Đề tài Nghiên cứu, đánh giá chất lượng tinh trùng được lấy từ mào tinh sau bảo quản đông lạnh

PAGE  PAGE 46 Phần I  MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Ngành nông nghiệp Việt Nam hiện nay đã đạt được nhiều thành tựu to lớn, đó là ngoài việc đáp ứng nhu cầu lương thực cho người dân, còn xuất khẩu một số lượng lớn lương thực ra nước ngoài góp phần cải thiện và nâng cao chất lượng cuộc sống của người dân. Ngành chăn nuôi nói chung, chăn nuôi lợn nói riêng giữ vị trí quan trọng trong sản phẩm nông nghiệp của thế giới. Trên thế giới chăn nuôi lợn đã cung cấp 40% tổng sản lượng các loại thịt tiêu thụ hàng năm, thịt trâu bò chiếm 31%, thịt gia cầm chiếm 24%. Ở Việt Nam thịt lợn chiếm khoảng 76% tổng lượng thịt tiêu thụ hàng năm. Để có được thành tựu to lớn trên thì bên cạnh việc áp dụng những tiến bộ của nhân loại trong kỹ thuật chăn nuôi, chăm sóc, dụng cụ, phương tiện chăn nuôi tiên tiến hiện đại, thì công việc quan trọng hàng đầu góp phần tạo nên thành công trên là việc nhân và lai tạo giống. Trong những năm qua, việc ứng dụng khoa học công nghệ vào thực tiễn sản xuất bước đầu đã thu được những thành tựu quan trọng, chẳng hạn trong công nghệ sinh học động vật: thụ tinh nhân tạo, cấy chuyển phôi, xác định giới tính phôi, động vật chuyển gen, đông lạnh tế bào và phôi, nhân bản động vật… Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo đã có từ lâu đời, trong đó kỹ thuật thụ tinh nhân tạo trên lợn đã mang lại hiệu quả cao cho ngành sản xuất giống cũng như chăn nuôi ở Việt Nam và trên thế giới. Tuy vậy còn nhiều vấn đề tồn tại cần được tiếp tục nghiên cứu, đặc biệt là vấn đề khai thác và bảo tồn tinh dịch. Việc khai thác tinh ở giai đoạn thích hợp sẽ thu được tinh dịch có số lượng cũng như chất lượng tốt, còn công tác bảo tồn tinh dịch vừa giữ được tinh trùng sống lâu, vừa dễ ứng dụng vào sản xuất. Đông lạnh tinh dịch gia súc để kéo dài thời gian sống của tinh trùng là một thành tựu kỳ diệu của kỹ thuật TTNT nói riêng và của sinh học lạnh nói chung. Bằng kỹ thuật đông lạnh, người ta có thể giữ tinh trùng sống hàng chục năm, tiến tới việc thành lập ngân hàng gen cho mỗi quốc gia. Với mục đích mang lại hiệu quả và năng suất cao cũng như nhằm khắc phục những hạn chế trong kỹ thuật khai thác tinh truyền thống, kỹ thuật thu lấy tinh trực tiếp từ bao dịch hoàn đã góp phần đáp ứng đáng kể nhu cầu của thời đại. Nhưng ở nước ta hiện nay kỹ thuật khai thác tinh trực tiếp từ mào tinh có được áp dụng rộng rãi hay không và chất lượng của tinh trùng có đảm bảo yêu cầu kỹ thuật trong thụ tinh hay không. Nhằm mục đích giải quyết những khúc mắc trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:“Nghiên cứu, đánh giá chất lượng tinh trùng được lấy từ mào tinh sau bảo quản đông lạnh” 1.2. Mục đích nghiên cứu Trên cơ sở nghiên cứu một số đặc tính sinh học của tinh dịch lợn nhằm: - Khảo sát, đánh giá chất lượng tinh lợn được mổ lấy từ mào tinh sau bảo quản lạnh để phục vụ TTON. - Từ những kết quả nghiên cứu có thể tìm ra được những ưu điểm và nhược điểm của phương pháp mới này để khác phục và nâng cao chất lượng tinh dịch, sư dụng tinh nguồn gốc mào tinh trong CNSS. 1.3. Ý nghĩa đề tài Đề tài mang ý nghĩa khoa học cũng như thực tiễn,việc nghiên cứu khảo sát, đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng tinh dịch lợn bảo quản ở -196oC trong ni-tơ lỏng giúp cho việc đánh giá bước đầu hiệu quả cuả phương pháp thu lấy tinh dịch từ mào tinh, đông lạnh tinh lợn, cung cấp nguyên liệu cho TTON, tiến tới thành lập ngân hang tinh và phôi động vật đông lạnh, chủ động trong nghiên cứu các kỹ thuật in vitro. Phần thứ hai TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Các phương pháp bảo quản tinh lợn 2.1.1. Tình hình đông lạnh tinh trùng Phương pháp TTNT đã có từ những nằm 1776 do tu sĩ Lazzaro Spallanzani áp dụng cho thú vật và đã thành công mỹ mãn. Ngày nay, ở Mỹ có khoảng 95% súc vật được TTNT, trong đó đối với lợn khoảng 50%,và đạt được tỷ lệ 80% lợn đẻ 10 con trên lứa, nhưng công nghệ sinh sản chỉ thực sự bắt phát triển những năm 1950 khi khoa học thành công trong việc đông lạnh tinh dịch bò ở -79oC(trong CO2) để thụ tinh với bò cái (Polge và Rowson, 1952). Hai tác giả người Anh này dã tìm ra Glyxerin để có thể đông lạnh vĩnh cửu tinh trùng (Trần Tiến Dũng vcs, 2002). Có thể hiểu: bảo quản lạnh là quá trình mà các tế bào hoặc toàn bộ mô được bảo quản ở nhiệt độ lạnh âm sâu, như 77K hay -196 oC(điểm sôi của Nitơ lỏng). Ở nhiệt độ đó, mọi hoạt động sinh học (trong đó có phản ứng sinh hóa) dẫn đến làm chết tế bào đều ngừng lại. Thay đổi chủ yếu trong việc dự trữ tinh trùng xảy ra vào những năm 1950 khi chuyển từ dự trữ trong CO2 rắn ở -79 oC sang dự trữ trong nitơ lỏng ở -196 oC. Năm 1960, người ta đã thành công trong việc bảo quản tinh dịch trong nitơ ở -196 oC có thể giữ khả năng thụ thai của tinh trùng hàng chục năm sau. Kết quả này đã tạo tiền đề cho những nghiên cứu về đông lạnh tinh sau này, trong đó những tổng kết về quả về bảo quản lạnh tinh trùng các loài động vật, bao gồm việc mô tả kỹ thuật và kết quả thụ tinh đối với trâu bò (Vishwanath va Shannon, 2000), cừu (Salamon và Maxel, 