Đề tài Nghiên cứu sản xuất kẹo viên synbiotic

Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic Trang 47 CHƢƠNG 2:NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KẸO VIÊN SYNBIOTIC 2.1. Công nghệ sản xuất kẹo 2.1.1. Thuyết minh quy trình KÑo lμ mét trong nh÷ng s¶n phÈm chÝnh, chiÕm khèi l­îng bËc nhÊt trong c«ng nghiÖp chÕ biÕn ®­êng. Phô thuéc vμo ®Æc tÝnh nh­ tr¹ng th¸i, thμnh phÇn vμ h­¬ng vÞ, kÑo ®­îc chia ra lμm nhiÒu chñng lo¹i nh­ kÑo cøng, kÑo mÒm, kÑo dai ... Do đặc tính dễ bảo quản, tiện ích trong việc sử dụng, cũng nhƣ đa dạng phong phú cho nhiều chủng loại kẹo khác nhau, nªn kÑo ®· ®­îc s¶n xuÊt vμ tiªu dïng réng r·i tõ bao ®êi nay trªn kh¾p thÕ giíi, cho mäi ®èi t­îng. §Ó t¨ng c­êng gi¸ trÞ cña kÑo, cũng nhƣ đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của ngƣời tiêu dùng, mong muốn đƣợc đem lại những sản phẩm không chỉ đảm bảo dinh dƣỡng, ngon miệng mà còn mang kèm những chức năng có lợi cho sức khỏe. Vì vậy, việc nghiên cứu để tạo ra viên kẹo synbiotic mang hƣơng vị sữa chua có bổ sung nhiều chủng khuẩn probiotic và sử dụng đƣờng chức năng FOS hoặc inulin nhằm mang lại nhiều tác động tích cực để cải thiện sức khỏe và tăng cƣờng khả năng phòng chống bệnh tật; đồng thời mong muốn hơn nữa là tạo đƣợc sản phẩm nhƣ món tráng miệng sữa chua nhƣng lại khá tiện lợi có thể sử dụng bất kì lúc nào, bất kì ở đâu. Quy trình sản xuất kẹo đƣợc trình bày nhƣ ở hình 2.1 Thuyết minh quy trình [22] Sữa tƣơi thu hoạch về từ các trang trại ( đƣợc hiệu chỉnh hàm lƣợng béo đạt 3.5%, hàm lƣợng chất khô gồm: protein 3.3%, và lactose 4,5%), đƣợc đun nóng đến 80 oC trong 30 phút, sau đó làm mát về đến nhiệt độ ủ. Các chủng probiotic đƣợc chọn lọc và qua vi gói, sau đó đem ủ ở 200C trong 20h một lƣợng 5% (w/v) probiotic này với sữa tƣơi đã qua xử lí nhiệt. Tiếp theo, trộn phần sữa lên men này với prebiotic inulin ( rau diếp xoăn, hoặc atiso), FOS, có kèm bột sữa gầy (SMP. Chang Fu). Tất cả hỗn hợp đƣợc đƣa qua sấy thăng hoa kèm phối trộn với tá dƣợc (44.5% sorbital và 4.5% xylitol). Sấy thăng hoa là một phƣơng pháp đƣợc lựa chọn cho bảo quản đảm bảo hoạt tính sinh học sản phẩm. Phƣơng pháp sấy này ít co ngót và kết quả sản phẩm có thể dễ dàng hòa tan trong nƣớc trở lại. Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic Trang 48 Cuối cùng, dùng máy nén Manesty F3 Tablet (Liverpool,Vƣơng quốc Anh) để nén hỗn hợp thành dạng kẹo viên. Sấy probiotic phối trộn với prebiotic và nén lại thành dạng viên có thể xem nhƣ là một sản phẩm kẹo mới, dùng nhƣ món tráng miệng. Hình 2.1 Quy trình công nghệ sản xuất kẹo viên synbiotic Tá dƣợc Ép viên Viên kẹo synbiotic Sấy thăng hoa Ủ (200C trong 20h) Trộn lần 2 Prebiotic, bột sữa gầy Sữa tƣơi probiotic Xử lí nhiệt Vi gói Trộn lần 1 Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic Trang 49 Điểm đáng chú ý của đề tài là tạo viên kẹo với sự kết hợp hữu ích của probiotic và prebiotic. Vậy nên các mục tiêu của nghiên cứu này phải khảo sát và giải quyết các vấn đề sau: (1) Kiểm tra sự phát triển của chủng probiotic khi có prebiotic trong môi trƣờng và chọn chủng probiotic phát triển tốt dƣới tác dụng của inulin và OF. (2) Xác định những tác động của việc thêm bột inulin, OF lên các hoạt động acid hóa và khả năng sống của các probiotic (LC-01) trong 28 ngày bảo quản tại 40C. 2.1.2. Vật liệu, phƣơng pháp 2.1.2.1. Phân lập giống probiotic Việc phân lập và tuyển chọn chủng giống sao cho phát huy đƣợc tối đa hoạt tính probitic, chẳng hạn nhƣ việc chọn chủng thƣơng mại Lactobacillus acidophilus LA-5, L.casei LC-01, Bifidobacterium bifidum BB-12, lấy từ Chr. Hansen Pty. Ltd (Australia ). Sau đó chúng đƣợc giữ ở -22oC cho đến khi bổ sung vào sữa tƣơi tiến hành quy trình làm kẹo [38]. Đồng thời chủng phải có sức chịu đựng tốt với điều kiện sấy bất lợi, theo nghiên cứu của Marıa Claudia Otero chọn chủng Lactobacillus gasseri CRL1421, Lactobacillus delbrueckii sp.bugaricus CRL1461 (LB) đã đƣợc chọn. [27] Chủng probiotic đặc biệt là Bifidobacteria phát triển chậm trong môi trƣờng sữa do chúng thiếu hoạt động thủy giải protein, vì vậy đòi hỏi kết hợp với các nhân tố tăng trƣởng cần thiết nhƣ là amino acid, peptid để tăng sự phát triển của chúng (Klaver và cs, 1993). Việc đồng nuôi cấy với chủng vi khuẩn phân giải tốt protein Lactobacillus delbrueckii sp.bugaricus CRL1461 (LB) cũng nhằm cải thiện sự tăng trƣởng và khả năng sống của probiotic và giúp giảm thời gian lên men ( Dave và Shah, 1998). Các chủng LAB đƣợc phân lập và tuyển chọn từ hạt kefir tại Hsinchu ở phía Bắc Đài Loan (Lin và cs. 1999) gồm Lactobacillus kefiri, Lactobacillus kefiranofaciens , Lactococcus lactis (Chen et al 2008.) 