Đề tài Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường và NaCl trong qúa trình lên men vang vải thiều (Litchi chinensis sonn)

àm nở bột mì, gây hương cho nước chấm, sản xuất một số dược phẩm khác. Tuy nhiên bên cạnh đó có một số nấm men có hại cho người và gia súc, làm hư hỏng lương thực, thực phẩm [3]. 2.2.2. Hình thái, kích thước và cấu tạo của tế bào nấm men Sacharomyces cerevisiae Hình thái: Đa số nấm men có hình ovan, hình trứng. Hình dạng và kích thước điển hình của tế bào nấm men chỉ tạo được trong điều kiện nhất định. Nếu thay đổi thì hình dạng tế bào cũng thay đổi. Kích thước của tế bào nấm men vào khoảng 4- 10 àm x 2- 8àm. Tế bào nấm men lớn gấp 10 lần tế bào vi khuẩn, cấu tạo tế bào nấm men phức tạp hơn tế bào vi khuẩn. Về mặt hoá học, có sự phân bố rõ ràng, tế bào nấm men Sacharomyces cerevisiae được bao bởi lớp thành tế bào. Cấu tạo chủ yếu của thành tế bào là Hêmixenlulô chiếm 70% trọng lượng khô (trong đó 31% manan, 29% glucan ). Ngoài ra còn chứa 1%- 3% kitin, 6% - 10% prôtêin, 8% - 8,5% lipit, 7% chất khoáng. Thành tế bào có cấu tạo nhiều lớp là cơ quan bảo vệ và duy trì hình dạng tế bào. Thành tế bào nấm men có khả năng kết dính, có ý nghĩa lớn trong công nghiệp sản xuất rượu vang và bia. Bên ngoài chất nguyên sinh là màng sinh chất (màng chất nguyên sinh ) có chức năng quan trọng là hấp phụ các chất dinh dưỡng và thải các các sản phẩm trao đổi chất. Màng chất nguyên sinh là lipoprotêin chứa nhiều hợp chất canxi. Màng chất nguyên sinh ăn sâu vào trong tạo thành mạng lưới nội chất gồm 2 lớp và dày khoảng 30- 40A0 và có ty thể. Ty thể của nấm men có dạng hình hạt và có thể thay đổi tuỳ thuộc điều kiện của môi trường cũng như trạng thái sinh lý của tế bào, kích thước khoảng 0,2 – 0,6 cm, ty thể có màng trong suốt, mỏng (60 – 80 A0 ), có tính thấm cao, màng ty thể có cấu tạo 2 lớp, lớp trong hình thành nếp gấp hoặc ống nhỏ hình răng lược. Lớp ngoài được cấu tạo bằng nhiều đơn vị hình thái. Ty thể được cấu tạo chủ yếu bằng hợp chất prôtêin, lipit trong đó chiếm một lượng lớn nuclêoprôtêin, photpholipit. Số lượng ty thể trong tế bào nấm men từ 10 đến 20. Chúng tham gia vào quá trình sinh trưởng của tế bào, sự hình thành và nảy mầm của bào tử. [1, 3, 9 ]. Trong tế bào nấm men có chứa một hoặc một hệ thống không bào được hình thành từ thể glogi hay mạng lưới nội chất, không bào có tính chất thẩm thấu cao và là nơi tích luỹ các sản phẩm của trao đổi chất. Không bào chứa một hệ thống keo, trong đó gồm các điện tử, enzim, protit, hiđrat cacbon, các muối canxi, photpho, kali, axit nuclêic. Hình dạng của không bào thường thay đổi do sự co rút của chất nguyên sinh. Trong không bào thường xảy ra các phản ứng oxi hoá - khử nhờ vào hệ thống enzim xitocromoxidaza trong không bào. Một dạng dự trữ của tế bào là glucogen trong môi trường giàu hiđrat cacbon, glicogen của tế bào nấm men được tích luỹ khá nhiều. Khác với tế bào vi khuẩn, tế bào nấm men có nhân thật, nhân có hình tròn, hình ôvan nằm gần không bào trung tâm có kích thước 1- 2,4 àm. Nhân tế bào được bao bọc bởi 2 lớp màng tế bào, mỗi màng có cấu trúc như màng cơ sở, gồm 3 lớp phân tử, những lớp này được liên hệ với nhau ở gần lỗ màng nhân. Lỗ màng nhân tham gia việc kiểm tra quá trình trao đổi chất tế bào. [6, 9]. 2.2.3. Sinh sản của tế bào nấm men Nấm men có nhiều hình thức sinh sản (sinh sản vô tính, sinh sản hữu tính,). Bình thường tế bào nấm men sinh sản nảy chồi khi gặp điều kiện không thuận lợi một số có thể sinh sản theo cách tạo bào tử. [1, 12 ]. Sinh sản vô tính: Sinh sản nảy chồi là hình thức sinh sản phổ biến nhất. Khi tế bào phát triển đến mức độ nhất định thì cơ thể của nó đâm ra một chồi nhỏ gọi là mầm (hay chồi ). Mầm sinh ra ở vị trí lệch tâm trên đầu của tế bào mẹ. Cùng một lúc tế bào mẹ có thể đâm ra nhiều những chồi ở nhiều phía khác nhau. ở mỗi chồi sẽ nhận được một phần chất nhân và chất nguyên sinh ở tế bào mẹ. Sau khi nảy mầm tế bào con có thể tách khỏi tế bào mẹ sống độc lập, cũng có thể không tách khỏi tế bào mẹ mà tiếp tục nảy mầm tạo ra một lớp tế bào nấm men giống hình cành cây. Trong điều kiện thuận lợi một tế bào được hình thành điều chỉnh và tách khỏi tế bào mẹ với thời gian 20- 30 phút. Nấm men còn có khả năng hình thành bào tử. Bào tử túi được sinh ra trong những túi nhỏ gọi là túi nang. Mỗi túi nang chứa từ 1 – 8 bào tử. (Thường từ 4 bào tử ). Nấm men được tạo thành từ 1 tế bào riêng rẽ không qua tiếp hợp. Bào tử túi gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành tế bào nấm men. Tế bào này sinh sản theo lối nảy chồi (Lodder.J.1971 ). Sinh sản hữu tính là hình thức hợp nhất 2 tế bào nấm men thành hợp tử. Tế bào này phát triển thành túi trong đó có giảm nhiễm để hình thành các bào tử. Nhờ kính hiển vi điện tử khoa học đã thấy được sự khác nhau về thời gian hình thành thoi vô sắc trong sinh sản vô tính ở nấm men phân đôi và nấm men nảy chồi. Nấm men sinh sản vô tính bằng nảy chồi hoặc phân đôi. Giữa quá trình này có thể sinh sản hữu tính. 2.2.4. Nấm men thuần chủng Trong thiên nhiên tồn tại một số lượng lớn các chủng nấm men khác nhau, chúng có những đặc tính đặc biệt và được sử dụng trong sản xuất. Tế bào nấm men có thể tìm thấy ở khắp mọi nơi đặc biệt trên bề mặt trái cây. Tuy nhiên trên bề mặt trái cây tồn tại cả những nấm men dại, vi khuẩn, nấm mốc. Để tránh ảnh hưởng cuả nấm dại, vi khuẩn, nấm mốc,.. mà ngày nay xu thế lên men với chủng thuần khiết đang được phổ biến rộng rãi. Nấm men thuần chủng là nấm men được phát triển từ cùng một tế bào đã được phân lập và tuyển chọn trên môi trường Hansen. Nấm men được phổ biến và sử dụng nhiều trong sản xuất là loài Sacharomyces cerevisiae – loài này đôi khi được gọi là Sacharomyces ellípsoideus hoặc Sacharomyces vini nhưng những tên này được coi là lỗi thời, nó được đặt tên bởi Hoyer (1837 ), được mô tả từ đầu bởi Schwann trong cùng một năm. * Một số chủng hay dùng trong sản xuất rượu vang: Sacharomyces vini trước đây gọi là Sacharomyces cerevisiae vaxini nấm men này chiếm tới 80% Saccharomyces. Trong khi lên men loại này có khả năng lên men glucza, fructoza, mantoza, glactoza, lactoza, peptoza, dextrin. Saccharomyces oriformis được tách từ nước nho lên men tự nhiên, đặc biệt loại này chịu được đường cao, tạo độ rượu cao (10% V) trong qúa trình lên men. Trong quá trình lên men giống nhau tạo thành màng trên bề mặt dịch quả, có khả năng lên men glucoza, fructoza, mantoza. Saccharomyces cerevisiae dùng sản xuất bánh mỳ, bia rượu vang, trước đây gọi là Saccharomyces ellipsoides khi lên men đạt 10 – 20% V cồn. * Khả năng lên men đường của Saccharomyces Sự lên men rượu xảy ra qua một số giai đoạn trong thời kỳ đầu khi môi trường còn chứa nhiều hàm lượng oxy đã hoà tan, nấm men chủ yếu oxy hoá đường đến CO2 và H2O, và sinh sôi nảy nở một cách mạnh mẽ. Năng lượng của sự lên men không đảm bảo cho mức độ phát triển cao của tế bào thời kỳ này. Trong giai đoạn cuối cùng của sự lên men, vì đường còn lại ít trong môi trường nấm men sẽ sử dụng các glicogen đã được tích luỹ trong đó, do đó hàm lượng glicogen trong tế bào giảm dần. Tốc độ lên men của các chủng Saccharomyces lên men rượu bia là khác nhau đối với mỗi loại đường. Tốc độ lên men đường glucoza và fructoza nhanh hơn xaccaroza. Tốc độ lên men được xác định lượng CO2 bay ra từ một thể tích môi trường nhất định trong một đơn vị thời gian (Nelte và cộng sự, 1976 ). * Có nhiều ý kiến khác nhau về việc sử dụng chủng nấm men thuần chủng cho sản xuất rượu vang [7]. Nhưng chỉ từ khi có những hãng rượu sản xuất được vang ngon từ giống thuần chủng thì vấn đề này mới được quan tâm, phát triển. Nấm men sử dụng rộng rãi trong sản xuất là giống Saccharomyces cerevisiae. Chúng có sự luân phiên thế hệ n và 2n. Thành phần hoá học của nấm men dao động mạnh phụ thuộc vào dạng của chúng và môi trường nuôi cấy. Trung bình nấm men chứa 75% nước, 25% chất khô. Theo quan điểm kinh tế, người ta chia nấm men ra thành các chủng như sau: + Chủng lên men với hiệu suất cồn cao, ở thời gian tối ưu sản xuất thì đạt 20,5% V cồn. + Chủng lên men trong thời gian ngắn, sản sinh 8 – 12% V cồn, thậm chí ở nhiệt độ thấp 4 – 100 c không bị kìm hãm. + Chủng chịu được nông độ đường cao, lên men được rượu vang gần 30% đường với hàm lượng cồn 10 -13% V. 2.3. Các biến động sinh lý, sinh hoá vi sinh khi lên men rượu vang, khả năng lên men đường của Saccharomyces cerevisiae Quá trình sản xuất rượu vang bắt đầu bằng công đoạn: đầu tiên nấm men sinh sản trong môi trường dịch quả. Lúc đầu cần nhiều oxy kích thích sinh trưởng của nấm men. Sau đó tạo điều kiện lên men rượu etylic yếm khí nhanh chóng, chiếm toàn bộ khoảng không cho quá trình lên men tạo thành CO2 và rượu etylic xảy ra mạnh mẽ, sự lên men rượu etylic được biểu diễn theo phương trình sau: [1, 12]. C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 + Q Năng lượng sinh ra phục vụ cho hoạt động sống của tế bào nấm men và tích luỹ trong sản phẩm rượu. Quá trình lên men rượu xảy ra qua 5 giai đoạn: Giai đoạn 1: Giai đoạn hoạt hoá phân tử glucoza gồm 3 phản ứng. Phân tử glucoza nhở enzim: hexotrinaza chuyển một gốc photphat từ ATP sang tạo ra glucoza 6 -  là dạng hoạt động. Glucoza 6 - bị tác dụng của enzim iromeza chuyển thành fructoza 6 -  có cấu tạo kém bền vững hơn. Fructoza 6 –  bị photphoril hoá 2 lần nhờ enzim photphorictokinaza với sự tham gia của phân tử ATP lần 2 tạo ra fructoza 1,6 đi photphoglyxeric * Giai đoạn 2: Giai đoạn cắt mạch. Fructo 1,6 đi  dễ dàng biến đổi thành 3 – Photphoglyxeralđehyt và đioxyhiđrooxy axeton photphat nhờ xúc tác của enzim aldolaza. ở giai đoạn này dưới tác dụng của trioza – photphatizomericeza có thể chuyển hoá lẫn nhau. Đioxyaxeton photphat alđehyt – 3 – photphoglyxeric. * Giai đoạn 3: Oxy hoá Dưới tác dụng của enzim alđehyt photphoglyxeriđehyđrogenaz mà alđehyt – 3 – photphoglyxeric bị oxy hoá thành axit 1,3 đi phophoglixeric. Axit này chuyển gốc photphat cao năng cho ADP thành ATP. Phản ứng này có ý nghĩa hơn vì năng lượng giải phóng cho quá trình oxy hoá được tích luỹ trong các phân tử ATP, đảm bảo cung cấp năng lượng cho quá trình hoạt động của tế bào trong điều kiện không có oxy. Phản ứng do enzim photpho – glyxeratkitonaza xúc tác tạo axit 3 – photphoglyxeric. * Giai đoạn 4: Sự tạo thành axit piruvic Dưới sự tác dụng của enzim photphat glyxeranmutaza mà axit 3 – photphoglyxeric bị chuyển thành axit 2 – photphoglyxeric. Do tác dụng của enzim enolaza mà axit 2 – photphoglyxeric chuyển thành axit enol piruvic Dước sự tác dụng của enzim piruvat kinaza mà axit 2 photpho enol piruvic chuyển thành axit piruvic. * Giai đoạn 5: Sự chuyển axit piruvic thành rượu. Đầu tiên axit piruvic bị khử nhóm cacboxyl thành CO2 và axetalđehyt nhờ enzim xúc tác là pyruvat đecacbonxylaza. Sau đó axetalđehyt bị khử thành etanol nhờ enzim alcođehiđrogenaz. Phương trình tổng quát quá trình lên men: C6H12O6 + 2ADP+ 2H3PO4 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP + 6H2O Như vậy sự lên men chuyển đường thành rượu là một dãy các quá trình oxy hoá khử có enzim trong tế bào nấm men tham gia. 2.4. Hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men rượu vang, bệnh vang 2.4.1. Nấm men 2.4.2. Nấm mốc Nấm mốc phát triển ở quả, chất bã của sản xuất rượu vang, thùng chứa thiết bị hoặc do bụi, không khí đưa đến như nấm mốc thuộc chi Rhizopus, Aspergillus. 2.4.3. Vi khuẩn Trong nước hoa quả và nước rượu vang có thể phát triển những dạng vi khuẩn có tính ổn định lớn với rượu và axit hữu cơ. Chúng có thể gây ra những biến đổi sâu sắc trong rượu vang về vị chua, mùi và có loài còn gây bệnh làm đục cho vang, đó thường là các vi khuẩn Acetorbacter xylium, Acetorbacter aceti. Pasteur đã khám phá cơ chế làm hoá lỏng vang của các vi sinh vật khi rượu vang tiếp xúc với không khí nhiễm vi khuẩn Bacillus. Do vậy, để bảo quản rượu vang người ta có thể thanh trùng pasteur nhưng nó làm giảm chất lượng rượu vang, phương pháp vi lọc hoặc dùng một số chất bảo quản phổ biến như SO2 ( 75 – 120 mg/l ). 2.4.4. Bệnh vang Bệnh vang đã được Pasteur nghiên cứu và khám phá. Bệnh vang là hiện tượng rượu bị chua đi và phẩm chất giảm rất nhanh. [1,18]. Nguyên nhân: Do rượu vang tiếp xúc với không khí và do đó dưới tác dụng của vi khuẩn axit axetic phát triển đã biến cồn thành axit. Ngoài ra bệnh vang còn có thể do vi sinh vật lên men kỵ khí. 2.5. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng của nấm men 2.5.1. Nguồn cacbon Cacbon có trong tế bào chất thành tế bào, trong tất cả các phản ứng enzim axit nucleic và sản phẩm trao đổi chất. Vì vậy các hợp chất cacbon có vị trí quan trọng hàng đầu cho sự sinh trưởng nấm men. Nguồn thức ăn chủ yếu của nấm men là hyđrat cacbon, nó đáp ứng 3 nhu cầu của nấm men là: - Sản sinh năng lượng - Tạo thành những tiền chất - Thực hiện quá trình oxy hoá khử để biến những tiền chất này thành sản phẩm trung gian, để xây dựng tế bào hoặc tích tụ trong môi trường. 2.5.2. Nguồn nitơ và muối khoáng - Nguồn nitơ: Trong quá trình sống của nấm men cũng như tất cả những cơ thể sống khác đều cần nitơ để xây dựng tế bào. Do đó môi trường nuôi cấy cần cung cấp đầy đủ các hợp chất nitơ mà nấm men có thể đồng hoá. - Các nguyên tố của photpho, lưu huỳnh đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất của tế bào nấm men, tham gia chủ yếu vào thành phần của nhân, hạt nhiễm sắc thể, enzim. Các ion: Ca2+, Mg2+ điều chỉnh sự phát triển của tế bào nấm men. Các ion: Fe3+, Mg2+ nằm trong thành phần của enzim hoạt động sinh học cũng ảnh hưởng tới sinh trưởng và phát triển của nấm men [16]. 2.5.3. Nguồn Oxi Đối với nấm men dùng để lên men, oxi cần trong giai đoạn đầu giúp nấm men sinh trưởng, tăng sinh khối. Quá trình lên men rượu diễn ra ở điều kiện yếm khí để tăng hiệu quả tạo cồn. Sự khuấy đảo làm tăng tốc độ lên men, rút ngắn thời gian lên men có lợi về mặt kinh tế nhưng không có lợi về công nghệ do tạo sản phẩm bậc hai quá lớn. 2.6. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men 2.6.1. pH môi trường Trong quá trình nuôi cấy, pH môi trường bị biến đổi khiến cho sự sinh sản của nấm men cũng bị biến đổi, ở giai đoạn cuối pH tăng lên một ít do môi trường lúc này bắt đầu khan hiếm chất dinh dưỡng và hoạt lực enzim trong tế bào lớn. Vì vậy nấm men tự phân huỷ và giải phóng NH3. Khi pH dưới 2 – 3 thì quá trình lên men bị yếu đi. Nếu pH trên 6,5 – 7,5 khả năng lên men vang phát triển tốt: 4,0 – 5,0. 2.6.2. ảnh hưởng của nhiệt độ Quá trình lên men thường sinh ra nhiệt và lượng nhiệt này có ảnh hưởng lớn đến chất lượng rượu. Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến quá trình phát triển của nấm men do các phản ứng sinh hoá diễn ra trong tế bào đều chịu sự chi phối của nhiệt độ. Nhiệt độ giới hạn của men rượu vang là không quá 300 c. ở 35 0c được coi là nhiệt độ nguy hiểm, tuy nhiên đây không được coi là quy luật chung tuyệt đối về nhiệt độ. Nhiệt độ 35 0c nấm men mất tác dụng , quá trình lên men bị dừng lại nhưng không bị chết nấm men. Trong quá trình lên men rượu vang, việc khống chế nhiệt độ dưới 30 0c là điều rất quan trọng. Nếu vượt quá đến nhiệt độ tới hạn (350 c ), quá trình lên men rượu bị ngừng lại ảnh hưởng đến việc chuyển hoá đường thành cồn và CO2. Đồng thời lượng đường sót lại chưa được lên men là môi trường cho các vi khuẩn sinh khí hoạt động, đặc biệt vi khuẩn chuyển hoá đường thành axit lắc tíc hoặc axit axetic, đó là hiện tượng hoá chua axit, làm giảm chất lượng rượu vang. Ngược lại ở nhiệt độ thấp (<20 0c), quá trình lên men xảy ra chậm chạp, các cấu tử có lợi cho rượu vang được hình thành quá ít. Quá trình lên men bắt đầu tốt ở nhiệt độ 200 c, ở 25 0c quá trình lên men xảy ra rõ rệt sau 12 h, còn 17 - 18 0c xảy ra sau 24 h. Quá trình lên men không diễn ra ở nhiệt độ thấp 100c. Như vậy nhiệt độ thích hợp cho nấm men phát triển là 20 - 28 0c. 2.6.3. ảnh hưởng của nồng độ cồn Nghiên cứu cho biết nồng độ cồn thích hợp cho rượu vang phát triển tốt: 9 – 140. Hàm lượng cồn cao gây khó khăn cho quá trình lên men, làm chậm, thậm chí làm dừng lại quá trình lên men. ảnh hưởng của cùng một hàm lượng cồn ở 300 c và 200c là hoàn toàn khác nhau. ở 300 c cồn gây ảnh hưởng xấu hơn ở 20 0c. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc cải tạo chất lượng rượu vang. Nhiều thí nghiệm chỉ ra rằng, chính hàm lượng cồn cao (nồng độ cồn 14% ) đã cản trở sự lên men chứ không phải sự thiếu vắng các chất sinh trưởng hoặc sự tạo thành các chất kháng khuẩn. Để phục vụ cho công nghiệp sản xuất rượu vang, cải thiện chất lượng vang, nhiều nhà nghiên cứu đã tạo ra những nòi nấm men thích ứng với nồng độ cao. Việc sử dụng các nòi nấm men này là bổ ích song các nòi này rất nhạy cảm với nhiệt độ cao. 2.6.4. ảnh hưởng của nồng độ đường và áp suất thẩm thấu Ngoài yếu tố pH, nhiệt độ, độ cồn thì nồng độ đường cũng là một yếu tố quan trọng, ảnh hưởng đến quá trình lên men. Nồng độ đường cao, ức chế quá trình lên men. Nồng độ đường thích hợp khoảng 200 – 280 g/l. Nếu cao hơn nữa tốc độ lên men giảm đi. Đường và các chất hoà tan khác trong môi trường tạo áp suất, áp suất thẩm thấu chênh lệch giữa tế bào nấm men và môi trường nuôi cấy. Sự chênh lệch này làm cho các chất dinh dưỡng dễ hòa tan và thấm vào môi trường tế bào qua màng và sản phẩm của tế bào hoà tan vào môi trường. áp suất thẩm thấu quá cao gây hiện tượng khô sinh lý teo chất nguyên sinh. Nồng độ quá cao tế bào nấm men không sinh trưởng được. Nồng độ đường quá thấp tế bào sẽ ngừng phát triển. Phần 3 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 3.1. Đối tượng nghiên cứu Quả vải thiều (Litchi chinensis sonn ) được thu nhận từ hai trung tâm trồng và thu hoạch nhiều nhất ở Việt Nam là huyện Lục Ngạn (Bắc Giang ) và Thanh Hà (Hưng Yên ). Các chủng nấm men nghiên cứu được phân lập từ dịch cùi quả vải thiều có vị trí phân loại theo Yelinov N.(1996 ) sau đây: Lớp : Ascomycetes Bộ : Saccharomyateae Họ phụ : Saccharomyateaetdieae Giống : Saccharomyces Loài : Cervisiae 3.2. Hoá chất - Đường: glucoza, sacaorza. - Một số chất vô cơ: KH2SO4 ( Kalihiđrophotphat ). MgSO4. 7H2O ( Magie sun phat ). - Một số chất hữu cơ: Thạch agar, peptôn, phenolphtalein. - Nước cất, nước máy. - Cồn. 3.3. Dụng cụ thiết bị - Nồi hấp áp lực. - Cồn kế. - Kính hiển vi quang học. - Buồng đếm Goriaev. - Cân kỹ thuật và cân phân tích. - Tủ sấy. - Buồng vô trùng. - ống nghiệm. - Máy đo pH và giấy đo pH. - Hộp pêtri. - Bình cầu, bình tam giác. - Bàn trong thuỷ tinh, phễu thuỷ tinh, côc thuỷ tinh. - Que cấy, đèn cồn. 3.4. Môi trường Dựa vào tính chất của nấm men Saccharomyces cerevisiae chúng tôi chọn môi trường vô cơ theo tỷ lệ sau: 3.4.1. Môi trường Hansen (MT1 ) g/l: Môi trường phân lập và sơ tuyển chủng nấm men - Đường glucoza : 50 g. - Pepton : 5,0 g. - MgSO4. 7 H2O : 0,5 g. - KH2PO4 : 1,0 g. - (NH4)2SO4 : 1,0 g. - Thạch agar : 20 g. - Nước cất : 1000 ml. 3.4.2. Môi trường nhân giống (MT2 ): g/l. - Đường glucoza : 50 g. - Pepton : 5,0 g. - MgSO4. 