2000), lợn (Jonhson vcs,2000), dê (Seboeuf vcs, 2000), ngựa (Ecot vsc, 2000) gần đây đã được xuất bản. Sự đông lạnh tinh trùng đã được thực hiện cách đây hơn 30 năm và kết quả được thể hiện ở con cháu đang sống của chúng sau khi tiến hành thụ tinh ở voi Fallope, tuy nhiên, kỹ thuật đông lạnh hiện nay vẫn đem lại sản lượng thấp vì sự dung nạp của tinh trùng khi đông lạnh là thấp. Chúng ta biết là khả năng xâm nhập vào trứng của cả tinh trùng tươi và tinh trùng đông lạnh- giải đông là khác nhau phụ thuộc vào lợn đực được khai thác tinh. Vì những lý do sinh lý học của tinh trùng nên khó khăn trong việc kiểm soát sản phẩm phụ trong quá trình bảo quản lạnh tinh trùng lợn. Tuy nhiên, bảo quản lạnh tinh trùng lợn là nguồn lực chính trong việc bảo tồn nguồn gen lợn. Theo K. Kikuchi vcs (1998) đã công bố kết quả nghiên cứu về khả năng thụ tinh ống nghiệm của tinh trùng lợn được khai thác từ mào tinh và được bảo quản lạnh ở 4oC. 2.1.1.1. Cơ sở khoa học xây dựng môi trường pha loãng bảo tồn Ivanov (1999) khẳng định: tinh thanh không tham gia thụ tinh mà chức năng sinh học của tinh thanh là nuôi dưỡng, hoạt hóa tinh trùng, hoạt hóa đường sinh dục cái. Ông cho rằng có thể thay thế tinh thanh bằng môi trường nhân tạo và ý niệm này đã đặt nền móng cho việc điều chế, chế tạo môi trường pha loãng tinh dịch mà ngày nay sử dụng rất phổ biến. Một số đặc điểm lý hóa học cơ bản của tinh dịch chính là thể hiện đòi hỏi về điều kiện sống của tinh trùng ngoài cơ thể. Do vậy việc tổng hợp môi trường cần thỏa mãn tối ưu các yêu cầu cơ bản đó. 2.1.1.2. Nguyên tắc cơ bản của MTPLBT tinh dịch lợn - Áp lực thẩm thấu của môi trường phải tương đương áp lực thẩm thấu của tinh dịch. - pH của môi trường phải tương đương hoặc thấp hơn 1 chút so với pH tinh dịch. - Môi trường phải có năng lực đệm. - Môi trường tổng hợp phải đảm bảo đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sống và trao đổi của tinh trùng. - Môi trường phải có tỷ lệ các chất điện giải/ chất không điện giải thích hợp. - Tỷ trọng của môi trường phải tương đương tỷ trọng của tinh dịch. - Độ nhớt của môi trường phải tương đưng độ nhớt tinh dịch. - Môi trường phải đảm bảo vô trùng tuyệt đói. - Môi trường phải có điểm sôi, điểm đông đặc, điểm bốc hơi phải tương đương hoặc thấp hơn môi trường tinh dịch. - Môi trường phải thả mãn tính kinh tế và thực tiễn nghĩa là giá thành rẻ và dễ ứng dụng trong sản xuất. 2.1.1.3. Các chất cấu tạo nên môi trường pha loãng và bảo tồn tinh dịch - Chất đường: cung cấp chất dinh dưỡng cho tinh trùng sống và vận động, còn có tác dụng bảo vệ màng tinh trùng, tránh hiện tượng tinh trùng bị tụ dính. Milovanov (1962), Salisbury (1978), Xecduc (1970)…sử dụng đường Glucose trong môi trường pha loãng và bảo tồn tinh dịch lợn. Ngoài đường Glucose có thể sử dụng đường Fructose, Sacarose để pha chế tinh lợn. - Chất muối: có vai trò duy trì áp lực thẩm thấu cho tinh trùng và có tác dụng đệm để ổn định pH môi trường. Các nhà khoa học thường dùng muối Natricitrat, Natrikalitartrat (Nguyễn Văn Hưởng 1976; Xecduc 1970). Muối Trilon B (tên khác: EDTA-B2, complexon-3, Selecton II, Titon (Na2H2Y- , M = 372,24) nhờ muối này môi trường sống của tinh trùng trở nên vô độc, kéo dài thời gian sống của tinh trùng. TrilonB lần đầu tiên được Voloxievich (1962-1963) (Dương Đình Long, 1996) dung để bảo tồn tinh dịch lợn ở 0oC. Cơ chế tác dụng của muối này: H2Y2- sẽ tạo phức càng cua với các ion kim loại nặng Ca2+, Mg2+ trong tinh dịch, tác dụng như chất rửa sạch môi trường. - Chất kháng sinh: tập đoàn vi sinh vật phát triển rất nhanh trong tinh dịch làm thay đổi đặc điểm lý hóa môi trường sống của tinh trùng và cướp chất dinh dưỡng làm tinh trùng bị chết nhanh chóng. Bổ sung chất kháng sinh vào môi trường là hết sức cần thiết. Tuy nhiên, các chất kháng sinh đó về định tính và định lượng phải vô hại với tinh trùng. Dựa vào cơ chế tác dụng và phổ tác dụng của kháng sinh đối với các loại vi khuẩn, trong môi trường pha loãng bảo tồn tinh dịch lợn người ta thường bổ sung các chất kháng sinh penicillin, streptomycin, tetracycline… Hỗn hợp penicillin và streptomycin được sử dụng rộng rãi để bảo tồn tinh lỏng cũng như tinh đông lạnh. - Chất đông lạnh: Ở nhiệt độ thấp, quá trình sống và vận động, trao đổi chất của tinh trùng bị ức chế nên kéo dài được thời gian sống của tinh trùng ngoài cơ thể. Song nhiệt độ thấp dễ làm tinh trùng bị sốc lạnh. Nguyên sinh chất của đầu tinh trùng bị “thủy tinh hóa” làm cho chúng bị gãy cổ đứt đuôi. Để bảo tồn tinh dịch ở nhiệt độ thấp, hay bảo quản lạnh cần bổ sung vào môi trường chất chống lạnh cho tinh trùng. Lòng đỏ trứng gà: chứa nhiều Lecitine (7%) là 1 lipoit có tác dụng bảo vệ tinh trùng, chống lại hiện tượng sốc lạnh, và cũng để tăng độ nhớt, tăng độ dinh dưỡng cho môi trường. Lecitine có khả năng chống lạnh cho tinh trùng là do cấu trúc phần tử của nó có 1 phần ưa nước và 1 phần kị nước, phần ưa nước bị hydrat hóa, phần kị nước không bị hydrat hóa và liên kết với nhau tạo thành 1 hệ lưới vi thể trong dung dịch làm giảm hệ số tăng nhiệt trong môi trường. Do đó mà tinh trùng đỡ bị sốc do nhiệt độ (Trần Tiến Dũng vcs, 2002). Vì vậy, lòng đỏ trứng