Đề tài Khảo sát ảnh hưởng của vi khuẩn methylobacteriumsp lên sự phát sinh cơ quan cây lúa (oryza sativa l.) nuôi cấy in

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** CHU LÝ HẢI ANH KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP. LÊN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN Ở CÂY LÚA (Ozyra sativa L) NUÔI CẤY IN VITRO Luận văn kỹ sƣ Chuyên Ngành: Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP. LÊN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN Ở CÂY LÚA (Ozyra sativa L) NUÔI CẤY IN VITRO Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành:Công nghệ sinh học Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS. TS. BÙI VĂN LỆ CHU LÝ HẢI ANH ThS. KIỀU PHƢƠNG NAM Khóa: 2002-2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY STUDYING EFFECT OF METHYLOBACTERIUM SP. ON MORPHOGENESIS OF IN VITRO RICE (Ozyra sativa L) Engineer Thesis Major: Biotechnology Research adviser Researcher BÙI VĂN LỆ, PROF, PhD CHU LÝ HẢI ANH KIỀU PHƢƠNG NAM, MSc Term: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 iv MỤC LỤC Trang CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU …………………………………………………………………….. 1 TỔNG QUAN………………………………………………………………... 3 2.1 Giới thiệu về cây lúa…………………………………………………….. 3 2.1.1 Vị trí phân loại……………………………………………………. 3 2.1.2 Nguồn gốc và phân bố…………………………………………….. 4 2.1.3 Đặc điểm hình thái………………………………………………… 5 2.1.4 Đặc điểm hạt lúa…………………………………………………... 6 2.2 Ứng dụng phƣơng pháp nuôi cấy mô trong cải tiến giống lúa………... 7 2.3 Phƣơng pháp nuôi cấy mô, tế bào in vitro………………………………10 2.3.1 Sự tái sinh mẫu cấy (sự tạo cơ quan)……………………………..10 2.3.2 Sự tạo mô sẹo từ cơ quan………………………………………….11 2.3.3 Ảnh hƣởng của một số môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy trên sự nuôi cấy tế bào…………………………………………………………….13 2.3.3.1 Môi trƣờng nuôi cấy………………………………………13 2.3.3.2 Các nhân tố vật lý…………………………………………13 2.3.3.3 Ảnh hƣởng của chất điều hòa tăng trƣởng thực vật……14 2.4 Ảnh hƣởng của vi sinh vật lên sự phát triển thực vật………………….14 2.5 Đặc điểm của chi Methylobacterium……………………………………..15 2.5.1 Lịch sử phát hiện và phân loại…………………………………….15 2.5.2 Đặc điểm sinh thái………………………………………………….17 2.5.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa……………………………...18 v 2.5.4 Các ứng dụng của vi khuẩn Methylobacterium sp………………..19 2.5.4.1 Tƣơng tác với thực vật……………………………………..19 2.5.4.2 Sinh tổng hợp auxin và cytokinin………………………….23 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP……………………………………………24 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu……………………………………….24 3.2 Vật liệu nghiên cứu……………………………………………………….24 3.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu………………………………………………24 3.2.2 Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu………………………27 3.2.3 Mẫu cấy và điều kiện nuôi cấy………………………………….....27 3.3.4 Nhân sinh khối và giữ giống vi khuẩn………………………….....27 3.3.5 Môi trƣờng nuôi cấy………………………………………………..28 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu…………………………………………………28 3.3.1 Tạo vật liệu khởi đầu (mô sẹo)……………………………………...28 3.3.2 Nhân sinh khối vi khuẩn…………………………………………….30 3.3.3 Nội dung thí nghiệm…………………………………………………30 3.3.3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4-D lên khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ20………………………………………...30 3.3.3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo của giống lúa VĐ20…………………...31 3.3.3.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của nồng độ NAA lên khả năng tái sinh rễ từ mô sẹo của giống lúa VĐ20………………………………..31 3.3.3.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tạo mô sẹo của giống lúa VĐ20……………………………………………32 3.3.3.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ20………………………………………………...33 3.3.3.6 Thí nghiệm 6: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo của giống lúa VĐ20………………………………33 3.3.3.7 Thí nghiệm 7: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh rễ từ mô sẹo của giống lúa VĐ20………………………………...34 vi 3.3.3.8 Thí nghiệm 8: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tăng sinh mô sẹo của giống lúa VĐ20……………………………………..34 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………………………………36 4.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4-D lên khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ20…………………………………………………………………36 4.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo của giống lúa VĐ20……………………………………………38 4.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của nồng độ NAA lên khả năng tái sinh rễ từ mô sẹo của giống lúa VĐ20…………………………………………………….43 4.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tạo mô sẹo của giống lúa VĐ20………………………………………………………………….45 4.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ20………………………………………………………………….47 4.6 Thí nghiệm 6: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo của giống lúa VĐ20…………………………………………………….50 4.7 Thí nghiệm 7: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh rễ từ mô sẹo của giống lúa VĐ20…………………………………………………………53 4.8 Thí nghiệm 8: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tăng sinh mô sẹo của giống lúa VĐ20……………………………………………………………..55 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ……………………………………………………..58 5.1 Kết luận……………………………………………………………………...58 5.2 Đề nghị……………………………………………………………………….59 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC vii CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : Dichlorophenoxy-acetic acid Aux : Auxin BAP : 6-Benzylamino-purin Cs : Cộng sự Cyt : Cytokinin MS : Murashige-Skoog MMS : Methanol mineral salts NAA : α-naphthalene acetic acid viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4-D đến kích thƣớc mô sẹo (cm) sau 4 tuần nuôi cấy………………………………………………………………………......36 Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA đến tỷ lệ tái sinh chồi từ mô sẹo……………………………………………………………………………….38 Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA đến số chồi hình thành từ mô sẹo……………………………………………………………………………….40 Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến tỷ lệ tái sinh và số rễ hình thành…43 Bảng 4.5: Ảnh hƣởng của chủng 1019 đến tỷ lệ tạo sẹo của hạt lúa…………….45 Bảng 4.6: Ảnh hƣởng của chủng 1019 