Đề tài Nấm Vân Chi

Click to edit Master title style Click to edit Master text styles Second level Third level Fourth level Fifth level 27/06/2013 ‹#› Viện công nghệ sinh học & thực phẩm Môn: kỹ thuật trồng và chế biến nấm Đề tài: Nấm Vân Chi GVHD: ths. Nguyễn Trung Hậu Danh sách nhóm 1. Nguyễn Thị Ngọc Châu 10076431 2. Nguyễn Thị Thùy Dung 10057781 3.Hà Thị Lý 10057121 4. Đoàn Thị Kỳ 10075581 5. Đặng Thị Trúc Mai 10058821 6. Đinh Thị Mến 10055101 Đặt vấn đề Những năm gần đây, ngoài giá trị dinh dưỡng đã được biết đến từ rất lâu, nấm còn được đề cập đến như một nguồn dược liệu quý. Trong điều kiện khí hậu ở Việt Nam rất thích hợp cho việc nuôi trồng các loại nấm, Do đó việc tìm ra phương pháp cũng như môi trường nuôi trồng thích hợp đối với từng loại nấm để đạt được hoạt tính nhiều nhất là điều cần thiết Người ta biết đến hiệu quả chữa bệnh của nấm vân chi thông qua hai hợp chất chính trích từ nấm này là PSP (polysaccharide peptide) và PSK (polysaccharide Kureha). Nhưng hiện nay, ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về vân chi và ngành trồng nấm vân chi lại chưa phát triển. Với mong muốn phát triển hơn nữa khả năng nuôi trồng và ứng dụng nấm vân chi trong ngành dược phẩm, do đó đã thực hiện đề tài: Khảo sát sinh trưởng một chủng nấm vân chi đen Trametes versicolor có nguồn gốc từ Trung Quốc. Mục Đích Đề Tài Yêu Cầu Tổng quan tài liệu Vân chi có nhiều tên gọi rất khác nhau, Vân chi có tên khoa học phổ biến hiện nay là Trametes versicolor. Là một loại nấm lớn thuộc phân lớp Basidiomycetes. Gây hoại sinh cây bệnh, cư trú trên gỗ đã chết, thuộc loại nấm gây mục trắng mạnh có thể phá huỷ đồng thời tất cả các cấu tử gỗ (hemicellulose, cellulose, lignin). Là dạng nấm gỗ Đặc điểm cấu tạo Loại nấm hàng năm, không cuống, phát triển một bên. Khi non quả thể có dạng nhiều u lồi tròn, mọc thành dạng vành với mép tán màu trắng-trắng kem. Nấm trưởng thành có dạng quả giá, chất da hoá gỗ. Quả thể hình nan quạt có nhiều vân đồng tâm, chồng chất xen kẽ nhau như ngói lợp, nhìn rất giống đuôi gà tây đang xòe. Đặc điểm cấu tạo Mũ nấm mỏng, phẳng hoặc hơi quăn hình bán nguyệt, mọc thành cụm kích thước 1 - 6 x 1 - 10 cm. Màu sắc các chủng vân chi phụ thuộc vào môi trường và hệ di truyền. Thịt nấm màu trắng hoặc trắng kem, gồm nhiều sợi dày 0,6 - 2,5 mm. Quy trình nuôi trồng nấm Chọn dòng và giữ giống Nhân giống cấp 1 và cấp 2 Nuôi Trồng Ra Quả Thể Nuôi trồng thu sinh khối Ngoài công nghệ nuôi trồng trên giá thể tổng hợp hay trên gỗ khúc, người ta còn tiến hành thu sinh khối nấm trong các nồi lên men. Hiện nay nhiều xí nghiệp dược phẩm đã sản xuất sinh khối nấm vân chi theo phương pháp lên men chìm trong các nồi lên men Giá trị dược tính của nấm vân chi Vân chi được sử dụng để điều trị nhiều loại ung thư và