7 H2O : 0,5 g. - KH2PO4 : 1,0 g. - (NH4)2SO4 : 1,0 g. - Nước cất : 1000 ml. 3.4.3. Môi trường lên men (MT3 ) : g/l. - Dịch siro hoa quả :200 - MgSO4. 7 H2O : 1,0 g. - KH2PO4 : 1,0 g. - (NH4)2SO4 : 1,0 g. - Nước cất : 1000 ml. 3.5. Phương pháp nghiên cứu: Trong đề tài này tôi sử dụng phương pháp nghiên cứu sau: Tuyển chọn khuẩn lạc nấm men. Xác định hoạt lực lên men bằng: + Cân bình trọng lượng. +Xác định số lượng tế bào trên buồng đếm Goriaev và hoạt hoá giống. Xác định hàm lượng đường bằng khúc xạ kế. Xác định độ pH bằng giấy đo pH và máy đo pH. Quan sát tế bào nấm men trên kính hiển vi quang học có độ phóng đại 1000 lần. Các phương pháp phân tích: + Xác định hàm lượng axit trong dịch lên men bằng chuẩn độ NaOH 0,1 N. + Xác định độ cồn bằng ancol kế rồi quy về độ cồn chuẩn 150c, bằng phương pháp hoá học. Xử lý số liệu bằng thống kê toán học. 3.5.1. Phân lập và tuyển chọn khuẩn lạc nấm men trên môi trường thạch đĩa: Để tuyển chọn một tập hợp tế bào nấm men của cùng một nòi có kích thước hình thái và khả năng lên men như nhau, chúng tôi chọn phương pháp phân lập trên hộp pêtri. Môi trường để tuyển chọn khuẩn lạc nấm men là Hansen. Các tiến hành: Môi trường phân lập được khử trùng và phân vào các hộp pêtri vô trùng để nguội theo phương pháp Pasteur. Dịch hoa quả đã được pha loãng 10-1- 10-10 bằng nước cất. Nhờ một hai giọt huyền phù với độ pha loãng 10-9 lên bề mặt thạch dàn đều bằng bàn trang. Gói kín và nuôi trong tủ ẩm ở điều kiện 24 – 280c trong 4 ngày trên bề mặt xuất hiện các khuẩn lạc, với các đặc điểm trắng, bóng đặc trưng cho nấm men (mép răng cưa và nhẵn bóng ). 3.5.2. Phương pháp hoạt hoá giống Trước khi cấy nấm men vào dịch lên men để có những tế bào to khoẻ thì tôi tiến hành hoạt hoá giống bằng cách nuôi trên môi trường thạch nghiêng 24 – 280c trong vòng 24 h trên máy lắc. Sau đó đem cấy vào dịch nhân giống được pha ở nồng độ đường 10% trong vòng 24 h được giống cấp hai. 3.5.3. Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men Để biết được hoạt lực lên men so sánh giữa các chủng, chúng tôi đã tiến hành dùng các phương pháp sau: * Phương pháp cân bình trọng lượng: Dịch lên men trong các bình có cùng thể tích 250 ml môi trường, có cùng một lượng tế bào nấm men của các giống khác nhau. Sau 24 h lên men đem cân trọng lượng chênh lệch giữa 2 lần cân là 0,1 thì dừng lại. * Phương pháp xác định tế bào bằng buồng đếm Goriaev: Cấy giống vào môi trường nhân giống ở 280c, lắc đều canh trường dùng pipet chia độ pha loãng canh trường. Tuỳ theo mức độ giai đoạn phát triển mà độ pha loãng theo tỷ lệ khác nhau. Dùng pipet lấy dịch pha loãng nhỏ vào một khe hở giữa hai tấm kính, chú ý tránh tạo bọt khí sau đó đặt lá kính lên trên để yên 3 – 5 phút rồi tiến hành soi trên kính hiển vi ở vật kính 10 và 40 đếm số tế bào trong 5 ô lớn chéo nhau. Cách tính số tế bào trong 1 ml : M = A. 50. B. Trong đó: M: Số tế bào trong 1 ml dịch huyền phù. A: Số lượng tế bào trung bình trong 1 ô vuông. B : Hệ số pha loãng. 3.5.4. Phương pháp phân tích + Xác định hàm lượng đường bằng khúc xạ kế. + Xác định độ pH bằng giấy đo pH và máy đo pH. + Xác định hàm lượng axit trong dịch lên men bằng cách: Dựa vào nguyên tắc trung hoà axit bằng dung dịch NaOH 0,1 N từ số ml NaOH 0,1 N dùng để chuẩn ta suy ra hàm lượng axit trong dịch lên men. Phản ứng trung hoà: OH- + H+ H2O 3.5.5. Quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi Quan sát hình thái tế bào nấm men trên kính hiển vi quang học có độ phóng đại 1000 lần. 3.5.6. Phương pháp xử lý các kết quả bằng thống kê toán học Xử lý các kết quả nghiên cứu và đánh giá theo phương pháp thống kê toán học thông qua các thông số sau: - Giá trị trung bình số học: = - Độ lệch chuẩn: = nếu n < 30 = nếu n 30 - Sai số trung bình số học: m = - Hệ số biến động: Cv % = . 100 (%). n : Số lần lặp lại. Xi : Giá trị đo lần thứ i. Phần 4 Kết quả nghiên cứu và thảo luận 4.1. Phân lập, tuyển chọn và định loại chủng nấm men 4.1.1. Tiêu chuẩn chọn chủng Quá trình sản xuất etanol phụ thuộc vào chủng dùng trong lên men. Nấm men sử dụng để lên men rượu vang từ dịch vải thiều phải đạt các yêu cầu sau: [10, 12]. - Lên men tốt trong môi trường có hàm lượng đường cao. - Chịu độ cồn và độ axit cao. - Tốc độ phát triển nhanh, chu kỳ lên men ngắn. - Hương thơm có tạo các este đặc biệt. - Dễ lắng trong. - ổn định lâu dài trong sản xuất. 4.1.2. Phân lập và tuyển chọn Môi trường phân lập là môi trường Hansen được thanh trùng theo phương pháp Pasteur sau đó được phân vào các đĩa petri đã vô trùng. Dịch vải được pha loãng từ 10-1 – 10-10, dùng pipet lấy 1 ml dịch huyền phù 10-9 mở hé đĩa petri nhỏ vào đó từ 1 – 2 giọt, dùng bàn trang vô trùng nhẹ nhàng dàn đều thể tích đó khắp bề mặt môi trường. Nuôi trong tủ ấm 280 c trong thời gian 48 giờ. Sau 12 lần phân lập chúng tôi đã chọn được 35 mẫu nấm men. Khi có mẫu tiến hành lựa chọn 2 mẫu có đường kính khuẩn lạc lớn nhất và khả năng lên men cao nhất đưa sang nghiên cứu tiếp. Hai mẫu nấm men này tạm thời được gọi là H7 và C13. 4.1.3. Xác định tên khoa học của hai mẫu nấm men H7 và C13 Dựa vào khoá phân loại của Loder năm 1971 (Khoá phân loại mới được nhiều người sử dụng ), theo khóa phân loại này cả hai mẫu nấm men nghiên cứu đều có đặc tính [10]: - Sinh sản bằng nảy chồi nhiều phía. - Không đồng hoá nitrat. - Tế bào hình trứng, ovan, hình cầu. - Lên men Glucôza mạnh. - Lên men được saccaroza, galactoza, mantoza. - Điều kiện không thuận lợi hình thành 1 4 bào tử. - Mỗi nang chứa 2 4 bào tử. Từ đó tạm thời đặt tên cho 2 mẫu nấm men là Sacharomyces cerevisiae H7 và C13. 4.2. Xác định hoạt lực lên men Trong quá trình lên men thì hoạt lực lên men được đánh giá bằng hàm lượng CO2 sinh ra. Lượng CO2 sinh ra càng nhiều, thoát ra ngoài môi trường thì trọng lượng bình lên men càng giảm. Điều đó chứng tỏ hoạt lực lên men càng mạnh. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên hai chủng H7 và C13 với số lần nhắc lại là 8 lần, thu được kết quả lượng CO2 thoát ra trong 72 h từ khi lên men ở bảng số 2. Bảng 2.Hàm lượng khí CO2 giải phóng sau 72 h lên men của hai chủng nấm men Sacharomyces cerevisiae H7 và C13. Tên chủngHàm lượng CO2 (g/100 ml )TN1TN2TN3TN4TN5TN6TN7TN8H72,32 2,362,30 2,582,602,352,472,40C132,602,482,452,322,302,58 2,282,35 Qua kết quả nghiên cứu cho thấy hai chủng H7và C13 đều lên men mạch, lượng CO2 thoát ra nhiều, phủ kín bề mặt lên men làm môi trường lên men ít bị ô nhiễm. Sự phát triển nhanh của tế bào nấm men làm cho vi khuẩn, nấm men dại khó xâm nhập, với lượng CO2 thoát ra đạt trên 4g/100 ml là đạt yêu cầu dùng cho lên men rượu vang các loại hoa quả. Vì vậy, hai chủng này được nghiên cứu tiếp động thái phát triển [10]. 4.2.2. Động thái phát triển của hai chủng nấm men Sacharomyces cerevisiae H7 và C13 Trong qúa trình sản xuất rượu vang giai đoạn nhân giống chiếm một thời gian ngắn khoảng 24 – 28 h, nhưng nó lại đóng vai trò hết sức quan trọng trong quá trình tăng nhanh số lượng của tế bào nấm men. Việc nghiên cứu các nhân tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển 2 chủng H7 và C13 là một phần trong quá trình sản xuất rượu. Chúng tôi tiến hành nuôi cấy trên môi trường số 2 (môi trường nhân giống ) ở điều kiện môi trường 280c, số tế bào ban đầu 3,5 . 106 tế bào, cứ sau 12 h kiểm tra 1 lần. Mục đích là xác định động thái phát triển của 2 chủng nấm men H7 và C13. Kết quả thí nghiệm được diễn ra ở bảng 3 và đồ thị 2. Bảng 3. Động thái phát triển của 2 chủng nấm men S . cerevisiae H7 và C13 Thời gian(h)H7C13M.106m (%)Cv (%)M.106m (%)Cv (%)03,5  0,20,000,003,5  0,20,000,0046,2  20,140,248,0  30,150,24811,8  2,50,120,2012,6  340,140,221214  20,120,2016 0,410,130,201628,2  0,360,080,1428  0,260,100,162037  0,230,060,1039  0,250,070,112446  0,250,030,0548  0,280,020,032852  0,360,020,0356  0,320,020,033268  0,420,030,0578  0,380,040,063682  0,380,070,1290  0,420,070,1140108  0,460,140,24112  0,480,140,2244116  0,420,160,25126  0,380,170,2748124  0,490,180,31138  0,510,210,3352120  0,430,150,22134  0,370,170,27 Số lượng tế bào ( M.106) Thời gian(h) Đồ thị 2. Động thái phát triển của 2 chủng H7 và C13. Như vậy cả 2 chủng H7 và C13 đều có khả năng phát triển tốt và theo đúng động thái phát triển . Từ kết quả trên ta xác định được động thái phát triển của 2 chủng như sau: - Pha tiền phát: từ 0h – 12h, vì giai đoạn này tế bào mới thích nghi với môi trường, kích thước tế bào tăng dần lên. - Pha logarit (pha cấp số mũ ): từ 12h – 48h, tế bào nấm men phát triển nhanh do lượng vật chất tích luỹ ở pha tiền phát. - Pha cân bằng: từ 48h – 60h, số lượng tế bào không tăng. - Pha suy vong: Tốc độ sinh trưởng của nấm men giảm nhanh do vậy nấm men chết nhiều. Một số nghiên cứu trước đây cho thấy kết quả là pha logarit từ 12h – 96h. Tuy nhiên pha logarit của 2 chủng H7 và C13 mà chúng ta đã nghiên cứu chỉ tồn tại từ 12h – 48h. Nguyên nhân do môi trường có độ cồn cao, độ pH thấp mà các tế bào nấm men sinh ra đã lên men, làm ức chế sự sinh trưởng của nấm men. 4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng và phát triển của 2 chủng nấm men Sacharomyces cerevisiae H7 và C13 trong môi trường lên men Như chúng ta đã biết hàm lượng rượu etylic tạo thành, lượng axit hữu cơ sinh ra sẽ quyết định đến chất lượng rượu vang. Do đó việc nghiên cứu yếu tố của môi trường đến quá trình lên men rượu vang là vấn đề cần thiết. Sự biến đổi các yếu tố môi trường trong một phạm vi nhất định sẽ ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của tế bào nấm men. Môi trường chúng tôi dùng để lên men là môi trường số 3 (MT3 ) môi trường được bổ sung đường cho đủ 210 g/l, hàm lượng men sót, hàm lượng rượu tạo thành, lượng CO2 giải phóng, các chỉ tiêu được xác định sau 15 ngày. Kết quả được dẫn ra ở bảng 4 và đồ thị số 2, 3. Bảng 4. Nồng độ cồn, hàm lượng đường sót,hàm lượng CO2, độ pH trong dịch lên men sau 15 ngày của 2 chủng H7 và C13 Thời gian (ngày)Đường (g/l)CO2 (g/l)Rượu (% V)pHH7C13H7C13H7C13H7C13121021000004,54,52180,6 1182 117,8 0,518 0,51,8 0,052,0 0,054,394,403160,5 1162,3 119,2 0,519,3 0,52,1 0,052,2 0,054,324,384143,1 1140,4 120,5 0,521,4 0,52,8 0,053,1 0,054,284,275110,4 1108,5 125,3 0,526,1 0,53,5 0,053,7 0,054,154,13687,9 0,886,3 0,828,9 0,529,4 0,54,1 0,054,2 0,054,114,09763,5 0,660,2 0,632,4 0,535,2 0,54,9 0,054,8 0,054,074,05858,6 0,659,3 0,640,1 0,540,4 0,55,5 0,055,6 0,054,04,0946,2 0,445,7 0,446,2 0,548,6 0,56,3 0,056,5 0,053,923,931037,1 0,439,2 0,453,5 0,559,2 0,57,7 0,057,4 0,053,863,821131,2 0,330,7 0,360,2 0,563,8 0,58,4 0,058,6 0,053,733,761222,8 0,323 0,378,1 0,580,2 0,59,3 0,059,4 0,053,623,641315,3 0,215,9 0,283,6 0,587,9 0,510,4 0,0510,6 0,053,513,561410,2 0,211,4 0,291,3 0,593,8 0,511,5 0,0511,5 0,053,333,29155,3 0,25,2 0,2103,8 0,5100,4 0,512,8 0,0512,9 0,053,203,21  Đồ thị 2. Nồng độ cồn, hàm lượng đường sót,hàm lượng CO2, độ pH trong dịch lên men sau 15 ngày của Sacharomyces cerevisiae H7 Đồ thị 3. Biểu diễn Nồng độ cồn, hàm lượng đường sót,hàm lượng CO2, độ pH trong dịch lên men sau 15 ngày của Sacharomyces cerevisiae C13 Qua bảng 4 và đồ thị 2, 3 cho thấy chủng Sacharomyces cerevisiae H7 và C13 phát triển mạnh bắt đầu từ ngày thứ 2 trở đi vì nó được đánh dấu bằng sự giảm đi hàm lượng đường trong dung dịch lên men. Sự giảm hàm lượng đường tăng mạnh ở các ngày tiếp theo. Đồng thời với sự giảm hàm lượng đường là sự tăng lên của khí CO2 thoát ra. Độ rượu cũng tăng và đạt cực đại vào ngày 15 là 12,8% V (H7 ) và 12,9% V (C13 ). Qúa trình lên men hàm lượng axit tăng lên làm pH của môi trường giảm mạnh từ 4,5 xuống 3,20 (H7 ), 3,21 (C13 ) tạo nên vị chua của rượu vang. 4.3.1. ảnh hưởng của hàm lượng đường tới quá trình lên men Quá trình lên men quyết định chất lượng rượu vang. Môi trường lên men có nhiều đặc điểm khác so với môi trường nhân giống: hàm lượng đường trong môi trường lên men cao hơn, thời gian kết thúc qúa trình lên men dài hơn. Quá trình lên men kỵ khí hoàn toàn còn quá trình nhân giống thông khí. Nếu như tốc độ sinh trưởng và phát triển của tế bào nấm men là nhân tố chính của quá trình nhân giống thì trong qúa trình lên men lại dựa vào các tiêu chuẩn khả năng sinh rượu, tạo hương, khả năng chuyển hoá đường, màu sắc sản phẩm. Trng qúa trình lên men, hàm lượng rượu sinh ra chủ yếu từ quá trình chuyển hoá đường của nấm men. Do đó, yếu tố môi trường phải nghiên cứu đầu tiên là ảnh hưởng của hàm lượng đường tới quá trình lên men. Theo tính toán, hàm lượng đường thích hợp cho nấm men là 200 – 240 g/l. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thí nghiệm với các hàm lượng 200, 210,220, 230, 240 g/l với hai chủng Sacharomyces cerevisiae H7 và C13. Các chỉ tiêu khác vẫn giữ nguyên pH = 4,5, giống 12%. Theo dõi quá trình lên men và phân tích chủ tiêu đánh giá: hàm lượng CO2 thoát ra (g/1000 ml ), số lượng tế bào sau 72h, phân tích nồng độ cồn và hàm lượng đường sót trong dịch lên men sau 360h kết quả được dẫn ra ở bảng 5.1,5.2,6 và biểu đồ 1,2. Bảng 5.1. Kết qủa về ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình lên men của chủng nấm men H7 Chỉ tiêuĐơn vịHàm lượng đường trong dịch lên men chủng H7200210220230240CO2g/l2,752,882,722,552,13Đường sótg/l5,80,25,30,26,00,26,10,26,50,2`Cồn%V10,10,212,80,211,00,211,50,212,40,2 Bảng 5.2. Kết qủa về ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình lên men của chủng nấm men C13 Chỉ tiêuĐơn vịHàm lượng đường trong dịch lên men chủng C13200210220230240CO2g/l3,163,323,02,92,45Đường sótg/l6,10,25,20,25,70,26,40,27,00,2Cồn%V12,20,212,90,211,20,211,60,212,40,2 Biểu đồ 1. Biểu diễn hàm lượng đường sót trong dung dịch lên men ở các hàm lượng đường khác nhau của chủng nấm men H7 và C13 Biểu đồ 2. . Biểu diễn hàm lượng cồn sinh ra trong dung dịch lên men ở các hàm lượng đường khác nhau của chủng nấm men H7 và C13 Bảng 6. ảnh hưởng của nồng độ đường tới sự sinh sản và phát triển của chủng nấm men Sacharomyces cerevisiae H7 và C13 ( x 106 tế bào/ml ) Hàm lượng đườngTên chủngThời gian(h)12243648607284200H7131261532783120412851235C13121231552743115412551204210H7141321622903130513551295C13141301572853127513551285220H7121251462733110412551204C13141221482703148412041154 230H712121141265396411041204C1311123142264395410741184Số lượng tế bào H7 (x106TB/ml) 240H71011813726027238531104C1380,82013825927538831074 Thời gian 12 24 36 48 60 72 84 Đồ thị 4 . Biểu diễn ảnh hưởng của hàm lượng đường tới sự sinh sản và phát triển của chủng saccharomyces cerevisiae H7(106TB/ml) Số lượng tế bào chủng H7 (x106 TB/ml) Đồ thị 5 . Biểu diễn ảnh hưởng của hàm lượng đường tới sự sinh sản và phát triển của chủng Saccharomyces cerevisiae C13(106TB/ml) Thời gian 12 24 36 48 60 72 84  Qua bảng 5.1,5.2,6 và đồ thị 4,5, biểu đồ 1,2 ta thấy khi hàm lượng đường trong dịch men cao thì hàm lượng đường sót cũng tăng, đặc biệt ở hàm lượng 240 (g/l) thì hàm lượng đường sót cao nhất là 6,5 (g/l ) và 7,0 (g/l ) đồng thời làm lượng cồn cũng là cao nhất 6,5 (g/l ) và 7,0 (g/l ). Hàm lượng đường trong dịch lên men càng cao thì hàm lượng đường sót, axit sinh ra cũng tăng nhưng hiệu suất lên men rượu vang bị giảm. Điều này là hoàn toàn phù hợp vì hàm lượng đường trong dịch lên men càng cao thì áp suất thẩm thấu càng lớn sẽ ức chế sự phát triển của nấm men và hạn chế quá trình tạo cồn. Mẫu rượu vang lên men từ dịch có hàm lượng đường 210 g/l, hàm lượng cồn sinh ra cao nhất 12,4 % V (H7), 12,6% V (C13) và hàm lượng đường sót thấp nhất 5,3 g/l (H7 ) và 5,2 g/l (C13). [6,10, 14]. Tương đương với vang bữa ăn. Chính vì vậy, chúng tôi chọn hàm lượng đường thích hợp trong dung dịch lên men là 210 g/l cho 2 chủng nấm men này. Theo kết quả nghiên cứu của tác giả Đinh Thi Kim Nhung, Đoàn Văn Tân hàm lượng đường thích hợp là 240 (g/l), 200 ( g/l) hàm lượng đường mà chúng tôi nghiên cứu là khác bởi vì: Do đặc tính sinh lý di truyền của hai chủng: Sacharomyces cerevisiae H7 và C13. Theo bảng 1 thành phần hoá học quả vải khác nhiều so với thành phần hoá học các loại quả, đặc biệt hàm lượng đường tổng số khá cao: Vải Lục Ngạn 152g/l, vải Thanh Hà 185g/l [12]. Trong môi trường nhân giống và môi trường lên men nguồn cơ chất đóng vai trò rất quan trọng. Nếu cung cấp đầy đủ nguồn dinh dưỡng thì ở giai đoạn đầu tế bào nấm men phát triển mạnh sau đó khi cạn kiệt nguồn dinh dưỡng chúng phát triển kém. Để tránh ảnh hưởng của môi trường giàu dinh dưỡng chúng tôi giảm bớt thành phần pepton còn khoảng gần 3/4 hoặc 1/2 tổng số. Tuy nhiên kết quả này đều nằm trong khoảng thích hợp cho sự phát triển của nấm men. Do đó chúng tôi chọn hàm lượng thích hợp là 210g/l. 4.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaCl Để xác định nồng độ NaCl cho 2 chủng H7 và C13 chúng tôi tiến hành thí nghiệm lên men ở hàm lượng đường 21%, KH2PO41 ‰ và NaCl ở các nồng độ 1 ‰, 2 ‰, 3 ‰ nhằm xác định nồng độ muối ăn phù hợp cho chủng Sacharomyces cerevisiae H7 và C13 sinh trưởng và phát triển. Theo dõi các chỉ tiêu nghiên cứu hàm lượng đường sót, nồng độ cồn, số lượng tế bào sau 120h trong dịch lên men. Kết quả thu được dẫn ra ở bảng 7,8 và đồ thị 6,7, biểu đồ 3, 4. Bảng 7. ảnh hưởng của nồng độ NaCl tới qúa trình lên men chủng Sacharomyces cerevisiae H7 và C13 Chỉ tiêu nghiên cứuĐơn vịNồng độ NaCl trong dịch lên menH7C131 ‰2 ‰3 ‰1 ‰2 ‰3 ‰đường sót(g/l )6,40,35,30,27,40,46,80,35,20,27,30,4Cồn(% V)11,00,212,50,210,70,210,80,212,80,211,30,2 Đồ thị 3: ảnh hưởng của nồng độ NaCl tới qúa trình lên men chủng Sacharomyces cerevisiae H7 và C13 Đồ thì 4: ảnh hưởng của nồng độ NaCl tới qúa trình lên men chủng Sacharomyces cerevisiae H7 và C13 Bảng 8. ảnh hưởng của nồng độ NaCl tới sự sinh sản và phát triển của chủng nấm men Sacharomyces cerevisiae H7 và C13 ( X 106 tế bào/ml ) N. độ NaClTên chủngThời gian (h )12243648607284961081201H711,0165,0387,0452,02502452452402382322C1312,0170,0390,0478,045124824624323723422H716,0180,0312051005954884814733583372C1317,0186,03124596,049448547836635233623H712,0170,03106587,04753623553482412332C1313,0176,03101584,04703643533452372302 Đồ thị 6. Biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ muối tới sự sinh sản và phỏt triển của chủng saccharomyces cerevisiae H7 (x106TB/ml) Đồ thị 7. Biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ muối tới sự sinh sản và phỏt triển của chủng saccharomyces cerevisiae C13 (x106TB/ml) Qua bảng 7, 8 và đồ thị 6, 7, biểu đồ 3, 4 ta thấy việc bổ sung hàm lượng muối NaCl trong môi trường lên men có ý nghĩa rất lớn bởi nó cung cấp thêm nguồn khoáng Na+ cho tế bào nấm men phát triển. ở đây nồng độ NaCl 2 ‰ thì số lượng tế bào nấm men Sacharomyces cerevisiae phát triển mạnh nhất, nó được đánh dấu bằng hàm lượng đường sót thấp nhất 5,3 g/l (H7 ) và 5,2 g/l (C13 ). Hàm lượng rượu sinh ra cao nhất 12,8% V (H7 ) và 12,9% V (C13 ) đồng thời giá trị cảm quan sản phẩm là tốt nhất. Do đó, chúng tôi quyết định chọn nồng độ NaCl bổ sung vào môi trường lên men thích hợp là 2 ‰. Theo kết quả nghiên cứu trước của T.S Đinh Thị Kim Nhung, Đoàn Văn Tân,Trần Văn Tuyển, Nguyễn Thị Tố Nga thì nồng độ NaCl đều ở mức thích hợp nhất định 2 ‰ cho quá trình lên men vang vải thiều. 