đến đƣờng kính mô sẹo…………………47 Bảng 4.7: Ảnh hƣởng của chủng 1019 đến tỷ lế tái sinh chồi và số chồi hình thành từ mô sẹo…………………………………………………………………………50 Bảng 4.8: Ảnh hƣởng của chủng 1019 đến tỷ lế tái sinh rễ và số rễ trên mẫu…...53 Bảng 4.9: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên sự tăng sinh mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy………………………………………………………………………………..55 ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1: Vi khuẩn có sắc tố hồng ngoại nhiễm vào môi trƣờng nuôi cây: A: Saintpaulia ionantha; B: Paulonia fortunei; C: Pacciflora sp. [8]………………………………….2 Hình 2.1: Oryza sativa L………………………………………………………....6 Hình 2.2: Cấu trúc hạt lúa……………………………………………………….7 Hình 2.3: Methylobacterium sp. trên cây rêu (A), hình dạng tế bào vi khuẩn chụp qua kính hiển vi điện tử (B)…………………………………………………….17 Hình 2.4: Methylobacterium sp. chủng BJ001 nuôi cấy trên môi trƣờng thạch LB (A) vào môi trƣờng dịch thể LB (B) chụp qua kính hiển vi điện tử quét [36]...18 Hình 2.5: Sự tái sinh chồi của loài cây thuốc lá chuyển gen ipt trên môi trƣờng MS không bổ sung hormone sau một tháng nuôi cấy. (a): không bổ sung vi khuẩn Methylovorus mays. (b): có bổ sung vi khuẩn Methylovorus mays[21]……….20 Hình 3.1: Giống lúa VĐ20: (a) hạt chƣa bóc vỏ trấu, (b) hạt bóc vỏ trấu……..24 Hình 3.2: Hạt lúa đã khử trùng trên môi trƣờng tạo sẹo……………………….29 Hình 4.1: Mô sẹo trên môi trƣờng MS bổ sung 0,5mg/l BAP và 1mg/l NAA sau 5 tuần nuôi cấy (1.1)……………………………………………………………..37 Hình 4.2: Các mô sẹo ở thí nghiệm 1 sau 5 tuần nuôi cấy…………………….38 Hình 4.3: Mô sẹo tái sinh chồi trên môi trƣờng MS bổ sung 2mg/l BAP và 1mg/l NAA sau 5 tuần nuôi cấy………………………………………………………42 Hình 4.4: Các mẫu mô tái sinh chồi ở thí nghiệm 2 sau 5 tuần nuôi cấy………42 Hình 4.5: Mô sẹo tái sinh rễ trên môi trƣờng MS bổ sung 1,5mg/l NAA sau 5 tuần nuôi cấy…………………………………………………………………………44 Hình 4.6: Các mẫu mô tái sinh rễ ở thí nghiệm 3 sau 5 tuần nuôi cấy…………45 Hình 4.7: Sự tạo mô sẹo trên môi trƣờng MS bổ sung 2mg/l 2,4-D: (a) có bổ sung 1ml dung dịch khuẩn, (b) không có bổ sung khuẩn sau 2 tuần nuôi cấy……….47 Hình 4.8: Sự tăng sinh mô sẹo trên môi trƣờng MS bổ sung 1mg/l BAP và 0,5mg/l NAA: (a) bổ sung 0,5ml dung dịch vi khuẩn, (b) không bổ sung khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy…………………………………………………………………………49 x Hình 4.9: Sự tăng sinh mô sẹo trên môi trƣờng MS bổ sung 1mg/l BAP, 0,5mg/l NAA và 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy (5.4)…………………49 Hình 4.10: Sự tái sinh chồi trên môi trƣờng MS bổ sung 2mg/l BAP, 1mg/l NAA và 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy (6.2)………………………..52 Hình 4.11: Sự tái sinh chồi trên môi trƣờng MS bổ sung 2mg/l BAP, 1mg/l NAA và 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy (6.4)………………………..52 Hình 4.12: Sự tái sinh rễ trên môi trƣờng MS bổ sung 1,5mg/l NAA và 0,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy (7.2)………………………………………..54 Hình 4.13: Sự tái sinh rễ trên môi trƣờng MS bổ sung 1,5mg/l NAA và 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy (7.4)………………………………………..55 Hình 4.14: Sự tăng sinh mô sẹo ở thí nghiệm 8 trên môi trƣờng MS không bổ sung hormone: (a) không có bổ sung khuẩn, (b) bổ sung 0,5ml dung dịch vi khuẩn, (c) bổ sung 1ml dung dịch vi khuẩn, (d) bổ sung 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy………………………………………………………………………..57 xi DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ Đồ thị 3: Đƣờng cong tăng trƣởng của chủng 1019……………………………...26 Đồ thị 4.1: Kích thƣớc mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy ở các nghiệm thức khác nhau36 Đồ thị 4.2: Tỷ lệ tái sinh chồi ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian……..39 Đồ thị 4.3: Số chồi hình thành trên mẫu ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian……………………………………………………………………………….40 Đồ thị 4.4: Tỷ lệ rễ tái sinh và số rễ hình thành ở các nghiệm thức khác nhau sau 2 tuần……………………………………………………………………………….43 Đồ thị 4.5: Tỷ lệ tạo mô sẹo ở các nghiệm thức khác nhau sau 2 tuần…………..46 Đồ thị 4.6: Kích thƣớc mô sẹo ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian…….48 Đồ thị 4.7: Tỷ lệ tái sinh chồi ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian……..50 Đồ thị 4.8: Số chồi hình thành trên mẫu ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian………………………………………………………………………………..51 Đồ thị 4.9: Tỷ lệ rễ tái sinh và số rễ hình thành trên mẫu ở các nghiệm thức khác nhau sau 2 tuần…………………………………………………………………...53 Đồ thị 4.10: Số chồi, số rễ hình thành trên mẫu, kích thƣớc mô sẹo ở các nghiệm thức khác nhau sau 4 tuần………………………………………………………...56 xii TÓM TẮT CHU LÝ HẢI ANH, Đại học Nông Lâm TPHCM. Tháng 8/2006. “ KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP. LÊN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN CÂY LÚA (Oryza sativa L.) NUÔI CẤY IN VITRO”. Giáo viên hƣớng dẫn: PGS. TS. Bùi Văn Lệ ThS. Kiều Phƣơng Nam Đề tài đƣợc thực hiện tại trại thực nghiệm – khoa Sinh học - trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên trên đối tƣợng là giống lúa VĐ20 và chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. 1019. Tiến hành nhân sẹo, tạo chồi, tạo rễ từ mô sẹo của giống lúa VĐ20 bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro, sau đó khảo sát ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng phát sinh cơ quan của mô sẹo bằng cách bổ sung những nồng độ khuẩn khác nhau vào môi trƣờng nuôi cấy với 34 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại với các chỉ tiêu nhƣ tỷ lệ tái sinh, số chồi trên mẫu, số rễ trên mẫu, đƣờng kính mô sẹo. Những kết quả thu đƣợc: - Chủng 1019 có tác dụng kích thích sự phát triển rễ, ức chế khả năng tái sinh chồi và thay đổi trạng thái, cấu trúc của mô sẹo. Chứng tỏ chủng khuẩn có tác động đến quá trình trao đổi chất, sinh lý, sinh hóa của tế bào mô sẹo, ảnh hƣởng đến sự phát sinh hình thái của sẹo. - Chủng 1019 có ảnh hƣởng đến quá trình phát sinh hình thái của giống lúa VĐ20, chiều hƣớng phát sinh cơ quan tuỳ thuộc vào bản chất của mô cấy và loài thực vật. - Nồng độ khuẩn cao sẽ ức chế hoàn toàn mô sẹo, không thấy đƣợc sự phát sinh cơ quan từ mô sẹo. xiii Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Phó Giáo sư- Tiến sĩ Bùi Văn Lệ. Ngƣời đã gợi ý đề tài, luôn giúp đỡ và tận tình hƣớng dẫn em trong suốt thời gian làm khoá luận. Thạc sĩ Kiều Phương Nam, đồng hƣớng dẫn, thầy đã tận tình hƣờng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành khoá luận này. Tiến sĩ Trần Thị Dung, cô đã giảng dạy và truyền đạt cho em nhiều kinh nghiệm quý giá trong suốt thời gian theo học ở trƣờng. Tiến sĩ Từ Bích Thủy, cô đã truyền đạt cho em nhiều kinh nghiệm làm việc, trình bày khóa luận và đóng góp những ý kiến quý báu cho khóa luận này. xiv Em xin chaân thaønh caûm ôn Toàn thể quí thầy cô trong bộ môn Công nghệ sinh học. Trường Đại học Nông Lâm TPHCM. Những người đã giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức quý giá trong thời gian học tập tại trường. Toàn thể quí thầy cô trong bộ môn Sinh học. Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia TPHCM. Những người đã tạo điều kiện thuận lợi và đóng góp nhiều ý kiến trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này. Tập thể các bạn sinh viên khóa DH02SH, Trường Đại học Nông Lâm TPHCM, và các bạn thân đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện khoá luận này. Các anh, chị và các bạn sinh viên khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia TPHCM, đã giúp đỡ và động viên em trong thời gian thực hiện khóa luận. Con xin tỏ lòng thành kính và biết ơn Ba, Mẹ. Người đã sinh thành và dưỡng dục con. Con xin tỏ lòng thành kính và biết ơn Bà ngoại, Bà nội. Người đã hết lòng thương yêu, dạy dỗ để con có được ngày hôm nay. Con xin tỏ lòng biết ơn Cô, Dì, Dượng đã thương yêu và động viên con. 1 GIỚI THIỆU Lúa là cây lƣơng thực quan trọng, là nhu cầu không thể thiếu đối với con ngƣời, đặc biệt ở các nƣớc Châu Á. Do đó, việc nghiên cứu, cải tiến và tạo ra các giống lúa có phẩm chất tốt, khả năng chống chịu cao là vấn đề quan tâm của nhiều nhà khoa học. Công nghệ nuôi cấy mô thực vật hiện nay đang phát triển rất mạnh mẽ và ngày càng mang lại hiệu quả kinh tế cao. Công nghệ này giúp tạo ra một số lƣợng lớn cây trồng đồng nhất, duy trì các tính trạng tốt, tạo cây sạch bệnh… Việc nâng cao năng suất lúa bằng cách phối hợp giữa phƣơng pháp thông thƣờng và công nghệ sinh học là chiến lƣợc đƣợc nhiều quốc gia quan tâm. Tuy nhiên, một trở ngại cần quan tâm trong nuôi cấy mô thực vật là hiện tƣợng nhiễm nấm, khuẩn sẽ ảnh hƣởng không tốt đến sự sinh trƣởng và phát triển của các mô thực vật. Nhƣng điều đó không có nghĩa là tất cả các loài nấm, khuẩn nhiễm trong môi trƣờng nuôi cấy đều có hại. Ngoài ra chính điều kiện vô trùng trong quá trình nuôi cấy đã loại bỏ các mối tƣơng tác có ích giữa thực vật và vi sinh vật. Theo một số nghiên cứu, sự hiện diện của một số loài nhƣ Bacillus spp. [5], Methylobacterium sp. [46], [47] .. trong môi trƣờng nuôi cấy không những không làm chết mô thực vật mà ngƣợc lại dƣờng nhƣ còn kích thích sự sinh trƣởng của cây. 2 A B C Hình 1: Vi khuẩn có sắc tố hồng ngoại nhiễm vào môi trƣờng nuôi cây: A: Saintpaulia ionantha; B: Paulonia fortunei; C: Pacciflora sp. [9] Đã có nhiều nghiên cứu đƣợc tiến hành trên cây lúa (Oryza sativa L) và kết quả cho thấy vi khuẩn Methylobacterium sp. có khả năng làm gia tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt, tăng trọng lƣợng tƣơi, chiều cao của cây mạ trong điều kiện in vitro …Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài: “KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP. LÊN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN Ở CÂY LÚA (Oryza sativa L) NUÔI CẤY IN VITRO”. Mục đích Tìm hiểu ảnh hƣởng của vi khuẩn Methylobacterium sp. lên sự phát sinh cơ quan cây lúa: mô sẹo, chồi, rễ. Yêu cầu Xác định nồng độ kích thích tố thích hợp đến khả năng tạo mô sẹo, nhân sẹo, tạo chồi, nhân chồi, tạo rễ ở cây lúa bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro. Khảo sát ảnh hƣởng của vi khuẩn Methylobacterium sp. lên khả năng tạo mô sẹo, tạo chồi, tạo rễ ở cây lúa. So sánh ảnh hƣởng của vi khuẩn Methylobacterium sp. với ảnh hƣởng của các kích thích tố lên sự phát sinh cơ quan. 3 TỔNG QUAN 2.1. Giới thiệu về cây lúa Lúa là cây lƣơng thực chính cho nhiều ngƣời và đồng thời lúa gạo cũng tham gia vào các hoạt động kinh tế quan trọng nhất trên thế giới. Châu Á là nơi sản xuất 90% tổng sản lƣợng và cũng là nơi tiêu thụ lúa gạo nhiều nhất. Khoảng 85% sản lƣợng gạo, 72% lúa mì và 19% ngô đƣợc con ngƣời tiêu thụ trực tiếp [38]. Lúa gạo cung cấp 21% năng lƣợng và 15% protein cho loài ngƣời [30]. Từ 1989 trở lại đây, Việt Nam trở thành một trong những nƣớc xuất khẩu gạo hàng đầu trên thế giới. Năm 2001 các nƣớc xuất khẩu gạo chính (tính theo triệu tấn) bao gồm: Thái Lan (6,4), Việt Nam (4,0), Trung Quốc (3,0), Mỹ (2,8) (USDA, 2001). 14 năm qua, cây lúa đặc biệt là ở ĐBSCL đã đóng góp cho đất nƣớc gần 8 tỷ USD trị giá xuất khẩu và đã góp phần to lớn cho công cuộc đổi mới ở Việt Nam có kết quả. Tuy sản xuất với số lƣợng nhiều, nhƣng chất lƣợng và giá gạo xuất khẩu của Việt Nam thƣờng thấp hơn so với một số nƣớc nhƣ Thái Lan, Mỹ, Úc, đặc biệt có sự chênh lệch lớn ở loại gạo đặc sản và gạo cao cấp [8]. 2.1.1 Vị trí phân loại Lớp: Monocotyledonae Họ: Poaceae Giống: Oryza Loài: Oryza sativa L. 4 Lúa O. sativa có 2n = 24 nhiễm sắc thể, thƣờng đƣợc phân biệt làm 3 nhóm: Lúa Indica: thƣờng trồng ở khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, có thân cao, dễ đổ ngã, nhiều chồi, lá ít xanh và cong và kháng đƣợc nhiều sâu bệnh nhiệt đới. Hạt gạo dài hoặc trung bình, có nhiều tinh bột. Năng suất kém hơn lúa Japonica. Lúa Japonica: thƣờng đƣợc trồng ở những vùng ôn đới hoặc những nơi có độ cao trên 1000 m (trên mặt biển), có thân ngắn, chống đổ ngã, lá xanh đậm, thẳng đứng, ít chồi, hạt gạo thƣờng tròn, ngắn hoặc trung bình, dẻo khi nấu vì ít chất tinh bột. Lúa Japonica có năng suất cao. Lúa Javanica (bulu) hay lúa Japonica nhiệt đới đƣợc trồng ở Indonexia, có đặc tính ở giữa hai loại lúa Japonica và Indica. Hình thức gần giống nhƣ lúa Japonica, có lá rộng với nhiều lông và ít chồi. Thân cứng, chắc và ít cảm quang. Hạt lúa thƣờng có đuôi [7]. 