Đề tài Nghiên cứu biểu hiện gen Trehalase tái tổ hợp ở E.coli và xác định các tính chất của enzyme

MỞ ĐẦU Ngày nay, công nghệ sinh học phân tử đã phát triển nhanh chóng, đạt được những thành tựu to lớn về lý thuyết và thực tiễn. Sự phát triển không ngừng của sinh học phân tử giúp cho con người hiểu biết cơ sở khoa học một số bệnh nan y, tìm ra các loại thuốc giúp cho con người chống lại các bênh tật và nâng cao sức khỏe đời sống. Thành tựu công nghệ sinh học phân tử ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp, nông nghiệp đặc biệt là các sản phẩm chức năng. Xã hội ngày càng phát triển nên vấn đề sức khỏe của con người ngày càng được quan tâm. Do đó các sản phẩm chức năng không ngừng được cải tiến nâng cao chất lượng. Và khi những thành tựu về y học, hóa sinh học, sinh lý học và dinh dưỡng học được cải tiến thì những thực phẩm chức năng, thực phẩm điều trị bệnh được sản xuất nhiều hơn. Ngày nay, thực phẩm chức năng đang được con người đặc biệt quan tâm vì đây là những thực phẩm có giá trị dinh dưỡng và mức năng lượng thấp nhưng trong đó có chứa rất nhiều tác dụng. Trong nhóm thực phẩm người ta quan tâm khá nhiều đến đường chức năng. Có rất nhiều loại đường chức năng như: đường Maltitol, đường Fructooligosaccharide, đường Sorbitol, đường Trehalose…Trong số đó đường Trehalose là một trong những loại đường có nhiều công dụng đối với cuộc sống con người, đặc biệt đối với những người béo phì, những người mắc bệnh tiểu đường, sâu răng,… Cùng với sự phát triển của đường chức năng, các loại enzyme ứng dụng trong lĩnh vực này cũng ngày được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng Trehalase là enzyme được sử dụng để sản xuất Trehalose là nhân tố điều chỉnh quá trình đông lạnh, ngăn ngừa quá trình kết tinh, cung cấp giá trị dinh dưỡng. Do vậy nghiên cứu sản xuất Trehalase là enzyme được sử dụng để sản xuất Trehalose là nhu cầu cần thiết. Đặc biệt trên thị trường Việt Nam hiện nay chủ yếu nhập chế phẩm này từ nước ngoài nên giá thành tương đối cao. Vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất enzyme Trehalase không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có giá trị kinh tế xã hội. Từ những lý do trên chúng tôi đã thực hiện đề tài nghiên cứu sau: “Nghiên cứu biểu hiện gen Trehalase tái tổ hợp ở E.coli và xác định các tính chất của enzyme” Mục tiêu của đề tài: 1. Biểu hiện gen Trehalase tái tổ hợp ở E.coli. 2. Tách và tinh chế enzyme. 3. Xác định các đặc tính của enzyme 4. Ứng dụng enzyme để tổng hợp Trehalose. PHẦN 1:TỔNG QUAN TÀI LIỆU I.1 Công nghệ DNA tái tổ hợp Kỹ thuật di truyền là thuật ngữ chung cho nhiều kỹ thuật cơ bản trong nghiên cứu di truyền phân tử. Thuật ngữ kỹ thuật gen còn gọi công nghệ gen hay kỹ thuật gen vấn đề cốt lõi của sinh học hiện đại. Năm 1983 Rudleg và Sediel: kỹ thuật di truyền là các kỹ thuật dẫn đến khả năng biến đổi định hướng gen, tần số kiểu gen của một quần thể, hoặc làm tăng căn bản khả năng sinh sản của một số cá thể để nâng cao vốn gen và tăng số lượng hợp tử của quần thể. Kỹ thuật gen được bắt đầu năm 1977, bao gồm các thao tác kỹ thuật trên gen, nhằm điều chỉnh và biến đổi gen hoặc tạo ra các gen mới từ đó tạo ra các cá thể mới. Kỹ thuật gen bao gồm một số kỹ thuật cơ bản là kỹ thuật DNA tái tổ hợp, phân lập gen, chuyển ghép gen, dung hợp gen vi thao tác gen. DNA tái tổ hợp là DNA được tạo ra từ hai hay nhiều nguồn vật liệu di truyền khác nhau. Phân tử DNA được gép nối từ các đoạn DNA của các cá thể khác nhau trong loài, hoặc các loài khác nhau gọi DNA tái tổ hợp. Nguyên tắc chung của công nghệ DNA tái tổ hợp bao gồm một số bước sau. Trước hết genome mục tiêu và DNA chuyển tải (vector) được tinh chế và cắt thành từng đoạn nhờ một loại Enzyme hạn chế. Trong nhiều trường hợp (đặc biệt đối với sinh vật bậc cao) DNA gen nome được thay thế bằng DNA tương bù (cDNA) củ mRNA thành thục. DNA này được tổng hợp từ khuôn RNA thông tin nhờ xúc tác của enzyme sao chép ngược (reverse transcriptase, rna-dependent DNA-polymerase). DNA vector có thể là một plasmid hoặc phage (nếu vật mang dòng hóa gen là vi khuẩn), plasmid Ti của vi khuẩn Agrobacterrium tumefaciens (nếu vật mang dòng hóa gen là tế bào thực vật), là Vius (retrovirus hoặc andovirus không gây bệnh, nếu vật mang dòng hóa gen là tế bào động vật). Bước thứ hai là chuyển vận DNA tái tổ hợp vào cơ thể vật mang, dòng hóa và bước tiếp sau đó là nuôi cấy vật mang, sản xuất (chiết suất và tinh chế) sản phẩm mục tiêu. Nhờ được cắt cùng một loại enzyme hạn chế (thường là enzyme đầu dính) các đoạn DNA mục tiêu và các đoạn DNA vector (chỉ cắt tại một điểm của mạch vòng xoắn kép) có thể ngẫu nhiên hình thành liên kết hidro tương bù ở các đầu dính, rồi được ligase hàn gắn các đầu khác. Kết quả trong hỗn hợp hình thành thể tái tổ hợp của vector với một hoặc một số mảnh DNA của genome mục tiêu (bên cạnh các sản phẩm không mong muốn như vector tự khép vòng, các vector tự tái tổ hợp với nhau và các mảnh DNA không tái tổ hợp hoặc tự tái tổ hợp). Tất cả các sản phẩm trong hỗn hợp đều được trộn đều với các vật mang tạo dòng, sau đó các vật mang được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng có yếu tố chọn lọc (chất kháng sinh đối với vi khuẩn, hóa chất gây chết đối với các tế bào động vật thực vật). Trong điều kiện đó, chỉ các tế bào vật mang vector sống sót. Hơn nữa, do plasmid bị enzyme hạn chế cắt tháo vòng tại một vị trí xác định trong một gen điều khiển một thuộc tính nhận biết khác, những plasmid đã tái tổ hợp mất khả năng tạo tính trạng đó ở vật mang (chẳng hạn, mất khả năng tổng hợp Beta-galactosidase), nên chỉ những vật mang sống sót và không biểu hiện tính trạng đó thì được chọn nuôi cấy tạo dòng. Bước tiếp theo là chọn những dòng tính trạng của gen mục tiêu hoặc những dòng gen mục tiêu (nhờ lai phân tử: các phương pháp thử nghiệm miễn dịch như ELISA, Westerm blot anlysis, Northern blot anlysis hoặc với các dò DNA hoặc RNA – southern blot anlysis, Norther blot anlysis), hoặc PCR. Nuôi cấy tạo dòng những cá thể vật mang thỏa mãn các bước thử nghiệm trên giúp tạo ra dòng thuần các sinh vật mang có thể sản xuất các sản phẩm mục tiêu. Thực chất của công nghệ DNA tái tổ hợp là tập hợp nhiều kỹ thuật trên một gen, cải biến cấu trúc của gen, bộ gen tạo ra các gen mới trong bộ gen. Công nghệ DNA tái tổ hợp bao gồm các bước cơ bản sau. Tách chiết DNA, RNA (phân lập gen) Tạo vector tái tổ hợp (bao gồm chuẩn bị vector tách dòng) Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ và nhân dòng. Sàng lọc, theo dõi hoạt động và biểu hiện của gen Cho đến nay, kỹ thuật di truyền đã đạt được những bước tiến vượt bậc. Nhiều sản phẩm có ích đã được sản xuất từ các vi sinh vật tái tổ hợp hay vi sinh vật biến đổi gen (gentically modified organisms – GMO) như giống ngũ cốc đậu tương, hạt có dầu, bông,… mang gen chống sâu bệnh hoặc kháng thuốc chống cỏ dại hoặc có chất lượng sản phẩm nâng cao như khoai tây chứa nhiều Protein, lúa nhiều vitamin A và sắt,… Tạo ra được những vacxin tái tổ hợp có thể dễ sản xuất (dễ nuôi cấy trên lứa cấy tế bào hay phôi gà) và dễ sử dụng cho ăn uống, hoặc những động vật tái tổ hợp sản sinh những sản phẩm hữu ích như thuốc chữa bệnh, thậm chí tạo ra những đàn lợn mang kháng nguyên người, hy vọng là vật có thể cho tim hoặc nội tạng khác để điều trị những trường hợp người bệnh cần thay thế nội quan,… Tuy nhiên, kỹ thuật di truyền cũng đặt loài người vào tình trạng có thể phải đương đầu với những đe dọa mới liên quan tới sức khỏe của người và sinh thái – môi trường. Chưa thể chứng minh được tính vô hại của GMO thực phẩm đối với con người, cũng như chưa phủ nhận khả năng lan truyền gen kháng thuốc (của Plasmid vector) trong tập đoàn các vi khuẩn tự nhiên của cơ thể (ví dụ trong đường ruột) người và động vật. Chăm sóc những loại cây trồng đề kháng thuốc diệt cỏ và thuốc diệt sâu bệnh có thể dẫn đến lạm dụng nông dược và nếu thoái hóa trở thành cỏ dại thì thực vật kháng thuốc và kháng sâu bệnh sẽ là một nguy cơ mới đối với nông nghiệp. Tương tự, nguy cơ những sinh vật GMO lấn át sinh vật tự nhiên sẽ là rất cao và có thể dẫn đến sự tuyệt diệt của nhiều loài sinh vật hiện có gây hậu quả nghiêm trọng đến môi trường sinh thái… I.2 Đại cương về vi khuẩn E.coli Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1973); Nguyễn Lân Dũng (1976), trực khuẩn Escherchia Coli có tên khoa học là Bacterium Coli Comunis bình thường E.coli cư trú ở phần sau của ruột (ruột già và phần cuối của ruột non), ít khi có ở dạ dày hay phía trước ruột non của động vật (Nguyễn Vĩnh Phước,1978). Tỉ lệ E.coli ở kết tràng là 58.3%, trực tràng 55.3%, manh tràng là 39.3% E.coli xuất hiện và sinh sống ở động vật chỉ vài giờ sau khi sinh và tồn tại đến khi con vật chết. Loài ăn tạp và ăn thịt thải nhiều E.coli hơn loài ăn cỏ. Theo Kefman những chủng E.coli thường gặp về huyết thanh được chia thành những Serotype riêng. Trong số này một số serotype đóng vai trò quan trọng trong việc gây bệnh cho người và động vật. I.2.1 Đặc điểm hình thái E.coli là loài trực khuẩn hình gậy gắn, hai đầu tròn, có lông, di động được, không hình thành nha bào, giáp mô, bắt màu Gram âm, thường thẫm ở hai đầu ở giữa nhạt, kích thước vi khuẩn 2-3 uM x 0.4-0.6 um.Trong cơ thể gia súc, vi khuẩn có hình cầu, đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. I.2.2 Đặc tính nuôi cấy E.coli là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy tiện, dễ nuôi cấy, có thể sinh trưởng và phát triển thích hợp nhất ở 37oC, pH thích hợp là 7.2-7.4. Tuy nhiên chúng vẫn có thể phát triển trong môi trường có pH = 5.5-8.0. Môi trường nước thịt: E.coli phát triển rất nhanh, môi trường đục đều, có lắng cặn xuống đáy màu tro nhạt, trên mặt hình thành màng mỏng màu ghi nhạt dính vào thành ống nghiệm, canh trùng có mùi phân thối. Môi trường thịt thường: nuôi cấy ở 37oC trong 24h hình thành khuẩn lạc tròn, ướt hới lối, không trong suốt, màu tro nhạt, đường kính khuẩn lạc khoảng 2-3mm. Môi trường Endo: hình thành khuẩn lạc có ánh kim. Môi trướng SS: trên môi trường này sau 24h nuôi cấy hình thành khuẩn lạc màu hồng nhạt hoặc màu đỏ cánh sen. Môi trường EMB: E.coli có khuẩn lạc màu tím đen. Môi trường Macconkey: E.coli hình thành khuẩn lạc màu đỏ. Môi trường Billiant –Green–agar: khuẩn lạc của E.coli có dạng S, màu vàng chanh. I.2.3.Đặc tính sinh hóa Các chủng E.coli đều lên men sinh hơi mạnh các loại đường Glucose, Galactose, Lactose, Mannitol… E.coli lên men không sinh hơi các loại đường như Saccarose, Ramnose, Xalixin, Valin, Glyxeron. Các phản ứng sinh hóa khác: Phản ứng indol (+), phản ứng VP (=), phản ứng MR (+), phản ứng H2S (+), hoàn nguyên Nitrat thành Nitrit, Urease (-), Gelatin (-). I.2.4 Sức đề kháng của E.coli E.coli bị tiêu diệt ở nhiệt độ 55oC trong một giờ, 60oC trong 30 phút (Willon và Miles, 1995), (Nguyễn vĩnh Phước, 1973). Các chất sát trùng như: Axit phenic, Clorua thủy ngân, Formol có thể tiêu diệt E.coli trong 5 phút. I.3. Tình hình sản xuất và ứng dụng enzyme trên thế giới và Việt Nam I.3.1 Tình hình sản xuất và ứng dụng enzyme trên thế giới Enzyme có vai trò vô cùng quan trọng, không chỉ xúc tác cho các phản ứng hóa học xảy ra trong hệ thống sống mà sau khi tách khỏi hệ thống sống chúng vẫn có thể xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào (intro). Bởi vậy, công nghệ enzyme ngày càng phát triển. Những thành tựu cơ bản về enzyme là cơ sở để phát triển các nghiên cứu ứng dụng enzyme trong thực tiễn. Enzyme thường được sử dụng theo hai cách: không tách enzyme ra khỏi nguyên liệu mà tạo điều kiện thuận lợi cho hoạt động của một số enzyme có sẵn trong nguyên liệu để chúng chuyển hóa các chất có cùng trong nguyên liệu theo hướng mong muốn. Hoặc tách enzyme ra khỏi nguyên liệu ở dạng chế phẩm khi cần thiết. Enzyme hoạt động sinh học có thể được tách từ bất kỳ cơ quan sống nào. Ví dụ enzyme thương mại có thể được sản xuất từ Acitinoplanes tới Zymomonas. Từ rau chân vịt (spinach) đến nọc độc của rắn. Do đó có thể tận dụng nguồn nguyên liệu giàu enzyme để tách enzyme, dùng enzyme để chế biến các loại nguyên liệu khác nhau hoặc sử dụng vào những mục đích khác nhau. Hàng trăm enzyme thương mại được sản xuất ra, trong đó hơn một nửa từ nấm mốc và nấm men, quá 1/3 từ vi khuẩn, còn lại 8% từ động vật, 4% từ thực vật. Vi sinh vật là nguồn nguyên liệu tốt nhất của công nghệ enzyme vì chúng có tốc độ sinh trưởng nhanh trên các môi trường dinh dưỡng không đắt tiền, không đòi hỏi thiết bị đắt tiền, có thể tự động hóa hoặc điều khiển, năng suất cao…Hơn nữa, ta có thể chủ động điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzyme, nâng