4.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ KH2PO4 Để xác định nồng độ KH2PO4 thích hợp cho 2 chủng S . cerevisiae H7 và C13, chúng tôi tiến hành thí nghiệm lên men ở hàm lượng đường 21%, NaCl 2%0 và KH2PO4 ở các nồng độ 0,6%0; 0,8%0; 1%0; 1,2%0. Chỉ tiêu đánh giá : hàm lượng đường sót lại và nồng độ cồn trong dung dịch lên men. Chúng tôi thấy rằng khi bổ sung vào môi trường lên men một lượng nhỏ KH2PO4 (1%0) thì tốc độ lên men đạt lớn nhất. Biểu hiện ở nồng độ cồn trong dịch lên men sau 360h đạt giá trị lớn nhất là 11,4 đối với chủng H7 và 11,7 đối với chủng C13. Hàm lượng đường sót trong dịch lên men sau 360h đạt giá trị nhỏ nhất là 5,6 % đối với chủng H7 và 5,4 % đối với chủng C13. Nguyên nhân là khi bổ sung vào môi trường một lượng nhỏ KH2PO4 có nghĩa là ta đã cung cấp nguyên liệu cho quá trình tổng hợp các hợp phần của tế bào có chứa photpho, tế bào chất và chất nhân, đồng thời điều chình hoạt tính hệ enzim đồng hóa các loại thức ăn cacbon, thúc đẩy quá trình trao đổi chất của tế bào nấm men. Tuy nhiên, nếu bổ sung quá nhiều sẽ làm rối loạn quá trình sinh tổng hợp các chất của tế bào, nếu quá ít làm quá trình trao đổi chất diễn ra chậm chạp, tốc độ lên men yếu. Một số nghiên cứu của tảc giả đi trước cũng thu được kết quả như trên. Vì vậy tôi khẳng định lượng KH2PO4 thích hợp là 1%0. Kết luận: Môi trường dinh dưỡng phù hợp với chủng Sacharomyces cerevisiae H7 và C13là: Hàm lượng đường Saccharoza: 210g/l Nồng độ NaCl :2 0/00 Nồng độ KH2PO4 :1 0/00. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện lên men với chủng Sacharomyces cerevisiae H7 và C13. Sự sinh trưởng, phát triển của tế bào nấm men không chỉ phụ thuộc vào các yếu tố của môi trường dinh dưỡng, mà còn phụ thuộc vào hàm lượng men giống,độ pH ban đầu, nhiệt độ. Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu xác định điều kiện thuận lợi nhất về hàm lượng men giống, pH ban đầu, nhiệt độ cho quá trình lên men với chủng Sacharomyces cerevisiae H7 và C13. ảnh hưởng của hàm lượng men giống Quá trình sản xuất rượu vang phụ thuoch rất nhiều vào hàm lượng men giông đưa vào, vì nó là tác nhân chính của quá trình lên men. Hàm lượng men giống nhiều quá trình lên men được thúc đẩy nhưng nếu nhiều quá sẽ xảy ra cạnh tranh nguồn dinh dưỡng đến lên men. Để xác định được hàm lượng men giống thích hợp, chúng tôi tiến hành thí nghiệm với 2 chủng S. cerevisiae H7 và C13 trên môi trường lên men có hàm lượng đường 210g/l, NaCl 2%0, KH2PO41%0, với hàm lượng men giống: 8%, 10%, 12%,14%. Theo dõi sự sinh trưởng , phát triển của 2 chủng S .cerevisiae H7 và C13 bằng cách đếm số lượng tế bào sau 72h. phân tích nồng độ cồn và hàm lượng đường sót trong dung dịch lên men sau 360h . Ta thấy khi hàm lượng men giống tăng từ 8 – 12% thì hiệu suất lên men tăng dần và đạt cao nhất ở hàm lượng men giống là 12% cụ thể: đối với chủng H7 số lượng tế bào lớn nhất là 128 . 106 tế bào ở 48 – 60h, hàm lượng đường sót là 5,3 g/l, độ cồn là 12,8%V. Đối chủng C13: số lượng tế bào lớn nhất là 132.106 tế bào ở 48 – 60h, hàm lượng đường sót là 5,2 g/l, độ cồn là 12,9%V. Trong khi ở hàm lượng giống 14% tế bào nấm men phát triển và đạt giá trị tối đa sớm (nhanh đạt đến logarit) nhưng lại giảm rất nhanh ở pha suy vong do môi trường cạn kiệt chất dinh dưỡng. Khả năng chuyển hoá đường diễn ra trong thời gian ngắn do đó độ đường sót cao, độ rượu thấp. ở hàm lượng giống 12%, tế bào nấm men phát triển từ từ, đạt pha logarit chậm hơn nhưng lại giảm dần dần ở pha suy vong, vì vậy thời gian chuyển hoá đường dài hơn. ở hàm lượng giống 8 – 10 %, số lượng tế bào ít do đó đạt giá trị lớn nhất ở pha logarit thấp, vi khuẩn lây nhiễm xâm nhập, có xuất hiện màng vi khuẩn sau thời gian lên men chính. Xét về mặt kinh tế nếu hàm lượng men giống quá lớn thì hiệu quả kinh tế thấp. Đối chiếu với kết quả của một số tác giả đi trước của T.S Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Ngọc Linh tôi thấy ở hàm lượng men giống 12% là thích hợp cho quá trình lên men. ảnh hưởng của pH ban đầu pH của môi trường lên men cũng là một yếu tố làm ảnh hưởng đến khả năng sinh sản và phát triển của nấm men. Để nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình lên men chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên môi trường lên men. Riêng độ pH ban đầu được giữ lại ở mức pH =3,5; 4,5; 5,5; 6. Chúng tôi thấy rằng pH ban đầu từ 3,55 thì cả 2 chủng đều có xu thế chung hàm lượng rượu sinh ra tăng và cao nhất ở pH=4,5 như H7là 12,6% còn C13 là 12,7%. Đồng thời hàm lượng đường sót thấp. Khi độ pH tăng 56 thì hàm lượng rượu sinh ra giảm.. Ví dụ pH=6 H7 là 10,2% và C13 là 10,5%. Như vậy pH ban đầu cao thì không thuận lợi cho quá trình lên men có thể không tạo môi trường axit thích hợp cho nấm lên men. Từ kết quả và nhận xét trên tôi quyết định lấy pH=4,5 là pH thích hợp cho quá trình lên men. ảnh hưởng của nhiệt độ lên men tới quá trình lên men Yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng đến cả quá trình lên men song mỗi chủng nấm men đều có giới hạn nhiệt độ nhất định . Hơn nữa nước ta là nước có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm gió mùa. Do đó theo tôi việc nghiên cứu tìm ra khoảng nhiệt tối ưu cho quá trình lên men là cần thiết để nâng cao chất lượng của rượu vang. Tiến hành sử dụng 2 chủng H7 và C13 vào các lần lên men với các nhiệt độ khác nhau 200c,250c,300c,350c. Nhiệt độ trong khoảng 25-300C rất thuận lợi cho việc lên men. Kết luận: Hàm lượng men giống, pH ban đầu, nhiệt độ tối ưu nhất cho quá trình lên men chủng Sacharomyces cerevisiae H7 và C13 lần lượt là 12%, 4,5 và 25- 300C. 4.5. ứng dụng các chủng H7 và C13 lên men ở quy mô phòng thí nghiệm Qua kết quả nghiên cứu chúng tôi tiến hành lên men H7 và C13 với môi trường lên men nhưng thực hiện quá trình lên men ở nhiệt độ 300C và pH=4,5 với quy mô phòng thí nghiệm ( có bình lên men 5 lit) Sau 15 ngày kết thúc giai đoạn lên men chính đánh giá rượu thành phẩm bằng cảm quan và bổ sung 2-3% cồn