2.1.2 Nguồn gốc và phân bố Cây lúa đƣợc canh tác từ vĩ tuyến 400 phía nam bán cầu đến vĩ tuyến 530 của bắc bán cầu, và đƣợc trồng từ mặt đất thấp hơn mặt nƣớc biển cho đến độ cao 2000m trên mặt biển. Trên thế giới có 20 loài lúa hoang và 2 loài canh tác. Cây lúa hiện đƣợc canh tác đại trà để cung cấp lƣơng thực cho con ngƣời trên thế giới là Oryza sativa L. ở châu Á, có năng suất cao và đƣợc ƣa chuộng. Loài lúa Oryza glaberrima Steud. đƣợc canh tác ít hơn ở Tây châu Phi, có năng suất và chỉ số thu hoạch thấp hơn O.sativa. Các cuộc nghiên cứu trên đất gạch bằng trấu trong các thành phố danh tiếng đổ nát ở Ấn Độ và trong vùng sông Cửu Long nhƣ Myanma, Thái Lan, Lào, Campuchia và Việt Nam phát hiện rằng cây lúa trồng ở Đông Dƣơng do phát triển theo 2 ngả: từ Lào theo sông Cửu Long đi xuống phƣơng nam có đặc tính cây lúa Japonica nhiệt đới, một ngả khác từ Ấn Độ qua vịnh Bengal đến bờ biển Đông Dƣơng, với đặc tính của cây lúa Indica. Vì vậy, Việt Nam với khí hậu nhiệt đới nằm trong vùng đa dạng sinh thái của thảo mộc gồm cả cây lúa Indica và Japonica nhiệt đới [7]. 5 2.1.3 Đặc điểm hình thái O. sativa là cây thân thảo, hệ thống rễ chùm, sống hằng năm, có thời gian sinh trƣởng thay đổi tùy theo giống lúa, vụ trồng, nơi trồng vá các điều kiện sinh thái và kéo dài trong khoảng từ 75-250 ngày. Cây mọc thẳng đứng hay mọc nghiêng rồi bò dài (lúa nổi), lúa sống ở cạn, đất cao hay nƣớc ngập chân hoặc một phần thân hay trong nƣớc sâu 2-4m. Thân cao từ 70-150cm, một số giống lúa nổi có thân cao 2-3m, hay 5-6m (lúa nổi ở Bangladesh). Đốt thân nhẵn và cách nhau bởi những dóng dài, ngắn khác nhau. Phiến lá thẳng hình đều, đầu lá nhọn, bề mặt phiến lá và mép lá đều ráp. Bẹ lá có thìa lìa, lá dìa hình mũi mác hay chẻ đôi, các đầu chẻ đều nhọn. Lúa thƣờng tạo ra thành nhiều nhánh (dảnh lúa: tillers), bao gồm cọng và lá có hoặc không có bông (panical). Nhánh bậc 1 xuất hiện từ những đốt gần thân chính và nhánh bậc hai, bậc ba xuất hiện từ những nhánh bậc một này. Lá mọc liên tiếp trên thân bao gồm bẹ lá bao lấy thân và phiến lá. Cổ lá nối giữa phiến lá và bẹ lá có một lƣỡi bẹ và 2 thìa lìa từ cổ lá. Bông mọc trên đốt trên cùng của thân từ bên trong lá cờ và mang nhiều hoa trong một bông con. Cụm hoa là một chùm thƣa, thẳng, hẹp, đầu hơi cong xuống, dài 15-30cm hoặc dài hơn. Hoa nhỏ hình thuôn dài, mày hoa thuôn dài hình mũi mác, hoa màu hồng vàng hay màu tím, có hoa lƣỡng tính, tự thụ phấn. Hoa có 6 nhị đực mảnh, bao phấn dài, bầu hoa có vòi, nhụy ngắn và hai đầu nhụy có lông tơ [28]. Về cơ bản, lúa là cây thích nghi với điều kiện có nƣớc. Ba giai đoạn chính trong quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây lúa theo viện nghiên cứu quốc tế IRRI là: - Nẩy mầm và sinh trƣởng sinh dƣỡng - Giai đoạn phát triển cơ quan sinh sản - Giai đoạn hạt chín [28] 6 Hình 2.1: Oryza sativa L. 2.1.4 Đặc điểm hạt lúa Cơ cấu hạt lúa là quả dĩnh nhỏ gồm có:  Vỏ trấu gồm trấu trên và trấu dƣới.  Cám gồm biểu bì, quả bì và chủng bì (nucellus). Màu sắc hạt gạo do lớp chủng bì.  Phôi nhũ gồm có lớp aleuron và phôi nhũ tích tụ tinh bột.  Mầm cây gồm có phôi (mầm) lá, phôi rễ và trụ phôi giữa ở phần dƣới của hạt. Hạt lúa là noãn sào thụ tinh đã chín, có hai mày trấu nhỏ trên và dƣới, hai vỏ trấu trên và dƣới, cuống trấu ở phần dƣới của hạt và đuôi ở chót hạt (ngắn hoặc dài). Một hạt lúa có trọng lƣợng từ 12 – 44 mg ở 0% ẩm độ. 7 Hình 2.2: Cấu trúc hạt lúa Theo IRRI, hạt gạo đƣợc phân loại theo chiều dài của hạt gạo nhƣ sau: rất dài: > 7,50 mm, dài: 6,61 – 7,50 mm, trung bình: 5,51 – 6,60 mm, và ngắn: < 5,50 mm. Theo Ủy ban thực phẩm Codex (1990), sự xếp hạng gạo theo tỉ lệ bề dài – đối với – bề rộng nhƣ sau: hạt dài: 3,1, hạt trung bình: 2,1 – 3,0, và hạt ngắn: 2,0 [38]. 2.2. Ứng dụng phƣơng pháp nuôi cấy mô trong cải tiến giống lúa Các tiến bộ mới đây về kỹ thuật sinh học đặc biệt là nuôi cấy mô, tế bào và sinh học phân tử đã mở ra những hƣớng mới cho việc cải tiến cây lúa có năng suất cao và ổn định, tạo ra cơ hội tốt để hoàn thiện các mục tiêu chọn giống mà trƣớc đây chúng ta không thể làm đƣợc. Phƣơng pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật là phƣơng pháp nhân giống lý tƣởng không chỉ do đòi hỏi ít diện tích, nhanh mà còn 8 giữ nguyên đƣợc tính ƣu việt của giống ban đầu. Trong quá trình nghiên cứu cơ sở di truyền của sự biến đổi các tế bào thực vật nuôi cấy, ngƣời ta thấy rằng công nghệ nuôi cấy tế bào cho chúng ta lợi thế quan trọng làm thay đổi giống cây trồng theo hƣớng có lợi [4]. Bên cạnh đó nuôi cấy in vitro góp phần quan trọng trong việc tạo ra các vật liệu cần thiết nhƣ chồi, phôi mầm… cho các phƣơng pháp chọn lọc giống, phƣơng pháp chuyển nạp gen trên lúa và các đối tƣợng thực vật khác. * Nuôi cấy túi phấn Nuôi cấy túi phấn để phát triển các dòng đồng hợp tử hay dòng đơn bội kép. Sự tái sinh cây trồng từ túi phấn chỉ giới hạn trong kiểu gen japonica, nó có nhƣợc điểm là khá năng trồng cây lai rất thấp nhất là đối với các giống lúa indica. Cho đến nay kỹ thuật này chỉ mới thành công để cái tiến các giống lúa japonica ở Trung Quốc, Hàn Quốc [57]. * Cứu sống phôi mầm Cứu sống phôi mầm để tạo ra con lai đặc biệt: các loài hoang dại là nguồn phong phú của các gen hữu ích. Phôi mầm 10 ngày tuổi đƣợc tách ra và cấy vào môi trƣờng, tiếp tục hồi giao với giống lúa trồng để có con lai vừa nhận đƣợc gen cần thiết của lúa hoang và dạng hình cải tiến của lúa trồng. Kỹ thuật này thành công trong việc khai thác nguồn gen kháng rầy nâu, rầy lƣng trắng trong tổ hợp lai giữa O. officinalis và O. sativa [42]. * Khai thác biến dị tế bào soma và chọn lọc các đột biến có ích trong nuôi cấy mô tế bào Tính chất biến dị này đã đƣợc biết với các đột biến nhƣ đặc tính kháng bệnh, kháng mặn, kháng độ độc nhôm, đặc tính chiều cao và thời gian sinh trƣởng. Trên lúa, Oono (1981, 1983) đã ghi nhận sự biến dị của một số đặc tính con lai trong nuôi cấy mô, quan sát dòng R2 có 52% biểu hiện dạng hình mới [51], [52], [58] . Schaeffer và cs (1984) đã tìm thấy biến dị đối với đặc tính dạng hạt, hàm lƣợng protein, chiều cao, số chồi khi nuôi cấy túi phấn của giống Calrose 76 [56]. Nguồn biến dị đƣợc kích thích bởi kỹ thuật nuôi cấy mô của con lai cần đƣợc nhấn mạnh 9 đặc biệt về cách du nhập các gen trong những genome khác nhau mà trong đó không có tính chất tƣơng đồng của nhiễm thể. * Khai thác biến dị phôi (somatic embryogenesis) Nuôi cấy tế bào phôi đang trở nên quan trọng