2.1.2.2. Chuẩn bị prebiotic: Bột inulin rau diếp xoăn thƣơng mại (Raftiline GR với chiều dài chuỗi trung bình là 10) và chuỗi ngắn inulin hoặc oligofructose (OF) (Raftilose P95 với chiều dài chuỗi trung bình là 4) đã đƣợc cung cấp bởi Mandurah Australia Pty. Ltd (Dandenong, Vic., Australia).[38] Inulin Atisô Jerusalem (JAI): Các JAI đƣợc chiết xuất từ củ JA theo Paseephol và cs (2007) có nồng độ lớn hơn 12o B. Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic Trang 50 Các đặc điểm lý-hóa của JAI đƣợc so sánh với hai loại bột inulin rau diếp xoăn thƣơng mại thể hiện trong Bảng 2.1 Bảng 2.1 Tính chất hóa lí của các prebiotic nghiên cứu 2.1.2.3. Xác định hoạt lực của các loại prebiotic : Khả năng thúc đẩy sự tăng trƣởng của các prebiotic đƣợc đánh giá trên chủng probiotic lựa chọn (LA-5, LC-01, BB-12); so sánh hiệu quả của inulin , FOS thƣơng mại và inulin từ atiso với nhau , tất cả đƣợc thêm vào probiotic ở mức 4%. Mẫu kiểm tra không chứa prebiotic. Sử dụng môi trƣờng MRS cho LC-01, BB-12 và LA-5 theo Paseepholvà cs. (2008). Để duy trì điều kiện phát triển ổn định trong tất cả các thí nghiệm, thực hiện khử trùng môi trƣờng. Bốn gam mỗi loại bột inulin đƣợc hòa tan trong 20 ml nƣớc cất và thêm 80 ml môi trƣờng tăng trƣởng để đạt đƣợc nồng độ inulin cuối cùng 4% (w / v). Môi trƣờng không bổ sung prebiotic (100 ml môi trƣờng tăng sinh) đƣợc sử dụng để kiểm tra đối chứng. Một ml probiotic đã đƣợc chuyển vô trùng vào mỗi môi trƣờng ủ ở 370C trong 16 h trong điều kiện hiếu khí cho LA-5, kỵ khí cho BB-12 và LC-01. Độ đục của môi trƣờng phát triển đã đƣợc kiểm tra tại cuối thời kỳ ủ bằng cách đo mật độ quang học (OD). Các chai đƣợc vortex trong 20 s, và môi trƣờng đồng nhất đƣợc chuyển vào cuvette cho đọc độ hấp thu ở 600 nm (Kneifel.,2000). 2.1.2.4. Quá trình bảo quản lạnh Hiệu quả của prebiotic nâng cao khả năng sống của probiotic trong thời gian bảo quản lạnh hơn 28 ngày ở (40C). Ba mẫu thí nghiệm gọi tên là JAY, INY và OFY đƣợc chuẩn bị bằng cách bổ sung 12% SM (skim milk) cùng 4% của mỗi loại inulin atiso, inulin rau diếp xoăn (Raftiline GR) và oligofructose (Raftilose P95), tƣơng Tính chất Raftilose P95a RaftilineGRa JAI Cấu trúc GFn + Fn GFn GFn + Fn Chiều dài mạch 4 12 9 Độ ẩm (%) 95 95 95 Inulin/FOS 95 92 75 Đƣờng 5 8 15 pH 5-7 5-7 5-7 [38] Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic Trang 51 ứng. Mẫu đối chứng NFCY (control non fat yoghurt) cũng đƣợc chuẩn bị: 16% tổng chất khô đều là SM. 2.1.2.5. Phân tích sản phẩm:  Xác định độ axit titratable (TA) Titratable axit (nhƣ % axit lactic) đƣợc xác định theo phƣơng pháp chuẩn độ AOAC 947.05 sử dụng NaOH 0.1 M (AOAC, 2000).  Xác định độ pH Độ pH của sữa chua đã đƣợc đo bằng pH kế (mô hình 520A, Orion Research Inc, Boston, MA, USA). Tất cả các phân tích đƣợc thực hiện tại 200C.  Định lƣợng probiotic Số các đơn vị hình thành (CFU) trên đĩa có chứa 25-250 khuẩn lạc đƣợc tính toán cho mỗi gram mẫu và khả năng sống của probiotic trong các mẫu khác nhau đƣợc tính nhƣ sau (Bruno và cộng sự, 2002.): % Khả năng sống = (CFU/g sau 28 ngày bảo quản) / (CFU/g ban đầu) x 100  Khảo sát tính chất vật lý: Độ cứng của kẹo đã đƣợc đo trên máy kiểm tra độ cứng Pharma Test PTB311 (Hamburg, Đức). Tính dễ vỡ vụn đo bằng máy đo Roche (Hoffman La Roche, Basel, Thụy Sĩ). Sau khi tạo viên cân khối lƣợng, 20 viên kẹo đã đƣợc quay trong 20 phút và sau đó tiến hành cân lại để kiểm tra phần trăm trọng lƣợng bị mất do vỡ và mài mòn. Kiểm tra độ hòa tan, đo lƣờng tốc độ hòa tan của kẹo, đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp mô tả bởi Rawlins (1977), tốc độ quay là 60 vòng / phút và nhiệt độ là 37 oC.[22] 2.1.3. Thảo luận: hiệu quả sử dụng prebiotic Hai thí nghiệm riêng biệt đƣợc thực hiện để đánh giá chức năng của prebiotic và để xác định ứng dụng có thể của nó trong các sản phẩm sữa.