không thể thiếu trong môi trường đông lạnh tinh dịch (môi trường phối hợp sẵn Laicifot, Baier, môi trường sữa, môi trường Polge 1970). Glyxerin: đóng vai trò quan trọng trong sự thành công của kỹ thuật đông lạnh tinh dịch nói riêng và công nghệ sinh học lạnh nói chung. Khi đông lạnh tinh dịch ở nhiệt độ lạnh sâu thì các phân tử Glyxerin không bị kết tinh, do đó tinh dịch đông lạnh không tăng về thể tích, không “thủy tinh hóa”. Khi giải đông các tế bào lại hồi phục sự sống sau “ ngủ đông”. Glyxerin trong nước làm thay đổi tính chất vật lý của nước, đặc biệt là làm tăng nhiều giá trị của độ tăng phí điểm và độ hạ băng điểm của dung dịch so với dung môi, nghĩa là với sự có mặt của Glyxerin thì hệ số truyền nhiệt bị giảm đi nhiều. Hơn nữa Glyxerin còn có tác dụng bảo vệ màng tế bào, ngăn ngừa hiện tượng mất nước của plasma tế bào, giúp tế bào tránh được hiện tượng “thủy tinh hóa” nguyên sinh chất trong điều kiện lạnh sâu. Vì vậy việc phát hiện ra Glyxerin có tác dụng tốt trong vai trò đông lạnh cho tinh trùng là một gốc quan trọng trong công nghệ sinh học,. 2.1.2. Phương pháp bảo quản lạnh tinh trùng 2.1.2.1. Đông lạnh tinh từ dịch tinh xuất ra ngoài - Năm 1949, tinh trùng được bảo tồn lạnh lần đầu tiên bởi nhóm các nhà khoa học do Polge lãnh đạo. Nền tảng của bảo tồn tinh trùng đã có hơn nửa thế kỷ trước đây bằng việc phát hiện ra những tác nhân có tính chat bảo vệ trong lòng đỏ trứng khi làm lạnh (Phillip vcs, 1940) và Glyxerol để đông lạnh tinh trùng gà và trâu bò (Polge vcs, 1952). Xuất phát từ thực trạng sử dụng lợn đực giống trong những năm qua: trong khi các nghiên cứu cho thấy tiềm năng khai thác tinh dịch lợn rất lớn nhưng thực tế cho thấy: việc phối giống trực tiếp gây lãng phí tinh dịch và hiệu quả kinh tế thấp do 1 đực giống chỉ phụ trách 1 đến 2 lợn nái, kể cả việc TTNT bằng tinh tươi cũng gặp phải 1 số khó khăn: thời gian giữ tinh dịch không được lâu, đối với vùng giao thông đi lại khó khăn, việc mua tinh tươi rồi bảo quản, vận chuyển về đến nơi thường mất nhiều thời gian làm giảm chất lượng tinh dịch, tỷ lệ thụ thai thấp, hơn nữa, TTNT bằng tinh tươi cần lượng tinh dịch rất lớn (đối với lợn nội là 30ml tinh pha, còn lợn ngoại là 100 ml tinh pha). Còn sản xuất tinh theo liều phối dạng viên hay cọng rạ, bảo quản đông lạnh ở -196oC trong ni-tơ lỏng dùng cho TTNT hoặc IVF, cho phép khai thác tối đa tiềm năng sinh sản của đực giống tốt, lại bảo quản được rất lâu, nó còn có ý nghĩa đặc biệt trong việc bảo tồn giống nòi tránh nguy cơ tuyệt chủng. Chính vì vậy, xây dựng ngân hang tinh, phôi cung cấp tinh cọng rạ cho IVF và TTNT đã thay thế hầu hết tinh tươi và việc phối giống tực tiếp, tạo ra bước đột phá trong chăn nuôi nói riêng, CNSH động vật nói chung. Trong những năm qua, những điều chỉnh kỹ thuật thực nghiệm đã được đưa vào kỹ thuật bảo quản lạnh tinh trùng với mục đích mở rộng phương pháp đối với nhiều loài và cải tiến hiệu quả của quá trình đông lạnh. Tinh trùng của các loài có màng tế bào khác nhau (Cross, 1998), nên ảnh hưởng của việc làm lạnh đến tinh trùng cũng khác nhau: lợn đực mẫn cảm nhất, trâu bó, cừu ngựa rất mẫn cảm, chó mèo mẫn cảm có mức độ, thỏ, người, gà ít mẫn cảm hơn (Parks, 1997). Có thể phòng tránh sốc lạnh trong kỹ thuật bảo quản lạnh bằng việc kiểm soát tốc độ làm lạnh và bổ sung các thành phần bảo vệ vào chất pha loãng tinh dịch (Parks, 1997; Foote, 1984). Tốc độ làm lạnh phù hợp nhất là: đầu tiên nhanh để cho nước ở ngoài tế bào đông lạnh mà không hình thành tinh thể đá trong tế bào, tốc độ đong lạnh tối ưu đối với tinh trùng dao động theo loài: 1-10oC/ phút đối với người, 50-100 oC/phút đối với trâu bò (Woelders, 1997). Theo Holth vcs (2000), ở một số loài, sử dụng liều tinh trùng bảo quan lạnh dù cao thì cũng đạt được tỷ lệ thụ thai tương đương với sử dụng tinh tươi: tinh trùng bò bảo quản lạnh phải được phối với liều gấp 2-10 lần so với tinh tươi để đạt được tỷ lệ thụ thai tương đương. Nhưng tinh trùng đông lạnh cần phải đực phối giống gần với thời điểm rụng trứng để tăng khả năng thụ thai (Parrish vcs, 1986). 2.1.2.2. Đông lạnh tinh từ mào tinh a) Khai thác tinh từ mào tinh *) Cơ sở khoa học Trong những phương pháp để khai thác tinh thì khai thác tinh từ mào tinh là một đề cử quan trọng cho việc bảo quản lạnh tinh trùng. Mào tinh là nguồn cung cấp nguồn gen quan trọng của động vật đực đối với những động vật đang bị đe dọa tuyệt chủng, cũng như động vật hoang dã hay động vật nuôi nhốt. Hơn nữa, đông lạnh- giải đông tinh khai thác từ mào tinh mang lại kết quả cao hơn trong IVF so với tinh trùng đông lạnh- giải đông khai thác bằng phương pháp xuất tinh của cùng con lợn. Việc sử dụng phương pháp bảo quản lạnh tinh trùng khai thác từ mào tinh, thụ tinh ở vòi Fallop hay IVF, kế tiếp là chuyển phôi (IVF/ET) là những phương pháp có thể hoàn thiện và khắc phục giới hạn về chất lượng tinh trùng kém. Bởi vì tinh trùng được thụ tinh trong âm đạo thì cần một lượng lớn và chất lượng tốt. Còn thụ tinh ở vòi Fallop hoặc IVF/ET yêu cầu tinh trùng có khả năng thụ tinh trong ống nghiệm vì tinh trùng không ở lại hoặc chỉ ở lại 1 khoảng thời gian ngắn trong đường sinh dục con cái, (H,Ikeda, K,Kikuchi, I,Noguchi, H,Takeda, 2000, Effect of preincubation of cryopreserved porcine epididymal sperm). Bản báo cáo đã nhấn mạnh việc bảo quản lạnh tinh trùng khai thác từ mào tinh là 1 phương pháp quan trọng cho việc bảo tồn nguồn gen lợn. *) Kỹ thuật khai thác - Thu lấy dịch hoàn lợn từ lò mổ - Mổ dịch hoàn thu lấy mào tinh - Đầu nhỏ của mào tinh được nối với ống để chứa tinh dịch - Dùng kim cỡ 15 đã bấm đầu nhọn gắn vào lòng ống phia đầu còn lại của mào tinh - Dùng xilanh 100ml đã hút đầy không khí gắn vào kim, rồi bơm hết không khí ra. Khi đó tinh dịch trong mào tinh sẽ được dồn hết về phía ống chứa tinh. Chúng ta sẽ thu được tinh dịch từ mào tinh. b) Đông lạnh tinh khai thác từ mào tinh Sau khi thu được tinh dịch, tỷ lệ % hoạt lực tinh trùng sẽ được đánh giá dưới ánh sáng kính hiển vi với khả năng chịu nhiệt 370C, độ phóng đại 0.05) khi bổ sung tinh thanh với nồng độ khác nhau (5%;20%) vào môi trường bảo quản trước khi đông lạnh. Như vậy, kết quả của chúng tôi gợi ý rằng : có thể sử dụng phương pháp đông lạnh, môi trường đông lạnh, chất chống lạnh mà phòng Cộng nghệ Phôi đã tiến hành thử nghiệm để mở rộng quy mo sản xuất tinh đông lạnh, nhằm mục đích trước tiên là chủ động cung cấp nguyên liệu cho TTON, sau là đáp ứng từng bước cho việc cung cấp tinh lợn cho nhu cầu của nhà chăn nuôi, đặc biết là vì mục đích bảo tồn quỹ gen vật nuôi và duy trì đa dạng sinh học dưới dạng tinh và phôi đông lạnh. 4.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG TINH TỪ MÀO TINH CỦA LỢN LANDRACE SAU KHI BẢO QUẢN TRONG NITƠ LỎNG -1960C Để so sánh hiệu quả bảo tồn đông lạnh tinh dịch, chúng tôi tiến hành so sánh các chỉ tiêu A %, Sg %, K % giữa tinh trùng khai thác từ mào tinh của các lợn Landrace trước và sau khi bảo quản lạnh. Kết quả được trình bày ở bảng từ 4.3- 4.7. Bảng 4.3. Kết quả so sánh các chỉ tiêu A %, Sg %, K % giữa tinh trùng khai thác từ mào tinh của lợn Landrace 1 trước và sau khi bảo quản lạnh KT1 Chỉ tiêuTrước bảo quảnSau bảo quảnA %84,72± 1,8627,00± 5,87Sg %90,41±1,5538,38±4,03K %4,35± 0,8317,08± 1,71 Bảng 4.4. Kết quả so sánh các chỉ tiêu A %, Sg %, K % giữa tinh trùng khai thác từ mào tinh của lợn Landrace 2 trước và sau khi bảo quản lạnh KT2 Chỉ tiêuTrước bảo quảnSau bảo quảnA %74,57± 1,8326,50± 5,80Sg %86,64±2,4737,37±5,50K %4,42± 0,8917,29± 0,95 Bảng 4.5. Kết quả so sánh các chỉ tiêu A %, Sg %, K % giữa tinh trùng khai thác từ mào tinh của lợn Landrace 3 trước và sau khi bảo quản lạnh KT3 Chỉ tiêuTrước bảo quảnSau bảo quảnA %84,78± 1,5332,00± 4,83Sg %91,62±1,8339,70±4,04K %3,96± 0,8018,31± 2,05 Bảng 4.6. Kết quả so sánh các chỉ tiêu A %, Sg %, K % giữa tinh trùng khai thác từ mào tinh của lợn Landrace 4 trước và sau khi bảo quản lạnh KT4 Chỉ tiêuTrước bảo quảnSau bảo quảnA %74,23± 1,0329,00± 4,59Sg %86,98±1,8838,89±3,62K %4,91± 0,3918,52± 2,05 Bảng 4.7. Kết quả so sánh các chỉ tiêu A %, Sg %, K % giữa tinh trùng khai thác từ mào tinh của lợn Landrace 5 trước và sau khi bảo quản lạnh KT5 Chỉ tiêuTrước bảo quảnSau bảo quảnA %79,93±1,2127,50±6,35Sg %88,65±1,7739,10±3,95K %5,41±0,6318,28±1,17 Qua các bảng so sánh trên chúng ta nhận thấy: - Hoạt lực của tinh trùng sau khi bảo quản lạnh giảm đi rất nhiều so với trước khi bảo quản. Nguyên nhân do tác động của các yếu tố bên ngoài như: nhiệt độ, môi trường pha loãng, môi trường đông lạnh tác động đến tinh trùng làm cho tinh trùng bị sốc dẫn đến làm giảm hoạt lực của tinh trùng. - Tỷ lệ sống của tinh trùng cũng giảm đi rất nhiều sau khi đông lạnh tinh dịch. Sau khi tinh dịch được lấy ra khỏi mào tinh, tinh trùng bị chịu tác động của nhiều yếu tố ngoại cảnh bất lợi, làm cho sức sống của tinh trùng giảm dần đi, rồi chết. - Sau quá trình đông lạnh tỷ lệ tinh trùng kỳ hình tăng lên rất nhiều sau khi bảo quản lạnh. Cũng do tác động của môi trường bên ngoài, do tính chất hóa-lý của môi trường pha loãng bảo quản tinh dịch làm cho tinh trùng bị thay đổi về hình dạng, bị đứt gãy, từ đó làm tăng tỷ lệ tinh trùng kỳ hình trong tinh dịch sau bảo quản lạnh. Như vậy, để tránh và giảm đến tối thiểu sự biến đổi theo chiều hướng bất lợi của tinh trùng sau khi bảo quản lạnh, thì chúng ta cần tạo ra môi trường pha loãng, bảo quản có những tính chất hóa-lý tương tự như trong điều kiện mào tinh, và cần phải có độ nhanh, độ chính xác cao trong các thao tác. 4.4. KẾT QỦA TTON BẰNG TINH TỪ MÀO TINH CỦA LỢN LANDRACE SAU BẢO QUẢN TRONG NITƠ LỎNG -1960C Các mẫu tinh đông lạnh của giống lợn Landrace sau khi giải đông được chúng tôi tiến hành TTON với trứng đã thành thục. Chúng tôi đều sử dụng trứng lợn lai kinh tế, được khai thác từ lò giết mổ làm nguyên liệu để TTON bằng tinh đông lạnh của cả 2 giống lợn trên. Mỗi cá thể chọn ngẫu nhiên 5 lô thí nghiệm để theo dõi, ghi lại số trứng đem thụ tinh, số trứng được thụ tinh từ đó biết được tỷ lệ thụ tinh. Kết quả được trình bày ở bảng 4.8. Bảng 4.8. Kết quả TTON bằng tinh từ mào tinh từ mào tinh của lợn Landrace sau bảo quản trong Nitơ lỏng -1960C KT 1KT 2KT 3KT 4Số trứng đem thụ tinh 262475310260Số trứng được thụ tinh 185361219198Tỷ lệ thụ tinh (%)70,54±0,7876,21±1,0670,58±0,8176,12±0,69 Kết quả thu được ở bảng 4.8 cho