đối với việc tạo ra một tần suất cao của sự tái sinh từ tế bào, từ hạt phấn, từ tế bào trần cũng nhƣ các tế bào chuyển nạp. Ngƣời ta tạo ra hạt tổng hợp (synthetic seeds) bằng cách nuôi cấy tế bào phôi, sau đó bảo quản phôi trƣởng thành trong túi (encapsulation) để làm vật liểu giống cây trồng. Đối với lúa nghiên cứu hạt tổng hợp vẫn còn rất mới mẻ, cần nghiên cứu sâu hơn invitro để phát triển các phôi somatic có thể nảy mầm thành cây. Kỹ thuật hạt giống tổng hợp trên cây lúa có tiềm năng rất lớn để khai thác ƣu thế lai, vì nó giúp cho việc nhân giống, cũng nhƣ phát triển các cây lai có ƣu thế mạnh đƣợc sớm đƣa ra sản xuất rộng rãi [2]. * Kỹ thuật chuyển nạp gen và sản xuất cây lúa transgenic Các tiến bộ gần đây trong nuôi cấy mô và sinh học phân tử đã mở ra những hƣớng mới trong thu nhập các gen lạ vào cây trồng. Gen lạ đƣợc lắp ghép thành công ở nhiều loài cây trồng thông qua vi khuẩn Agrobacterium cũng nhƣ phƣơng pháp chuyển nạp DNA trực tiếp [61]. Có 2 cách để đƣa vật liệu di truyền ngoại lai ở dạng từng gen riêng biệt vào tế bào thực vật: (1) Chuyển gen qua vector: các plasmid có thể đƣợc dùng làm vector để chuyển các vật liệu di truyền vào tế bào thực vật. Các plasmid này gọi là Ti và Ri. (2) Truyền trực tiếp DNA - phƣơng pháp vi tiêm - biến nạp bằng xung điện - biến nạp do mở lỗ bằng điện - biolistics Nghiên cứu sản xuất cây lúa transgenic đã đƣợc báo cáo [45] . Nhiều đặc tính cây lúa có thể đƣợc cải tiến bằng phƣơng pháp du nhập các gen mới. Đề án hợp 10 tác giữa IRRI và PGS (Plant Genetic System) Bỉ, nhằm thực hiện tách gen Bt (từ Bacillus thurigiensis) dòng có độc tính đối với sâu cuốn lá và sâu đục thân - đồng thời chuyển gen này vào cây lúa. Chuyển nạp gen giữa các tế bào trần đã áp dụng thành công trên giống Tepei Boro (Bangladesh) và IR43 [37]: cả hai phƣơng pháp lai tế bào trần và bắn gen đều đƣợc sử dụng, những cây đƣợc chuyển nạp đều có hai gen của bacteria. 2.3. Phƣơng pháp nuôi cấy mô, tế bào in vitro 2.3.1 Sự tái sinh mẫu cấy (sự tạo cơ quan) Môi trƣờng và chất điều hòa sinh trƣởng thực vật thích hợp cho sự phân chia tế bào để tế bào tăng sinh nhanh chóng thì không thể cảm ứng cho sự phát sinh hình thái (tạo chồi, rễ). Tuy nhiên, trong nuôi cấy mô thực vật, sự phát sinh cơ quan xảy ra khi mô sẹo đƣợc nuôi lâu trong môi trƣờng, nhƣng có thể sự phát sinh hình thái này bị ức chế nếu mô sẹo cấy chuyền liên tục. Trong trƣờng hợp khác, mô sẹo hình thành từ mẫu cấy trong môi trƣờng tạo mô sẹo, sau đó chuyển sang môi trƣờng khác có thành phần dƣỡng chất và chất điều hòa sinh trƣởng thực vật thay đổi thì sự phát sinh cơ quan (chồi, rễ) sẽ xảy ra. Sự phát sinh cơ quan từ mô sẹo tƣơng tự nhƣ sự phát sinh cơ quan trực tiếp từ mẫu cấy. Khi thay đổi thành phần và nồng độ các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật thì tế bào mô sẹo lại đƣợc cảm ứng để phân hóa tạo cơ quan [13]. Tái sinh cây từ mô sẹo lúa: khi đƣờng kính mô sẹo đạt 0,5-1mm, mô sẹo sẽ đƣợc cấy chuyền sang môi trƣờng tái sinh. Nếu các mô sẹo còn non (0,5mm hay nhỏ hơn) mà đã cấy chuyền sang môi trƣờng tái sinh thì sẽ bị chết nhiều và cho số chồi xanh ít. Mô sẹo càng già thì khả năng tái sinh càng kém. Vì vậy nên chọn những mô sẹo trung bình và đang tăng trƣởng tốt để cấy chuyền. Kích thƣớc mô sẹo tăng khá nhanh, sau vài tuần, trên một số mô sẹo xuất hiện những điểm xanh, từ những điểm xanh này sẽ hình thành chồi và phát triển thành cây [13]. 11 2.3.2 Sự tạo mô sẹo từ mô hay cơ quan Kỹ thuật tạo mô sẹo đƣợc tiến hành lần đầu tiên vào cuối những năm 1920, đầu những năm 1930, và là một trong những phƣơng pháp đầu tiên của kỹ thuật nuôi cấy mô trong nhiều năm [59]. Trong phƣơng pháp này, mô sẹo ở những điều kiện môi trƣờng thích hợp có thể tái sinh cơ quan theo chiều hƣớng mà ta mong muốn, tạo ra những vật liệu sử dụng trong các phƣơng pháp sinh học khác nhƣ: chuyển gen, chọn lọc dòng soma, tạo giống cây sạch bệnh… Mô sẹo (callus) là một khối tế bào không có tổ chức, có đặc tính phân chia mạnh, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã phân hóa dƣới các điều kiện đặc biệt: có vết thƣơng, xử lý các chất điều hòa tăng trƣởng nhƣ 2,4- D trong tối… Các tế bào thuộc các mô hoặc các cơ quan này, trừ tế bào của mô phân sinh, phải chịu một sự phản phân hóa trƣớc lần đầu tiên. Sự phản phân hóa có vai trò rất quan trọng, nó cho phép một tế bào đã trƣởng thành trở lại trạng thái trẻ (trẻ hóa). Sự trẻ hóa giúp tế bào tái lập khả năng phân chia và tạo phôi soma trong điều kiện thích hợp [54]. * Vai trò của loại cơ quan, tuổi cơ quan và ánh sáng trong sự tạo mô sẹo Khả năng tạo mô sẹo của mô và cơ quan phụ thuộc rất nhiều vào trạng thái sinh lý, sinh hóa và kiểu gen [59]. Sự tăng sinh của mô sẹo là kết quả của sự cân bằng giữa trạng thái sinh lý của mẫu cấy và tác động của các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật ngoại sinh áp dụng trong môi trƣờng nuôi cấy [13]. - Các mô và các cơ quan có thể đƣợc sử dụng làm vật liệu tạo mô sẹo nhƣ: rễ, thân, lá, củ, chồi hoa, túi phấn, phôi hợp tử chƣa trƣởng thành, phôi hợp tử trƣởng thành…Tuy nhiên, với mỗi loại mô hay cơ quan, thƣờng phải sử dụng các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật với loại và nồng độ khác nhau tuỳ theo mức độ nhạy cảm của các tế bào trong mô hay cơ quan đó. - Những mảnh cơ quan đã trƣởng thành thƣờng không có khả năng tạo mới cơ quan, cũng không có khả năng tạo mô sẹo. Ngƣợc lại, cây non 12 (còn nguyên vẹn hay cắt đoạn) hay những mảnh thân còn rất non của cây trƣởng thành có thể tạo mô sẹo trên môi trƣờng có chất điều hòa sinh trƣởng thực vật, đặc biệt là auxin. - Tùy theo loại mẫu cấy, ánh sáng cần hoặc không cần trong suốt thời gian tạo mô sẹo [54]. Trong đa số trƣờng hợp, sự tạo mô sẹo trong tối thƣờng tốt hơn ngoài sáng, đặc biệt là đối với mẫu cấy lá nhƣ tạo mô sẹo từ lá khoai tây; ngƣợc lại, sự tạo mô sẹo từ lá cây thuốc lá Nicotiana tabacum; mô củ khoai tây… xảy ra trong điều kiện chiếu sáng. - Vai trò của auxin trong tăng trƣởng mô sẹo: mô sẹo sau khi hình thành nếu đƣợc tiếp tục duy trì trong môi trƣờng có auxin thì mô sẹo sẽ tăng sinh nhanh, nhƣng nếu chuyển sang một môi trƣờng có đầy đủ các thành phần dinh dƣỡng nhƣng không có sự hiện diện của auxin thì sự tăng sinh của mô sẹo xảy ra rất chậm. Tốc độ tăng trƣởng của mô sẹo phụ thuộc vào thành phần cũng nhƣ nồng độ của auxin. - Vai trò của các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật trong phát sinh hình thái mô sẹo: hình thái của mô sẹo phụ thuộc rất nhiều vào loại cũng nhƣ nồng độ của các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật hiện diện trong môi trƣờng nuôi cấy. Nếu giữ nguyên nồng độ và loại auxin nhƣng thay đổi thành phần và nồng độ cytokinin thì hình thái mô sẹo thay đổi. Trong đa số trƣờng hợp, sự hiện diện của BAP trong môi trƣờng nuôi cấy kích thích sự tạo mô sẹo dạng nốt, chắc, màu nâu và có khả năng sinh phôi; mô sẹo trên môi trƣờng có kinetin có dạng bở và thƣờng không có khả năng sinh phôi. Nồng độ auxin tăng cao kích thích sự tạo mô sẹo dạng bở nhƣng khi giảm nồng độ auxin thì mô sẹo có dạng nốt và chắc [13]. 