[38] 2.1.3.1. Hiệu lực prebiotic Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic Trang 52 Hình 2.2 Hiệu quả sử dụng của prebiotic lên probitic [38] Phân tích Hình. 2.2 cho thấy khả năng sử dụng các loại bột inulin khác nhau bởi ba chủng probiotic, đo giá trị các mẫu ở OD 600 nm. Nhìn chung, chủng LC-01 có thể sử dụng prebiotic tốt nhất, tiếp theo là BB-12. Đối với sự tăng trƣởng của LA-5 là thấp với tất cả các loại prebiotic, điều này thể hiện qua giá trị OD đo đƣợc của mẫu bổ sung P95 nuôi với LA-5 ở 600 nm là 0.8 là thấp hơn rất nhiều so với 2.2 của LC-01 và 1.6 của BB-12. Sự tăng trƣởng của LC-01 là cao nhất trong môi trƣờng có chứa oligofructose (Raftilose P95), và JAI kích thích sự tăng trƣởng của LC-01 tƣơng tự nhƣ inulin (Raftiline GR). Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic Trang 53 Theo Voragen (1998), sự khác nhau trong cấu trúc hóa học của prebiotic (phân nhánh hoặc không ), mức độ trùng hợp (DP), thành phần của các monomer và mức độ hòa tan vào nƣớc ảnh hƣởng đến việc sử dụng chúng bởi vi sinh vật. Trong nghiên cứu, Raftilose P95 là prebiotic sử dụng tốt nhất cho cả ba chủng probiotic vì độ dài chuỗi ngắn, độ hòa tan trong nƣớc cao. Trong khi sự tăng trƣởng các chủng probiotic trong inulin là thấp hơn. Những phát hiện này phù hợp với nghiên cứu của Roberfroid và cs. (1998) : chuỗi ngắn inulin (DP <10) là chất lên men tốt nhất, đƣợc lên men nhanh hơn so với chuỗi inulin dài. Kết quả so sánh mẫu probiotic nuôi trên môi trƣờng kiểm chứng không bổ sung prebiotic, cho thấy nếu không bổ sung prebiotic, hiệu quả tăng trƣởng các chủng probiotic là kém hơn hẳn, mật độ tế bào đo đƣợc trong mẫu CTRL là kém hơn nửa mật độ mẫu P95 cho chủng BB-12 và chỉ bằng một phần năm mật độ mẫu P95 cho chủng LC-01 Hình 2.2 Từ các kết quả tổng hợp đƣợc: prebiotic đƣợc sử dụng hiệu quả nhất trên chủng LC-01, và prebiotic đƣợc chọn là OF P95. 2.1.3.2. Đánh giá sản phẩm kẹo trong quá trình lưu trữ lạnh Trong nghiên cứu này, nghiên cứu những ảnh hƣởng của việc bổ sung bột inulin (JAI và inulin rau diếp xoăn ), FOS về sự sống và hoạt động acid hóa của probiotic trong quá trình lên men và bảo quản lạnh ở 40C.  Thay đổi độ pH và TA [38] Hình. 2.3 cho thấy biến đổi độ pH và độ axit của các mẫu thử nghiệm và mẫu kiểm chứng trong quá trình lƣu trữ lạnh đến ngày 28. Không có sự khác biệt (P > 0,05) đáng kể trong các giá trị pH và TA trong việc bổ sung và không bổ sung prebiotic ( môi trƣờng NFCY) trong suốt thời gian lƣu trữ. Một kết quả tƣơng tự cũng đƣợc báo cáo của bởi Guven và cộng sự. (2005) và Zhu (2004). Vào ngày 1, việc sản xuất acid trong mẫu bổ sung JAI (JAY, pH 4.2, TA 1,02%) thì cao hơn, nhƣng không đáng kể so với mẫu bổ sung oligofructose (OFY, pH 4.4, TA 0,86%) , với mẫu inulin rau diếp xoăn (INY, pH 4.5, TA 0,79%), và giá trị acid JAI là tƣơng đồng với mẫu kiểm chứng. Tất cả mẫu có chứa chất prebiotic có độ pH và độ chua ổn định theo thời gian, thực nghiệm đƣợc hiển thị trên hình 2.3 cho thấy độ giảm chỉ tối đa là 0,2 đơn vị pH và tăng 0,28% giá trị TA ở ngày cuối lƣu trữ. Vào ngày 28, độ pH trung bình từ 4,3 (đối với INY) đến 4.1 (cho OFY và JAY), tính axit của tất cả các mẫu thay đổi từ 1,05% (đối với INY) đến 1,20% (đối với NFCY). Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic Trang 54 Hình 2.3 Biểu diễn sự thay đổi pH (đường gạch đứt), và TA (đường liền) cho bốn mẫu trong suốt quá trình lên men và bảo quản ở 40C.[38] ( Tam giác): INF, ( dấu chéo): OFY, (hình thoi): JAY, (hình vuông): NFCY Các giá trị pH và độ acid thể hiện trên hình cho thấy có một sự tƣơng đƣơng tính chất môi trƣờng cho mẫu có và không bổ sung prebiotic, nhƣ vậy việc bổ sung prebiotic là không tạo ảnh hƣởng tiêu cực ( môi trƣờng quá acid ) ức chế probiotic. Hình 2.3 [38]  Thay đổi số lƣợng probiotic Sự thay đổi số lƣợng LC-01 và LB trong mẫu có và không có bổ sung prebiotic trong quá trình lên men và trong thời gian lƣu trữ 28 ngày đƣợc trình bày trong Bảng 2.2 Nhìn chung, khả năng sống của LB và LC-01 là gần tƣơng tự nhau, nhƣng LC- 01 cho tỉ lệ sống tốt hơn. So sánh, kiểm tra, việc bổ sung của inulin không ảnh hƣởng đến sự sống của LB, nhƣng cải thiện đáng kể khả năng tồn tại của LC-01. Thứ tự tính hiệu quả của prebiotic tác dụng hỗ trợ probiotic: xét ở giai đoạn cuối vào ngày 28, chủng LC-01 đƣợc cải thiện khả năng sống tốt nhất trong inulin rau diếp xoăn (Raftiline GR, gần 7.4 log CFU/g) tiếp theo là oligofructose (Raftilose P95, 7.3 log CFU / g) và đến JAI (7.1 log CFU /g). Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic Trang 55 Trong khoảng thời gian 28 ngày lƣu trữ, các prebiotic cho thấy hỗ trợ tốt nhất hoạt động tăng trƣởng của LC-01 vào giai đoạn 7 ngày đầu, nhƣng sau đó tốc độ động tăng trƣởng giảm dần. Đến ngày 21 thì lƣợng tế bào giảm xuống con số hơn 7 log CFU/g, việc suy giảm này có thể đƣợc giải thích vì các sản phẩm trao đổi chất, acid hữu cơ sinh ra, ức chế sự phát triển của probiotic. Tuy nhiên, so với trong môi trƣờng NFCA lƣợng tế bào ở ngày 28 chỉ khoảng hơn 6 log CFU/g thì rõ ràng bổ sung prebiotic cải thiện tích cực lƣợng probiotic trong bảo quản. Nhƣ vậy, việc bổ sung bột inulin là hữu ích trong việc cải thiện sự tăng trƣởng của LC-01 trong thời gian lên men và sự sống của chúng trong thời gian lƣu trữ (P  0,05). Các kết quả này phù hợp với những báo cáo của Aryana và McGrew (2007): có sự gia tăng số lƣợng L. casei với việc bổ sung bột inulin. Bên cạnh những kết quả có đƣợc từ thí nghiệm, cũng đã có những kết luận tƣơng tự về việc sử dụng bột inulin bởi các probiotic đã đƣợc báo cáo trƣớc đó của al Akalin và cộng sự. (2004), Bruno và cộng sự. (2002), Shin cs. (2000) và Varga cs . (2003) tìm thấy rằng : có một cải tiến đáng kể trong việc lƣu giữ khả năng tồn tại của bifidobacteria trong sữa chua có chứa prebiotic (inulin / OF) trong thời gian lƣu trữ. Tƣơng tự nhƣ vậy, Aryana cs (2007), Capela cs. (2006), Desai cs. (2004) và Donkor cs. (2007)., quan sát rằng inulin rau diếp xoăn là nguồn carbon ƣa thích cho các chủng Lactobacillus, do đó giúp tăng trƣởng và duy trì khả năng tồn tại trong thời gian lƣu trữ. Cơ chế mà inulin cải thiện khả năng tồn tại của các sinh vật probiotic trong kho lạnh vẫn còn chƣa rõ ràng. Hai cơ chế có thể đề xuất cho đến nay là : inulin cung cấp chất dinh dƣỡng bổ sung để thúc đẩy môi trƣờng tăng trƣởng (Makras et al, 2005.) và chúng bảo vệ các tế bào probiotic khỏi bị tổn thƣơng bởi acid (Desai et al, 2004.). Khả năng sống của probiotic phụ thuộc vào nhiều yếu tố, chẳng hạn nhƣ : loại chủng probiotic đƣợc sử dụng, môi trƣờng, nhiệt độ thời gian trong bảo quản, ảnh hƣởng của các sản phẩm phụ sinh ra SCFA, hydro, peroxide( (Medina và Jordano, 1994 ; Shah, 2000). Trong bài sẽ khảo sát sự ảnh hƣởng của việc vi gói và chế độ sấy thăng hoa lên khả năng sống của probiotic. Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic Trang 56 Bảng 2.2. Khả năng sống của LC-01, LB (log CFU/g) trong môi trƣờng có và không có bổ sung prebiotic trong bảo quản ở 4oC 2.2. Ảnh hƣởng chế độ vi gói 2.2.1. Cơ sở khoa học vi gói Phƣơng pháp phun phủ cho vi gói probiotic gồm ba công nghệ chủ yếu khác nhau về kiểu tầng sôi không khí đƣợc sử dụng và vị trí trong thiết bị - nơi vật liệu bao phủ cùng không khí nén đƣợc phun vào (hình2.4). Các vi khuẩn probiotic vi gói có mặt trong các hạt bột mịn, đƣợc giữ trong chuyển động bên trong thiết bị và đƣợc chuẩn bị cho các quá trình tiếp theo (lên men, cô đặc, sấy thăng hoa). Trong thực phẩm ứng dụng lớp phủ chủ yếu là lipid (ví dụ nhƣ sáp, axit béo và các loại dầu đặc biệt), nhƣng các protein (ví dụ nhƣ gluten và casein) hoặc carbohydrate (dẫn xuất của cellulose, carrageenan và alginate) cũng có thể đƣợc sử dụng. Hình biểu diễn minh họa 2.4 [10] Môi trƣờng thời gian NFCY JAY OFY INY LC- 01 0 5.26 5.31 5.28 5.44 1 8.01 8.26 8.34 8.21 2 7.98 8.2 8.34 8.28 7 7.86 8.21 8.2 8.20 14 7.52 8.1 8.15 8.14 21 7.11 7.42 7.54 7.89 28 6.06 7.1 7.3 7.37 LB 0 5.29 5.36 5.27 5.44 1 8.18 8.13 8.15 8.16 2 8.16 8.13 8.13 8.16 7 7.67 7.71 7.72 7.84 14 7.00 7.03 7.02 7.02 21 6.33 6.49 6.36 6.64 28 6.2 6.2 6.23 6.39 [38] Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic Trang 57 Hình 2.4 Phương pháp vi gói phun phủ [10] Kĩ thuật tạo hạt gel cho vi gói (ME) probiotic, có ba kỹ thuật đƣợc sử dụng cho ME của probiotic trong gel alginate (nhƣ ở hình 2.5). Trong quá trình phun đẩy tạo hạt vi gói ( hình 2.5 bên trái), kích thƣớc của các hạt có thể đƣợc điều chỉnh bằng cách sử dụng vòi rung hoặc hiệu ứng piezzo. Với quá trình nhũ tƣơng ( hình 2.5 ở giữa và bên phải), tốc độ rung chuyển tùy vào máy trộn cho phép điều chỉnh kích thƣớc hạt. Các quá trình nhũ tƣơng đƣợc thực hiện bằng cách cho dịch tế bào alginate hoặc carrageenan vào pha dầu. việc tạo hạt gel sau đó xảy ra thông qua việc bổ sung dung dịch CaCl2 hoặc một dung dịch acid. Đồng vi gói , có thể đƣợc thực hiện bằng cách thêm các thành phần hoạt tính sinh học thứ hai (các dung dịch polymer hóa hoặc các dung dịch bao phủ) vào dung dịch alginate. [10] Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic Trang 58 Hình 2.5 Kĩ thuật tạo hạt gel vi gói[10] Các kỹ thuật phổ biến nhất đƣợc sử dụng trong vi gói probiotic là nhũ tƣơng, dùng lực đẩy và sấy phun. Kích thƣớc của các hạt vi gói thu đƣợc là rất quan trọng bởi vì nó ảnh hƣởng đến tính chất cảm quan của thực phẩm. Hạt alginate đƣợc tạo bởi kỹ thuật nhũ tƣơng có kích thƣớc từ 20 m đến 2 mm, và bằng kỹ thuật phun đẩy từ 2-4 mm. Với công nghệ phun đẩy mới , có thể tạo đƣợc kích thƣớc hạt 150 m. Kĩ thuật phun đẩy cho hình dạng hạt đồng nhất hơn kỹ thuật nhũ tƣơng. Sấy phun sản xuất đƣợc hạt vi gói kích thƣớc từ 5 - 80 m. Đối với việc vi gói, vi khuẩn probiotic đƣợc tăng trƣởng trong điều kiện môi trƣờng tối ƣu, sau đó đƣợc ly tâm và đƣợc sử dụng dƣới hình thức dịch hoặc bột sấy thăng hoa . Việc sử dụng bột đông khô, có thể là một giải pháp thiết thực hơn trong ngành công nghiệp thực phẩm vì sự ổn định của sản phẩm sấy đông khô trong quá trình vận chuyển cũng nhƣ lƣu trữ. [36] 2.2.2. Vật liệu, phƣơng pháp vi gói Trong bài nghiên cứu theo phƣơng pháp vi gói của Thomas Heidebach [37] 2.2.2.1. Chuẩn bị nguyên liệu Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic Trang 59 Transglutaminase từ vi sinh vật (TGase) thu đƣợc từ Công ty Ajinomoto, Inc (Hamburg, Đức), với hoạt tính 1000 U/g. Protease N ―Amano" lấy từ Công ty Enzym Amano (Nagoya, Nhật Bản) với hoạt tính lớn hơn 150000 U/g. Tinh bột (RS) đƣợc mua từ Sigma-Aldrich (Steinheim, Đức). Dầu hoa tinh khiết đƣợc lấy từ một cửa hàng địa phƣơng. 2.2.2.2. Chuẩn bị hỗn hợp tế bào - protein Tất cả các dụng cụ thủy tinh sử dụng đƣợc tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút. Dịch chiết protein đã đƣợc chuẩn bị bằng cách phân tán trong caseinate natri nồng độ 15% (w / w). Sau 2 h khuấy đảo, độ pH của dịch casein đƣợc điều chỉnh đến 7.0 với NaOH 5N, hòa tan, khuấy đảo qua đêm ở 4oC trƣớc khi sử dụng tiếp. Hai gam Lactobacillus, Bifidobacterium đƣợc làm tan đá và trộn với 28g casein, để tạo ra một hỗn hợp protein- tế bào với khoảng 1010 - 2 x 1010 (CFU g-1) probiotic. Thêm 1% (w / w) RS vào hỗn hợp protein - tế bào trƣớc khi tiến hành quá trình đóng gói. 2.2.2.3. Quá trình vi gói : Quá trình vi gói đƣợc thực hiện theo một phƣơng pháp mô tả trƣớc đây dựa trên các kỹ thuật nhũ tƣơng nƣớc trong dầu (Heidebach và cộng sự, 2009a.). TGase đƣợc thêm vào hỗn hợp protein-tế bào ở 400C, tiếp tục bổ sung 150 g dầu hoa (40oC) trong một bình Erlen 200 ml và khuấy tốc độ không đổi 900 vòng / phút bằng máy khuấy từ trong 120 phút. Trong quá trình nhũ tƣơng hóa sự phân tán giọt hỗn hợp protein - tế bào đƣợc chuyển đổi thành các hạt gel nhờ enzym. Hình 2.6 Phần mặt cắt ngang của gel casein cảm ứng bởi Tgase sau quá trình vi gói Lactobacillus và Bifidobacterium[37] Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic Trang 60 Trong hình là đại diện hình ảnh mặt cắt ngang của gel casein sau quá trình vi gói ở độ phóng đại 10000. Các tế bào Lactobacillus (đánh dấu bằng mũi tên) có thể đƣợc tìm thấy phân bố ngẫu nhiên trong mạng gel protein. Sau đó, các tế bào vi gói qua keo hóa sẽ đƣợc tách khỏi dầu nhờ ly tâm nhẹ (500v, 1 phút). Phần dịch đƣợc tách bỏ và phần tủa sau ly tâm đƣợc tái pha loãng hai lần, lắc trong 5 phút và sau đó tách ra một lần nữa. Nƣớc và dầu còn sót lại, đƣợc tách bỏ. Các tế bào vi gói đƣợc bảo quản ở 40C, sau đó quá trình sấy thăng hoa đƣợc thực hiện trong vòng 1 ngày. Quá trình sấy thăng hoa đã đƣợc thực hiện theo mô tả của Higl và cs. (2007). Một gam dịch tế bào vi gói hoặc không vi gói (hỗn hợp tế bào-protein, xem phần 2.2.2.2) đã đƣợc chuyển vào lọ thủy tinh có đƣờng kính trong 25 mm và sấy bằng máy sấy thăng hoa (Alpha LSC 1-4, Đức). Các mẫu ban đầu đƣợc đông lạnh tại - 20 0 C trong máy sấy thăng hoa ở áp suất khí quyển. Sau 1 h quá trình sấy đã đƣợc bắt đầu bằng cách giảm áp suất buồng đến 0,370 mbar và tăng nhiệt độ đến +100C, sau đó quá trình sấy đƣợc thực hiện theo các điều kiện này trong 3 h. Các mẫu sấy khô có chứa khoảng 1.5x1010 - 4,5x 1010 CFU g-1. Nƣớc còn sót lại trong tất cả các mẫu sau khi sấy là từ 3% và 4%. 