cao hàm lượng enzyme trong tế bào vi sinh vật dễ dàng hơn tế bào thực vật và động vật. Hàng năm, hàng trăm tấn chế phẩm enzyme được sản xuất phục vụ cho ngành công nghiệp và y học. Năm 1980, trên thế giới sản xuất 530 tấn protease từ vi khuẩn, 350 tấn glucoamylase, 320 tấn  – Amylase, 70 tấn glucoisomerase, tất cả trị giá 150 triệu USD. Hiện nay trên thị trường có khoảng 12 hãng sản xuất enzyme chính với trên 60 nhà cung cấp lớn. Hai hãng sản xuất enzyme lớn nhất hiện nay là Novo Nordisk (Đan Mạch) và Gist Brocades chiếm 60% lượng enzyme trên thị trường. Tiếp đó là Mỹ 15%, trong đó 2/3 sử dụng nội địa chủ yếu dùng để sản xuất cồn và đường nghịch đảo. Năm 1993, trên thị trường Mỹ tiêu thụ 50 triệu USD đối với renin, 27 triệu USD đối với glucoAmylase, 23 triệu USD đối với glucoisomerase… Khoảng 50 loại enzyme khác nhau được bán trên thị trường Mỹ. Nhật chiếm 12-15% thị trường tiêu thụ với các sản phẩm đa dạng. Trung Quốc và Nga là hai thị trường sản xuất chủ yếu để phục vụ trong nước. Đến nay người ta đã biết và phân loại khoảng 3500 loại enzyme, khoảng vài trăm loại được sản xuất trên quy mô công nghiệp chủ yếu là enzyme Amylase, Protease. Lipase… Amylosidase: sản xuất với sản lượng 5 tấn /năm sử dụng để tách L- acid amin khỏi hỗn hợp DL axit amin (250 tấn L axit amin trên năm) Amyloglucosidase: sản lượng 1 tấn /năm, sản xuất 3000 tấn glucose từ tinh bột/năm. Glucoisomerase: sử dụng để sản xuất xiroglucose – fructose 42% (2.150.000 tấn /năm) và xiroglucose- fructose 55% (1.450.000 tấn/ năm). Phần lớn enzyme được sử dụng ở mức độ công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơn cấu tử xúc tác cho phản ứng phân hủy. Khoảng 70% chế phẩm là enzyme thủy phân sử dụng để thủy phân các cơ chất tự nhiên. Các protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay dùng trong quá trình đông tụ sữa sản xuất fomat, làm mềm thịt, sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da. Tiếp đến là các enzyme nhóm Hydaratcacbonat như Amylase, Cellulose, Pectinase… Sử dụng nhiều trong chế biến thực phẩm, thức ăn gia súc, công nghiệp dệt, công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy. Trong công nghiệp thực phẩm các chế phẩm enzyme được sử dụng với 4 mục đích chính: - Điều chỉnh những khiếm khuyết của nguyên liệu. Nguyên liệu của công nghiệp thực phẩm là các sản phẩm phức tạp có nguồn gốc từ động vật và thực vật được hình thành qua nhiều giai đoạn tổng hợp sinh học. Do đó, thành phần nguyên liệu phụ thuộc vào các yếu tố bên trong như giống loài và các yếu tố bên ngoài như điều kiện canh tác khí hậu. Các yếu tố này có thể làm thay đổi thành phần nguyên liệu và chuyển hóa nó. Trong trường hợp này các chế phẩm enzyme được sử dụng một phụ gia lấp đầy những thiếu hụt. Trong công nghiệp chế biến đường, tinh bột, bánh mỳ, bia… người ta bổ sung Amylase để bù hoạt lực enzym yếu của nguyên liệu ngũ cốc. Trong sản xuất fomat, enzyme lipase và protease được sử dụng thay thế các enzyme từ nguyên liệu sữa bị vô hoạt để thanh trùng. - Tham gia chuyển hóa, ứng dụng nhiều nhất trong sản xuất bánh bisque, fomat, nước uống … protease cho phép cải thiện tính lọc của bia và tính năng ổn định của nó ở nhiệt độ thấp. Amylase, pectinase, hemicellulase tạo điều kiện cho việc tách chiết và lọc nước quả. Protease trung tính làm mềm dẻo khung gluten cải thiện độ nở của bột nhào và độ giòn của bisque. - Tăng giá trị nguyên liệu tự nhiên. Enzyme có thể tham gia vào việc đa dạng hóa sản phẩm nhận từ nguyên liệu tự nhiên. Sự phát triển của công nghệ enzyme đã cho ra đời một loạt các chế phẩm enzyme cho phép tạo ra nhiều sản phẩm: chất làm đặc, chất thơm, chất tạo ngọt, chất tạo chua… việc cải thiện đặc tính của enzyme về tính đặc hiệu và tính chịu nhiệt là cơ sở để sản xuất chế phẩm enzyme mới thích hợp môi trường và đặc hiệu hơn. - Cải thiện chất lượng sản phẩm: các enzyme sử dụng để loại bỏ các chất tự nhiên có ảnh hưởng xấu tới tính chất cảm quan của thực phẩm. Chế phẩm enzyme còn cho phép tạo hương vị, màu sắc sản phẩm như lipase trong sản xuất fomat, lactase trong sản xuất sữa. Trong công nghiệp thực phẩm, protease được dùng để làm mềm thịt, công nghiệp bánh mỳ, enzym dịch vị 9 chủ yếu là chimosin thu được từ dạ dày bò được sử dụng để sản xuất fomat, papain từ nhựa đu đủ để làm mềm thịt. Enzyme trong công nghiệp thực phẩm chủ yếu sử dụng để sản xuất đường tinh bột. Đầu tiên người ta sử dụng hai enzyme - Amylase và - Amylase để sản xuất mật từ tinh bột, sản phẩm này chứa dextrin, glucose và maltose được dùng nhiều trong công nghiệp bánh kẹo. Glucose được sản xuất nhờ - Amylase và - Amylase, tuy nhiên glucose dùng trong thực phẩm có nhược điểm độ ngọt thấp chỉ vào khoảng 0.8 lần đường kính vì vậy nó được dùng chủ yếu cho y dược. Năm 1970, người ta sản xuất được Fructose và xirogluco – fructose cao loại đường này có độ ngọt gấp 1.73 lần so với đường kính nhưng giá thành cao hơn nhiều. Năm 1998, tổng lượng đường tiêu thụ trên thế giới là 10 triệu tấn thì riêng Mỹ tiêu thụ 4.2 tấn Fructose (bao gồm cả xirogluco – fructose), Nhật là 800.000 tấn, EU là 2 triệu tấn, Canada 300000 tấn, Đông Âu 200000 tấn, các nước đang phát triển là 500000 tấn. Sau công nghiệp thực phẩm các chế phẩm enzyme được sử dụng trong công nghiệp, nông nghiệp, dược phẩm, y tế, chế biến thức ăn gia súc. Đặc hiệu việc sử dụng enzyme của các hệ vi sinh vật trong nước thải trong công nghiệp xử lý môi trường ngày càng được nghiên cứu khai thác sử dụng. Trong công nghiệp dệt, việc sử dụng enzyme đã được áp dụng từ những năm 20 của thế kỷ 20. Enzyme từ nước chiết Malt và Pancrease được sử dụng để rũ hồ. Năm 1971, sử dụng enzyme Amylase của Bacillus subtilis rũ hồ ở nhiệt độ cao, rút ngắn thời gian. Enzyme Glucanase, Pectinase, Estrase, Protese được sử dụng trong quá trình nấu nhằm loại bỏ những thành phần không phải Cellulose ra ngoài. Trong công nghiệp thuộc da, hai quá trình sử dụng enzyme là tách lông và làm mềm da. Người ta sử dụng enzyme collagenase, trypsin, chymotripsin, cacboxypeptidase tách chất nhờn và phá hủy liên kết trong sợi collagen, nhờ vậy lông được tách khỏi da và trở nên mềm hơn. Trong công nghiệp bột giặt và tẩy rửa, các chế phẩm enzyme được sử dụng là protease, lipase, cellulose, amylase, oxydoreductase tăng vận tốc và hiệu quả quá trình tẩy rửa. Một số enzyme được bổ xung vào các loại xà phòng và kem dưỡng da, thuốc đánh răng như bromelin, collagenase, lipase…các enzyme này có tác dụng tẩy hôi, tẩy các vết bẩn bám trên da khá tốt, đồng thời làm mịn và tăng độ đàn hồi cho da. Trong nông nghiệp, enzyme dùng để sản xuất thức ăn cho động vật nhằm tăng giá trị thức ăn thô, tăng hệ số sử dụng cho thức ăn. Các enzyme sử dụng với mục đích này là các enzyme thủy phân như amylase, protease, đặc hiệu là celluloase và hemicelluloase. Chúng thủy phân các chất có phân tử lớn thành dạng dễ hấp thụ hơn thường làm tăng hiệu quả sử dụng thức ăn. Điều này có ý nghĩa quan trọng khi chuẩn bị thức ăn cho động vật còn non vì hệ thống tiêu hóa của chúng chưa thích hợp với việc ăn các loại thức ăn thô. Sự phát triển của y học phản ánh sự lớn mạnh của tiềm năng enzyme. Ngay từ thế kỷ 19 enzyme tụy tạng được sử dụng để chữa bệnh rối loạn tiêu hóa. Enzyme Tripsin, Chymotripsin sử dụng để làm tiêu viêm, lành vết thương, vết bỏng, viêm phổi, viêm khí quản. Tripsin chữa bệnh viêm tĩnh mạch huyết khối, viêm tụy. Chymotripsin chữa bệnh loét dạ dày tá tràng. Một số enzyme tiêu hóa được sử dụng để chữa bệnh suy dinh dưỡng ở trẻ em, người già và người bệnh như Pepsin (từ dạ dày lợn). Ngày nay, một số thuốc tổng hợp hóa học đã lần lượt được thay thế bằng các quá trình enzyme nhờ những ưu điểm của nó. Ví dụ việc sản xuất Pinicillin bán tổng hợp nhờ enzyme penicillin acylase để sản xuất hai dẫn xuất ban đầu 6- APA và 7 – ADCA, từ đó tổng hợp lên kháng sinh thế hệ II, III, IV, V. Cùng với sự phát triển của kỹ thuật gen và lai tạo tế bào, người ta đã sản xuất được những chất mà cơ thể sống chỉ có thể tổng hợp được với lượng cực nhỏ như interferon, hormone sinh trưởng người, isulin, vaccine… Trong những năm gần đây một số công trình nói đến việc chữa bệnh của asparaginase…Sự giúp ích của enzyme học đối với y học hiện nay tuy còn hạn chế nhưng với đà phát triển mạnh mẽ của ngành khoa học nói chung và phát triển của enzyme học nói riêng, cùng với sự tiến bộ về kỹ thuật thì nói chung tương lai enzyme sẽ giúp ích nhiều hơn cho y học đặc biệt trong lĩnh vực phân tử. Ngoài việc nghiên cứu enzyme trong y học lâm sàng và trong điều trị học, người ta còn nghiên cứu sự phát triển của enzyme trong cơ thể từ giai đoạn bào thai cho đến lúc già. Bởi vậy ngày nay enzyme học còn đóng vai trò quan trọng trong di truyền học phân tử, trong nghiên cứu quá trình tiến hóa của các giống nòi và trong nhiều lĩnh vực khác. Ngoài các enzyme thuộc nhóm trên, enzyme khác được sản xuất với quy mô nhỏ và nhiều enzyme đặc hiệu được dùng để cắt, nối gen trong kỹ thuật gen, nghiên cứu phân tử protein (endonuclease), sử dụng enzym Urease để định lượng ure trong nước tiểu… Cho đến nay, người ta vẫn cho rằng 99% khả năng ứng dụng của enzyme vẫn ở dạng tiềm năng. Trên cơ sở nghiên cứu cơ bản về cấu trúc phân tử và cơ chế sinh tổng hợp enzyme đã mở ra triển vọng của ngành enzyme học: - Tổng hợp enzyme nhân tạo: các chất có hoạt tính tương tự enzyme có thể tổng hợp bằng con đường nhân tạo thiết kế và tổng hợp các chất gắn rất đơn giản xong việc thiết kế trung tâm xúc tác rất khó khăn. Đến nay, một vài enzyme nhân tạo được sử dụng thành công như acid polyglutamic có hoạt tính tương tự như estsrase. - Biến đổi cấu trúc enzyme: áp dụng kỹ thuật di truyền làm biến đổi định hướng cấu trúc enzyme, biến đổi hoạt tính, hiệu suất… người ta sử dụng công nghệ protein để cải biến trung tâm hoạt động của enzyme mục đích làm cho có hoạt tính cao hơn hoặc enzyme có hoạt tính mới. - Enzyme sử dụng trong phân tích, chuẩn đoán, điều trị. - Bảo vệ môi trường: sử dụng enzyme để xử lý chất thải, tái tạo vật liệu hay sử dụng vật liệu tái chế. I.3.2 Tình hình sản xuất và ứng dụng enzyme ở Việt Nam. Việc nghiên cứu và ứng dụng enzyme ở Việt Nam chỉ mới được tập trung chú ý trong vài thập kỷ trở lại đây. Cho đến nay Việt Nam chưa có một enzyme nào được sản xuất ở quy mô công nghiệp mà mới chỉ dừng lại ở quy mô nhỏ, phạm vi phòng thí nghiệm của các trường đại học, các viện nghiên cứu. Enzyme pepsin từ dạ dày bò (Trường Đại Học Bách khoa Hà Nội), bromelin từ dứa (Đại Học Quốc Gia Hà Nội), a- amylase glucoase amylase, protease từ vi sinh vật (viện công nghiệp thực phẩm) Những chế phẩm enzyme được sử dụng rộng rãi nhất ở nước ta hiện nay là amylase chủ yếu dùng trong công nghiệp sản xuất rượu bia, đường glucose, đường nha, công nghiệp dệt…Enzyme phân giải protein (protease) tăng độ bền ngọt của bia, công nghiệp chất tẩy rửa, nước chấm, y học… Một số enzyme (chủ yếu nhập từ nước ngoài) được sử dụng rộng rãi trong việc nâng cao chất lượng sản phẩm và đa dạng hóa sản phẩm sữa. Các chế phẩm protease (dùng trong công nghiệp sản xuất nước chấm, chế biến thịt cá) và prozimabo (y học) là các chế phẩm có nguồn gốc từ thực vật. Sản lượng chế phẩm enzyme tiêu thụ hàng năm khoảng 100-300 tấn/năm. Tuy nhiên, việc sử dụng enzyme trong các ngành công nghiệp ở nước ta còn ở dạng tiềm năng, do vậy trong những năm tới khả năng ứng dụng của enzyme còn được khai thác và mở rộng ra nhiều lĩnh vực khác: xử lý rác thải sinh hoạt và rác công nghiệp, sản xuất bột dinh dưỡng trẻ em, sản xuất chế phẩm probiotic, prebiotic… I.4 Trehalase I.4.1 Giới thiệu về enzyme Trehalase Trehalase là enzyme phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Nó được dùng khá phổ biến trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực khác. Trehalase là một loại enzyme glycoside hydrolase có tác dụng xúc tác cho quá trình chuyển đổi trehalose thành glucose. Nó được tìm thấy trong hầu hết các động vật. Trehalose là đường đôi không khử (α-D-glucopyranosyl-1,1-α-D-glucopyranoside) là một trong những nguồn carbohydrate quan trọng nhất xuất hiện trong hầu hết các loại sinh vật, trừ lớp động vật có vú. Disaccharide được thủy phân vào 2 phân tử glucose bằng enzyme Trehalase. Có 2 loại Trehalase được tìm thấy trong Saccharomyces cerevisiae (nấm men), là Trehalase trung tính (NT)và Trehalase axit (AT) được phân loại dựa vào độ pH của chúng [4]. NT có độ pH là 7.0 trong khi AT là 4.5. Theo báo cáo mới đây, hơn 90% AT hoạt động trong S. cerevisiae là ngoại bào và tách ngoại bào Trehalose thành glucose trong môi trường chất bao. I.4.2 Trehalase trong vi khuẩn Trehalose được tìm thấy như tích lũy carbonhydrate trong Pseudomonas, Bacillus, Rhizobium và trong rất nhiều khuẩn tia và là nguyên nhân của khả năng kháng khuẩn. Hầu hết các enzyme Trehalase tách biệt với các vi khuẩn có độ pH từ 6.5 đến 7.5. Enzyme Trehalase của Mycobacterium là một màng protein bị ràng buộc. Tế bào chất Trehalase của Escherichiacoli K12 được kích thích bở sự tăng cao trong nồng độ thẩm thấu. Sự thủy phân của Trehalose thành glucose diễn ra trong bào chất, và sau đó glucose được chuyển vào các tế bào vi khuẩn. Một tế bào chất Trehalase khác cũng được tìm thấy từ E.coli. Gen mã hóa tế bào chất Trehalase có tính đồng đẳng cao với Trehalase tế bào chất. I.4.3 Trehalase trong thực vật Trong thế giới thực vật, mặc dù Trehalose được tìm thấy từ rất nhiều loài cây không hoa bao gồm Selaginella lepidophylla và Botrychium lunaria; đường rất hiếm trong cây có mạch và chỉ được tìm thấy trong quả chín của các loại thuộc Apiaceae và trong lá cây của thực vật hạt kín có khả năng chịu khô hạn như Myrothamnus flabellifolius. Tuy nhiên enzyme Trehalase lại phổ biến trong các loại cây. Điều này rất khó hiểu vì tuy thiếu cơ chất nhưng Trehalase lại có mặt ở các loại thực vật bậc cao. Không có sự chứng minh rõ ràng nào về vai trò hoạt động của Trehalase trong thực vật. Tuy nhiên có nhiều ý kiến cho rằng Trehalases có thể đóng vai trò trong cơ cấu kháng khuẩn hoặc enzyme có thể đóng vai trò trong việc giảm lượng Trehalose có nguồn gốc từ vi sinh thực vật I.4.4 Trehalase trong nấm men Trong S.cerevisiae có ít nhất 2 enzyme Trehalase khác biệt được tìm thấy. Một loại được điều hòa bởi cAMP-phụ thuộc phosphorylation. Hoạt động của loại enzyme này được tìm thấy trong dịch bào tương. Loại enzyme hoạt động thứ hai được tìm thấy trong các không bào của 12 vi sinh vật tương ứng. Nồng độ pH của Trehalase dịch bào tương vào khoảng 7.0 do đó nó được cho vào cùng loại với Trehalase trung tính. Trong khi đó, enzyme Trehalase không bào được cho rằng có khả năng hoạt động tốt nhất tại độ pH khoảng 4.5 và được coi là Trehalase axit. Hai loại enzyme này mã hóa bởi hai loại gen khác nhau là NTH1 và ATH1 I.4.5 Thủy phân Trehalose Một phân tử Trehalose được thủy phân thành 2 phân tử glucose bằng enzyme Trehalase. Thủy phân enzyme của Trehalose lần đầu tiên được tiến hành vào năm 1893 tại Aspergillus niger bởi Bourquelot. Fischer đã thấy được phản ứng này trong S. cerevisiae vào năm 1895. Trehalase (α, α-trehalose-1-C-glucohydrolase, EC 3.2.1.28) đã được tìm thấy trong rất nhiều sinh vật bao gồm động vật và thực vật. Mặc dù Trehalose không được tìm thấy trong lớp động vật có vú nhưng enzyme Trehalase có trong màng biên tế bào thận và lông nhung của màng ruột. Trong ruột, chức năng của enzyme này là giúp ruột hấp thụ được Trehalose. Thủy phân Trehalose bằng enzyme Trehalase là một quá trình sinh lý học quan trọng của nhiều loại sinh vật như nảy mầm bào tử nấm, côn trùng bay và tăng trưởng lại trong tế bào không hoạt động tích cực.

I.5. Tổng quan về đường chức năng Trehalose
I.5.1 Trehalose Trehalose là đường đôi không khử (α-D-glucopyranosyl-1,1-α-D-glucopyranoside) Trehalose là một đường tự nhiên với chức năng tương tự như đường sucrose nhưng ổn định hơn và có vị ngọt nhẹ hơn. Trehalose là đường đa chức năng, vị ngọt nhẹ của nó (45% sucrose).
Hình 1: Biểu đồ hàm lượng đường trehalose, maltose, glucose, sucrose Thành phần các chất dinh dưỡng trong đường Trehalose: Thành phần  Giá trị thành phần trong 100g   Năng lượng  628kj/150kcal   Protein  0g   Carbonhydrate trong đường  100g   Hàm lượng chất béo  0g   Hàm lượng xenluloza  0g   Hàm lượng natri  0g   Bảng 1: Thành phần các chất trong đường Trehalose Sau đây là bảng hàm lượng Trehalose có trong một số thực phẩm và lượng mà chúng ta phải hấp thụ mỗi ngày mà chúng tôi đã thống kê được: Loại thực phẩm  Hàm lượng đường Trehalose (%)  Lượng thực phẩm tiêu thụ mỗi ngày (g/ngày)   Nước ép hoa quả và rau  10  16   Kem  10-20  4.8   Mứt kẹo  7-20  10   Lớp phủ kem trên bánh ngọt  5  0.1   Thóc, gạo  2  19   Các sản phẩm từ bột mỳ  2  14   Bánh quy, bánh ngọt  5-10  40   Sản phẩm từ cá  10  0.3   Hỗn hợp khác  10-20  1.8   Bảng 2: Hàm lượng Trehalose và lượng thực phẩm tiêu thụ mỗi ngày Cấu tạo Trehalose:

Hình 2: Công thức cấu tạo của trehalose

Hình 3: Sơ đồ phản ứng enzyme I.5.2 Ảnh hưởng của Trehalose lên cơ thể sống I.5.2.1 Ảnh hưởng của Trehalose đến sự chuyển hóa hydratcacbon Trehalose không hoặc rất ít bị thủy phân bởi hệ enzyme đường ruột nên khi ăn lượng đường hòa tan trong máu không bị biến động. Trong gan, hoạt lực của enzyme trên tăng lên nếu chỉ ăn sacaroza nhưng sẽ được bình thường hóa bởi sự cung ứng Trehalose. Như vậy, Trehalose có vai trò khá tích cực trong việc phòng và chữa bệnh tiểu đường xét về góc độ bệnh lý liên quan đến sự gia tăng của lipoprotein trong máu. Vì thế Trehalose hiện nay được dùng nhiều như một chất thấp năng lượng đặc biệt dành cho các đối tượng bị bệnh tiểu đường. Từ kết quả của một nghiên cứu khác cho thấy, đối với những người mắc bệnh tiểu đường, nếu mỗi ngày mỗi người ăn 8g trehalose, lượng đường trong máu sẽ giảm nhanh trong 14 ngày. I.5.2.2 Vai trò thúc đẩy quá trình hấp thụ canxi của Trehalose Nhiều nghiên cứu cho thấy, sử dụng Trehalose có thể tăng cường sự hấp thụ canxi của tế bào. Nhờ đặc tính này, Trehalose có thể giúp cho con người phòng chống các bệnh về chuyển hóa và bệnh loãng xương. Quá trình thúc đẩy hấp thụ canxi của Trehalose xảy ra trong ruột già. Cơ chế thúc đẩy trên chưa được xác định rõ ràng nhưng các tác giả đều có một kết luận chung là do ba yếu tố sau: + Đường Trehalose trong ruột già được các vi sinh vật sinh axit lên men, làm giảm pH của môi trường, dẫn đến sự tái hòa tan của các muối canxi + Trong ruột già các vi khuẩn Bifidobacterium lên men mạnh khi môi trường có chứa Trehalose sinh ra các axit mạch ngắn, các axit này khuếch tán vào tế bào biểu bì thành ruột, từ đó thúc đẩy sự hấp thụ canxi. + Sự dịch chuyển Trehalose trong ruột già sẽ kéo theo sự dịch chuyển của hợp chất canxi – protein, nhờ đó canxi được tiếp xúc nhiều hơn với các tế bào thành ruột, tạo điều kiện tốt cho sự hấp thu vào máu. Ngoài canxi, Trehalose đồng thời còn thúc đẩy sự hấp thụ cả magie. Điều này thúc đẩy quá trình