13 2.3.3 Ảnh hƣởng của một số môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy trên sự nuôi cấy tế bào 2.3.3.1 Môi trƣờng nuôi cấy Tiềm năng tạo sẹo của một số loài thực vật đƣợc xác định bởi sự tƣơng tác giữa trạng thái sinh lý của vật liệu nuôi cấy và môi trƣờng nuôi cấy [15], [49]. Vì vậy, việc chọn đúng môi trƣờng nuôi cấy thích hợp cho từng đối tƣợng nuôi cấy rất cấn thiết trong công tác nuôi cấy mô và tế bào thực vật [6]. Các môi trƣờng cơ bản đƣợc sử dụng trong nuôi cấy mô lúa thƣờng là: MS (Murashige và Skoog); N6 (Chu và csv). Đây là các môi trƣờng đƣợc đánh giá là giàu dinh dƣỡng và có thành phần khoáng cân bằng [6]. Thông thƣờng có sự đồng nhất giữa môi trƣờng cảm ứng tạo sẹo và môi trƣờng thích hợp cho sự tăng trƣởng của mô sẹo; tuy nhiên, trong một số trƣờng hợp có sự khác nhau của nồng độ chất điều hòa tăng trƣởng thực vật ở cả hai môi trƣờng này [25]. 2.3.3.2 Các nhân tố vật lý Ánh sáng: Nhu cầu ánh sáng cho sự hình thành và tăng trƣởng của mô sẹo tuỳ thuộc vào loài thực vật. Ở một số loài, mô sẹo thƣờng đƣợc cảm ứng và tăng trƣởng trong điều kiện tối tuy nhiên một số loài sự cảm ứng và tăng trƣởng của mô sẹo đòi hỏi điều kiện ánh sáng hoặc quang kỳ thích hợp [55]. Hiệu ứng ánh sáng với chiều hƣớng tăng trƣởng và biệt hóa tế bào trong nuối cấy tế bào in vitro không chỉ phụ thuộc vào kiểu gen của vật liệu nuôi cấy mà còn phụ thuộc vào bƣớc sóng, cƣờng độ, thời gian chiếu sáng và giai đoạn tăng trƣởng của tế bào nuôi cấy [33]. Nhiệt độ: Hầu hết các mô và tế bào đều tăng trƣởng tốt ở điều kiện nhiệt độ khoảng 26-30oC [43]. Tuy nhiên, hiệu ứng nhiệt độ cũng thay đổi tùy loài thực vật Phaseolus 28 o C, Brassica 15 o C [20]; Oryza sativa 24-32 o C [33]. 14 2.3.3.3 Ảnh hƣởng của chất điều hoà tăng trƣởng thực vật Chất điều hòa tăng trưởng thực vật là thuật ngữ đƣợc dùng để chỉ tổng quát những hợp chất hữu cơ có tác động làm biến đổi một quá trình sinh lý nào đó của thực vật ở nồng độ rất thấp. Chúng không phải là chất dinh dƣỡng hay là nguyên tố khoáng cần thiết cho sự tăng trƣởng của thực vật [11]. Kích thích tố thực vật (phytohormone) là thuật ngữ đƣợc dùng để chỉ những hợp chất thiên nhiên do thực vật tạo ra với hàm lƣợng rất thấp từ vị trí sản xuất di chuyển đến vị trí hoạt động: ở đây, chúng tác động làm biến đổi một quá trình sinh lý nào đó của thực vật [11]. Để có hoạt tính, các chất điều hòa tăng trƣởng thực vật phải cố định trên một thể nhận chuyên biệt của tế bào đích, thể nhận này có thể thay đổi theo mô đích, nên một chất điều hòa tăng trƣởng thực vật có hiệu ứng khác nhau trên những mô đích khác nhau. Nhìn chung, hoạt động của các chất điều hòa tăng trƣởng thực vật phụ thuộc vào các yếu tố sau: - Bản chất và nồng độ của các chất điều hòa tăng trƣởng thực vật. - Sự cân bằng giữa các chất điều hòa tăng trƣởng thực vật trong mô đích. - Loại mô đích và trạng thái sinh lý của mô đích [3] 2.4. Ảnh hƣởng của vi sinh vật lên sự phát triển của thực vật Giữa thực vật và vi sinh vật có mối quan hệ mật thiết với nhau, bên cạnh một số vi sinh vật có hại thì một số khác có lợi cho cây trồng giúp cây dễ hấp thu, có khả năng tổng hợp các hormone tăng trƣởng thực vật và các chất tạo tính kháng với các tác nhân gây bệnh. Dựa vào những đặc điểm có lợi đó ngƣời ta áp dụng các kỹ thuật sinh học tạo ra các loại phân bón, thuốc trừ sâu sinh học thay thế cho phân bón, thuốc trừ sâu hóa học gây độc cho ngƣời và động vật. Ví dụ nhƣ: - Azobacterin là loại vi khuẩn cố định đạm, có khả năng cung cấp một lƣợng lớn chất auxin, giberelin do đó để tăng năng suất cây trồng trong đó có cây lúa, ngƣời ta sản xuất hàng loạt các vi khuẩn này để sản xuất phân bón cho đất màu mỡ gọi là phân sinh học Azotobacterin [4]. 15 - Nấm Trichoderma là nấm hiện diện trên nhiều thực vật và là chủng nấm có lợi, khi xử lý trên ruộng lúa thì không những gia tăng năng suất lúa mà còn gia tăng khả năng kháng bệnh của cây lúa [10]. - Baculovirus gây nhiễm cho hơn 600 loài côn trùng khác nhau, vấn đề quan trọng là nó không gây nhiễm cho ngƣời, động vật và cả thực vật. Baculovirus có tiềm năng nhƣ là tác nhân kiểm soát sinh học đối với vật làm hại côn trùng. Song thị trƣờng áp dụng còn nhiều hạn chế, do đó đòi hỏi phải có nhiều hiểu biết hơn nữa để kiểm soát sự biểu hiện gene của Baculovirus hy vọng mang đến nhiều lợi ích cho sản xuất vaccin và thuốc trừ sâu sinh học [4]. * Trong nuôi cấy mô tế bào, điều kiện vô trùng phải đƣợc đảm bảo tuyệt đối, và chíng điều kiện vô trùng đã loại bỏ các mối tƣơng tác có ích giữa thực vật và vi sinh vật. Có rất nhiều nghiên cứu đã đƣợc tiến hành nhằm mục tiêu chọn lọc những chủng vi khuẩn có tác động tốt tới sự phát triển của cây in vitro, cải thiện phẩm chất, phát triển khả năng trong chọn lọc giống cây trồng. Một vài nghiên cứu gần đây đã đề cập đến tác động của vi khuẩn Methylobacterrium sp. lên nhiều loại cây trồng. 