thực phẩm và chuyển tiếp lên men phụ. Kết quả phân tích bằng phương pháp hoá học được dẫn ra ở bảng 19 và biểu đồ 4. Bảng 9. Kết quả phân tích rượu thành phẩm Vang Tiêu chíVang(H7)Vang(C13)Độ rượu %v12,913,2Đường sót(%)4,33,6pH4,23,9Axit(%)0,450,5Độ trong, hương vịTrong, thơmTrong, thơm Biểu đồ 4 . Biểu diễn kết quả phân tích rượu thành phần Từ kết quả phân tích thành phần hoá học của rượu thành phẩm tôi thấy rằng 2 chủng S.HC7 và S.HC13 có khả năng ứng dụng trong thực tế sản xuất và với điều kiện tối ưu của pH=4,5 và nhiệt độ t0=25300C thì quá trình lên men rất thuận lợi. Qua nghiên cứu sơ bộ này cúng tôi hy vọng đóng góp phần nâng cao chất lượng rượu vang đáp ứng được thị hiếu người tiêu dùng. 4.6. Quy trình công nghệ sản xuất rượu vang Qua quá trình nghiên cứu thực nghiệm trên quy mô phòng thí nghiệm, chúng tôi đã xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vang vải thiều như sau: Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất rượu vang vải thiều Quy trình công nghệ sản xuất Thuyết minh công nghệ *) Quả : Nếu là vải tươi chọn vải chín mọng không dập nát. Nếu là vải khô chọn loại sấy vỏ nâu tươi có cùi màu cánh gián. Đối với vải tươi khi ngâm lấy dịch không cần thêm nước. Đối với vải khô cần bổ sung nước sôi để nguội. *) Men giống được sử dụng trực tiếp từ ống giống thạch nghiêng. *) Môi trường nhân giống: khử trùng Pasteur trước khi cấy. Nhân giống ở nhiệt độ 27- 280C, pH=4,5. Sau 24h có thể nhân tiếp hoặc sử dụng ngay. Thường xuyên kiểm tra số lượng tế bào, nếu số lượng tế bào nhỏ hơn 108 (TB/ml) thì thay ống giống khác. Bổ sung (NH4)2SO4 3-4g/l và pepton(3g/l).Bổ sung vitaminB1 và vitamin H. Lắc trong 24h. *) Môi trường lên men: bổ sung giống 12% ( 2.108 tb/ml) cho lên men ở pH=4,5. Nhiệt độ ổn định trong khoảng 25- 300C .Giai đoạn lên men chính thường là 15-17 ngày (quan sát bằng mắt thường) thấy ít hoặc không thấy bọt khí thoát ra và dung dịch không bị đảo trộn do hoạt động của nấm men. Dịch lên men bắt đầu lắng trong. *) Tách cặn bằng cách lắng gạn : hút dịch phía trên thùng lên men sang thùng khác bằng ống hút cao su vô trùng trước. Cặn ở dưới vứt bỏ. Sau 4-5 lần tách cặn ta thu được rượu vang non. *) Lên men phụ: rượu vang no được tăng trữ nhằm ổn định hương vị của vang được tiến hành ở chỗ dâm mát (<200C) có thể bổ sung 2-3% cồn thực phẩm. Thời gian từ 2-3 tháng hoặc dài hơn nếu sau thời gian này còn xuất hiện cặn mịn thì tiếp tục lắng gạn và qua máy lọc trước khi đóng chai. Phần 5 Kết luận và đề nghị 1. Kết luận. Đã phân lập 35 mẫu Sacharomyces cerevisiae và tuyển chọn được hai mẫu nấm men H7 và C13 có hoạt lực lên men mạnh, nhanh, tạo được nồng độ cồn khá cao, hàm lượng đường sót trong dịch lên men thấp, độ trong sản phẩm cao, có hương vị thơm ngon. Xác định được hoạt lực lên men và nghiên cứu động thái phát triển hai chủng H7 và C13 trong môi trường nhân giống. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng Sacharomyces cerevisiae H7 và C13 trong quá trình lên men và xác định được môi trường dinh dưỡng phù hợp nhất là: hàm lượng đường saccaroza 210g/l, NaCl 20/00, KH2PO4 10/00. Đã nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng men giống, pH ban đầu, nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng Sacharomyces cerevisiae H7 và C13 trong quá trình lên men và xác định được điều kiện lên men thích hợp với chủng Sacharomyces cerevisiae H7 và C13 cho hiệu quả kinh tế cao, hàm lượng men giống 12%, pH ban đầu 4,5, nhiệt độ 25 – 300C. Đã xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất vang vải thiều. 2. Đề nghị Với kết quả thu được chúng tôi rất mong muốn chủng nấm men Sacharomyces cerevisiae H7 và C13 được nhanh chóng áp dụng vào sản xuất rượu vang vải thiều làm phong phú chủng loại rượu vang trên thi trường.  Tài liệu tham khảo [1]. Nguyễn Thị Thuý Bạch, Nguyễn Thanh Nga, Nguyễn Ngọc Linh, Vũ Thanh Thuỷ, Đinh Thị Kim Nhung. 2000. Tuyển chọn chủng nấm men Sacharomyces cerevisiae ứng dụng vào lên men rượu vang với quy mô phòng thí nghiệm. Thông báo khoa học trường ĐHSP Hà Nội 2, năm 2000 số 1, trang 351-357 [2]. Nguyễn Lân Dũng. 1986. Men gia súc và men rượu. NXB KHKT. [3]. Nguyễn Lân Dũng và cộng sự. 1976.Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học tập I, II, III. NXB KHKT Hà Nội. [4]. Nguyễn Lân Dũng. 1983. Thực tập vi sinh vật học. NXB Mir Maxcơva [5]. Nguyễn Thành Đạt. 1980. Cơ sở vi sinh vật học. NXB GD . [6]. Nguyễn Quang Hào, Lê Văn Nhương, Trần Quý Thắng. 1999. Động thái quá trình lên men vang đào lộn hột. Tạp chí khoa học công nghệ tháng 01/1999 [7]. Nguyễn Thanh Hằng, Phạm Thị Thuỷ. 2001. Nghiên cứu nâng cao chất lượng rượu vang nho Việt Nam. Viện công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm ĐH Bách Khoa Hà Nội. [8]. Vũ Công Hậu. 1982. Chế vang trái cây trong gia đình. NXB Nông nghiệp. [9].Đinh Thị Kim Nhung. 2001. Nghiên cứu đặc tính sinh học của hai chủng nấm men Sacharomyces cerevisiae N9 và P6 ứng dụng lên men rượu vang. Thông báo khoa học, ĐHSPHN 2. Trang 331-342. [10]. Đinh Thị Kim Nhung. 2003. tuyển chọn và nghiên cứu nấm men Sacharomyces cerevisiae ứng dụng vào lên men rưou vang. Báo cáo tổng kết đề tài cấp bộ. [11]. Lê Văn Nhương. 1977. Bạn và thù dưới ống kính hiển vi. NXB KHKT Hà Nội. [12]. Nguyễn Thị Tố Nga. 2004. Tuyển chọn và nghiên cứu đặc tinh sinh học của chủng nấm men Sacharomyces cerevisiae, ứng dụng lên men vang vải thiều luận văn tốt nghiệp. [13]. Đinh Thị Kim Phương. 1993. Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men phù hợp với yêu cầu sản xuất rượu vang. Luận án tiến sỹ sinh học. [14]. Nguyễn Đình Sinh 1997. Nấm men và khả năng sử dụng chúng trong công nghệ sinh học ĐHSP-ĐHQGHN [15]. Nguyễn Quang Thảo, Nguyễn Thành Đạt, Lê Văn Nhương.2000 Nghiên cứu động học quá trình lên men vang vải thiều. Tạp chí công nghiệp và nông nghiệp thực phẩm số 9. Trang 470-471 [16]. Đoàn Văn Tân. 2004. Tuyển chọn chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae luận văn tốt nghiệp. [17]. Nguyễn Quang Thảo. 2000. Nghiên cứu lên men vang vải thiều. Tóm tắt luận án tiến sỹ sinh học. Trường ĐHSP - ĐHQG Hà Nội. [18]. Trần Quý Thắng.1999. Phân lập, tuyển chọn một số đặc điểm sinh học của nấm men dùng lên men quả điều. Tóm tắt luận án tiến sỹ sinh học trường ĐHSP - ĐHQG HN .