cũng được dùng để trị bệnh viêm gan mãn tính, viêm nhiễm đường hô hấp, viêm cơ quan bài tiết và cơ quan tiêu hoá Giá trị dược tính của nấm vân chi Vân chi được dùng để tăng cường hiệu quả cho hệ miễn dịch, loại bỏ độc tố cơ thể, giảm đờm, tăng năng lượng và làm tinh thần sảng khoái, kéo dài tuổi thọ, hạ nhiệt do vân chi có tính hàn, vị ngọt. Thành phần hoá học sơ bộ nấm vân chi Thành phần các yếu tố có trong dịch trích Carbon : 40,5% Hydrogen : 60,2% Nitrogen : 5,2% Oxygen : 47,5% Thành phần hoá học dịch trích Hydrate carbon: 42 - 43 % (91 - 93 % chuỗi beta-glucan chứa các polymer có glucose) Protein : 28 - 35 % Ẩm độ : 7 - 7,6 % Khoáng : 6 - 7 % Phần còn lại là đường tự do và aminoacid PSK(polysaccharide - Kureha) Cấu tạo: Được ly trích từ vân chi CM-101 bằng nước và bằng phương pháp muối hoá. Cấu tạo gồm 62% polysaccharide và 38% protein. Trọng lượng phân tử khoảng 94 - 100 kDa. PSK không độc, liều LD50 thấp và không xuất hiện các dị hình trong các thử nghiệm độc tính cấp và bán cấp. Dược tính PSP (polysaccharide-peptide) Dược tính Dược tính Phương pháp tiến hành thí nghiệm và kết quả 1.Quan sát hình thái giải phẫu quả thể nấm vân chi a. Hình thái cấu tạo quả thể - Quan sát hình dạng quả thể, cấu tạo quả thể hoàn chỉnh,thân nấm và lớp bào tầng, cấu trúc cắt ngang quả thể, chụp hình. - Quan sát hệ sợi trên quả thể dưới kính hiển vi có vật kính X40 và chụp hình. 1.Quan sát hình thái giải phẫu quả thể nấm vân chi Kết quả: 1.Quan sát hình thái giải phẫu quả thể nấm vân chi Hệ sợi trích từ quả thể nấm vân chi 1.Quan sát hình thái giải phẫu quả thể nấm vân chi b. Hệ sợi tơ thứ cấp Lấy mẫu hệ sợi lan trên môi trường thạch cho lên mặt lame, không nhuộm màu mẫu, dùng lamelle đè nhẹ, quan sát dưới kính hiên vi vật kính X40, quan sát hình dạng hệ sợi, vách ngăn ngang, mấu liên kết và sau đó chụp hình. 1.Quan sát hình thái giải phẫu quả thể nấm vân chi Kết quả Kết quả Nấm Vân chi Trametes versicolor xuất hiện 3 loại hệ sợi. Khi quan sát hiển vi không nhuộm màu, cả 3 loại sợi đều không màu, trong suốt Sợi dinh dưỡng Sợi cứng Sợi bện 1.Quan sát hình thái giải phẫu quả thể nấm vân chi c. Đảm và đảm bào tử - Cách tiến hành: Lấy cốc thuỷ tinh có đựng nước (không đầy đến miệng cốc), đặt quả thể nấm lên trên (quả thể nấm phải lớn hơn đường kính cốc) hướng lớp bào tầng về phía miệng cốc, để nơi kín gió. Sau 1 - 2 ngày, lấy bào tử có trong cốc, quan sát dưới kính hiển vi vật kính X40 và chụp hình. - Kết quả: Không quan sát được đảm, chỉ quan sát được bào tử đảm. Bào tử đảm trong suốt, nhẵn, thon dài hơi cong giống hình quả dưa gang, vách mỏng, có đường kính 1,7 - 2,4 ^m, chiều dài 3,4 - 5,1 ^m. 2. Khảo sát đặc điểm dinh dưỡng, sinh lý của hệ sợi nấm vân chi trên môi trường thạch a. Khảo sát tốc độ lan của hệ sợi trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau Thí nghiệm được tiến hành trên 5 môi trường: - Môi trường 1: PGA - Môi trường 2: Bán tổng hợp (Khoai tây - muối khoáng) - Môi trường 3: Crapek - Môi trường 4: PGA + 10% nước dừa - Môi trường 5: PGA + 10% nước chiết giá 2. Khảo sát đặc điểm dinh dưỡng, sinh lý của hệ sợi nấm vân chi trên môi trường thạch Thời gian (ngày) Đường kính hệ sợi lan (mm) MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 3 39,82 ± 3,90 27,63 ± 1,19 37,76 ± 0,98 41,31 ± 1,54 39,57 ± 2,51 4 62,15 ± 3,24 45,42 ± 0,58 59,56 ± 3,00 65,58 ± 1,62 60,57 ± 0,33 5 79,24 ± 0,24 60,22 ± 0,67 78,11 ± 3,10 82,81 ± 1,35 78,79 ± 2,75 2. Khảo sát đặc điểm dinh dưỡng, sinh lý của hệ sợi nấm vân chi trên môi trường thạch Biểu diễn đường kính hệ sợi lan trên 5 môi trường dinh dưỡng theo thời gian 2. Khảo sát đặc điểm dinh dưỡng, sinh lý của hệ sợi nấm vân chi trên môi trường thạch Đường kính hệ sợi tăng trưởng trên các môi trường dinh dưỡng sau 4 ngày cấy 2. Khảo sát đặc điểm dinh dưỡng, sinh lý của hệ sợi nấm vân chi trên môi trường thạch b. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ Môi trường sử dụng là môi trường bán tổng hợp - BTH (khoai tây - muối khoáng). Khử trùng môi trường 121oC/ 30 phút sau đó đổ vào đĩa petri vô trùng (mỗi môi trường đổ 10 đĩa). Sau 24h, cấy vào mỗi đĩa một hạt lúa từ môi trường hạt. Tiến hành ủ ở hai mức nhiệt độ 27 ± 2oC và nhiệt độ phòng (30 ± 2oC). Sau 3 ngày tiến hành thu thập số liệu 2. Khảo sát đặc điểm dinh dưỡng, sinh lý của hệ sợi nấm vân chi trên môi trường thạch Kết quả Thời gian (ngày) Đường kính hệ sợi lan (mm) 30oC 27oC 3 37,76 ± 2,98 33,46 ± 3,66 4 59,56 ± 3,00 52,18 ± 3,16 5 78,11 ± 3,10 72,26 ± 1,89 Đường kính hệ sợi lan trên môi trường BTH ở hai mức nhiệt độ theo 2. Khảo sát đặc điểm dinh dưỡng, sinh lý của hệ sợi nấm vân chi trên môi trường thạch Đường kính hệ sợi lan trên môi trường BTH ở 27oC và 30oC vào ngày thứ 4 2. Khảo sát đặc điểm dinh dưỡng, sinh lý của hệ sợi nấm vân chi trên môi trường thạch c. Khảo sát ảnh hưởng của pH Môi trường dùng làm thí nghiệm là môi trường bán tổng hợp - BTH (khoai tây - muối khoáng), điều chỉnh về các pH khác nhau: 5; 5,5; 6; 6,5; 7. Điều chỉnh pH acid dùng dung dịch HCl 1M và pH kiềm dùng NaOH 1M. Khử trùng môi trường 121oC/ 30 phút, mỗi thí nghiệm đổ 10 đĩa, sau 24h cấy giống. Ủ nhiệt độ phòng (30 ± 2oC). Bắt đầu đo và thu thập số liệu sau 3 ngày 2. Khảo sát đặc điểm dinh dưỡng, sinh lý của hệ sợi nấm vân chi trên môi trường thạch Kết quả Thời gian (ngíiy) Đường kính hệ sợi lan (mm) pH7 pH6,5 pH6 pH5,5 pH5 3 24,93 ± 2,17 30,60 ± 3,03 33,06 ± 3,59 35,21 ± 3,29 36,15 ± 3,20 4 37,50 ± 2,32 46,88 ± 2,81 53,10 ± 2,64 57,38 ± 4,26 57,61 ± 3,22 5 49,15 ± 2,06 61,18 ± 2,00 70,10 ± 3,71 75,64 ± 3,22 74,38 ± 3,27 Đường kính hệ sợi lan trên môi trường BTH ở các pH khác nhau theo thời gian 2. Khảo sát đặc điểm dinh dưỡng, sinh lý của hệ sợi nấm vân chi trên môi trường thạch Đường kính hê sợi lan trên môi trường BTH ở các pH vào ngày thứ 4 3. Khảo sát môi trường nhân giống cấp hai * Tiến hành thí nghiệm: MT 1: Lúa 90% + Mùn cưa 5% + Cám gạo 5% MT 2: Lúa 90% + Mùn cưa 5% + Cám bắp 5% MT 3: Lúa 80% + Mùn cưa 5% + Bắp xay 15% MT 4: Bắp xay 50% + Cám gạo 25% +Mùn cưa 25% MT 5: Bắp xay 50% + Mùn cưa 25%+ Đậu xanh 25% MT 6: Bắp xay 50% + Mùn cưa 50% MT 7: Mùn cưa 50% + Cám gạo 50% + (NH4)2SO4 0,2% MT 8: Mùn cưa 50% + Cám gạo 50% + Urea 0,1% MT 9: Mùn cưa 50% + Cám bắp 50% * Các chỉ tiêu theo dõi, quan sát : - Tốc độ tăng trưởng của hệ sợi qua các ngày 4, 6, 8, 10, 12 ngày sau khi cấy. -Màu sắc hệ sợi trên ống nghiệm. 3. Khảo sát môi trường nhân giống cấp hai Kết quả: Môi trường Chiều dài hệ sợi lan (mm) Ngày thứ 4 Ngày thứ 6 Ngày thứ 8 Ngày thứ 10 Ngày thứ 12 1 40,33 ± 3,18 57,14 ± 3,20 73,86 ± 3,05 85,28 ± 3,75 92,94 ± 4,07 2 39,61 ± 2,37 57,56 ± 1,90 74,19 ± 2,16 88,42 ± 0,52 102,17±0,44 3 37,08 ± 1,10 52,56 ± 0,77 68,44 ± 0,38 82,33 ± 0,67 94,92 ± 1,37 4 33,61 ± 3,13 47,46 ± 3,50 63,31 ± 2,16 73,11 ± 2,50 82,06 ± 3,00 5 38,08 ± 1,72 55,97 ± 1,89 73,56 ± 1,50 88,36 ± 2,29 100,92±1,91 6 34,92 ± 2,17 50,50 ± 2,68 66,78 ± 1,58 79,42 ± 1,88 94,39 ± 1,64 7 35,11 ± 1,90 47,11 ± 3,36 60,31 ± 4,04 70,31 ± 4,89 77,89 ± 4,01 8 33,50 ± 3,66 45,39 ± 3,62 58,28 ± 2,61 67,67 ± 4,06 75,42 ± 3,64 9 37,92 ± 1,91 53,75 ± 2,27 70,58 ± 2,48 83,39 ± 2,64 92,14 ± 2,66 Chiều dài hệ sợi lan trên các môi trường nhân giống cấp hai 3. Khảo sát môi trường nhân giống cấp hai Hệ sợi lan trên các môi trường nhân giống trung gian sau 7 ngày cấy 4. Khảo sát môi trường nuôi trồng ra quả thể * Tiến hành thí nghiệm: Thử nghiệm khả năng cho quả thể trên các môi trường sau: MT 1: Mùn cưa + Cám gạo 5% + Urea 0,25% MT 2: Mùn cưa + Cám gạo 5% + Urea 0,25% + DAP 0,25% MT 3: Mùn cưa + cám gạo 5% + SA 0,5% + DAP 0,25% MT 4: Mùn cưa + Cám gạo 5% + Nitrate Canxi 0,5% + DAP 0,25% MT 5: Mùn cưa + Cám gạo 5% + NPK 20-20-15 0,5% MT 6: Mùn cưa + Cám gạo 10% MT 7: Mùn cưa + Cám bắp 10% MT 8: Mùn cưa + Cám gạo 5%+ Supe lân 0,5% + Urea 0,25% MT 9: Mùn cưa + Urea 0,25% + DAP 0,25% s MT 10: Mùn cưa + Cám 5% + Dynamic lifter 0,25% * Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi thời gian xuất hiện hệ sợi nấm trên các bịch môi trường và thời gian xuất hiện tai nấm ở các nghiệm thức 4. Khảo sát môi trường nuôi trồng ra quả thể Kết quả: Bảng 4.5: Tỉ lệ xuất hiện hệ sợi trên các môi trường nuôi trồng o • • • • o o Môi trường Tỉ lệ xuất hiện hệ sợi (%) Ngày thứ 6 Ngày thứ 9 Ngày thứ 12 1 64,3 85,6 100 2 57,1 78,5 100 3 92,3 100 100 4 92,9 100 100 5 85,7 100 100 6 71,4 