2.5. Đặc điểm của chi Methylobacterium 2.5.1 Lịch sử phát hiện và phân loại Chi Methylobacterium bao gồm nhiều loài vi khuẩn có sắc tố hồng dinh dƣỡng methyl tùy ý (pink- pigmented facultative methlotrophs, PPFM) [24], [53]. Chúng có khả năng sử dụng các hợp chất chỉ chứa một nguyên tử carbon nhƣ formaldehyde, methanol hay các hợp chất chứa nhiều nguyên tử carbon làm nguồn cung cấp năng lƣợng và carbon cho quá trình sinh trƣởng [44]. Đa số các loài đều có khả năng phát triển trên môi trƣờng nutrient agar, một số loài có khả năng tăng trƣởng trên môi trƣờng có bổ sung methylamine và chỉ có một loài có khả năng sử dụng methan [34]. Loài Methylobacterium đƣợc phân lập và mô tả lần đầu tiên vào năm 1913 do Bassalik phân lập từ giun đất và đƣợc đặt tên là Bacillus extorquens. Mặc dù vi 16 khuẩn PPFM hiện diện rất phổ biến trong đất hay trên các sinh vật nhƣng trong một thời gian dài các vi khuẩn này không đƣợc phân lập và nghiên cứu nhiều. Vào những năm 1960, 1970 khi nghiên cứu tập trung vào con đƣờng đồng hóa các hợp chất một cacbon thì nhóm vi khuẩn dinh dƣỡng methyl đƣợc phân lập và nghiên cứu, trong đó tập trung vào các phƣơng thức biến dƣỡng năng lƣợng và những ứng dụng của nhóm vi khuẩn này [34]. Năm 1974, Patt và các cộng sự phân lập đƣợc loài vi khuẩn PPFM đầu tiên có khả năng sử dụng methan. Loài này sắp xếp vào một chi mới là Methylobacterium với tên loài là Methylobacterium organophilum. Năm 1982, Green và Bousfield nhận thấy chủng Methylobacterium organophilum có nhiều đặc điểm rất giống các loài vi khuẩn PPFM đã đƣợc công bố trƣớc đây. Khi so sánh 140 đặc điểm sinh lý, sinh hóa và hình thái của 149 chủng vi khuẩn PPFM với lòai M. organophilum cho thấy chúng tƣơng đồng hơn 70%. Do vậy, Green và Bousfield đã đề nghị sắp xếp các loài vi khuẩn PPFM vào chi Methylobacterium [34]. Từ năm 1992 đến năm 2005 đã có thêm 15 loài Methylobacterium sp. mới phân lập và đặt tên. Trong đó, các loài mới đƣợc xác định nhờ vào các đặc điểm sinh lý, sinh hóa khác biệt và sự tƣơng đồng của trình tự rRNA giữa các loài khác nhau [29], [48], [62]. Vị trí phân loại chi Mehtylobacterium trong giới vi sinh vật nhƣ sau: Giới: Bacteria Ngành: Proteobacterium Lớp: Alphaproteobacteria Bộ: Rhizobiales Họ: Methylobacteriaceae 17 2.5.2 Đặc điểm sinh thái Vi khuẩn Methylobacterium phân bố rộng rãi trong tự nhiên, chúng hiện diện trong nhiều môi trƣờng khác nhau bao gồm: đất, đất bùn ao hồ, nƣớc sạch, nƣớc mƣa, không khí, bề mặt lá cây, nốt sần ở rễ thực vật, các loại hạt giống…[23], [29]. PPFM phân bố rộng rãi trên nhiều loài cây, chúng đƣợc phân lập từ hơn 100 loài thực vật từ địa tiền, rêu cho đến các loài cây hạt trần và cây hạt kín [26]. Vi khuẩn PPFM là những vi khuẩn hiếu khí hoàn toàn, do vậy các vi khuẩn này thƣờng đƣợc phân lập từ bất kỳ môi trƣờng nƣớc sạch nào có chứa oxy hòa tan. Ngoài ra, vi khuẩn PPFM còn có khả năng kháng với ion Cl- nên chúng vẫn hiện diện trong nƣớc sạch dùng trong sinh hoạt [32], [33]. Vi khuẩn PPFM thƣờng lan truyền qua không khí và có khả năng thực hiện nhiều quá trình trao đổi chất khác nhau, trong một số điều kiện thuận lợi nhất định vi khuẩn PPFM có khả năng lên men tạo ra các sản phẩm khác nhau. Do vậy, các vi khuẩn PPFM đang đƣợc sử dụng các sản phẩm có giá trị sinh học, chẳng hạn nhƣ các hợp chất polyme sinh học [27], [34]. Hình 2.3: Methylobacterium sp. trên cây rêu (A), hình dạng tế bào vi khuẩn chụp qua kính hiển vi điện tử (B) [36] 18 2.5.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá Hầu hết các loài vi khuẩn Methylobacterium sp. thƣờng có hình que (0,8-1,0 x 1,0-0,8 μM). Vi khuẩn thƣờng nằm ở dạng tế bào đơn hay đôi hay đôi khi kết lại theo dạng hoa hồng (rosettes) [9]. Hình 2.4: Methylobacterium sp. chủng BJ001 nuôi cấy trên môi trƣờng thạch LB (A) vào môi trƣờng dịch thể LB (B) chụp qua kính hiển vi điện tử quét [22] Đa số các chủng đều có khả năng di động nhờ một tiêm mao ở cực hay gần cực, tuy nhiên một vài loài lại không có khả năng di động. Đa số các loài vi khuẩn Methylobacterium sp. là vi khuẩn Gram âm, một số có Gram biến đổi. Vi khuẩn thƣờng tăng trƣởng chậm, khuẩn lạc thƣờng có màu hồng đậm hay đỏ cam sáng, một số chủng không tăng trƣởng đƣợc trên môi trƣờng nutrient agar. Sắc tố hồng của vi khuẩn không tan trong nƣớc, không phát sáng huỳnh quang và là hợp chất carotenoid, hấp thu bƣớc sóng cực đại ở 473, 499 và 532 nm [29], [34]. Ở môi trƣờng lỏng nuôi cấy tĩnh vi khuẩn tạo thành một lớp màng mỏng trên bề mặt, điều này cho thấy hầu hết các chủng là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc. Oxidase dƣơng tính yếu, catalase dƣơng tính hay âm tính tuỳ thuộc vào loài vi khuẩn. Methylobacterium sp. là những vi khuẩn hoá dị dƣỡng, có khả năng sử dụng tùy ý các hợp chất methyl. Do vậy, tất cả các loài đều có khả năng tăng trƣởng trên môi trƣờng có bổ sung formaldehyde (ở nồng độ thấp), formate và methanol, một vài loài có khả năng sử dụng các hợp chất methylamine, chỉ có một 19 loài duy nhất là M. organophilum có khả năng sử dụng methane làm nguồn cung cấp carbon và năng lƣợng [29], [34]. Nhiệt độ thích hợp dao động từ 25 đến 30oC, một số loài vẫn có thể sinh trƣởng ở nhiệt độ 37oC hay 51oC. Đa số các loài đều tăng trƣởng ở pH trung tính, một số loài phát triển ở pH=4, pH=10. Hầu hết các loài đều nhạy cảm với các hợp chất kháng sinh nhƣ: kanamycin, gentamycin, streptomycin và tetracylin, trong đó chất kháng sinh tetracylin có hoạt tính ức chế mạnh đối với vi khuẩn Methylobacterium sp. [34]. 2.5.4 Các ứng dụng của vi khuẩn Methylobacterium sp. 2.5.4.1 Tƣơng tác với thực vật Giữa cây và vi khuẩn có quan hệ tƣơng hỗ, một số vi khuẩn có lợi cho cây trồng vì chúng tham gia vào các chu trình sinh địa hoá, cung cấp cho cây các chất dinh dƣỡng cần thiết. Vi khuẩn dinh dƣỡng methyl chiếm tỷ lệ lớn trong hệ vi sinh vùng lá của nhiều loài cây. Kalyaeva và cộng sự (2000, 2003) phát hiện việc gây nhiễm vi khuẩn Methylovorus mays và Methylomonas methanica vào môi trƣờng nuôi cấy invitro tạo mối liên kết bền vững giữa vi khuẩn và mô thực vật [39], [40]. Thuốc lá, cây lanh và khoai tây khi nhiễm vi khuẩn tăng trƣởng mạnh hơn so với đối chứng (số chồi tăng, rễ phát triển mạnh), ngay cả trên môi trƣờng không có vitamine [35]. 