Đề tài Khảo sát sự thủy phân protein từ đậu nành dưới tác dụng enzyme protease của nấm mốc aspergillus oryzae

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG LÊ MINH SƠN KHẢO SÁT SỰ THỦY PHÂN PROTEIN TỪ ĐẬU NÀNH DƯỚI TÁC DỤNG ENZYME PROTEASE CỦA NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Cần Thơ, 2009 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Tên đề tài: KHẢO SÁT SỰ THỦY PHÂN PROTEIN TỪ ĐẬU NÀNH DƯỚI TÁC DỤNG ENZYME PROTEASE CỦA NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. Võ Tấn Thành Lê Minh Sơn MSSV: 2051673 Lớp: CNTP K31 Cần Thơ, 2009 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang ii Luận văn đính kèm theo đây, với đề tài “Khảo sát sự thủy phân protein từ đậu nành dưới tác dụng enzyme protease của nấm mốc Aspergillus oryzae” do sinh viên Lê Minh Sơn thực hiện và báo cáo đã được hội đồng chấm luận văn thông qua. Giáo viên hướng dẫn Cần Thơ, ngày ….. tháng ….. năm 2009. Chủ tịch hội đồng TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang iii LỜI CẢM TẠ Trong suốt thời gian học tập tại Trường Đại Học Cần Thơ, dưới sự chỉ dạy tận tình của các thầy cô, em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn của mình đến các Thầy cô Trường Đại Học Cần Thơ, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm. Và em sẽ luôn ghi nhớ những tình cảm cao quý đó trong hiện tại cũng như sau khi ra trường. Em xin trân trọng cảm ơn Thầy Võ Tấn Thành – giáo viên trực tiếp hướng dẫn em thực hiện đề tài. Mặc dù bận rộn với công việc giảng dạy nhưng thầy luôn quan tâm, theo dõi và giúp đỡ em tận tình về kiến thức, phương pháp học tập, nghiên cứu,… Thầy đã tạo điều kiện tốt nhất để em có thể hoàn thành tốt luận văn này. Em xin chân thành cảm ơn Giám Đốc Công ty TNHH Phong Dinh, các anh chị phòng kỹ thuật, phòng kinh doanh, tổ cơ điện và anh chị em công nhân trong công ty đã giúp đỡ, chỉ dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt luận văn này. Em xin cảm ơn thầy Lý Nguyễn Bình, trưởng Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng đồng thời là cố vấn học tập của lớp Công Nghệ Thực Phẩm K31, đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho em thực hiện luận văn và hoàn thành quá trình nghiên cứu của mình. Em xin chân thành biết ơn tập thể cán bộ phòng thí nghiệm của Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm cùng tất cả các bạn sinh viên lớp Công Nghệ Thực Phẩm K31 đã nhiệt tình đóng góp ý kiến và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian vừa qua. Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn đến tất cả các quý thầy cô và các bạn. Kính chúc quý thầy cô và các bạn luôn thành công trong công việc cũng như trong cuộc sống. Cần Thơ, ngày tháng năm 2009 Sinh viên thực hiện Lê Minh Sơn Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang iv TÓM TẮT Nhằm mục đích cải tiến quy trình sản xuất nước tương lên men truyền thống bằng phương pháp kiểm soát trực tuyến thời gian ủ mốc, nhiệt độ lên men và sử dụng mấm mốc Aspergillus oryzae thuần chủng trong quá trình ủ mốc, để sản xuất nước tương lên men có giá trị dinh dưỡng và chất lượng cao, không chứa độc tố aflatoxin và rút ngắn thời gian sản xuất, đề tài “Khảo sát sự thủy phân protein từ đậu nành dưới tác dụng enzyme protease của nấm mốc Aspergillus oryzae” được tiến hành. Phần nghiên cứu thí nghiệm được tiến hành với các nội dung: - Sử dụng kỹ thuật xử lý ảnh (Image Processing) để thể hiện hoạt lực enzyme protease theo màu sắc của nấm mốc. Sử dụng hệ màu ”RGB” (red, green, blue) để khảo sát hoạt tính nấm mốc theo màu sắc trong thời gian ủ. - Ảnh hưởng của cơ chất (bột mì) đến sự phát triển và sản sinh enzyme protease của nấm mốc Aspergillus oryzae trong quá trình ủ mốc. - Ảnh hưởng của nồng độ muối và tỉ lệ phối trộn bột mì (trong quá trình ủ mốc) đến quá trình thủy phân protein của đậu nành trong quá trình lên men. Nghiên cứu thu được một số kết quả như sau: - Có thể Sử dụng kỹ thuật xử lý ảnh (Image Processing) để theo dõi hoạt lực enzyme protease trong quá trình ủ mốc. Có thể sử dụng hệ màu “RGB” (red, green, blue) hoặc “Lab” để biết được khoảng thời gian chính xác nấm mốc sinh ra nhiều enzyme nhất để kết thúc quá trình ủ nhằm rút ngắn thời gian sản xuất. - Bổ sung thêm 5% bột mì vào môi trường ủ mốc, giúp nấm mốc phát triển tốt và sản sinh ra nhiều enzyme protease thủy phân protein. - Bổ sung thêm 5% bột mì trong quá trình ủ, kết hợp với nồng độ muối 15% trong môi trường lên men đạt hiệu suất thủy phân cao nhất. - Lên men trong tủ ủ ở nhiệt độ 500C giúp làm giảm lượng đạm amoniac sinh ra. Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang v MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ ................................................................................................................... iii TÓM TẮT..........................................................................................................................iv MỤC LỤC...........................................................................................................................v DANH SÁCH HÌNH........................................................................................................vii DANH SÁCH BẢNG ..................................................................................................... viii Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ .............................................................................................1 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ. ....................................................................................................1 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ..............................................................................1 Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU..........................................................................2 2.1 MỘT SỐ QUY TRÌNH SẢN XUẤT TRONG NƯỚC....................................2 2.1.1 Qui trình sản xuất nước tương hoá giải.......................................................2 2.1.2 Qui trình sản xuất nước tương lên men .......................................................3 2.2 NGUYÊN LIỆU .................................................................................................4 2.2.1 Đậu nành......................................................................................................4 2.2.2 Lúa mì ..........................................................................................................6 2.2.3 Muối ăn ........................................................................................................7 2.2.4 Aspergillus oryzae........................................................................................8 2.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT .............9 2.3.1 Ngâm đậu .....................................................................................................9 2.3.2 Hấp đậu........................................................................................................9 2.3.3 Độ ẩm trong quá trình nuôi mốc..................................................................9 2.3.4 Nhiệt độ trong quá trình nuôi mốc...............................................................9 2.3.5 Lên men trong nước muối ..........................................................................10 2.3.6 Nhiệt độ và khuấy đảo trong quá trình lên men.........................................10 2.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ NGOÀI NƯỚC LIÊN QUAN ĐẾN SẢN XUẤT NƯỚC TƯƠNG................................................................11 Chương 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................13 3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU....................................................................13 3.1.1 Địa điểm và thời gian.................................................................................13 3.1.2 Nguyên liệu ................................................................................................13 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang vi 3.1.3 Thiết bị và dụng cụ.....................................................................................13 3.1.4 Hóa chất.....................................................................................................13 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................................14 3.2.1 Qui trình thí nghiệm sản xuất nước chấm lên men từ đậu nành................16 3.2.2 Các chỉ tiêu cần phân tích .........................................................................17 3.2.3 Phân tích số liệu.........................................................................................17 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................18 4.1 Thí nghiệm 1: Sự thay đổi giá trị màu sắc(red, green, blue) trong quá trình ủ nấm mốc ....................................................................................................................18 4.2 Thí nghiệm 2: Sự ảnh hưởng của tỉ lệ phối trộn bột mì trong quá trình ủ và nồng độ muối trong quá trình thủy phân đến hàm lượng đạm amin sinh ra ........20 Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ......................................................................29 5.1 Kết luận.............................................................................................................29 5.2 Đề nghị ..............................................................................................................29 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...............................................................................................30 PHỤC LỤC 1 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH .....................................................x PHỤ LỤC 2 SỐ LIỆU VÀ KẾT QUẢ THỐNG KÊ...................................................xiv Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang vii DANH SÁCH HÌNH Hình 1. Phương pháp sản xuất nước tương theo công nghệ acid (Trần Bích Lam, 2007)..2 Hình 2. Qui trình sản xuất nước tương và tương Tàu .........................................................3 Hình 3: Aspergillus oryzae...................................................................................................8 Hình 4: Qui trình thí nghiệm sản xuất nước chấm lên men từ đậu nành ...........................16 Hình 5: Đồ thị thể hiện sự thay đổi màu sắc trong quá trình ủ mốc theo thời gian ủ với hàm lượng bột mì bổ sung 0% ..........................................................................................18 Hình 6: Đồ thị thể hiện sự thay đổi màu sắc trong quá trình ủ mốc theo thời gian ủ với hàm lượng bột mì bổ sung 5% ..........................................................................................19 Hình 7: Đồ thị thể hiện sự thay đổi màu sắc trong quá trình ủ mốc theo thời gian ủ với hàm lượng bột mì bổ sung 10% .........................................................................................19 Hình 8: Sự thay đổi hàm lượng đạm amin ở các mẫu cùng hàm lượng bột mì 0% và khác nhau về hàm lượng muối theo thời gian lên men...............................................................22 Hình 9: Đồ thị thể hiện tương tác của hàm lượng muối và thời gian lên men đến hàm lượng đạm amin sinh ra ở hàm lượng bột mì bổ sung là 0% .............................................22 Hình 10: Sự thay đổi hàm lượng đạm amin ở các mẫu cùng hàm lượng bột mì 5% và khác nhau về hàm lượng muối theo thời gian lên men ......................................................23 Hình 11: Đồ thị thể hiện tương tác của hàm lượng muối và thời gian lên men đến hàm lượng đạm amin sinh ra ở hàm lượng bột mì bổ sung là 5% .............................................24 Hình 12: Sự thay đổi hàm lượng đạm amin ở các mẫu cùng hàm lượng bột mì 10% và khác nhau về hàm lượng muối theo thời gian lên men ......................................................25 Hình 13: Đồ thị thể hiện tương tác của hàm lượng muối và thời gian lên men đến hàm lượng đạm amin sinh ra ở hàm lượng bột mì bổ sung là 10% ...........................................25 Hình 14: Đồ thị so sánh hàm lượng đạm amin sinh ra theo thời gian lên men giữa các mẫu tốt nhất ở 0%, 5% và 10% bột mì bổ sung.........................................................................26 Hình 15: Sự thay đổi hàm lượng ammoniac theo hàm lượng bột mì bổ sung ...................28 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang viii DANH SÁCH BẢNG Bảng 1. Thành phần hoá học chính của đậu nành (% căn bản khô) ....................................5 Bảng 2. Thành phần acid amin tối cần thiết của đậu nành và thành phần acid amin chất lượng chuẩn của FAO (g/16g protein) .................................................................................5 Bảng 3. Thành phần hoá học của bột lúa mì........................................................................7 Bảng 4: Thể hiện sự tương tác giữa hai nhân tố nồng độ muối (A)và tỉ lệ bột mì (B)......15 Bảng 5: Hàm lượng đạm amin ( gN/l) theo thời gian (ngày)............................................21 Bảng 6: Hàm lượng đạm amoniac ( gN/l) theo thời gian (ngày) ......................................27 Bảng 7: Sự thay đổi màu sắc của nấm mốc và đậu nành trong quá trình ủ ở những hàm lượng bột mì bổ sung khác nhau theo thời gian ủ .............................................................xiv Bảng 8: Kiểm định LSD 95% hàm lượng đạm amin ở 0% bột mì theo nồng độ muối ...xx Bảng 9 : kết quả thống kê thể hiện sự tương tác giữa nồng độ muối và thời gian ảnh hưởng đến đạm amin..........................................................................................................xx Bảng 10: Kiểm định LSD 95% hàm lượng đạm amin ở 5% bột mì theo nồng độ muối .xxi Bảng 11 : kết quả thống kê thể hiện sự tương tác giữa nồng độ muối và thời gian ảnh hưởng đến đạm amin.........................................................................................................xxi Bảng 12: Kiểm định LSD 95% hàm lượng đạm amin ở 10 % bột mì theo nồng độ muối ..........................................................................................................................................xxii Bảng 13: kết quả thống kê thể hiện sự tương tác giữa nồng độ muối và thời gian ảnh hưởng đến đạm amin........................................................................................................xxii Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 1 CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ. Thực phẩm lên men truyền thống là loại thực phẩm được sản xuất thủ công, mang bản sắc riêng của từng dân tộc. Công nghệ sản xuất các sản phẩm truyền thống được thực hiện từ rất lâu và được truyền từ đời này sang đời khác. Tương và nước tương là sản phẩm tiêu biểu của các sản phẩm lên men truyền thống được chế biến từ đậu nành. Đặc biệt là nước tương, một loại nước chấm thường được sử dụng trong bữa ăn của người Việt Nam. Nước tương không chỉ có tác dụng giúp hương vị món ăn thêm đậm đà mà còn thể hiện một nét riêng, đặc trưng của ẩm thực Việt Nam. Thế nhưng, tình hình sản xuất nước tương ở nước ta hiện nay còn khó kiểm soát chất lượng. Đa số các cơ sở sản xuất tương đều sản xuất theo phương pháp cổ truyền hoặc phương pháp hoá giải. Sản xuất theo phương pháp cổ truyền thì phụ thuộc rất lớn vào thiên nhiên nên thời gian lên men kéo dài, năng suất thấp, chất lượng tương không ổn định, thay đổi theo thời tiết và vùng sản xuất, sản phẩm tương không đồng nhất và dễ bị hư hỏng do nhiễm các tạp khuẩn gây thối,… Đôi lúc nhiễm cả nấm mốc Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin tồn tại trong sản phẩm gây ung thư (Nguyễn Đức Lượng, 2003). Ngược lại, nếu sản xuất theo phương pháp hoá giải thì chi phí sản xuất cao, thiết bị ăn mòn sinh ra các chất phụ độc hại và chứa hàm lượng cao chất 3-MCPD, 1.3-DCP, …là các chất gây ung thư. Hiện nay, vài quy trình chế biến nước tương sạch đã được nghiên cứu và công bố (Viện Sinh học nhiệt đới, Tp. Hồ Chí Minh, 2007) với hàm lượng 3-MCPD có thể chấp nhận trong sản phẩm. Thế nhưng, các quy trình đó cũng chỉ khảo sát tiến trình và các điều kiện tối ưu để sản xuất trong qui mô nhỏ, chưa có nghiên cứu kiểm soát tiến trình triệt để ở qui mô thí điểm để có thể phát triển thành sản xuất lớn. Vì vậy, cần phải có nghiên cứu để đưa ra một quy trình sản xuất nước tương có kiểm soát tiến trình để áp dụng vào sản xuất lớn. 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Nghiên cứu môi trường thích hợp để nuôi cấy mốc Aspergillus oryzae và thời gian để mốc sản sinh nhiều enzyme protease (có quan sát tiến trình). Sử dụng mốc Aspergillus oryzae thuần chủng có hoạt tính cao để thủy phân protein từ đậu nành đạt hiệu quả cao, đồng thời rút ngắn thời gian ủ mốc và thời gian lên men. Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 2 CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 MỘT SỐ QUY TRÌNH SẢN XUẤT TRONG NƯỚC Ở nước ta nước tương thông thường được sản xuất theo hai phương pháp chính là phương pháp hóa giải và phương pháp lên men truyền thống . 2.1.1 Qui trình sản xuất nước tương hoá giải Trước đây, các sản phẩm nước tương trên thị trường Việt Nam chủ yếu được sản xuất theo phương pháp thuỷ phân bằng acid HCl đậm đặc tạo ra sản phẩm phụ độc hại là 3-MCPD, nước tương sản xuất bằng qui trình này có mùi vị rất ngọt, thơm, hậu ngọt hơi chua và phù hợp với hương vị người tiêu dùng, thường được gọi với tên khác là “tàu vị yểu”. Qui trình công nghệ theo sơ đồ sau: Hình 1. Phương pháp sản xuất nước tương theo công nghệ acid (Trần Bích Lam, 2007) Phương pháp này có ưu điểm là rẻ, nhanh, hiệu suất thủy phân cao từ 85 ÷ 90%, sản phẩm giàu acid amin và dễ bảo quản. Nhược điểm chính của phương pháp acid là chi phí năng lượng và thiết bị cao do phải đáp ứng điều kiện phản ứng nhiệt độ cao và ăn mòn mạnh, chi phí xử lý sau sản xuất cao, các chất thiết yếu bị phân hủy Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 3 một phần hay hoàn toàn, sinh ra nhiều hợp chất phụ độc hại, đặc biệt là 3-MCPD và các chất đồng đẳng của chúng,…(Trần Bích Lam, 2007). 