thấy, tỷ lệ thụ tih bằng tinh đông lạnh của lợn Landrace khá cao, cao nhất là con đực KT2 với 76,21%; con KT1, KT3, KT4 có tỷ lệ thụ tinh thấp hơn không đáng kể so với con KT2, thấp nhất là con đực số 1 với 70,54%. Kết quả này chứng tỏ rằng tinh cọng rạ của lợn KT2 có chất lượng tốt nhất trong những đực giống chúng tôi đã khảo sát. Kết quả còn được thể hiện ở biểu đồ 4.2. Biểu đồ 4.2. Kết quả TTON bằng tinh từ mào tinh từ mào tinh của lợn Landrace sau bảo quản trong Nitơ lỏng -1960C. Như vậy, bảo quản lạnh tinh lợn lâu dài vẫn duy trì được khả năng thụ tinh tốt có ý nghĩa to lớn không chỉ đối với nghiên cứu khoa học (tinh đông lạnh được giải đông để sử dụng khi cần, khắc phục nhược điểm và tính bị động của việc dùng tinh tươi trước đây) mà còn đối với vấn đề bảo tồn đa dạng sinh học. 4.5. MỘT SỐ HÌNH ẢNH THU ĐƯỢC TỪ THỰC NGHIỆM Hình 4.1. Lợn LandraceHình 4.2. Lợn Bản Hình 4.3. Tinh trùng kỳ hình lợn LandraceHình 4.4. Tinh trùng kỳ hình lợn Bản  Hình 4.5. Tinh trùng lợn BảnHình 4.6. Trứng bị nhiễm Hình 4.7. Trứng chưa thành thụcHình 4.8. Trứng đã thành thục Phần VKẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN Đây là những kết luận bước đầu về khảo sát đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng tinh dịch lợn sau quá trình bảo quản lạnh và theo dõi hiệu quả bảo tồn đông lạnh tinh dịch lợn thông qua kết quả TTON. 5.1.1. Sinh học tinh dịch lợn Các chỉ tiêu chúng tôi khảo sát ở trên là các chỉ tiêu quan trọng nhất để kiểm tra, đánh giá chất lượng tinh dịch lợn trước khi đưa vào TTON. Các chỉ tiêu A, Sg, K , đều đạt tiêu chuẩn đông lạnh quy định. 5.1.2. Bảo quản lạnh tinh lợn trong nitơ lỏng -1960C Bằng phương pháp đông lạnh đã chọn, chúng tôi đã thành công trong việc bảo quản đông lạnh tinh dịch lợn trong nitơ lỏng ở nhiệt độ -1960C. Tất cả các chỉ tiêu kiểm tra sau đông lạnh đều đạt quy định của tinh đông lạnh mà TCVN 1984 đề ra. Các chỉ tiêu khảo sát đều cho thấy chất lượng tinh lợn Landrace sau khi bảo quản lạnh của tinh từ mào tinh đều tốt hơn tinh xuất. 5.1.3. Kết quả TTON bằng tinh đông lạnh Tỷ lệ trứng được thụ tinh bằng tinh đông lạnh là khá cao từ 70,54- 76,21%. Phôi thu được từ TTON được sử dụng triệt để cho những nghiên cứu quan trọng tiếp theo. 5.2. ĐỀ NGHỊ + Đối với tinh trùng đông lạnh - Tiếp tục nghiên cứu trên các đối tượng khác nhằm mục đích nhân rộng và bảo tồn những gen quý của các động vật quý hiếm mà hiện nay đang bị đe dọa và đối mặt với sự mất đi của loài đó. - Từ các việc nghiên cứu như thế chúng ta có thể thành lập ngân hàng tinh trùng va ngân hàng gen của động vật quý ở các nước trong khu vực nói chung và có thể áp dụng để cho nhà chăn nuôi có bước đi mới phát triển thúc đẩy việc chăn nuôi của mình ngày càng ngày đặt hiệu quả cao nói riêng. + Đối với kết quả thụ tinh ống nghiệm: - Theo những kết quả của việc thụ tinh ống nghiệm bằng cách sủ dụng tinh trùng đã được bảo quản tron ngân hàng với trứng được nuôi thành thục, cho thấy rằng chúng ta có thể áp dụng phương pháp này vào trong thực tiễn nhằm mục đích bảo tồn gen của động vật quý cũng như để nâng cao hiệu quả của việc chăn nuôi, giữ giống, Hiện nay do các đề tài nghiên cứu ngày càng được mở rộng, chúng ta có thể xác định được trước khi sinh về giới tính v.v… - Chúng ta có thể áp dụng các phương pháp nghiên cứu này và phát triển thành phương pháp mới cho con người để chữa bệnh vô sinh và sinh đẻ có kế hoạch. Phần VI TÀI LIỆU THAM KHẢO 6.1. TÀI LIỆU TRONG NƯỚC 1. Nguyễn Tấn Anh, Nguyễn Quốc Đạt, 1997. Thụ tinh nhân tạo cho gia súc gia cầm. NXB Nông nghiệp TP HCM. 2. Nguyễn Anh, 2004. Báo cáo kết quả thực hiện đề tài nghiên cứu triển khai công nghệ bảo quản tinh đông lạnh lợn Ỉ nhằm bảo tồn nguồn gen quý hiếm của Việt Nam. Viện Công nghệ sinh học-2005. 3. Nguyễn Tấn Anh, Nguyễn Thiện, 1993. Thụ tinh nhân tạo cho lợn ở Việt Nam. NXB Nông nghiệp Hà Nội- 1993. 4. Hà Văn Chiêu, 1999. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh họctinh dịch bò(Holsteinfriz, Zebu) và khả năng sản xuất tinh đông lạnh của chúng ở Việt Nam. Luận án TS Nông nghiệp, viện chăn nuôi Việt Nam. 5. Trần Tiến Dũng, Nguyễn Văn Thành, Dương Đình Long, 2002. Giáo trình sinh sản gia súc. NXB Nông nghiệp Hà Nội -2002. 6. Cù Xuân Dần, Nguyễn Xuân Tịnh, Tiết Hồng Ngân, Nguyên Bá Mùi, Lê Mộng Loan, 1996. Giáo trình sinh lý học gia súc. NXB Nông nghiệp Hà Nội- 1996. 7. Nguyễn Thị Ước , Nguyễn Hữu Đức, Lê Văn Ty, Quản Xuân Hữu, Nguyễn Trung Thành, Bùi Linh Chi, Nguyễn Văn Hạnh, Nguyễn Thùy Anh, Nguyễn Việt Linh, Bùi Xuân Nguyên, 2003. Kết quả thụ tinh ống nghiệm và cấy phôi ở bò Laisind. Báo cáo Khoa học Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, Hà Nội 2003. NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội- 2003. 8. Nguyễn Thị Ước, Nguyễn Hữu Đức, Lê Văn Ty, Bùi Linh Chi, Nguyễn Thị Xiêm, Đào Lan Hương, Bùi Xuân Nguyên, 1999. Hoạt hóa và bảo quản lạnh tinh trùng phục vụ thụ tinh ống nghiệm và điều trị vô sinh. Báo cáo Khoa học Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, Hà Nội 1999. NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội- 1999. 