phát triển xương, tăng cường hàm lượng canxi trong xương. I.5.2.3 Ảnh hưởng của Trehalose đến hệ vi sinh vật trong khoang miệng Bệnh sâu răng chủ yếu là do vi khuẩn streptococci đột biến và các liên cầu khuẩn gây nên. Các vi sinh vật có rất nhiều trong khoang miệng của người và động vật. Khi đưa thức ăn vào chúng sẽ lựa chọn thành phần dinh dưỡng thích hợp dễ lên men, phát triển và gây bệnh. Vì thế nếu trong thành phần thức ăn của ta không chứa hoặc ít chứa chất thích hợp cho quá trình dinh dưỡng của loại vi sinh vật trên sẽ có thể ngăn ngừa được bệnh. Để xét ảnh hưởng của Trehalose đến bệnh sâu răng người ta đã tiến hành thí nghiệm trên cơ thể chuột. Kết quả cho thấy nhóm chuột thí nghiệm (ăn đường Trehalose) bị sâu răng ít hơn nhiều so với nhóm chuột đối chứng (ăn Saccaroza) Các thí nghiệm nuôi cấy vi sinh vật phân lập từ khoang miệng lên môi trường Trehalose đã chứng tỏ cơ chế và khả năng phòng bệnh sâu răng của nó. Đó là do Trehalose không phải là môi trường thích hợp cho các vi sinh vật trên phát triển. Ngoài ra Trehalose còn có khả năng chữa bệnh sâu răng. Vì thế ngày nay trên thế giới người ta còn dùng Trehalose thay thế cho đường kính trong thành phần ăn hoặc trong chế biến bánh kẹo, đặc biệt là bánh kẹo cho trẻ em để phòng bệnh sâu răng. I.5.2.4 Tính kháng khuẩn của Trehalose Như chúng ta đã biết probiotic là những chế phẩm chứa nhiều vi sinh vật có lợi như lactobacillus và bifidobacteria. Các vi sinh vật này có khả năng kháng khuẩn gây bệnh đi ngoài. Hiện nay các chế phẩm probiotic bán trên thị trường thường chứa nhiều đường Trehalose, bởi đường Trehalose có tác dụng là cơ chất tốt cho sự phát triển của các vi sinh vật có lợi. Chính sự có mặt và đóng góp vai trò tích cực trên người ta đã nói rằng đường Trehalose có khả năng kháng khuẩn (antibiotic) I.5.2.5 Tính an toàn của Trehalose Để khẳng định tính an toàn của Trehalose đối với cơ thể sống đã có nhiều nghiên cứu về tế bào và gen của động thực vật ăn Trehalose. Các nghiên cứu này chủ yếu tập trung để trả lời các câu hỏi là khi động vật sử dụng Trehalose có ảnh hưởng đến khả năng kháng khuẩn của tế bào hay không? Có gây ra đột biến về gen dẫn đến sự tổng hợp AND bất quy tắc hay không? Tất cả các nghiên cứu đã cho kết luận là Trehalose không gây độc hai đến tế bào chủ thể. I.6. Ứng dụng của Trehalose Một số sản phẩm đường Trehalose : Hình 4: Một số loại thực phẩm chứa trehalose Phụ thuộc vào độ tinh khiết Trehalose thương phẩm chủ yếu có hai loại là Trehalose có độ tinh khiết 45% và Trehalose có độ tinh khiết cao hơn 70%. Với độ tinh khiết 45% thường được dùng trực tiếp như một loại thực phẩm hoặc như một loại chất ngọt bổ sung trong chế biến các loại thực phẩm khác. Còn đường có độ tinh khiết cao hơn 70% thường dùng cho các đối tượng mắc bệnh, các đối tượng ăn kiêng. Ngoài ra đường tinh khiết 100% dùng trong việc phân tích hóa học. Đường Trehalose có nhiều đặc tính sinh học đáng quý, có hương vị và tính chất hóa lý tương tự đường kính nên được sử dụng thay thế đường kính trong sản xuất các loại thực phẩm chứa đường như kẹo, bánh và bột dinh dưỡng trẻ em.v.v… Sản phẩm sau khi cải tiến này sẽ có giá trị cao về mặt dinh dưỡng cũng như chức năng phòng ngừa bệnh tật đồng thời hương vị cũng được cải tiến rất nhiều. Trên thế giới việc sử dụng đường Trehalose trong sản xuất các mặt hàng chức năng như sữa, bánh kẹo, thức ăn cho người bệnh.v.v… Các sản phẩm được bổ sung đầu tiên là bánh quy, sữa chua. Ngày nay đã được dùng cho các sản phẩm đồ uống. Ngoài ra, Trehalose còn được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau. Đường có độ tinh khiết thấp có thể làm chất bổ sung trong môi trường nuôi cấy một số vi khuẩn, loại có hàm lượng trung bình dùng cho người ăn trực tiếp hoặc bổ sung vào thực phẩm còn loại tinh khiết dùng trong kỹ thuật phân tích. Trehalose cũng được sử dụng như một loại dược phẩm dùng nhiều cho các đối tượng người già, trẻ em và người bệnh trong thời kỳ phục hồi sức khỏe để tăng cường hoạt động tiêu hóa, giúp cho các đối tượng trên nhuận tràng ăn tốt. Trehalose có tính hòa tan cao
Hình 5: Tính hòa tan của Trehalose và Sucrose I.7 Tình hình nghiên cứu và sản xuất Trehalose trên thế giới Trehalose có thể thu nhận được bằng cách chiết suất chúng từ các loại cây quả, hoặc bằng các phương pháp hóa học, hóa lý, hóa sinh. Nhưng cho tới nay phương pháp được coi là có hiệu quả và có khả năng công nghiệp hóa nhất là phương pháp công nghệ sinh học. Thông thường Trehalose được sản xuất theo phương pháp liên tục và không liên tục. Trong phương pháp sản xuất liên tục công nghệ cố định enzyme hoặc cố định tế bào được sử dụng, còn đối với phương thức sản xuất không liên tục thì sử dụng enzyme đã chiết tách. Giải pháp cố định enzyme và cố định tế bào trong sản xuất Trehalose cho hiệu quả cao hơn vì sản xuất liên tục tiêu hao năng lượng ít, nhà xưởng nhỏ… nhưng tính ổn định kém và cần máy móc thiết bị hiện đại, nhà xưởng tiêu chuẩn. Tuy vậy, đây lại là phương pháp có khả năng công nghiệp hóa cao và được tập trung nghiên cứu nhiều ở các nước có nền công nghiệp phát triển như Nhật Bản, Hàn Quốc. Trung Quốc, Pháp, Mỹ,… I.8. Tình hình nghiên cứu và sản xuất Trehalose ở Việt Nam Công nghiệp sản xuất thực phẩm chức năng nói chung và công nghiệp sản xuất đường Trehalose nói riêng đang được phát triển mạnh trên thế giới. Cùng với xu hướng phát triển chung của toàn cầu. Ở Việt Nam lĩnh vực này cũng đang được chú ý rất nhiều do nhu cầu thị trường ngày càng cấp bách. Ngoài viện Công nghiệp thực phẩm ra một số trường và các viện khác như trường đại học Bách Khoa Hà Nội, trường đại học Nông Nghiệp, Viện đại học Mở Hà Nội, viện nghiên cứu thực phẩm thành phố Hồ Chí Minh cũng bắt đầu có những nghiên cứu thăm dò trong lĩnh vực nghiên cứu và sản xuất loại đường chức năng này. Tuy nhiên các nghiên cứu mới chỉ ở quy mô phòng thí nghiệm. PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II.1 Nguyên vật liệu và hóa chất II.1.1 Giống vi sinh vật Chủng giống vi sinh vật. Escherichia coli DH5 alpha. E.coli được nuôi cấy trong môi trường LB (Luria – Bertani) [1% tryptone, 0.5% yeast extract và 1% NaCl] có bổ sung 100µg/ml ampicillin để làm nhân tố chọn lọc. II.1.2 Plasmid: DNA mang gen Trehalase được cung cấp bởi Viện Công Nghệ Sinh Học Hàn Quốc, Seoul