2.1.2 Qui trình sản xuất nước tương lên men 2.1.2.1 Qui trình sản xuất nước tương truyền thống Tương và nước tương là hai sản phẩm lên men với nguyên liệu chính là đậu nành. Qui trình sản xuất tương và nước tương thường giống nhau, nhưng trong qui trình sản xuất nước tương sẽ thêm một công đoạn ép lấy nước tương và loại bỏ bã. Trong qui trình sản xuất tương sẽ không áp dụng công đoạn ép, lọc. Ở Việt Nam có hai loại tương: tương Tàu và tương Ta được sản xuất theo hai qui trình có một vài điểm khác biệt, trong đó người ta dùng bột gạo hoặc bột mì để làm cơ chất giúp vi sinh vật phát triển. Đậu nành (5 kg) Bột gạo (1 kg) Vo đãi, ngâm nước qua đêm Rang Đãi sạch, hấp mềm nhừ Rây mịn Trộn đều Ủ với lá nhãn, đậy kín Sau 72 ÷ 76 giờ hạt đậu bóp ra màu nâu và cứng 1 kg muối đun sôi trong 10 lít nước, để nguội Cho vào lu hay bể chứa Ban ngày phơi nắng, đêm đậy kín Đảo khuấy ngày/lần trong 1 tháng Ép Nước tương Đem lu vào nhà, bảo quản nơi khô mát Lọc, vào chai Tương thành phẩm Thành phẩm Hình 2. Qui trình sản xuất nước tương và tương Tàu (Trần Phước Đường, 2004) Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 4 Các qui trình sản xuất thủ công thường không ổn định do việc sử dụng nguồn nấm mốc có trong tự nhiên. Bên cạnh sản lượng thành phẩm không ổn định do không thể khống chế được số lượng bào tử và lượng enzyme sinh ra không đủ hoạt lực,… Ngoài ra việc sử dụng nguồn nấm mốc có trong tự nhiên còn có khả năng nhiễm các loại nấm mốc khác như Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus sinh độc tố aflatoxin tồn tại trong sản phẩm là nguyên nhân gây bệnh ung thư (Võ Thị Hạnh et al., 2007; Nguyễn Đức Lượng, 2003). Ở nước ngoài (Nhật), bằng việc sử dụng nguồn vi sinh vật thuần và hệ thống trang thế bị kỉ thuật tiên tiến theo qui trình công nghệ mới giúp kiểm soát được tiến trình, tạo ra sản phẩm có chất lượng cao và luôn ổn định. Dựa trên sự khác biệt về thành phần nguyên liệu, điều kiện lên men hay thời gian ủ chín mà nước tương lên men được chia làm 5 loại: Koikuchi, Usukuchi, Tamari, Shiro và Saishikomi (Hesseltine and Wang, 1986). 2.2 NGUYÊN LIỆU 2.2.1 Đậu nành Đậu nành có tên khoa học là Glycine max (L.) Merrill, có nguồn gốc Á Đông, du nhập sang phương Tây vào thế kỷ 20 (Endres, 2001 ; Liu, 2004). Đậu nành có nhiều màu sắc khác nhau, trong đó đậu nành màu vàng là loại tốt nhất nên được trồng và sử dụng nhiều (Ngạc Văn Giậu, 1983; Nguyễn Đức Lượng, 2002, 2003; Nguyễn Thị Hiền, 2004). Đậu nành xuất xứ từ vùng đông bắc Trung Quốc vào khoảng 2200 năm Trước Công nguyên. Hàm lượng protein trong đậu nành rất cao (35 ÷ 45%) là một nguồn protein rất quan trọng đối với con người. Năm 2002, bốn nước sản xuất đậu nành hàng đầu thế giới là Hoa Kỳ (chiếm 39% sản lượng trên thế giới), Brazil (26%), Argentina (18%) và Trung Quốc (8%) (Trần Phước Đường, 2004). Hạt đậu nành gồm 3 bộ phận: Vỏ chiếm 8% trọng lượng hạt; phôi chiếm 2%; tử diệp chiếm 90% (Nguyễn Đức Lượng, 2003; Nguyễn Thị Hiền, 2004). Hạt đậu nành chứa nhiều protein, lipid, carbohydrate, nhiều loại khoáng chất trong đó đáng chú ý là calci, phosphor, mangan, kẽm và sắt. Ngoài ra, hạt đậu nành chứa nhiều loại vitamin, trừ vitamin C và D (Trần Minh Tâm, 2000; Nguyễn Đức Lượng, 2003; Nguyễn Thị Hiền, 2004; Trần Phước Đường, 2004). Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 5 Bảng 1. Thành phần hoá học chính của đậu nành (% căn bản khô) Thành phần Tỷ lệ Protein % Dầu % Tro % Carbohydrate % Hạt đậu nành nguyên 100,0 40,0 21,0 4,9 34,0 Tử diệp 90,3 43,0 23,0 5,0 29,0 Vỏ hạt 8,0 8,8 1,0 4,3 86,0 Phôi 2,4 41,1 11,0 4,4 43,0 (Nguyễn Thị Hiền, 2004) Bảng 2. Thành phần acid amin tối cần thiết của đậu nành và thành phần acid amin chất lượng chuẩn của FAO (g/16g protein) Acid amin Đậu nành Tiêu chuẩn FAO Isoleucine 5,1 6,4 Leucine 7,7 4,8 Lysine 5,9 4,2 Methionin 1,6 2,2 Cystein 1,3 4,2 Phenylalanine 5,0 2,8 Treonin 4,3 2,8 Tryptophan 1,3 1,4 Valine 5,4 4,2 ( Nguyễn Thị Hiền, 2004) Ngoài ra, trong đậu nành còn có các thành phần vi lượng khác có lợi cho sức khỏe như isoflavon, saponin đồng thời cũng có những chất gây hại nếu không xử lý nguyên liệu đúng cách như phytale, chất ức chế trypsin, lecthin. Flavonoid được tìm thấy trong một số loại thực vật và mô động vật, nhưng isoflavon chỉ có ở một vài loại thực vật. 2.2.1.1 Isoflavon Isoflavon ở hạt đầu nành có hàm lượng cao nhất, chiếm 0,1 ÷ 0,4% trọng lượng chất khô. Đã có rất nhiều bài báo cáo khoa học nói về những ảnh hưởng đến có lợi của isoflavon đối với sức khỏe con người trong việc ngăn ngừa và điều trị bệnh tim mạch, ung thư, loãng xương, hội chứng tiền kinh nguyệt và tiền mãn kinh. 2.2.1.2 Sapoin Sapoin là chất hoạt động bề mặt, chiếm 0,17 ÷ 6,16% trong hạt đầu nành. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy saponin làm giảm hàm lượng cholesterol trong máu do nó liên kết với cholesterol sau đó theo đường ruột và bài tiết ra ngoài. Ngoài ra, nó còn làm giảm nguy cơ ung thư và bệnh tim bằng cách liên kết với acid mật, loại bỏ Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 6 cholesterol do đó giảm nguy cơ ung thư ruột hay liên kết với tế bào ung thư và như thế ức chế được sự phát triển của tế bào ung thư (Liu, 2004). 2.2.1.3 Phytate Phytate là muối của inositol hexaphosphoric acid (hay acid phytic) với Ca, Mg, K. Phytate là nguồn cung cấp phosphor chủ yếu của đậu nành, chiếm 1,0 ÷ 1,47% trọng lượng chất khô và đại diện cho 51,4 ÷ 57,1% phosphor của hạt. Phytate ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của khoáng chất và tính tan của protein khi hiện diện trong thực phẩm hay thức ăn chăn nuôi. 2.2.1.4 Chất ức chế Chất ức chế trypsin, do gắn vào cấu trúc của enzyme (trypsin hay chymotrypsin) và làm mất hoạt tính enzyme. Một số nghiên cứu cho thấy chất ức chế trypsin làm phình to tuyến tụy và làm ảnh hưởng đến khả năng tiết dịch tụy để tiêu hóa thức ăn. 75 ÷ 95% chất này bị phá hủy bởi nhiệt. 