2.2.2.4. Lưu trữ các mẫu sấy Sau khi sấy thăng hoa mẫu đƣợc lƣu trữ trong môi trƣờng muối hòa tan của LiCl hoặc MgCl2 tại độ ẩm tƣơng đối (RH) là 11% và 33% (Castro và cộng sự, 1995.), bảo quản ở 4 và 250C. 2.2.2.5. Xác định khả năng sống sau khi sấy thăng hoa Để phân tích số lƣợng tế bào sống: đã vi gói hoặc dạng tự do sau khi sấy, mỗi lọai đƣợc hydrat hóa trở lại với nƣớc cất hai lần ở nhiệt độ phòng trong vòng 30 phút trƣớc khi phân tích. Khả năng sống (tỉ lệ sống) sau khi sấy thăng hoa đƣợc xác định là mối quan hệ giữa CFU g-1 trƣớc khi sấy (NBF) và các CFUg -1 của mẫu hydrat hóa lại sau khi sấy (NAF) xem công thức : khả năng sống (%) = NAF/ NBF x100% (1) Sự sống của các tế bào vi gói probiotic hoặc hỗn hợp protein-tế bào không vi gói sau thời gian bảo quản khác nhau đƣợc tính toán bởi công thức : khả năng sống (%) = Nt/ NAF x 100% (2) Trong đó: Nt là CFU g -1 probiotic vi gói (hoặc không) đƣợc hòa tan trở lại vào nƣớc tại các thời điểm t lƣu trữ khác nhau. 2.2.2.6. Phân tích thống kê Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic Trang 61 Các thí nghiệm cho dữ liệu có ý nghĩa với ít nhất hai thí nghiệm độc lập có độ lệch chuẩn (SD). Mức ý nghĩa thống kê đƣợc thiết lập tại p <0,05. Trong các thí nghiệm lƣu trữ với ít nhất hai thí nghiệm độc lập của từng điều kiện lƣu trữ, phân tích hồi quy đƣợc thực hiện để kiểm tra sự tƣơng quan giữa số lƣợng vi khuẩn và thời gian lƣu trữ. Với hệ số xác định R2  0.8 trong mọi trƣờng hợp, thống kê có ý nghĩa cho sự tƣơng quan tại p <0,01. 2.2.3. Thảo luận: tác động của vi gói 2.2.3.1. Sự sống của các tế bào probiotic vi gói Ảnh hƣởng của việc vi gói lên sự sống của Bifidobacterium và Lactobacillus sau sấy thăng hoa đƣợc thể hiện trong hình. 2.7 Hình. 2.7 Khả năng sống tế bào Bifidobacterium và Lactobacillus vi gói (cột màu xám đen tối), vi gói với RS (cột màu xám nhạt) và tế bào tự do (cột trắng) khi sấy thăng hoa[37]. Đối với Bifidobacterium không có sự khác biệt trong tỷ lệ sống giữa các mẫu không vi gói, mẫu vi gói có và không có RS. Với Lactobacillus, tỷ lệ sống của các tế bào vi gói không bổ sung RS cao hơn đáng kể so tế bào tự do. Loài vi khuẩn khác nhau thể hiện khả năng sống khác nhau trong cùng điều kiện sấy nhƣ nhau, đó là do các yếu tố nội tại khác nhau trong tế bào. Biểu đồ cũng cho thấy, khả năng sống của Lactobacillus so với Bifidobacterium là kém hơn. 2.2.3.2. Nghiên cứu vỏ vi gói Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic Trang 62 Trong một nghiên cứu của al Kearney và cộng sự. (1990), cũng có kết luận Lactobacillus plantarum vi gói với alginate cải thiện khả năng sống cao hơn so với các tế bào tự do trong điều kiện sấy thăng hoa tƣơng tự. Tốc độ hydrat hóa trở lại và thể tích chất lỏng sau khi sấy thƣờng ảnh hƣởng đến sự hồi phục tế bào probiotic lactobacilli (Meng và cộng sự, 2008.). Trong nghiên cứu của Kearney và cộng sự. (1990), một gel caseinate liên kết ngang đƣợc sử dụng làm chất vi gói , giúp bảo vệ các tế bào chống lại tác dụng thẩm thấu, nhờ đó có thể giải thích sự sống cao hơn cho Lactobacillus vi gói trong nghiên cứu này. Việc sử dụng vỏ protein để vi gói probiotic là một khái niệm khá mới. Reid và các cộng sự. (2005) đã sản xuất vỏ bọc protein sữa bằng cách cho hỗn hợp whey protein trộn với Lactobacillus rhamnosus , nhỏ giọt vào dung dịch Ca2+. Theo nghiên cƣú Higl cs, 2008;. Santivarangkna và cộng sự, 2008;. Zayed và Roos, 2004 cho biết hoạt động của nƣớc thấp làm lƣợng nƣớc còn lại trong mẫu sau khi sấy là thấp dẫn đến tỷ lệ sống của probiotic sau sấy cũng thấp theo. Trong trƣờng hợp vi gói vỏ protein, khả năng sống tế bào vi gói sau sấy không có sự khác biệt quan trọng so với các tế bào tự do, nhƣng lƣợng nƣớc còn sót lại trong tế bào sau sấy cao hơn đáng kể so với các tế bào tự do, nhƣ vậy sẽ cải thiện đáng kể khả năng sống của Lactobacillus rhamnosus. Bảng 2.3 Hoạt độ nƣớc của các mẫu thí nghiệm Lactobacillus, Bifidobacterium Trong phần nghiên cứu này, đã dùng tinh bột bắp để bổ sung vào nguyên liệu vi gói, sau đó khảo sát hoạt độ nƣớc giữa các mẫu chỉ vi gói, vi gói với bột bắp và Mẫu hoạt độ nƣớc Vi gói Lactobacillus không bổ sung RS 0.109 Vi gói Lactobacillus với RS 0.118 Tế bào Lactobacillus tự do 0.096 Vi gói Bifidobacterium không bổ sung RS 0.097 Vi gói Bifidobacterium có RS 0.115 