II.1.3 Hóa chất Tinh bột tan (Trung Quốc), bactotryton (Hàn Huốc), bacto yeast extract (Hàn Quốc), NaCl (Trung Quốc), canxiclorua (Trung Quốc), agar (Việt Nam), glycerol (Việt Nam), acrylamide (Trung Quốc), N,N-methylene-bis Acrylamide (Trung Quốc), glycine (Trung Quốc), sodiummetabisulfate (Trung Quốc), methanol (Trung Quốc), acetic acid (Trung Quốc), Amononium persulfate (ASP, USA), Ampicillin (USA), comassie-blue R-250 (USA), axit photphoric (Trung Quốc), ethanol (Trung Quốc), Tris-base (Sigma, USA), phenol (Trung Quốc), NaOH (Trung Quốc), potassium Sodium Tartrate (Trung Quốc), EDTA (USA), SDS (USA), DNS 3,5 Dinitro salicylic (Trung Quốc), Imidazole (Hàn Quốc), Glucose (Trung Quốc), Maltose (Trung Quốc), NaH2PO4(Trung Quốc), Na2HPO4(Trung Quốc), 2-mercaptoethanol (Đức), Bromophenol blue (Đức), NaHCO3 (Trung Quốc), Na2CO3(Trung Quốc), potassium acetate (Hàn Quốc), Boric axit (Trung Quốc), HCl (Trung Quốc), n-butanol (Trung Quốc), TEMED (Trung Quốc), APS (Trung Quốc), Dithiotheritol (Hàn Quốc), Ethidumbromide (Hàn Quốc) II.1.4 Máy móc và thiết bị Máy li tâm (Trung Quốc), máy so màu quang điện, máy đo pH, máy lắc (Trung Quốc), bình ổn nhiệt (Trung Quốc), nồi hấp (Trung Quốc), máy khuấy từ (Trung Quốc), máy siêu âm (Trung Quốc), cân điện tử (Đức), máy điện di (Trung Quốc), tủ sấy, box cấy (Trung Quốc), cân kỹ thuật (Mỹ), buồng điện di DNA (Nhật), máy li tâm lạnh siêu tốc liên tục (Đức). Và các dụng cụ cần thiết khác như bình tam giác, ống nghiệm, ống eppendof, đầu côn xanh, đầu côn vàng, đĩa peptri, pipet thủy tinh và pipet ... II.2 Phương pháp nghiên cứu II.2.1 Biến nạp E.coli DH5 alpha bằng phương pháp sốc nhiệt Biến nạp là quá trình chuyển DNA plasmid trực tiếp tách ra từ tế bào thể cho sang thể nhận. Có nhiều phương pháp biến nạp được sử dụng như biến nạp bằng xung điện, sốc nhiệt…Trong đó biến nạp bằng sốc nhiệt là phương pháp được sử dụng phổ biến hơn cả, đơn giản và cho hiệu quả cao. Cơ chế biến nạp chủ yếu bao gồm việc làm thay đổi cấu trúc thành tế bào vi khuẩn để vi khuẩn có thể tiếp nhận DNA từ bên ngoài, phục hồi lại cấu trúc thành tế bào sau khi tiếp nhận DNA để vi khuẩn mang DNA ngoại lai có thể phát triển bình thường. Những tế bào có khả năng tiếp nhận DNA ngoại lai được gọi là các tế bào khả biến Nguyên tắc: Để biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn thì bề mặt tế bào được xử lý CaCl2 để tăng hoạt tính tiếp nhận DNA. Tạo hỗn hợp vi khuẩn với DNA trong điều kiện lạnh sau đó đưa hỗn hợp vào tình trạng nhiệt độ cao (4oC). Sự phân chia tế bào vi khuẩn xảy ra, DNA tự tiếp xúc với tế bào vi khuẩn. Ngay lập tức đưa hỗn hợp vào lạnh, ở sốc lạnh các DNA sẽ đi vào và cố định trong tế bào vi khuẩn. Hỗn hợp này được chuyển vào đĩa peptri chứa môi trường có bổ sung kháng sinh. Quy trình biến nạp gồm 2 giai đoạn: tạo tế bào khả biến và biến nạp. Phương pháp tiến hành như sau: + Tạo tế bào khả biến DH5 alpha Hoạt hóa tế bào E.coli trên môi trường thạch LB (1% w/v Bacto trypton; 0.5% w/v Bactoyeast extract; 0.5 % NaCl; 2% Agar) ở 37oC, 24 giờ. Lấy một khuẩn lạc cấy vào môi trường 5ml LB lỏng
Hình 6: Vi khuẩn E.coli trong LB rắn (khuẩn lạc) Môi trường LB lỏng: 1% w/v Bacto trypton; 0.5% w/v Bactoyeast extract; 0.5 % NaCl Nuôi trên máy lắc (37oC, 12 – 14 giờ). Sau đó lấy 1% dịch nuôi cấy trên (50µl cho 50ml môi trường nuôi cấy LB) tiến hành lắc trên máy lắc 200 – 250 rpm ở 37oC để đạt được Abs 600 (khoảng 2 – 3 giờ). Tiếp đó chuyển dịch nuôi cấy trên vào hai ống ly tâm 50ml và ly tâm ở 4oC tốc độ 5000 – 7000 rpm trong 5 phút. Sau khi ly tâm bỏ dịch trong phía trên và cho một nửa (12.5 ml) dung dịch 50mM CaCl2. Lắc nhẹ để làm tan cặn tế bào sau đó bảo quản 30 phút trên đá. Tiến hành ly tâm 6000 rpm trong 5 phút, bỏ dịch trong phía trên và cho vào 1/10 thể tích (2.5 ml) dung dịch 100mM CaCl2 và làm tan hoàn toàn cặn. Để bảo quản dịch tế bào lấy 850 µl dịch tế bào với 150 µl 100% glycerol bảo quản trong nitơ lỏng. + Biến nạp Lấy 200 µl dịch tế bào trên cho vào ống eppendoff và bổ sung 1 µl DNA. Sau đó để trên đá 30 phút rồi sốc nhiệt 2 phút ở 42oC. Sau sốc nhiệt bổ sung thêm 1ml LB và ủ ở 37oC trong 1h. Sau đó lấy 100 – 200 µl dịch đã biến nạp trên cấy trên môi trường thạch LB chứa kháng sinh (100ml LB, 100µl Amp) và để phát triển qua đêm ở 37oC.
Hình 7: Vi khuẩn E.coli sau khi biến nạp trong LB rắn có kháng sinh Tất cả các thao tác đều làm trong box cấy vô trùng, các dụng cụ đều được hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút. II.2.2 Tách DNA plasmid DNA tái tổ hợp sau khi được biến nạp vào chủng DH5 alpha sẽ nhân lên thành nhiều bản sao cùng với quá trình sinh trưởng của vi khuẩn. Sau đó vector tái tổ hợp được tách chiết ra khỏi DNA genom vi khuẩn bằng cách xử lý với NaOH, SDS. Trong điều kiện này, DNA genom của vi khuẩn ở dạng mạch thẳng có phân tử lượng lớn sẽ bị đứt gãy còn plasmid ở dạng mạch vòng có kích thước phân tử nhỏ và bền vững nên sẽ không bị đứt gãy. Protein và tạp chất được loại bỏ bằng hỗn hợp Chloroform: iso – amyl alcohol. DNA plasmid thu được nhờ quá trình kết tủa với cồn và muối CH3COONa. Có rất nhiều phương pháp tách plasmid như: tách plasmid bằng phương pháp kiềm, tách plasmid bằng phương pháp boiling. Phương pháp tiến hành: Nuôi cấy tế bào trong môi trường lỏng, nhặt một khuẩn lạc E.coli chứa plasmid từ đĩa petri nuôi cấy tế bào qua đêm vào ống nghiệm hoặc bình tam giác có chứa 5ml môi trường LB lỏng có bổ sung chất kháng sinh Ampicillin (nồng độ 100µg/ml) nuôi lắc qua đêm ở nhiệt độ 37oC, tốc độ 200 vòng/phút. Thu tế bào, chuyển dịch nuôi vào trong các eppendoff 1.5ml. Ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 10 phút để thu sinh khối loại dịch nổi. Đồng nhất tế bào, cho 100µl Sol I vào trong ống eppendoff chứa tế bào, hòa tan tế bào bằng máy vortex. Dung dịch Sol I: 25mM Tris – HCl pH 8.0; 10mM EDTA pH 8.0; 50mM glucose. Dung dịch được khử trùng ở 126oC và được cất giữ ở 4oC. Phá màng tế bào, cho 200µl Sol II vào tiếp, dùng tay đảo ngược ống eppendoff nhanh, nhẹ nhàng từ 3 – 5 lần. Dung dịch Sol II: 0.2N NaOH; 1% SDS Cho 150µl Sol III vào tủa protein, dùng tay đảo nhẹ ống từ 3 – 5 lần. Dung dịch Sol III: 3M Potasium Acetate pH 5.5; acetic acid 11.5M dung dịch được khử trùng và cất giữ ở 4oC Sau đó ly tâm ở 4oC với tốc độ 10000 rpm/phút trong 20 phút. Dùng pipet lấy dịch trong ở trên cho vào eppendoff mới (eppendoff được khử trùng) bỏ cặn. Lấy 600 - 800µl Isopropanol cho vào và lắc lên lắc xuống nhiều lần. Đem ly tâm ở 4oC với tốc độ 12000rpm/phút trong 10phút. Ta bỏ dịch phía trên đi, lấy cặn (DNA). Ta cho 500µl cồn 70% (cồn để lạnh) để rửa DNA, dùng pipet bơm lên, bơm xuống cho DNA tung ra. Ly tâm lạnh ở 12000 rpm/phút trong 15 phút sau đó lấy hết cồn ra rồi thực hiện rửa cồn 1 lần nữa. Làm khô mẫu ở nhiệt độ phòng. Hòa tan DNA plasmid tách được trong 40µl dung dịch TE hoặc nước cất vô trùng. Điện di mẫu kiểm tra mấu DNA plasmid trên gel agarose 0.8%. Bảo quản mẫu ở -20oC. II.2.3 Xác định DNA biểu hiện ở E.coli trên gel Agarose Nguyên tắc: Phương pháp điện di DNA trên gel agarose dựa vào đặc tính tích điện âm của phân tử axit Nucleic ở pH trung tính nhờ các nhóm photphat nằm trên các cầu nối phosphodiester của axit Nucleic. Khi được đặt trong điện trường, các phân tử axit Nucleic sẽ dịch chuyển về cực dương với tốc độ khác nhau tùy theo kích thước của chúng. Các phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn các phân tử có kích thước bé. Khả năng di động của các phân tử axit Nucleic này còn phụ thuộc vào nồng độ gel. Ở đây chúng tôi sử dụng gel agarose 0.8%. Các axit Nucleic trong gel sẽ hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) nhờ hóa chất ethidium bromide. Phương pháp tiến hành: 0.8% agarose gel trong dung dịch đệm TBE được đổ trên một giá thể nằm ngang (chuẩn bị gel agarose vào dung dịch đệm đun cho agarose tan hoàn toàn). Để nguội khoảng 50oC,cho 1µl ethidium bromide vào rồi đổ dung dịch agarose vào khay điện di có cài sẵn răng lược. Sau khoảng 30 phút, gỡ lược ra, đặt bản gel vào bể điện di. Đổ dung dịch chạy điện di là đệm TBE (40mM Tris HCl và 2 mM EDTA, pH 8.) vào bể để dung dịch ngập cách mặt gel khoảng 2mm và tiến hành tra mẫu. Trộn mẫu với 1.5µl đệm màu xanh 1X – xanh Bromophenol. Quá trình chạy điện di được tiến hành dưới hiệu điện thế 100V, thời gian là 25 – 30 phút. Sau khi chạy xong lấy bản gel ra và đem soi bằng tia tử ngoại UV 280 nm, plasmid DNA là những vạch màu da cam được so sánh với marker DNA ta xác định được kích thước và độ tinh sạch của DNA. II.2.4 Phương pháp phá vỡ tế bào Protein chiết xuất từ các tế bào vi khuẩn là một bước quan trọng đặc biệt đối với nghiên cứu trong các lĩnh vực hóa sinh học, vi sinh học và sinh học phân tử cũng như cho sự phát triển của quá trình sản xuất protein trong công nghệ sinh học và kỹ thuật sinh hóa. Hiện nay, protein chiết xuất từ các tế bào vi khuẩn thường được sử dụng phương pháp cơ học, đòi hỏi dụng cụ tương đối đắt tiền và đòi hỏi kỹ năng kỹ thuật. Đệm lysis i4 đã được phát triển bằng công nghệ Enzyme phòng thí nghiệm của các quốc gia Trung tâm Kỹ thuật di truyền và Công nghệ sinh học (BIOTEC-Thailand) để cung cấp một giải pháp rẻ tiền để chiết xuất protein, DNA. Có rất nhiều phương pháp để phá vỡ tế bào: phương pháp phá vỡ tế bào bằng phương pháp cơ học và phi cơ học. Trong đó, phương pháp cơ học gồm có rất nhiều phương pháp như phương pháp phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm, phá vỡ tế bào bằng máy đồng hóa cao áp, phá vỡ tế bào bằng phương pháp lạnh đông,… Phương pháp không bằng cơ học như phương pháp sốc thẩm thấu, phương pháp xử lý kiềm,… Do enzyme của chúng tôi là enzyme nội bào nên ở đây chúng tôi sử dụng hóa chất để phá vỡ bề mặt tế bào. Các bộ đệm lysis đã được xây dựng để thu protein vi khuẩn bằng cách sử dụng hóa chất để phá vỡ bề mặt tế bào. Điều quan trọng ở đây là chúng tôi sử dụng dung dịch phá vỡ tế bào rất có hiệu quả với nhiều loại tế bào vi khuẩn, nấm trong khi vẫn bảo toàn hàm lượng và hoạt tính của protein. Dung dịch đệm cũng được sử dụng cho tách chiết DNA từ vi sinh vật. Các đặc điểm của đệm lysis i4: - Dung dịch đệm có thể được sử dụng tách protein một cách hiệu quả từ rất nhiều loại vi sinh vật: vi khuẩn, nấm men, nấm. - Quá trình đơn giản và dễ làm - Đồ dùng và dụng cụ, máy móc không đòi hỏi cao - Dung dịch đệm không làm phản ứng biến tính và cung cấp protein để sử dụng cho thí nghiệm hóa học hay sản xuất protein trong công nghệ sinh học - Ngoài ra dung dịch đệm này còn được sử dụng ở bước bổ sung cho việc tách DNA một cách hiệu quả Phương pháp tiến hành: Lấy 2 ống eppendoff sạch đem cân ống eppendoff trên cân phân tích và ghi lại trọng lượng. Nuôi cấy tế bào trong môi trường lỏng. Nhặt một khuẩn lạc từ đĩa petri (đã biến nạp, đĩa petri LB thạch có kháng sinh). Nuôi cấy tế bào qua đêm vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh, nuôi lắc qua đêm ở 37oC tốc độ 200v/p Sau đó thu tế bào, chuyển dịch nuôi vào trong 2 eppendoff mà ta vừa cân được đem ly tâm ở 6000rpm/phút trong 20 phút ở 4oC để thu sinh khối. Bỏ dịch trong và cân trọng lượng tế bào thu được. Bổ sung 200-300 µl/100mg tế bào. Sau đó, hòa tan cặn bằng vortex và đem ngâm đá 15 – 20 phút. Ly tâm 10 000 v/phút trong 30 phút rồi bỏ cặn thu dịch nổi. II.2.5 Xác định hàm lượng protein tổng bằng phương pháp Bradford Cơ sở của phương pháp: hàm lượng protein – enzyme đã được xác định vào năm 1976 bằng phương pháp của bradford. Cơ sở của phương pháp là dựa vào độ hấp thụ màu của phản ứng giữa enzyme và dung dịch Bradford, dựa vào đồ thị chuẩn BSA-Bradford để tính hàm lượng protein – enzyme. Phương pháp tiến hành: cho 100µl dung dịch protein pha loãng vào 900µl dung dịch Bradford (100mg Coomassie Brillitant Blue G250 hòa tan 500 ethanol, bổ sung 100ml phosphorich acid 85%, sau đó định mức đến 1lít bằng nước cất). Chuẩn bị blank (mẫu đối chứng) bằng cách bổ xung nước cất thay cho protein. Hỗn hợp phản ứng giữ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, cứ 1 phút vortex một lần. Sau đó, hỗn hợp được đo quang phổ ở bước sóng 595nm bằng máy spectrophotometer (máy so màu). Độ hấp thụ quang của dung dịch phản ứng dựa vào đồ thị đường chuẩn BSA-Bradford tính được nồng độ enzyme – protein có trong mẫu. Dựa vào đồ thị đường chuẩn BSA-Bradford có: Y = 1.0361x + 0.0524 R2 = 0.9944 Phương pháp tính toán hàm lượng protein – enzyme được viết như sau: X (mg/ml) = (∆abs - 0.0524): 1.0361 *D*RF Trong đó: X: Hàm lượng protein có trong mẫu phản ứng ∆abs:Giá trị hấp thụ quang phổ của mẫu ở bước sóng 595nm D: Hệ số pha loãng của enzyme