96,4 100 7 96,8 100 100 8 14,3 53,8 84,6 9 37,0 92,3 100 10 57,1 96 100 Tỉ lệ xuất hiện hệ sợi trên các môi trường nuôi trồng 5. Khảo sát khả năng tạo sinh khối trên môi trường lỏng Thí nghiệm 1: Thử nghiệm trên 3 loại môi trường với thành phần dinh dưỡng khác nhau Môi trường tự nhiên: PS (khoai tây + đường) Môi trường bán tổng hợp (BTH): khoai tây + muối khoáng + đường Môi trường tổng hợp: Crapek => Mục đích thí nghiệm: dựa trên lượng sinh khối thu được từ các môi trường trong TN1, chọn môi trường có lượng sinh khối nhiều nhất để làm đối chứng cho TN2 5. Khảo sát khả năng tạo sinh khối trên môi trường lỏng Kết quả: Thời gian (ngày) Sinh khối (gam) PS BTH CRAPEK 5 0,0195 ± 0,0068 0,0713 ± 0,0185 0,0059 ± 0,0010 10 0,1289 ± 0,0007 0,2350 ± 0,0290 0,0241 ± 0,0046 15 0,2101 ± 0,0042 0,4323 ± 0,0375 0,0459 ± 0,0047 Sinh khối nấm vân chi trên môi 3 trường lỏng 5. Khảo sát khả năng tạo sinh khối trên môi trường lỏng Sinh khối nấm vân chi trong 3 môi trường lỏng 5. Khảo sát khả năng tạo sinh khối trên môi trường lỏng Thí nghiệm 2: Thử nghiệm trên các môi trường được bổ sung các nguồn dinh dưỡng tự nhiên: MT 1: PS + 5% Nước chiết bắp MT 2: PS + 10% Nước chiết bắp MT 3: PS + 15% Nước chiết bắp MT 4: PS + 5% Nước chiết giá MT 5: PS + 10% Nước chiết giá MT 6: PS + 15% Nước chiết giá MT 7: PS + 5% Nước dừa MT 8: PS + 10% Nước dừa MT 9: PS + 15% Nước dừa MTĐC: MT TN1 5. Khảo sát khả năng tạo sinh khối trên môi trường lỏng Kết quả: Môi trường Sinh khối nâm vân chi (gam) 5 ngày 10 ngày 15 ngày 1 0,0274 ± 0,0173 0,1153 ± 0,0115 0,1581 ± 0,0092 2 0,0259 ± 0,0066 0,1330 ± 0,0226 0,2276 ± 0,0188 3 0,0361 ± 0,0101 0,1419 ± 0,0161 0,2433 ± 0,0156 4 0,0359 ± 0,0046 0,1141 ± 0,0089 0,1973 ± 0,0173 5 0,0338 ± 0,0050 0,1204 ± 0,0138 0,2047 ± 0,0181 6 0,0290 ± 0,0040 0,1474 ± 0,0030 0,2074 ± 0,0133 7 0,2074 ± 0,0133 0,1234 ± 0,0029 0,3402 ± 0,0156 8 0,0142 ± 0,0049 0,1293 ± 0,0083 0,2332 ± 0,0164 9 0,0320 ± 0,0040 0,1248 ± 0,0155 0,2289 ± 0,0130 10 0,0713 ± 0,0185 0,2348 ± 0,0290 0,4323 ± 0,0375 Sinh khối vân chi trên các môi trường bổ sung dinh dưỡng tự nhiên 6. Định lượng polysaccharide thô ly trích từ nấm vân chi đen Trametes versicolor Quy trình ly trích hợp chất thô từ nấm vân chi 6. Định lượng polysaccharide thô ly trích từ nấm vân chi đen Trametes versicolor Kết quả: - Thí nghiệm 1:Định lượng hợp chất polysaccharide thô trích từ sinh khối nấm vân chi thu được trên 3 môi trường PS, BTH, CRAPEK   PS(%) BTH (%) CRA (%) Lần 1 10,89 11,38 0 Lần 2 11,03 10,65 0 Lần 3 10,43 11,44 0 Tỉ lệ TB 10,76 11,16 0 Tỉ lệ polysaccharide thô trích từ sinh khối thu được trên 3 môi trường Biểu diễn tỉ lệ polysaccharide thô trích từ sinh khối thu được trên 3 môi trường lỏng 6. Định lượng polysaccharide thô ly trích từ nấm vân chi đen Trametes