Tế bào Bifidobacterium tự do 0.092 [37] Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic Trang 63 không vi gói với nhau, ta có kết quả nhƣ bảng 2.3 . Từ bảng thấy rằng dùng vật liệu vi gói có bổ sung RS cho hoạt độ nƣớc của Bifidobacterium và Lactobacillus đều cao hơn các mẫu còn lại, và từ những kết luận của Higl cs, 2008;. Santivarangkna và cộng sự, 2008, có thể nói vi gói có bổ sung RS cho tỉ lệ sống của probiotic cao hơn. 2.3. Khảo sát tối ƣu môi trƣờng sấy thăng hoa Các chủng Lactobacillus đƣợc tiến hành sấy thăng hoa trong ba môi trƣờng khác nhau và trong nƣớc (môi trƣờng kiểm chứng), gồm : (i)% 6 (w / v) sữa tách béo , (ii) 6% (w / v) sữa tách béo với 6% (w / v) lactose và (iii)% 6 (w / v) sữa tách béo với 6% (w / v) sucrose.[35] Hình 2.8 Lượng tế bào sống Lactobacillus trên các môi trường khảo sát trong sấy thăng hoa[27]. Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic Trang 64 ( Cột trắng): trƣớc sấy, (cột sọc): sau sấy. Việc cải thiện khả năng sống trong mỗi môi trƣờng đối với mỗi chủng là khác nhau tùy vào chủng giống . Khảo sát thấy rằng khả năng tồn tại của L. gasseri CRL1421 trong quá trình sấy thăng hoa có bổ sung sữa và đƣờng so với L. delbrueckii subsp. delbrueckii CRL1461 là hiệu quả hơn rất nhiều (p <0,001) nhƣ thể hiện trong Hình 2.8, nhƣng sức chịu đựng với điều kiện môi trƣờng còn tùy thuộc nội tại bản thân chủng giống, điều này cũng góp phần dẫn đến sự sống L. delbrueckii sp. delbrueckii CRL1461 kém hơn L. gasseri CRL1421 sau khi sấy. Hơn nữa, việc sử dụng sữa tách béo, sữa tách béo kết hợp với đƣờng lactose hoặc sucrose tăng đáng kể khả năng sống của cả hai chủng sau quá trình sấy thăng hoa hơn rất nhiều so với sấy trong nƣớc (Hình 2.8 ). Điều này thể hiện rất rõ khi quan sát chủng L. delbrueckii sp. delbrueckii CRL1461: lƣợng tế bào trong mẫu sau sấy với sữa tách béo- sucrose là hơn 8 log CFU/ml, còn trong môi trƣờng sấy với nƣớc lƣợng tế bào sống sụt giảm đáng kể còn lại khá thấp chỉ 2 log CFU/ml. Nhƣ vậy, việc bổ sung sữa và đƣờng đã cải thiện đáng kể khả năng sống của Lactobacillus. Môi trƣờng tối ƣu đối với mỗi chủng cũng có khác nhau; với L. gasseri CRL1421: môi trƣờng sữa tách béo- lactose là hiệu quả hơn hai môi trƣờng còn lại; với L. delbrueckii sp. delbrueckii CRL1461 môi trƣờng tối ƣu đƣợc sử dụng là sữa tách béo – sucrose. 2.4. Khảo sát, tối ƣu quả trình bảo quản Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ bảo quản và độ ẩm tƣơng đối lên sự sống của probiotic. Từ hình 2.9 - 2.12 cho thấy sự sụt giảm các tế bào probiotic trong mẫu bảo quản khác nhau ở 40C và 250C ở hai độ ẩm tƣơng đối 11% và 33% cho Bifidobacterium và Lactobacillus. [37] Với mong muốn là các vi sinh vật có thể đƣợc lƣu trữ tại nhiệt độ cao hơn để tiết kiệm đƣợc chi phí cho việc làm mát trƣớc khi sử dụng. Tuy nhiên, qua thí nghiệm thấy bảo quản probiotic ở 250C là không hiệu quả bằng ở 40C. Vì nhiệt độ cao hơn làm thúc đẩy các phản ứng hóa học có hại, chẳng hạn nhƣ quá trình oxy hóa acid béo (Castro và cộng sự, 1995.). Do đó, để đạt đƣợc tỷ lệ sống cao, bảo quản lạnh vẫn là tốt hơn cho việc kéo dài thời gian lƣu trữ, giữ hoạt tính probiotic. Ngoài nhiệt độ bảo quản, độ ẩm bảo quản cũng đóng vai trò quan trọng đảm bảo khả năng sống của vi khuẩn probiotic. Lƣợng nƣớc dƣ trong mẫu tƣơng quan với các giá trị aw của mẫu. Hơn nữa, giá trị aw của mẫu cân bằng với độ ẩm tƣơng đối môi Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic Trang 65 trƣờng xung quanh trong thời gian lƣu trữ. Do đó, lƣu trữ tại RH quá cao dẫn đến tăng lƣợng nƣớc trong mẫu và gây bất lợi. Theo Castro et al., 1995 độ ẩm trong phạm vi 7- 11% là tối ƣu . Ở độ ẩm cao hơn, mức độ oxy hóa tăng lên nhanh (Castro và cộng sự, 1995; Higl và cs, 2007;.. Teixeira và cs, 1995). Hình 2.9 Khả năng sống của Bifidobacterium có và không có vi gói, bảo quản ở 4 o C và 25 o C, độ ẩm 11%[37] Hình 2.10 Khả năng sống của Bifidobacterium tự do và vi gói, bảo quản ở 4oC và 25 oC, độ ẩm 33% [37] Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic Trang 66 Từ các kết quả khảo sát ( đƣợc thể hiện trên hình ) cho thấy, nếu dùng chế độ vi gói sẽ cải thiện đáng kể khả năng sống của Bifidobacterium, so với tế bào không vi gói thì khả năng sống của Bifidobacterium cao hơn khỏang 10 lần sau hơn 90 ngày bảo quản ở 4oC và độ ẩm 11%. Kết