2.2.1.5 Lectin Lectin hay còn gọi là hemaglutinin, là một loại protein. Nghiên cứu trên động vật lectin liên kết với mô tế bào làm phình to tuyến tụy, giảm insulin trong máu, ức chế enzyme disaccharidase và proteinase trong ruột, làm suy gan và thận, ảnh hưởng sự hấp thu sắt và chất béo. Giống như chất ức chế trypsin, lectin cũng bị phá hũy bởi xử lý nhiệt nhưng xử lý nhiệt ướt hiệu quả hơn xử lý nhiệt khô. 2.2.2 Lúa mì Lúa mì có thành phần chủ yếu là glucid, protein và nước. Theo Ngạc Văn Giậu (1983), protein có 4 loại: albumin, globulin, prolamin và glutelin. Trong đó chủ yếu là glutelin và prolamin, chiếm khoảng 75% hàm lượng protein. Trong tinh bột của lúa mì có một lượng nhỏ glucose (0,1 ÷ 0,37%) và các loại đường khác (1 ÷ 3,7%). Các loại đường này có tầm quan trọng đặc biệt đối với quá trình lên men. Ngoài ra, trong lúa mì còn có một số enzyme như amylase, proteinase (protease), lipase, men oxy hoá - khử và một số vitamin như B1, B2, PP và một lượng nhỏ A và E (Ngạc Văn Giậu, 1983; Nguyễn Đức Lượng, 2003; Nguyễn Đức Lượng, 2006). Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 7 Bảng 3. Thành phần hoá học của bột lúa mì Thành phần Hàm lượng Nước 11,61 % Glucid 73,80 % Protein 12,48 % Lipid 01,78 % Vitamin B1 0,48 mg (%) PP 76 mg (%) Ca 36 mg (%) (Nguồn: Ngạc Văn Giậu, 1983; Nguyễn Đức Lượng, 2006) 2.2.3 Muối ăn Muối ăn hay còn gọi Natri Clorua có công thức hóa học là NaCl. Thông thường thành phần của muối ăn chủ yếu là NaCl và ít nhiều đều có chứa tạp chất. Những tạp chất không có hoạt tính hóa học như sỏi, cát, và những tạp chất có hoạt tính hóa học như hợp chất chlor, sulfate của ion Ca2+, Mg2+, Fe2+, Fe3+ (Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phụng, 1990). Phân tử muối ăn gồm ion Na+ và ion Cl- liên kết với nhau. Khi hòa tan muối ăn vào nước các phân tử dung môi bao quanh các ion gọi là sự hydrat hóa (hay solvate hóa), khi lực liên kết giữa các phân tử dung môi và ion lớn hơn lực hút giữa 2 ion của muối thì mạng tinh thể sẽ bị phá vỡ thành ion Cl- và Na+. Vì vậy, khi hòa tan muối hay bất kỳ một chất tan vào nước sẽ làm giảm hoạt độ của nước. Hoạt độ của nước được miêu tả là lượng nước dùng để hydrat hóa chất tan, ký hiệu aw. aw = Xw* γw = P/P0 Trong đó: X: là phân tử mol của nước γw: là hằng số hoạt động của nước P: là áp suất hơi nước riêng phần của thực phẩm P0: là áp suất hơi nước riêng phần của nước ở cùng điều kiện. Nước tinh khiết có aw = 1. Mỗi vi sinh vật có một giá trị aw giới hạn, dưới giá trị này vi sinh vật không thể sống, tạo bào tử và sản sinh độc tố. Phần lớn vi sinh vật phát triển tốt aw = 0,91 ÷ 0,99. Nồng độ nước muối từ 4,4% trỡ lên có thể làm ngưng sự phát triển của các loại vi khuẩn gây bệnh và nói chung nồng độ nước Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 8 muối đạt 10% thì có thể kiềm chế được sự phát triển của những vi khuẩn thông thường (Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phụng, 1990). 2.2.4 Aspergillus oryzae Aspergillus oryzae là nấm mốc sinh bào tử đính màu vàng hoa cau, thuộc giống Aspergillus, họ Aspergillaceae, trong bộ Plectascales (Bộ Cúc khuẩn). Họ nấm mốc Aspergillaceae có thể có tới hơn 200 loài. Aspergillus sinh khuẩn ty có vách ngăn, sinh đính bào tử trên tế bào hình chai. Một số loài trong họ Aspergillaceae có nhiều ứng dụng trong thực tế sản xuất, chế biến thực phẩm như A. oryzae… Chúng sinh ra nhiều enzyme: amylase, protease, pectinase và được ứng dụng nhiều trong công nghiệp sản xuất thực phẩm lên men như sản xuất rượu, tương, nước tương… (Lương Đức Phẩm, 2001). Hình 3: Aspergillus oryzae A. oryzae sinh sản chủ yếu bằng đính bào tử, rất ít khi sinh sản bằng bào tử nang. Cơ sở phân loại giống Aspergillus là ở đặc điểm cấu tạo, màu sắc của cuống đính bào tử (Lê Xuân Phương, 2001; Nguyễn Văn Bá et al., 2005). Trước đây, khi sử dụng nấm mốc tự nhiên trong qui trình sản xuất tương và nước tương truyền thống thường gặp phải 2 vấn đề chính: - Sản lượng và chất lượng sản phẩm không ổn định, hiệu suất thấp. - Nấm mốc sinh độc tố không mong muốn gây hại cho sức khoẻ người sử dụng. Trong giống Aspergillus có một số loài có khả năng sinh độc tố aflatoxin gây độc cho người sử dụng như A. flavus, A. niger… Bằng việc nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng nấm mốc thuần A. oryzae, qui trình sản xuất và nước tương cải tiến đã khắc phục một phần 2 vấn đề trên (Nguyễn Đức Lượng, 2003). Nấm mốc Aspergillus oryzae là loại vi sinh vật hiếu khí, phát triển tốt nhất ở pH 5,4 ÷ 6,5; nhiệt độ 27 ÷ 30ºC và độ ẩm 45 ÷ 55% (Nguyễn Thị Hiền, 2004). Khi cung cấp không khí bị giới hạn hoặc hàm lượng nước của môi trường dưới 30% sự phát triển sẽ chậm lại. Khi nhiệt độ dưới 28ºC, sự phát triển cũng trở nên chậm nhưng hoạt tính của enzyme vẫn duy trì ở mức cao (Liu, 2004). Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 9 A. oryzae có khả năng sản xuất nhiều loại enzyme cắt các đại phân tử: như amylase, pectinase, phosphatase, protease, peptidase, glutaminase và lipase, trong đó amylase có hoạt lực rất cao (Lê Xuân Phương, 2001). Các enzyme này biến đổi các polymer không hoà tan trong nước thành những chất hoà tan trong nước, có trọng lượng phân tử nhỏ và có giá trị sinh học cao. Đồng thời, các sản phẩm chuyển hoá hoá sinh tạo ra hàng trăm thành phần tạo mùi như aldehyde, amoniac, alcohol, hợp chất chứa sulfur, lactone,... làm cho sản phẩm có mùi tự nhiên (Lê Xuân Phương, 2001). 2.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT 2.3.1 Ngâm đậu Nhằm tạo độ ẩm thích hợp cho vi sinh vật và các phản ứng sinh hóa hoạt động. Đồng thời tạo điều kiện cho quá trình nấu nhanh hơn, tiết kiệm nhiên liệu.Trong quá trình ngâm chất khô sẽ hòa tan ra ngoài môi trường nước ngâm dẫn đến hàm lượng chất khô và một số chất khoáng bị mất. Các yếu tố có thể ảnh hưởng đến quá trình ngâm: thời gian ngâm, nhiệt độ ngâm, lượng nước ngâm (Nguyễn Thị Hiền, 2004 và Ngạc Văn Dậu, 1983). 2.3.2 Hấp đậu Nhiệt độ cao sẽ làm protein biến tính, tạo điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển và sinh sản ra enzyme, để thủy phân protein đạt hiệu quả cao. Mặt khác các vi sinh vật có hại sẽ bị tiêu diệt trong quá trình hấp tạo điệu kiện tối ưu cho nấm mốc phát triển sau này. Vị đắng của đậu bị biến mất và các chất có hại trong đậu nành như chất ức chế trypsin, hợp chất phytate sẽ bị phá hủy (Steinkraus, 2004). 2.3.3 Độ ẩm trong quá trình nuôi mốc Độ ẩm thấp sẽ khuếch tán chậm chất dinh dưỡng và chất chuyển hóa, độ ẩm cao dẫn đến sự liên kết cơ chất làm giảm bề mặt phân chia rắn khí. Do đó điều chỉnh độ ẩm vừa đủ, hoạt độ nước thích hợp là cần thiết trong quá trình lên men bề mặt. Theo phương pháp truyền thống thì độ ẩm trong quá trình nuôi mốc được chỉnh bằng kinh nghiệm. Theo Wood, (1994) và Hesseltine, (1983) thì độ ẩm thích hợp nhất cho quá trình nuôi mốc là 40 ÷ 45%. 