20 Hình 2.5: Sự tái sinh chồi của loài cây thuốc lá chuyển gen ipt trên môi trƣờng MS không bổ sung hormone sau một tháng nuôi cấy. (a): không bổ sung vi khuẩn Methylovorus mays. (b): có bổ sung vi khuẩn Methylovorus mays [39] Theo Maliti (2000), so với các vi khuẩn liên kết với thực vật khác thì vi khuẩn Methylobacterium sp. là loài tồn tại lâu dài và chiếm tỉ lệ lớn nhất khi bề mặt lá đƣợc rửa sạch [46]. Holland và cộng sự (1994) đã đề cập đến việc khử trùng thông thƣờng trong khâu chuẩn bị nuôi cấy mô không loại trừ đƣợc Methylobacterium sp., dù đã xử lý với hypochlorite và cồn nhƣng các mô sẹo phát sinh từ mẫu cấy này vẫn có nguy cơ bị nhiễm PPFM [35]. Đây là nhóm vi khuẩn rất phong phú và không gây bệnh thực vật. PPFM chiếm tỷ lệ lớn và có mật độ từ 10 4 đến 107 đơn vị khuẩn lạc (cfu) trên mỗi gram trọng lƣợng tƣơi của mô thực vật [35]. Chúng lây nhiễm qua hạt [26], ở hạt đậu nành khô mật độ là 105 cfu/gram [35]. Tuy PPFM không tăng trƣởng nhanh nhƣ các vi khuẩn vùng lá khác trên môi trƣờng giàu dinh dƣỡng nhƣng chúng vẫn có khả năng cạnh tranh tạo khuẩn lạc trên lá. Một số tác giả cho rằng dinh dƣỡng methyl tuỳ ý ở PPFM là một phần lý do duy trì mối quan hệ giữa chúng với thực vật. Bằng cách sử dụng nguồn thức ăn khác thƣờng là methanol, PPFM có thể loại bỏ chất độc này khỏi mô thực vật 21 và có đƣợc chỗ cƣ ngụ trong lá (môi trƣờng chỉ thích hợp với một vài loài vi khuẩn) [44], [50]. Bên cạnh tính phổ biến và tồn tại lâu dài, còn nhiều bằng chứng cho thấy mặc dù PPFM thu nhận chất dinh dƣỡng từ cây chủ nhƣng không phải là mối quan hệ một chiều. Các vi khuẩn này sử dụng nguồn carbon và khoáng chất từ cây, đồng thời tham gia vào các quá trình sinh hoá và chuyển hoá quan trọng ở cây chủ. Methylobacterium sp. nổi bật vì nhiều đặc tính quan trọng nhƣ khả năng tổng hợp amino acid, PHB (Poly- -Hydrobutyrate); tổng hợp carotenoid, tăng cƣờng tạo hƣơng vị ở dâu tây; tăng khả năng nảy mầm của hạt; khả năng phân hủy các hợp chất 2,4,6-trinitrotoluene, nitramine…; khả năng phân hủy và chuyển hóa một số cơ chất không cần thiết ở thực vật thành sản phẩm có giá trị [35]. Chủng PPFM đầu tiên đƣợc Basile và cộng sự (1969) phát hiện kích thích sinh trƣởng ở cây địa tiền (Scapania nemorosa) trong điều kiện in vitro [9]. Kalyaeva và cộng sự (2000, 2003) phát hiện việc nhiễm vi khuẩn Methylovorus mays và Methylomonas methanica vào môi trƣờng nuôi cấy in vitro tạo mối liên kết bền vững giữa vi khuẩn và mô thực vật. Thuốc lá, cây lanh và khoai tây khi nhiễm khuẩn tăng trƣởng mạnh hơn (số chồi tăng, rễ phát triển mạnh) [39], [40]. Năm 1994, Holland và cộng sự công bố về khả năng tƣơng tác của vi khuẩn Methylobacterium sp. và cây đậu nành trong việc chuyển hoá nickel [35]. Cây lúa (Oryza sativa) cũng là một loại cây có mối quan hệ mật thiết với các vi khuẩn PPFM. Nhiều nhà nghiên cứu cũng đã chứng tỏ vi khuẩn Methylobacterium sp. có tác động tích cực lên sự sinh trƣởng và phát triển của cây lúa cả trong điều kiện in vitro lẫn in vivo. Maliti (2000) nghiên cứu, đánh giá ảnh hƣởng của một số chủng Methylobacterium sp. đối với sự tăng trƣởng và phát triển của cây lúa ở 3 mức độ: nuôi cấy mô, cây con trong điều kiện in vitro và cây trƣởng thành trong môi trƣờng nhà kính. Kết quả cho thấy: vi khuẩn Methylobacterium sp. có khả năng 22 làm gia tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt, tăng trọng lƣợng tƣơi, chiều cao cây mạ trong điều kiện in vitro [46]. Năm 2004, Madhaiyan và cộng sự cũng đã tiến hành các thí nghiệm gây nhiễm PPFM lên hạt lúa hay phun lên lá và kết quả cho thấy: vi khuẩn Methylobacterium sp. có hoạt tính kích thích tăng trƣởng, gia tăng khả năng đẻ nhánh của lúa góp phần gia tăng năng suất lúa từ 22,1 đến 24,1%. Ngoài ra, các vi khuẩn Methylobacterium sp. còn có vai trò ức chế các chủng vi khuẩn gây bệnh trên cây lúa, góp phần làm giảm tỷ lệ cây bệnh từ 17,8-23,7%. Công trình của Madhaiyan và cộng sự (2004) cũng đã chứng tỏ mối tƣơng quan giữa khả năng kháng bệnh của cây lúa khi xử lý với vi khuẩn Methylobactreium sp. và sự gia tăng polyphenol oxidase trong cây [47]. Qua các kết quả khảo sát về ảnh hƣởng của vi khuẩn Methylobactreium sp. lên sự hình thành mô sẹo ở cây thuốc lá và cây cúc cho thấy: vi khuẩn có ảnh hƣởng khác nhau lên quá trình hình thành mô sẹo ở các loại mô hay các loại cây nuôi cấy. Đối với Chrysanthenum sp. vi khuẩn hạn chế sự hình thành mô sẹo nhƣng kích thích sự hình thành phôi ở các mô sẹo này, trong khi đó ở Nicotiana tabacum vi khuẩn lại ức chế quá trình hình thành mô sẹo ở mô phiến lá và mô lóng thân. Nhƣ vậy, vi khuẩn Methylobacterium sp. có khả năng tác động lên quá trình biệt hóa cơ quan ở thực vật. Ngoài vai trò tác động của vi khuẩn thì bản chất của mô và loài thực vật cũng quyết định đến khả năng và chiều hƣớng phát sinh cơ quan của nuôi cấy invitro. Bên cạnh đó các kết quả thí nghiệm còn cho thấy rằng vi khuẩn Methylobacterium sp. còn có khả năng tăng cƣờng quá trình hình thành rễ ở P. fortunei và Chrysanthemum sp., so với đối chứng ở nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn mẫu cấy thành lập rễ sớm hơn, nhiều hơn [9]. Ngoài PPFM, còn có những nghiên cứu sử dụng các loài vi khuẩn có lợi khác nhƣ khảo sát sự tăng trƣởng và phát triển của cây hoa Cúc, cây hoa Bi Bi và cây Địa Lan có sự hiện diện của Bacillus spp. trong nuôi cấy in vitro [5] cho kết quả: tuỳ theo từng loại cây mà Bacillus spp. có tác dụng khác nhau nhƣ tăng chiều cao, số lƣợng rễ, trọng lƣợng tƣơi. Vi khuẩn Methanotropic có ảnh hƣởng đến sự 23 hình thành callus của hạt lúa mì, gia tăng sự tạo rễ, đồng thời gia tăng sự tái sinh cây [40]. Với sự hiện diện của vi khuẩn Methylovorus mays trên môi trƣờng nuôi cấy làm tăng khả năng tái sinh chồi của cây thuốc lá chuyển gen ipt [39]. Từ những kết quả này chứng tỏ giữa thực vật và vi sinh vật có mối quan hệ tƣơng hỗ có lợi tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển và tăng trƣởng của thực vật trong điều kiện in vitro và in vivo. 2.5.4.2 Sinh tổng hợp auxin và cytokinin Không chỉ có thực vật mà vi sinh vật cũng có thể tổng hợp auxin và cytokinin, đối với các vi khuẩn có lợi và vi khuẩn tƣơng tác với thực vật thì đây có thể là nguyên nhân kích thích cây phát triển. Omer và cộng sự (2004) đã khảo sát sự hiện diện của IAA trong môi trƣờng chứa dịch nổi của PPFM bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp kết hợp với phân tích phổ NMR (Nuclear Mangnetic Radiation: cộng hƣởng từ hạt nhân) đã chứng tỏ vi khuẩn PPFM có khả năng tổng hợp hormone thực vật là IAA [50]. Holland và cộng sự (1994) kiểm tra mối quan hệ giữa PPFM, cytokinin và sự phát triển của thực vật đã cho thấy PPFM có ảnh hƣởng đến lƣợng cytokinin có trong mô tế bào thực vật [35]. 24 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu