg/ml), tỉ số OD260nm/OD280nm là 1,865. Như vậy, ADN tách chiết được từ gan có chất lượng tốt nhất. Tuy nhiên, chế phẩm ADN tách chiết được từ ba loại mô của nhông cát L.b.guttata Cuvier đều có chất lượng tốt (Tỉ số OD260nm/OD280nm nằm trong khoảng 1,8 – 2,0) [6] đảm bảo cho những nghiên cứu tiếp theo. Phần 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ I. KẾT LUẬN Qua nghiên cứu đề tài “Góp phần nghiên cứu tính đa hình của nhông cát Leiolepis belliana guttata Cuvier”, chúng tôi rút ra một số kết luận sau: - Nhông cát L.b.guttata Cuvier có khối lượng cơ thể trung bình là 38,94 g, chiều dài thân trung bình là 79,76 mm - Số lượng lỗ đùi là 15 - 23, vảy môi trên là 8 - 11, vảy môi dưới là 8 - 12. - Tỷ lệ % kích thước so với chiều dài đầu và chiều dài thân giữa các cá thể khác nhau không chênh lệch nhiều, tỷ lệ % của khoảng cách mắt – mõm / dài đầu, rộng đầu / dài đầu, tai – mõm /dài đầu, mép miệng – mõm / dài đầu là có sự chênh lệch lớn. - Sai khác về số lượng lỗ đùi, vảy môi trên, vảy môi dưới giữa các cá thể khác nhau trong một quần đàn cho thấy nhông cát L.b.guttata Cuvier có tính đa hình cao. - Đã tách chiết và tinh sạch ADN tổng số của nhông cát L.b.guttata Cuvier. - Chế phẩm ADN tách chiết được từ các mô của nhông cát (đuôi, cơ, gan) theo phương pháp của Gross – Bellard và cộng sự đều có chất lượng tốt đảm bảo cho những nghiên cứu tiếp theo. II. ĐỀ NGHỊ Trong phạm vi của một đề tài khóa luận tốt nghiệp, chúng tôi không có đủ điều kiện sử dụng các chỉ thị phân tử ADN như RAPD, RFLP, AFLP để phân tích tính đa hình của nhông cát Leiolep is belliana guttata Cuvier. Vì vậy tôi xin đề nghị: - Kéo dài thời gian nghiên cứu đặc điểm hình thái để thu được mẫu vào những thời điểm khác nhau trong năm. - Nghiên cứu thêm một số tính trạng khác để thấy rõ tính đa hình. - Tiếp tục nghiên cứu ở mức độ phân tử, phân tích ADN để thấy tính đa hình của loài. - Phân tích ADN của cả hai loài nhông hiện có ở Thừa Thiên Huế để củng cố giả thuyết chúng thuộc hai loài hay một loài. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Đinh Thị Phương Anh, 2005. Bước đầu nghiên cứu tính đa dạng di truyền thạch sùng vùng núi Bà Nà bằng kỹ thuật PCR – RAPD. Báo cáo khoa học, Hội nghị Khoa học toàn quốc, công nghệ sinh học trong nghiên cơ bản, Hà Nội: 72 – 75. 2. Nguyễn Thị Bảy, 2004. Sử dụng các chỉ thị phân tử để phân tích tính đa hình của các quần đần cá Tra nuôi (Pangasius Hypophthalmus) ở Việt Nam. Luận văn thạc sĩ khoa học Sinh học, Hà Nội. 3. Nguyễn Thị Thanh Bình, et al. 2005. Nghiên cứu đa dạng phân tử của các giống tằm sử dụng trong sản xuất bằng kỹ thuật PCR – RAPD. Báo cáo Khoa học, Hội nghị Khoa học toàn quốc, Công nghệ sinh học trong nghiên cứu cơ bản, Hà Nội: 76 – 79. 4. Ngô Đắc Chứng, 1991. Nghiên cứu đực điểm hình thái và sinh thái của nhông cát Leiolepis belliana ở Thừa Thiên Huế. Luận án phó tiến sĩ khoa học Sinh học. 5. Trần Quốc Dung, 2001. Nghiên cứu chuyển gen hormone sinh trưởng người vào cá chạch Misgurnus anguillicaudatus bằng vi tiêm. Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà nội. 6. Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 1997. Sinh học phân tử. Nxb Giáo dục: 122 – 134. 7. Trịnh Đình Đạt, 1994. Cơ sở di truyền chọn giống động vật. Giáo trình cao học, Nxb Nông nghiệp: 145 – 149. 8. Phạm Thành Hổ, 2004. Di truyền học. Nxb Giáo dục: 405 – 408. 9. Trần Thị Mai Hường, 2006. Nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái và nuôi thử nghiệm Rồng đất (Physignathus cocincinus Cuvier, 1829) ở Nam Đông - Thừa Thiên Huế. Luận văn thạc sĩ Sinh học, Huế. 10. Phan Cự Nhân, 2001. Di truyền học động vật, Nxb Khoa học Kỹ thuật: 128 – 132; 148 – 151. 11. Phan Cự Nhân, Trần Bá Hoành, Lê Quang Long, Phạm Đình Thái, Hoàng Thị Sản, Mai Đình Yên, 1997. Sinh học đại cương, tập 1. Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội: 330 – 336. 12. Khuất Hữu Thanh, 2002. Một số phương pháp ứng dụng PCR trong phân loại phân tử xác định tính đa dạng di truyền của sinh vật. Tập bài giảng trường ĐHBK Hà Nội. Lưu hành nội bộ. 13. Quyền Đình Thi, et al. 2003. Sử dụng microsarosatell, mtRFLP và RAPD để phân tích đa hình tôm sú (Panaeus monodon). Tạp chí Công nghệ sinh học 1930: 287 – 298. 14. Quyền Đình Thi, et al. 2004. Sử dụng các chỉ thị phân tử RAPD và mtDNA – RFLP để phân tích đa hình các quần đàn cá tra (Pangasius hypophthalmus) nuôi ở Việt Nam. Tuyển tập hội thảo toàn quốc về nghiên cứu và ứng dụng khoa học công nghệ trong nuôi trồng thủy sản, Vũng Tàu: 919 – 941. PHỤ LỤC I. NHÔNG CÁT Leiolepis belliana guttata Cuvier II. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI CỦA NHÔNG CÁT Mẫu Khối lượng (g) Dài thân (mm) Dài đầu (mm) Rộng đầu (mm) Dài mắt (mm) Vảy môi trên Vảy môi dưới Lỗ đùi 1 47 90 27 20 9,00 10 11 21 2 46 94 26 21 6,50 10 10 19 3 47,50 95 26 21,5 7,00 8 8 16 4 27,05 73 22 18 6,00 10 11 17 5 16,10 68 20 15 5,00 9 10 15 6 46,60 93 28 20 6,0 10 10 21 7 16,80 65 20 17 6,00 10 10 18 8 43,90 79 25 2 7,00 11 9 23 9 45,50 84 28 20 6,00 10 8 20 10 43 82 27 19 6,00 1 8 21 11 19 58 22 15 5,00 10 9 19 12 24,40 80 26 19 6,00 9 10 18 13 50 90 28 20 7,00 8 9 22 14 47,60 85 27 22 6,50 10 10 22 15 49,10 86 27 22 6,00 10 9 16 16 33,10 70 23 18 6,00 9 9 21 17 42,80 82 28 21 6,00 9 10 21 18 46 89 26 20 6,00 9 10 20 19 47 90 26 21 7,00 9 12 20 20 26 70 21 17 5,00 8 10 18 21 35,50 72 23 19 6,00 10 10 20 22 40 75 24 18 5,00 10 11 21 23 30,50 68 22 18 5,00 8 9 18 24 45 83 28 20 6,00 10 11 20 25 37 73 23 20 6,00 8 9 19 26 38,50 75 24 20 6,00 9 9 20 27 42 80 25 21 6,50 10 9 21 28 35 70 21 18 5,00 10 10 18 29 39,30 75 25 19 5,50 11 9 20 30 43,20 80 27 21 6,00 9 12 22 Mẫu Mũi – mõm (mm) Mắt – mõm (mm) Mắt - mắt (mm) Mũi – mũi (mm) Tai – mõm (mm) Mép miệng - mõm (mm) Dài đùi (mm) Dài ống (mm) 1 6,00 19 15 7,00 25 19 17 18 2 5,00 17 15 6,00 24 18 16 17 3 5,50 18,50 15 6,00 25 17,50 21 22 4 4,00 15 12 4,00 20 14 18 20 5 3,50 14 12 3,00 18,50 14 15 18 6 6,00 17 14,50 6,00 23 19 22 22 7 3,00 14 11 4,00 19 13 16 18 8 5,00 18 15 6,00 21 17 20 21 9 5,00 18 15 6,00 24 18 20 25 10 5,00 18 15 5,00 24 18 18 21 11 4,00 15 10 5,00 19 14 13 18 12 5,00 18 15 5,50 25 17 22 22 13 5,00 19 14 6,00 25 16 19 22 14 5,00 18 15 6,00 24 15 21 23 15 4,00 19 15 6,00 24 17 20 22 16 4,00 17 12 5,00 21 18 18 20 17 6,00 17 14 6,00 24 17 20 22 18 5,00 19 14 7,00 25 18 21 21 19 6,00 19 15 7,00 25 19 21 22 20 4,00 14 12 4,00 20 14 18 19 21 4,00 18 13 5,00 22 18 20 21 22 4,50 18 14 5,50 23 18 18 23 23 4,00 15 12 4,50 20 16 19 22 24 5,00 18 14 6,00 24 18 20 23 25 4,50 19 14 5,00 22 18 21 22 26 4,50 17 13 5,00 23 17 18 19 27 5,50 19 15 6,00 24 18 20 22 28 4,50 17 13 5,00 21 18 19 20 29 5,00 18 14 5,50 22 19 18 21 30 6,00 19 15 6,00 23 17 20 21 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 I. LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI 1 II. MỤC TIÊU VÀ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU 3 1. Mục tiêu 3 2. Nhiệm vụ 3 Phần 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 4 I. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU NHÔNG CÁT 4 1. Trên thế giới 4 2. Ở Việt Nam 6 II. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ 10 1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước. 10 2. Tình hình nghiên cứu trong nước 11 III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH 12 1. Phương pháp isoenzyme cổ điển 12 2. Các phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử AND 13 2.1. Phương pháp RAPD 13 2.2. Phương pháp RFLP 14 2.3. Phương pháp AFLP 16 2.4. Microsatellite 16 2.5. Đọc trình tự AND 16 2.6. Phân tích ADN ty thể 17 Phần 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 I. NGUYÊN LIỆU 19 1. Nguyên liệu 19 2. Dụng cụ 19 3. Hóa chất 20 4. Dung dịch và đệm 20 II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 1. Phương pháp nghiên cứu lí thuyết 21 2. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm 21 2.1. Phương pháp thu mẫu 21 2.2. Phương pháp phân tích đặc điểm hình thái 22 2.3. Phương pháp định lượng ADN bằng quang phổ kế. 22 2.4. Phương pháp điện di trên gel agarose 23 2.5. Phương pháp tách chiết ADN từ mô động vật 25 2.6. Phương pháp xử lý số liệu 27 Phần 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28 I. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI 28 1. Đặc điểm hình thái chung 28 2. Một số đặc điểm hình thái của nhông cát Leiolepis belliana guttata Cuvier 28 3. Tính trạng kích thước khác 31 II. PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG ADN MÔ NHÔNG CÁT 33 1. Tách chiết AND 33 2. Điện di AND 33 3. Đánh giá độ tinh sạch và hàm lượng của chế phẩm ADN 34 Phần 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37 I. KẾT LUẬN 37 II. ĐỀ NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 PHỤ LỤC 41