2.3.4 Nhiệt độ trong quá trình nuôi mốc Giai đoạn đầu cần có nhiệt độ cao 30 ÷ 350C để bào tủ nấm mốc nẩy mầm và thích hợp cho khuẩn ty phát triển đồng thời ngăn cản sự nhiễm Bacillus sp. (Liu, 2004). Trong quá trình nuôi mốc cần chú ý đến việc làm nguội khối nguyên liệu. Do sau 20 ÷ 25 giờ ủ, nấm mốc phát triển và hô hấp mạnh làm nhiệt độ khối ủ tăng cao, Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 10 nhiệt độ có thể lên đến 400C sẽ làm giảm sản lượng enzyme hoặc có thể làm nấm mốc không phát triển được thậm chí có thể tiêu diệt nấm mốc. Vì vậy, cần thông khí hoặc khuấy trộn để hạ nhiệt độ (Steinkraus, 2004; Liu, 2004). Trong giai đoạn sau, trước khi hình thành bào tử, hạ nhiệt độ thấp xuống còn 20 ÷ 250C để kích thích khuẩn ty sản sinh enzyme tối đa (Liu, 2004). 2.3.5 Lên men trong nước muối Đây là quá trình chuyển hóa chính trong điều kiện có muối, nhằm ngăn cản sự cạnh tranh của các tạp khuẩn trong môi trường giàu đạm và đường khử, đồng thời tiếp tục chuyển hóa tinh bột, protein thành các loại đường, acid amin, các acid hữu cơ, rượu, aldehyde, ester, cuối cùng cho nước tương có hương vị đặc trương. 2.3.6 Nhiệt độ và khuấy đảo trong quá trình lên men Nhiệt độ là nhân tố quan trọng trong quá trình thủy phân. Thông thường, nhiệt độ tăng tốc độ phản ứng thủy phân tuy nhiên nhiệt độ quá cao tốc độ phản ứng thủy phân bị giảm do enzyme bị biến tính (dưới tác dụng nhiệt độ). Mỗi loại enzyme có một nhiệt độ tối ưu ở nhiệt độ này thì enzyme đó sẽ cho tốc độ phản ứng cực đại (Dương Thị Hương Giang, 2006). Nhiệt độ thích hợp còn giúp cho sự phát triển và chuyển hóa của vi sinh vật tối ưu, làm tăng nhanh tốc độ khuếch tán vật chất từ đậu nành ra môi trường thủy phân. Nhiệt độ lên men còn phụ thuộc vào độ rộng thiết bị sử dụng. Trong quá trình lên men, thỉnh thoảng khuấy đảo là cần thiết. Mục đích khuấy là làm đồng nhất nhiệt độ trong môi trường thủy phân, làm tăng khả năng tiếp xúc giữa cơ chất và enzyme, làm tăng khả năng khuếch tán của acid amin hòa tan từ đậu nành ra môi trường bên ngoài. Tuy nhiên, khuấy đảo nhiều quá cũng không tốt cho quá trình lên men (Liu, 2004). Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 11 2.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ NGOÀI NƯỚC LIÊN QUAN ĐẾN SẢN XUẤT NƯỚC TƯƠNG Theo Đặng Ánh Tuyết (2008), kết quả của ứng dụng công nghệ sinh học cải tiến quy trình sản xuất nước tương. Cho thấy sử dụng tỉ lệ nguyên liệu đậu nành tách béo : gạo lúa mì là 1 : 1 và bổ sung 0,2% koji giống thuần Aspergillus oryzae cho hoạt tính protease cao gấp 3,5 lần so với làm koji theo phương pháp cổ truyền. Sử dụng trực tiếp bánh dầu đậu nành nuôi cấy nấm mốc Aspergllus oryzae để sản sinh protease với độ ẩm môi trường nuôi cấy là 30%, lượng bào tử chủng mốc 106 bào tử/ml, thời gian nuôi 56 giờ thì hoạt tính protease là 25 U/gck. Sau đó tiếp tục thuỷ phân ở 450C, pH = 6, cơ chất : dung dịch đệm là 1 : 3 và trong 24 giờ để đạt hiệu suất cao nhất (56,7% N) ( Lý Thị Thùy Trang, 2006). Kết quả của Nguyễn Tiến Sĩ (2007), cho thấy việc sử dụng nguyên liệu bánh dầu đậu nành cho nước tương có chất lượng tốt nhất và có lợi nhất về giá trị kinh tế. Nguyên liệu sau ủ được xay nhuyễn có tác dụng làm tăng khả năng phân cắt của enzyme amylase đối với các hợp chất đường trong bánh dầu đậu nành. Quy trình có bổ sung enzyme bromelin có tác dụng làm tăng giá trị dinh dưỡng của nước tương và lượng enzyme bromelin bổ sung thích hợp nhất là 10 g/kg. Theo Lý Thị Dù Múa (2005), sử dụng mốc thuần Aspergillus oryzae chế biến nước tương cho giá trị đạm amin (6,58g/l) và đạm tổng (13,37g/l) cao, gần với giá trị đạm amin (7g/l) và đạm tổng (16g/l) của nước tương Nhật Bản. Phương pháp cải tiến của Nguyễn Đình Trị cho tương hột tốt hơn phương pháp cổ truyền đã được ứng dụng vào trong nghiên cứu tương, kết hợp với tỉ lệ mốc là 0,2% và nồng độ nước muối là 15% cho tương có chất lượng tốt nhất (Phạm Xuân Phong, 2006). Ngoài ra theo nghiên cứu Keshun Liu, (2004): Để duy trì sự phát triển và hoạt tính lên men cao của tế bào nấm men cũng như hạn chế thấp sự nhiễm khuẩn, Zygosaccharomyces rouxii được bổ sung vào dịch lên men muối trong quá trình lên men theo phương thức hai giai đoạn. Trong giai đoạn đầu, nấm men được nuôi cấy trong môi trường 9% (w/v) Muối ăn ở 300C để nấm men phát triển mạnh. Trong giai đoạn hai, chủng vi sinh vật được bổ sung với 16% (w/v) muối ăn ở 150C để ức chế vi khuẩn Lactobacillus. Theo Chandran Sandhya et al., (2004): Nghiên cứu sản xuất protease trung tính bởi A.oryzae bằng phương pháp lên men bề mặt và lên men chìm. Thí nghiệm sử dụng 3 dòng A.oryzae (A.oryzae NRRL1808, 6270, 1989) và 4 dòng Penicillium sp. (P. funiculsun NRRL 1768, 1132, P. pinophilum NRRL 106, P. aculeatum NRRL 2129) với cơ chất là cám mì. Kết quả nuôi cấy bề mặt với dòng nấm Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 12 A.oryzae NRRL 1808, ẩm độ môi trường là 43,6%, mật số bào tử 8.108 bào tử/ml, ở 300C trong 72 giờ sản xuất enzyme có hoạt tính cao. Trong các nghiên cứu trên, quá trình nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae đã được các tác giả Chandran Sandhya et al., (2004), Lý Thị Thuỳ Trang (2006), Đặng Ánh Tuyết (2008) đề cập. Khảo sát hoạt tính enzyme protease trong quá trình nuôi cấy nấm mốc để được hoạt tính cao (Lý Thị Thuỳ Trang, 2006 và Đặng Ánh Tuyết, 2008). Tuy nhiên, việc kiểm soát trực tuyến quá trình nuôi cấy nấm mốc để đạt được hoạt tính cao chưa được đề cập. Mặt khác, khi theo dõi quá trình thuỷ phân protein đậu nành trong các đề tài của các tác giả Ngô Đại Nghiệp (2004), Lý Thị Dù Múa (2005), Phạm Xuân Phong (2006), Lý Thị Thuỳ Trang (2006), Nguyễn Tiến Sĩ (2007), Đặng Ánh Tuyết (2008) thì quá trình thuỷ phân protein đậu nành đều được tiến hành trong điều kiện tĩnh, không có khuấy trộn hoặc khuấy trộn theo định kỳ, khó có thể đưa vào sản xuất với qui mô công nghiệp. Thêm vào đó, các nghiên cứu trước chỉ chú trọng đến hàm lượng đạm amin trong sản phẩm cuối cùng (Lý Thị Dù Múa, 2005; Phạm Xuân Phong, 2006; Lý Thị Thuỳ Trang, 2006; Nguyễn Tiến Sĩ, 2007), chưa quan tâm đúng mức đến các phản ứng của quá trình thuỷ phân, đặc biệt là hàm lượng 3-MCPD, một chất có khả năng gây ung thư cho người tiêu thụ. Tóm lại, cần phải có một nghiên cứu có thể: - Quan sát tiến trình nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae. - Các điều kiện lên men có thể kiểm soát được chất lượng nước tương giúp sản phẩm luôn có chất lượng ổn định. Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 13 CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 3.1.1 Địa điểm và thời gian - Các thí nghiệm được thực hiện tại Công Ty TNHH Phong Dinh (địa chỉ: 108 đường 3/2, Quận Ninh Kiều, TP. Cần Thơ) và phòng thí nghiệm Bộ môn công nghệ thực phẩm Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng của Trường Đại Học Cần Thơ. - Thời gian thực hiện: 9/2/2009 – 15/6/2009. 3.1.2 Nguyên liệu Đậu nành, bột mì, muối ăn (NaCl), soy protein. Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae thương phẩm nhập khẩu từ Nhật. 3.1.3 Thiết bị và dụng cụ. Dụng cụ: nồi hấp, ống nghiệm, bình tam giác, ống nhỏ giọt, beaker, ống đong, phiễu, bình định mức, pipet, buret, giấy đo pH,... Một số thiết bị: tủ ủ nấm mốc có kiểm soát nhiệt độ, bộ chưng cất đạm Kjeldalh, cân phân tích, keo thủy tinh, máy đo độ ẩm, tủ lên men có thể điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm,... 3.1.4 Hóa chất. NaOH nồng độ 30%, acid sulfuric (H2SO4) chuẩn 0,1N, NaOH chuẩn 0,1N, dung dịch formaldehyde, methyl đỏ, methyl xanh,... Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 14 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thí nghiệm tiến hành qua các bước: 1. Khảo sát sự phát triển của nấm mốc Aspergillus oryzae trên môi trường có tỉ lệ phối trộn thành phần bột mì khác nhau: 0% bột mì; 5% bột mì; 10% bột mì (có quan sát tiến trình phát triển). 2. Khảo sát sự thuỷ phân protein thành acid amin dưới ảnh hưởng của nhiệt độ, tỉ lệ bột mì và nồng độ muối (thuỷ phân trong các thiết bị sản xuất có điều khiển nhiệt độ) có khả năng phát triển ở quy mô công nghiệp. Thực hiện 1. Khảo sát quá trình nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae:  Sử dụng kỹ thuật xử lý ảnh (Image Processing) để thể hiện hoạt lực enzyme protease theo màu sắc của nấm mốc. Sử dụng hệ màu “RGB” (red, green, blue) hoặc “Lab” để khảo sát hoạt tính nấm mốc theo màu sắc.  Chụp ảnh quá trình lên mốc (10 min/lần) suốt quá trình lên mốc khoảng 48h.  Xác định hoạt tính enzyme tương ứng với thời gian xử lý.  Từ đó tìm được mối quan hệ giữa yếu tố màu sắc và hoạt tính của enzyme trên các thông số tìm được từ kỹ thuật xử lý ảnh. 2. Khảo sát sự thuỷ phân protein thành acid amin dưới tác dụng của nhiệt độ và nồng độ muối: Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 2 nhân tố là tỉ lệ phối trộn bột mì (A) và nồng độ muối (B).  Với A1, A2, A3, lần lượt là tỉ lệ phối trộn của bột mì: 0%, 5%, 10%.  Với B1, B2, B3 lần lượt là nồng độ muối cho vào trong quá trình thủy phân: 0%, 10%, 15% Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 15 Bảng 4: Thể hiện sự tương tác giữa hai nhân tố nồng độ muối (A)và tỉ lệ bột mì (B) A1 A2 A3 B1 A1B1 A2B1 A3B1 B2 A1B2 A2B2 A3B2 B3 A1B3 A2B3 A3B3 Vậy ta có 9 đơn vị thí nghiệm với 1 lần lặp lại Sơ đồ thí nghiệm được bố trí như hình 4. Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 16 3.2.1 Qui trình thí nghiệm sản xuất nước chấm lên men từ đậu nành Hình 4: Qui trình thí nghiệm sản xuất nước chấm lên men từ đậu nành Đậu nành Ngâm nước (7 ÷ 8h) Mốc giống A. Oryzae (0,1%) Bột mì Hấp nồi áp suất (1020C, 1h20’) A1,A2,A3 (tỉ lệ bột mì) Để nguội 35 ÷ 45oC Trộn đều (Độ ẩm 45 ÷ 50%) Ủ ở trong tủ ủ (30 ÷ 370C) ( theo dõi sự phát triển của Mốc bằng camera) Bổ sung nước muối B1,B2,B3 (các nồng độ muối ) Ủ trong tủ ủ, khuấy đảo 1 lần/ngày (500C) Theo dõi, khuấy đảo 1 lần/ngày, lên men 20 ÷ 30 ngày ( Lấy mẫu phân tích Đạm: đạm acid amin, đạm NH3 mỗi ngày 1 lần ) Lọc Sản phẩm ( Đánh giá cảm quan, các chỉ tiêu hóa học và so sánh với các sản phẩm nước chấm có trên thị trường ) Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 17 Từ các thí nghiệm trên mẫu được chọn là mẫu cho ra chất lượng nước tương tốt nhất (nhiều đạm amin). Theo dõi diễn biến đạm formol và đạm NH3 theo thời gian (hàng ngày) từ đó ta tính được đạm amin có trong nước tương. Kết luận: Khả năng thuỷ phân protein thành acid amin và xác định thời gian kết thúc quá trình thuỷ phân. Từ đó xác định thời gian tối ưu, tỉ lệ bột phối trộn trong quá trình ủ và nồng độ muối tối ưu cho quá trình thuỷ phân. 3.2.2 Các chỉ tiêu cần phân tích Phân tích các chỉ tiêu chất lượng của nước tương được chế biến từ các phương pháp khác nhau, trên cơ sở đó có thể so sánh và đánh giá chất lượng nước tương từ các phương pháp chế biến, từ đó chọn ra được một phương pháp chế biến thích hợp nhất và cho sản phẩm chất lượng tốt nhất. Các chỉ tiêu cần phân tích (phương pháp chi tiết được thể hiện ở phụ lục 1) a. Xác định đạm formol bằng phương pháp chuẩn độ formol. b. Xác định đạm amoniac bằng phương pháp chưng cất lôi kéo hơi nước. c. Đạm amin: Đạm amin = Đạm formol – Đạm amoniac. 3.2.3 Phân tích số liệu - Kết quả thí nghiệm được xử lý bằng kỹ thuật xử lý ảnh (Image Processing) để thể hiện hoạt lực enzyme protease theo màu sắc của nấm mốc. Sử dụng hệ màu “RGB” (red, green, blue) hoặc “Lab” để khảo sát hoạt tính nấm mốc theo màu sắc, Excel và phương pháp phân tích thống kê, chọn ra nghiệm thức tối ưu bằng chương trình Statgraphic phus version 4.0. - Sử dụng phương pháp hồi quy nhiều chiều và mặt đáp ứng (Response surfaces) để đánh giá quá trình thủy phân tối ưu của các mẫu. Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 18 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thí nghiệm 1: Sự thay đổi giá trị màu sắc(red, green, blue) trong quá trình ủ nấm mốc Màu sắc là một trong những thông số quan trọng để đánh giá hiệu quả của quá trình ủ mốc trước khi tiến hành lên men. Tuy nhiên, quá trình thay đổi màu sắc trong thời gian ủ mốc chỉ thay đổi những màu sắc cơ bản, chứ không phải sự thay đổi trên tổng thể các màu. Vì vậy, dựa trên nguyên tắc thay đổi của màu sắc trong quá trình ủ phân tích màu sắc thành ba màu cơ bản: màu đỏ, màu xanh lá cây và màu xanh dương để thực hiện quan sát theo thời gian ủ đậu nành. Bên cạnh đó, trong quá trình ủ mốc có sự bổ sung bột mì nhằm bổ sung chất nền để nấm mốc phát triển, vì vậy mà màu sắc cũng phần nào bị ảnh hưởng. Thí nghiệm được khảo sát ở ba hàm lượng bột mì bổ sung là 0%, 5% và 10%. Kết quả thể hiện sự thay đổi màu sắc theo thời gian ủ ở (Phụ lục 2 bảng 7) Hình 5: Đồ thị thể hiện sự thay đổi màu sắc trong quá trình ủ mốc theo thời gian ủ với hàm lượng bột mì bổ sung 0% 100 120 140 160 180 200 10 18 0 35 0 52 0 69 0 86 0 10 30 12 00 13 70 15 40 17 10 18 80 20 50 22 20 23 90 25 60 Thời gian ủ (phút) Gi á t rị m àu sắ c Màu đỏ Xanh lá cây Xanh dương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 19 Hình 6: Đồ thị thể hiện sự thay đổi màu sắc trong quá trình ủ mốc theo thời gian ủ với hàm lượng bột mì bổ sung 5% Hình 7: Đồ thị thể hiện sự thay đổi màu sắc trong quá trình ủ mốc theo thời gian ủ với hàm lượng bột mì bổ sung 10% Qua hình 5, 6, 7 cho thấy, cả ba thí nghiệm này đều có sự thay đổi màu sắc trong quá trình ủ mốc theo thời gian ủ. Trong 12 giờ đầu của quá trình ủ các mẫu có sự gia tăng các giá trị màu sắc, tuy nhiên sau đó lại giảm dần theo thời gian ủ. Khi quan sát sự thay đổi màu sắc đỏ, xanh lá cây và xanh dương ở cả ba thí nghiệm này gần như song song với nhau theo thời gian ủ. Vì vậy, ta có thể dựa vào một trong 3 màu cơ bản hoặc kết hợp để quan sát quá trình phát triển của nấm mốc. 100 120 140 160 180 200 220 240 10 17 0 33 0 49 0 65 0 81 0 97 0 11 30 12 90 14 50 16 10 17 70 19 30 20 90 22 50 24 10 25 70 Thời gian ủ (phút) Gi á t rị m àu sắ c Màu đỏ Xanh lá cây Xanh dương 100 120 140 160 180 200 10 17 0 33 0 49 0 65 0 81 0 97 0 11 30 12 90 14 50 16 10 17 70 19 30 20 90 22 50 24 10 25 70 Thời gian ủ (phút) Gi á t rị m àu sắ c Màu đỏ Xanh lá cây Xanh dương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 20 4.2 Thí nghiệm 2: Sự ảnh hưởng của tỉ lệ phối trộn bột mì trong quá trình ủ và nồng độ muối trong quá trình thủy phân đến hàm lượng đạm amin sinh ra Một trong những yếu tố quyết định đến chất lượng của các sản phẩm nước chấm là thành phần đạm acid amin, acid amin có vai trò là chất dinh dưỡng đồng thời nó ảnh hưởng rất lớn đến hương vị đặc trương của nước tương. Trong các sản phẩm nước chấm nếu hàm lượng đạm acid amin càng cao thì nước chấm đó có hương vị càng tốt. Vì vậy, trong quá trình sản xuất, sự thay đổi hàm lượng đạm amin được đặc biệt quan tâm. Hàm lượng đạm amin sinh ra nhiều hay ít cũng là sự thể hiện hiệu quả của quá trình lên men trong nước tương. Kết quả thu nhận acid amin theo thời gian lên men được thể hiện ở bảng 5 qua bảng số liệu bảng 5 nhận thấy hàm lượng đạm amin tăng dần theo thời gian lên men. Tuy nhiên, có sự khác nhau về hàm lượng đạm amin sinh ra giữa những mẫu có hàm lượng bột mì bổ sung khác nhau (0%, 5%, 10% bột mì) và ngay trong cùng một hàm lượng bột mì giống nhau cũng có sự khác biệt ý nghĩa giữa các mẫu có nồng độ muối bổ sung không giống nhau (0%, 10%, 15% muối) kết quả được thể hiện ở bảng 5 và kết quả thống kê ở (phụ lục 2 bảng 8, 10,12). Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 21 Bảng 5: Hàm lượng đạm amin ( gN/l) theo thời gian (ngày) MẫuThời gian lên men, ngày 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 3,92 3,64 3,71 1,82 2,8 2,80 2,24 2,38 1,96 2 4,20 3,85 3,92 2,8 4,34 4,27 2,66 2,52 2,10 3 4,48 4,20 4,20 3,36 4,48 4,76 2,80 2,59 2,17 4 4,76 4,48 4,62 3,5 4,9 5,32 3,22 2,74 2,23 5 4,97 4,62 4,83 3,64 5,04 5,74 3,50 2,86 2,37 6 5,46 5,53 5,67 4,34 5,46 6,16 3,57 2,94 2,44 7 5,55 5,88 5,88 4,2 5,6 6,44 3,78 3,01 2,52 8 5,56 5,60 6,02 4,34 5,67 6,58 3,92 3,08 2,59 9 5,59 6,30 6,02 4,41 5,74 6,86 3,92 3,15 2,52 10 5,60 6,16 6,23 4,48 5,81 7,07 3,99 3,22 2,59 11 5,74 6,23 6,30 4,62 5,88 7,28 4,06 3,29 2,80 12 5,88 6,44 6,58 4,76 5,88 7,56 4,20 3,36 2,80 13 6,02 6,51 6,79 4,83 6,02 7,63 4,41 3,43 2,87 14 6,09 6,58 6,79 4,97 6,16 7,70 4,48 3,43 3,01 15 6,02 6,58 6,72 4,97 6,09 8,12 4,55 3,64 3,15 16 5,74 6,44 6,72 5,04 6,23 8,19 4,62 3,71 3,22 17 5,81 6,72 7,00 5,04 6,16 8,19 4,62 3,78 3,22 18 5,88 7,00 7,14 4,97 6,23 8,12 4,55 3,71 3,22 19 6,02 7,14 7,28 4,9 6,3 8,12 4,62 3,78 3,29 20 5,95 7,14 7,28 4,69 6,09 7,98 4,48 3,64 3,08 21 6,02 7,14 7,21 4,62 6,02 7,91 4,34 3,57 3,01 22 5,95 7,21 7,28 4,41 5,88 7,70 23 5,88 7,21 7,21 24 5,74 7,07 7,14 25 5,74 7,00 7,07 Trung bình 4,91 a 5,37b 5,47b 4,31c 5,58b 6,84a 3,71a 3,05b 2,59c (Các chữ cái khác nhau trong cùng một hàng ỏ 3 cột: cột 1,2,3(cột 1); cột 4,5,6 (cột 2) và cột 7,8,9 (cột 3) biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95% ) Trong đó: - Mẫu 1, 2, 3: lần lượt là 0%, 10%, 15% muối ăn và cùng 0% bột mì. - Mẫu 4, 5, 6: lần lượt là 0%, 10%, 15% muối ăn và cùng 5% bột mì. - Mẫu 7, 8, 9: lần lượt là 0%, 10%, 15% muối ăn và cùng 10% bột mì. Kết quả khảo sát sự thay đổi hàm lượng đạm amin theo thời gian ở mẫu 1, 2, 3 được thể hiện ở hình 8. Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 22 3.67594 + 0.285983*x - 0.0083752*x*x + 0.00791571*y -0.002192*y*y+0.00541571*x*y 0 5 10 15 20 25 30 X 0 3 6 9 12 15 Y Function 3.3 3.8 4.3 4.8 5.3 5.8 6.3 6.8 7.3 7.8 3.67594 + 0.285983*x - 0.0083752*x*x + 0.00791571*y -0.002192*y*y+0.00541571*x*y 0 5 10 15 20 25 30X 0 3 6 9 12 15 Y3.3 4.3 5.3 6.3 7.3 8.3 Fu nc tio nĐạm amin (Ng/L) Hình 8: Sự thay đổi hàm lượng đạm amin ở các mẫu cùng hàm lượng bột mì 0% và khác nhau về hàm lượng muối theo thời gian lên men Hình 9: Đồ thị thể hiện tương tác của hàm lượng muối và thời gian lên men đến hàm lượng đạm amin sinh ra ở hàm lượng bột mì bổ sung là 0% Qua kết quả bảng 5 và hình 8 nhận thấy, hàm lượng đạm amin sinh ra tăng dần theo thời gian lên men. Kết quả thống kê (phụ lục 2 bảng 8)giữa ba mẫu 1, 2, 3 cho thấy có sự khác biệt ý nghĩa giữa mẫu 1 với 2 mẫu còn lại và có kết quả đạm amin thấp nhất (bảng 5). Trong khi đó lại không có sự khác biệt ý nghĩa giữa mẫu 2 và mẫu 3 về trung bình hàm lượng đạm sinh ra. Như vậy, ở môi trường ủ 0% bột mì thì mẫu có bổ sung