9. Bùi Xuân Nguyên, Lê Văn Ty, Nguyên Hữu Đức, Bùi Linh Chi, Nguyễn Trung Thành, Nguyễn Việt Linh, Nguyễn Văn Hạnh, Quản Xuân Hữu, Hoàng Nghĩa Sơn, Nguyễn Thị Ước, 2003. Những thành tựu mới và phương hướng ứng dụng Nông-Sinh-Y của công nghệ phôi, và tế bào phôi. Báo cáo Khoa học Hội nghị Cộng nghệ sinh học toàn quốc, Hà Nội- 2003. NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội- 2003. 10. Bùi Xuân Nguyên, Lê Văn Ty, Đỗ Tước, Hoàng Ngọc Khanh, Ngô Việt Nhơn, Nguyên Hữu Đức, Bùi Linh Chi, Nguyên Khắc Tích, Dương Đình Long, Hoàng Nghĩa Sơn, Nguyễn Thị Ước, 1999. Nghiên cứu xây dựng ngân hàng tế bào và phôi động vật lạnh. Báo cáo Khoa học Hội nghị Cộng nghệ sinh học toàn quốc, Hà Nội- 1999. NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội- 1999. 11. Đào Đức Thà, Trịnh Văn Thân, Đỗ Hữu Hoàn, Trần Thị Hòa, Hoàng Thế Nha, 2003. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học tinh dịch gia súc gia cầm nhằm đánh giá chất lượng đực giống. Báo cáo Khoa học Hội nghị Cộng nghệ sinh học toàn quốc, Hà Nội- 2003. NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội- 2003 12. Đỗ Văn Thu, 2001. Cộng nghệ bảo tồn tinh dịch cừu phục vụ nâng cao chất lượng giống và bảo tồn quỹ gen. Báo cáo kết quả thực hiện đề tài cấp cơ sỏ năm 2003, Viện Cộng nghệ sinh học. 13. Đỗ Văn Thu, 2001. Nghiên cứu sinh học tinh dịch và công nghệ bảo quản tinh dê nhằm góp phần phát triển đàn dê nuôi tại Việt Nam. Luận án TS Khoa học, viện cộng nghệ sinh học. 14. Đỗ Văn Thu, Nguyễn Anh, Lê Thành Đô, 2003. Đặc điểm sinh học tinh dịch cừu và cộng nghệ bảo tồn. Báo cáo Khoa học Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, Hà Nội 2003. NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội 2003. 15. Lê Thị Xuyến, 1998. Kiểm tra, đánh giá chất lượng tinh dịch lợn qua các môi trường pha chế bảo tồn và bước đầu xác định độ nhiễm khuẩn tinh dịch lợn tại trung tâm giống gia súc Hải Dương. Luân án Th.S Khoa học Nông nghiệp 1998. PAGE  PAGE 48 6.2. TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 16. Abeydeera, LR. In vitro Fertilization and embryo development in the pig. J Reprod Fertil 2001; 58 (supply) : in press. 17. Abeydeera, LR. In vitro production of embryo in swine. Theriogenology 2002; 57: 257 – 273. 18. Aderson, T., 1945. The semen of animal and its use for AI. Tech. Comm. Imperial bureau of animal Breeding Genetics, Edinburgh. 19. Betthauser, J., Forsberg, EJ. et al, Cloning pigs using in vitro systems. Theriogenology 2001; 55: 255 abstr. 20. Funahashi, H., 2003. Polyspermic penetration in porcine IVM – IVF system. Reprod Fertil Develop 15, 167 -177. 21. Hammerstedt, R.H., Graham, J.K,. Nolan, J.P.,1990. Cryopreservation of mammalian sperm: what we ask them to survive. J. Androl. 11, 73- 88. 22. Hidalo M. et al. The effect of cryopreservation on sperm head morphometry in Florida male goat related to sperm freezability, Animal Reproduction Science (2006), doi: 10, 1016/j. anireprosci. 2006.07.003. 23. Kikuchi K., Nagai T., Kashiwazaki N., Ikeda H., Noguchi J., Shimada A., et al. Cryopreservation and ensuring in vitro fertilization ability of boar spermatozoa from epididymides stored at 4oC. Theriogenology 1998., 50: 15- 23. 24. Kim N.H, H. Funahashi, LR. Abeydeera, ST. Moon, RS Prather, BN. Day, 1996. Effect of oviductal fluid on sperm penetration and cortical granul Exocytosis during fertilization of pig oocytes in vitro. J. Reprod Fertil 107, 79- 86. 25. Leibfried – Rutledge M.L., Crister E.S., Eyeston W.H., Northey D.L. and First, 1986. “ Developmental potential of bovine oocyte matured in vitro or in vivo”. Theriogenology, 25, 164. 26. Nagai T., Moor RM. Effect of oviductal cells on the incidence of polyspermy in pig eggs fertilized in vitro. Mol Reprod Dev 1990; 26: 77-82. 27. Nagai T., K. Miura, K. Kikuchi, N. Okamura, 1993. Effect of caffeine on in vitro fertilization of pig follicular occytes. J. Reprod. Develop 39, 347- 352. 28. Nguyen B.X, Y. Heyman., J-P. Renard, 1984. Direct freezing of cattle embryos after partial dehydration at room temperature. Theriogenology, 22, 4, 389- 399. 29. Nguyen B.X, 1997. Long – term conservation of gametes and embryos using the associated treatment of dehydration and freezing. Proceeding of Bestcapsule 2001 conference, Japan, Nov, 1997. H 4 – 11. 30. Peters, RM., Well, KD. Culture of pig embryo. J. Reprod Fertil. Suppl 1993; 48; 61-73. 31. Renard J-P., H de Rochambeau and J.J lauvergne, 1983. Utilization pf gametes and embryos banking for the preservation and study of genetic resource in Farm Animals. Proceeding of VWCAP, Vol 1 PP 66- 72. 32. Takashi Nagai, Hiroaki Funahashi, Koji Yoshika and Kazuhiro Kikuchi 2006. In vitro production of porcine embryos. Frontiers in Bioscience 11, 2565 – 2573. 33. Thibier M., Guerin, B., 2000. Hygienic aspects of storage and use of semen for artificial insemination. Anim. Reprod. Sci. 62 (1-2). 233- 251. 34. Ikeda H., Kikuchi K., Noguchi I. Takeda H., 2000, Effect of preincubation of cryopreserved porcine epididymal sperm. 