versicolor Kết quả: Thí nghiệm 2 : Định lượng hợp chất polysaccharide thô trích từ các môi trường PS có bổ sung các nguồn dinh dưỡng khác nhau. 6. Định lượng polysaccharide thô ly trích từ nấm vân chi đen Trametes versicolor Môi trường Tỉ lệ polysaccharide thô (%) 1 11,16 ± 0,63 2 11,65 ± 0,12 3 12,38 ± 0,43 4 11,68 ± 1,87 5 14,02 ± 1,53 6 14,55 ± 0,68 7 12,96 ± 1,86 8 21,75 ± 3,35 9 15,05 ± 2,62 10 11,16 ± 0,44 Tỉ lệ hợp chất polysacharide thô trích từ sinh khối nấm vân chi thu được trong 10 môi trường nuôi cấy lỏng 6. Định lượng polysaccharide thô ly trích từ nấm vân chi đen Trametes versicolor Môi trường Khối lượng polysaccharide thô (mg/l) 1 353 2 530 3 602 4 461 5 574 6 603 7 882 8 1014 9 689 10 965 Khối lượng polysaccharide thô trích được từ sinh khối nấm trong 1 lít môi trường 6. Định lượng polysaccharide thô ly trích từ nấm vân chi đen Trametes versicolor Biểu diễn khối lượng polysaccharide thô trích được từ sinh khối nấm trong 1 lít môi trường MT 6. Định lượng polysaccharide thô ly trích từ nấm vân chi đen Trametes versicolor Kết quả: - Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu trích   QUẢ THỂ HÊ SƠI Lần1 7,36 11,38 Lần 2 7,92 10,65 Lần 3 7,78 11,44 Tỉ lệ TB (%) 7,69 11,16 Tỉ lệ polysaccharide thô chiết được từ các nguồn nguyên liệu khác nhau (%) KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận - Nấm vân chi có tên khoa học là Trametes versicolor, là giống mới có nguồn gốc từ Trung Quốc. - Môi trường nhân giống cấp một thích hợp: Môi trường PS + 10% nước dừa - pH thích hợp : 5,5 - Nhiệt độ thích hợp cho hệ sợi tăng trưởng tốt: 30oC± 2oC - Môi trường nhân giống cấp hai thích hợp: Môi trường hạt gồm: Lúa 90%, Mùn cưa 5%, Cám bắp 5%. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ - Môi trường tạo sinh khối tốt nhất là môi trường BTH (nước chiết khoai tây và muối khoáng). - Môi trường nuôi cấy cho tỉ lệ hợp chất polysaccharide thô cao nhất là môi trường PS + Nước dừa 10%. - Vậy nuôi cấy với mục đích lấy polysaccharide làm dược phẩm hổ trợ trong điều trị ung thư thì môi trường PS + Nước dừa 10% là môi trường thích hợp. - Môi trường tạo quả thể thích hợp: Môi trường Mùn cưa + Vôi bột 0,25% + Cám gạo 10%. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 2. Đề nghị -Khảo sát nhiệt độ, ẩm độ thích hợp sau khi hệ sợi lan đầy bịch từ đó hoàn thiện quy trình nuôi trồng nấm vân chi đen Trametes versicolor . - Để tiếp tục theo dõi lượng sinh khối và tỉ lệ polysaccharide chiết từu hệ sợi vân chi trên môi trường lỏng, cần thực hiện bổ sung thêm vài nồng độ nước chiết bắp cao hơn. - Thực hiện giai đoạn sau ly trích hợp chất thô, thử nghiệm các phương pháp chiết xuất để tinh sạch hợp chất mong muốn. Thử nghiệm các chất có dược tính trích từ nấm trên các mẫu động vật bệnh in vitro.