35. Hanh N.V., Huu Q.X., Linh N.V., Men N.T., Uoc N.T., Kikuchi K., Takashi Nagai, 2007 Conservation of endangered species semens. TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA THÚ Y ---------------- KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU, ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG TINH TRÙNG ĐƯỢC LẤY TỪ MÀO TINH SAU BẢO QUẢN ĐÔNG LẠNH HÀ NỘI - 2010 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA THÚ Y ---------------- KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU, ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG TINH TRÙNG ĐƯỢC LẤY TỪ MÀO TINH SAU BẢO QUẢN ĐÔNG LẠNH Người thực hiện:CHRIM CHHENGLIMLớp:THÚ Y A Khóa:50Ngành:THÚ YNgười hướng dẫn 1:TS. BÙI XUÂN NGUYÊNPHÒNG CÔNG NGHỆ PHÔIVIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAMNgười hướng dẫn 2:PGS.TS. TRẦN TIẾN DŨNGBộ môn: NGOẠI SẢN HÀ NỘI - 2010 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện đề tài “Nghiên cứu, đánh giá chất lượng tinh trùng được lấy từ mào tinh sau bảo quản đông lạnh” tôi đã nhận được sự chỉ đạo tận tình của các thầy cô giáo, sự động viên giúp đỡ của gia đình bạn bè, Vì vậy, khi đề tài này được hoàn thành tôi mong muốn gửi lời cảm ơn tới tất cả mọi người, Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến TS. Nguyễn Thị Ước, TS. Nguyên Văn Hạnh, Em Nguyên Thị Mến cùng tập thể cán bộ phòng Cộng nghệ Phôi, viện Công nghệ sinh học, viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã đóng góp ý kiến và hướng dẫn tận tình, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt đề tài này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn TS. Bùi Xuân Nguyên đã nhiệt tinh hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành sâu sắc tới PGS,TS, Trần Tiến Dũng- giảng viên bộ môn Sản khoa- Khoa Thú Y- Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội; đã dành nhiều thời gian hướng dẫn giúp đỡ tôi trong quá tình thực hiện và hoàn thành đề tài, Cuối cùng, tôi xin cảm các bạn bè đã nhiệt tình giúp đỡ trong suốt quá trình thực hiện đề tài, Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 5 năm 2010 Người thực hiện CHRIM CHHENGLIM MỤC LỤC  hyperlink \l "_toc263336303" Lời cảm ơn  pageref _toc263336303 \h i  hyperlink \l "_toc263336304" Mục lục  pageref _toc263336304 \h ii  hyperlink \l "_toc263336305" Danh mục bảng  pageref _toc263336305 \h v  hyperlink \l "_toc263336306" Danh mục hình  pageref _toc263336306 \h vi  hyperlink \l "_toc263336307" Danh mục biểu đồ  pageref _toc263336307 \h vi  hyperlink \l "_toc263336308" Danh mục các chữ viết tắt  pageref _toc263336308 \h vii  TOC \h \z \t "1,1,2,2,3,3"  HYPERLINK \l "_Toc263336258" Phần I MỞ ĐẦU  PAGEREF _Toc263336258 \h 1  HYPERLINK \l "_Toc263336259" 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ  PAGEREF _Toc263336259 \h 1  HYPERLINK \l "_Toc263336260" 1.2. Mục đích nghiên cứu  PAGEREF _Toc263336260 \h 2  HYPERLINK \l "_Toc263336261" 1.3. Ý nghĩa đề tài  PAGEREF _Toc263336261 \h 2  HYPERLINK \l "_Toc263336262" Phần thứ hai TỔNG QUAN TÀI LIỆU  PAGEREF _Toc263336262 \h 3  HYPERLINK \l "_Toc263336263" 2.1. Các phương pháp bảo quản tinh lợn  PAGEREF _Toc263336263 \h 3  HYPERLINK \l "_Toc263336264" 2.1.1. Tình hình đông lạnh tinh trùng  PAGEREF _Toc263336264 \h 3  HYPERLINK \l "_Toc263336265" 2.1.2. Phương pháp bảo quản lạnh tinh trùng  PAGEREF _Toc263336265 \h 7  HYPERLINK \l "_Toc263336266" 2.2. Tình hình đông lạnh tinh tại Việt Nam  PAGEREF _Toc263336266 \h 11  HYPERLINK \l "_Toc263336267" 2.3. Đặc điểm sinh học tinh dịch lợn  PAGEREF _Toc263336267 \h 12  HYPERLINK \l "_Toc263336268" 2.3.1. Tinh trùng  PAGEREF _Toc263336268 \h 12  HYPERLINK \l "_Toc263336269" 2.3.2. Tinh thanh  PAGEREF _Toc263336269 \h 14  HYPERLINK \l "_Toc263336270" 2.4. Quá trình phát triển của tinh trùng  PAGEREF _Toc263336270 \h 15  HYPERLINK \l "_Toc263336271" 2.4.1. Giai đoạn phát triển  PAGEREF _Toc263336271 \h 15  HYPERLINK \l "_Toc263336272" 2.4.2. Giai đoạn sinh trưởng  PAGEREF _Toc263336272 \h 15  HYPERLINK \l "_Toc263336273" 2.4.3. Giai đoạn thành thục  PAGEREF _Toc263336273 \h 15  HYPERLINK \l "_Toc263336274" 2.4.4. Giai đoạn biến thái  PAGEREF _Toc263336274 \h 15  HYPERLINK \l "_Toc263336275" 2.4.5. Giai đoạn phát dục  PAGEREF _Toc263336275 \h 16  HYPERLINK \l "_Toc263336276" 2.4.6. Giai đoạn biến đổi hóa học  PAGEREF _Toc263336276 \h 16  HYPERLINK \l "_Toc263336277" 2.5. Các chỉ tiêu đánh giá tinh dịch sau khi bảo quản đông lạnh  PAGEREF _Toc263336277 \h 17  HYPERLINK \l "_Toc263336278" 2.5.1. Hoạt lực tinh trùng tiến thẳng (A%)  PAGEREF _Toc263336278 \h 17  HYPERLINK \l "_Toc263336279" 2.5.2. Nồng độ tinh trùng (C: triệu/ml)  PAGEREF _Toc263336279 \h 18  HYPERLINK \l "_Toc263336280" 2.5.3. Tỷ lệ sống (Sg: %)  PAGEREF _Toc263336280 \h 19  HYPERLINK \l "_Toc263336281" 2.5.4. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (K: %)  PAGEREF _Toc263336281 \h 20  HYPERLINK \l "_Toc263336282" 2.6. Thụ tinh ống nghiệm bằng tinh bảo tồn lạnh trong Nitơ lỏng -1960C  PAGEREF _Toc263336282 \h 21  HYPERLINK \l "_Toc263336283" Phần thứ ba VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  PAGEREF _Toc263336283 \h 24  HYPERLINK \l "_Toc263336284" 3.1. Đối tượng nghiên cứu  PAGEREF _Toc263336284 \h 24  HYPERLINK \l "_Toc263336285" 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu  PAGEREF _Toc263336285 \h 24  HYPERLINK \l "_Toc263336286" 3.3. Nội dung nghiên cứu  PAGEREF _Toc263336286 \h 24  HYPERLINK \l "_Toc263336287" 3.4. Phương pháp nghiên cứu  PAGEREF _Toc263336287 \h 24  HYPERLINK \l "_Toc263336288" 3.4.1. Phương pháp thu tinh  PAGEREF _Toc263336288 \h 24  HYPERLINK \l "_Toc263336289" 3.4.2. Phương pháp đánh giá một số chỉ tiêu sinh học tinh dịch lợn thu được  PAGEREF _Toc263336289 \h 25  HYPERLINK \l "_Toc263336290" 3.4.3. Pha loãng và bảo tồn tinh dịch lợn ở nhiệt độ -1960C  PAGEREF _Toc263336290 \h 28  HYPERLINK \l "_Toc263336291" 3.4.4. Phương pháp khảo sát, đánh giá chất lượng tinh dịch lợn sau thời gian bảo tồn  PAGEREF _Toc263336291 \h 28  HYPERLINK \l "_Toc263336292" 3.4.5. TTON bằng tinh lợn bảo tồn ở -1960C  PAGEREF _Toc263336292 \h 28  HYPERLINK \l "_Toc263336293" Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN  PAGEREF _Toc263336293 \h 30  HYPERLINK \l "_Toc263336294" 4.1. Kết quả nghiên cứu một số đặc điểm sinh học tinh xuất và tinh từ mào tinh của lợn Landrace  PAGEREF _Toc263336294 \h 30  HYPERLINK \l "_Toc263336295" 4.2. Kết quả khảo sát, đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng tinh lợn Landrace từ mào tinh bảo quản trong nitơ lỏng -1960c  PAGEREF _Toc263336295 \h 32  HYPERLINK \l "_Toc263336296" 4.3. Kết quả khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng tinh từ mào tinh của lợn Landrace sau khi bảo quản trong nitơ lỏng -1960c  PAGEREF _Toc263336296 \h 36  HYPERLINK \l "_Toc263336297" 4.4. Kết qủa TTON bằng tinh từ mào tinh của lợn Landrace sau bảo quản trong nitơ lỏng -1960c  PAGEREF _Toc263336297 \h 39  HYPERLINK \l "_Toc263336298" 4.5. Một số hình ảnh thu được từ thực nghiệm  PAGEREF _Toc263336298 \h 41  HYPERLINK \l "_Toc263336299" Phần V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ  PAGEREF _Toc263336299 \h 43  HYPERLINK \l "_Toc263336300" 5.1. Kết luận  PAGEREF _Toc263336300 \h 443  HYPERLINK \l "_Toc263336301" 5.2. Đề nghị  PAGEREF _Toc263336301 \h 44  HYPERLINK \l "_Toc263336302" Phần VI TÀI LIỆU THAM KHẢO  PAGEREF _Toc263336302 \h 45 PAGE  DANH MỤC BẢNG  TOC \h \z \t "5,5"  HYPERLINK \l "_Toc263336177" Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu một số đặc điểm sinh học tinh xuất và tinh từ mào tinh của lợn Landrace.  PAGEREF _Toc263336177 \h 30  HYPERLINK \l "_Toc263336178" Bảng 4.2. Kết quả bảo quản lạnh của tinh dịch lợn Landrace từ mào tinh trong Nitơ lỏng -1960C  PAGEREF _Toc263336178 \h 33  HYPERLINK \l "_Toc263336179" Bảng 4.3. Kết quả so sánh các chỉ tiêu A %, Sg %, K % giữa tinh trùng khai thác từ mào tinh của lợn Landrace 1 trước và sau khi bảo quản lạnh  PAGEREF _Toc263336179 \h 37  HYPERLINK \l "_Toc263336180" Bảng 4.4. Kết quả so sánh các chỉ tiêu A %, Sg %, K % giữa tinh trùng khai thác từ mào tinh của lợn Landrace 2 trước và sau khi bảo quản lạnh  PAGEREF _Toc263336180 \h 37  HYPERLINK \l "_Toc263336181" Bảng 4.5. Kết quả so sánh các chỉ tiêu A %, Sg %, K % giữa tinh trùng khai thác từ mào tinh của lợn Landrace 3 trước và sau khi bảo quản lạnh  PAGEREF _Toc263336181 \h 37  HYPERLINK \l "_Toc263336182" Bảng 4.6. Kết quả so sánh các chỉ tiêu A %, Sg %, K % giữa tinh trùng khai thác từ mào tinh của lợn Landrace 4 trước và sau khi bảo quản lạnh  PAGEREF _Toc263336182 \h 38  HYPERLINK \l "_Toc263336183" Bảng 4.7. Kết quả so sánh các chỉ tiêu A %, Sg %, K % giữa tinh trùng khai thác từ mào tinh của lợn Landrace 5 trước và sau khi bảo quản lạnh  PAGEREF _Toc263336183 \h 38  HYPERLINK \l "_Toc263336184" Bảng 4.8. Kết quả TTON bằng tinh từ mào tinh từ mào tinh của lợn Landrace sau bảo quản trong Nitơ lỏng -1960C  PAGEREF _Toc263336184 \h 39  DANH MỤC HÌNH  TOC \h \z \t "6,6"  HYPERLINK \l "_Toc263336187" Hình 4.1. Lợn Landrace  PAGEREF _Toc263336187 \h 41  HYPERLINK \l "_Toc263336188" Hình 4.2. Lợn Bản  PAGEREF _Toc263336188 \h 41  HYPERLINK \l "_Toc263336189" Hình 4.3. Tinh trùng kỳ hình lợn Landrace  PAGEREF _Toc263336189 \h 41  HYPERLINK \l "_Toc263336190" Hình 4.4. Tinh trùng kỳ hình lợn Bản  PAGEREF _Toc263336190 \h 41  HYPERLINK \l "_Toc263336191" Hình 4.5. Tinh trùng lợn Bản  PAGEREF _Toc263336191 \h 42  HYPERLINK \l "_Toc263336192" Hình 4.6. Trứng bị nhiễm  PAGEREF _Toc263336192 \h 42  HYPERLINK \l "_Toc263336193" Hình 4.7. Trứng chưa thành thục  PAGEREF _Toc263336193 \h 42  HYPERLINK \l "_Toc263336194" Hình 4.8. Trứng đã thành thục  PAGEREF _Toc263336194 \h 42  DANH MỤC BIỂU ĐỒ  HYPERLINK \l "_Toc263336185" Biểu đồ 4.1. Kết quả bảo quản tinh dịch lợn Landrace thu từ mào tinh  PAGEREF _Toc263336185 \h 33  HYPERLINK \l "_Toc263336186" Biểu đồ 4.2. Kết quả TTON bằng tinh từ mào tinh từ mào tinh của lợn Landrace sau bảo quản trong Nitơ lỏng -1960C.  PAGEREF _Toc263336186 \h 40 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT V Lượng tinh dịch đã lọc (ml) A Hoạt lực tinh trùng tiến thẳng (%) C Nồng độ tinh trùng (106/ml) K Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (%) Sg Tỷ lệ tinh trùng sống (%) MTPL&BTTD Môi trường pha loãng và bảo tồn tinh dịch PCBT Pha chế bảo tồn CNSH Công nghệ sinh học TTNT hay AI Thụ tinh nhân tạo TTON hay IVF Thụ tinh ống nghiệm vcs và cộng sự