quả cũng tƣơng tự cho bảo quản ở 25 oC nhƣng do ảnh hƣởng của nhiệt độ cao làm gia tăng các phản ứng hóa học có hại nên thời gian bảo quản Bifidobacterium chỉ trong thời gian ngắn khoảng 60 ngày. Trong chế độ bảo quản ở 33% hàm ẩm, khả năng sống của Bifidobacterium có suy giảm chút ít (ở cả 4oC và 25 oC) , và thời gian bảo quản bị rút ngắn đi chỉ còn khoảng 30 ngày nếu bảo quản ở 25 oC (giảm đi một nửa so với bảo quản ở 25 oC, 11% ẩm). Từ các kết quả cho thấy, việc bảo quản hiệu quả nhất ở 4oC, độ ẩm 11% và có vi gói Bifidobacterium: cho kết quả khả năng sống của Bifidobacterium khoảng 10% và lƣu trữ đƣợc trong hơn 90 ngày. Hình 2.11 Khả năng sống của Lactobacillus tự do và vi gói, bảo quản ở 4oC và 25 oC, độ ẩm 11% [37] Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic Trang 67 Hình 2.12 Khả năng sống của Lactobacillus tự do và vi gói, bảo quản ở 4oC và 25 oC, độ ẩm 33% [37] Quan sát tƣơng tự ta cũng nhận thấy Lactobacillus thích hợp bảo quản ở chế độ 4 oC và độ ẩm 11% nâng cao đƣợc khả năng sống hơn 1% và kéo dài thời gian bảo quản hơn 90 ngày. Chế độ vi gói là không có ảnh hƣởng lên Lactobacillus. Ngoài ra, so sánh giữa Lactobacillus và Bifidobacterium khả năng tồn tại của Lactobacillus là kém. Điều này do bản thân sức chịu đựng của giống, cũng đã đƣợc thảo luận nhiều trong những phần trên. 2.5. Đánh giá cảm quan viên kẹo  Thành phần hóa học, tính chất vật lí, lƣợng tế bào sống và giá trị cảm quan của viên kẹo synbiotic[22]. Thành phần hóa học và tính chất của kẹo viên synbiotic đƣợc đƣa ra trong Bảng 2.4. Giá trị protein trong các sản phẩm bánh kẹo trên thị trƣờng là từ 0% (nhiều nhất bao gồm kẹo đậu, kẹo bơ cứng,) đến 5% (kẹo sữa có phủ chocolate). So với giá trị dinh dƣỡng protein cho các sản phẩm bánh kẹo thƣơng mại, kẹo kefir chứa 12,38% protein sữa, cao hơn hầu hết các các loại bánh kẹo. Một chỉ tiêu khá quan trọng cần xem xét là đảm bảo đủ số lƣợng tế bào sống để mang đến những tác động có lợi cho ngƣời tiêu dùng, theo quy định của Hiệp hội sữa Thế giới: sản phẩm sữa lên men phải đảm bảo chứa > 107 (CFU/g) để mang lại lợi ích cho sức khỏe . Lƣợng tế bào sống trong sản phẩm đạt 7.37 log CFU/g sau 28 ngày lƣu trữ trong môi trƣờng có bổ sung Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic Trang 68 inulin ( rau diếp xoăn) và bột sữa gầy (bảng 2.2) , điều này cho thấy tính hữu ích của sản phẩm. Tính chất vật lý của kẹo cũng đƣợc liệt kê trong Bảng 2.4. Trọng lƣợng trung bình của sản phẩm là 0,7 g với độ dày 5,7 mm. Độ cứng và mức độ vỡ vụn của kẹo lần lƣợt là 51,60 N và 0,96%,. Bertocchia và cộng sự (2005) chỉ ra rằng các lực nén ép trong quá trình ép tạo viên ảnh hƣởng lớn tới độ cứng, thời gian tan rã và kích thƣớc trung bình của viên kẹo. Tốc độ hòa tan kẹo chủ yếu liên quan đến các tính chất bề mặt của viên kẹo. Ngoài ra, khả năng vỡ vụn cao hơn làm tăng việc giải phóng, hòa tan kẹo. Viên kẹo đƣợc tạo ra cần 14,46 phút để hòa tan hoàn toàn trong nƣớc và theo Wolff và cộng sự . 2003 ., độ cứng tiêu chuẩn cho kẹo yêu cầu cần trung bình 12 phút để hòa tan hoàn toàn trong nƣớc. Bảng 2.4 Tính chất lí hóa và lƣợng tế bào sống của kẹo 2.6. Bảo quản kẹo synbiotic bằng bacteriocin: Nhƣ ở đầu đề tài có đề cập đến chủng vi khuẩn đƣờng ruột gây hại nhƣ H. pylori , Salmonellae, Listeria, E.coli , có thể dẫn đến tử vong ở ngƣời. Cũng nhƣ có nhiều nhóm vi sinh vật gây hƣ hỏng, xâm nhiễm quá trình lên men. Một điều có thể Thành phần hóa học Độ ẩm (%) 1,45 Protein (%) 12,38 chất béo (%) <0,10 Tính chất vật lý Trọng lƣợng (g) 0,70 Độ dày (mm) 5,70 khả năng vỡ vụn(%) 0,96 Độ cứng (N) 51,60 độ hòa tan(min) 14,46 khả năng sống vi khuẩn lactic (log cfu / g) 7.37 [22] [] Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic Trang 69 thấy là probiotic hoàn toàn có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn gây hại xâm nhập đƣờng ruột. Sở dĩ các vi khuẩn này có khả năng kháng khuẩn tốt là do trong quá trình trao đổi chất đã tạo ra các sản phẩm có tính kháng khuẩn nhƣ axit hữu cơ (axit lactic và axit acetic), hydroperoxide, ethanol, diacetyl, acetaldehyde, CO2, reuterin, reutericyclin và bacteriocin... Các sản phẩm trao đổi chất này chính là "vũ khí" kháng khuẩn của probiotic. Có hai cơ chế giúp probiotic phát huy khả năng kháng khuẩn:  Khả năng kháng khuẩn của các axit hữu cơ Các axit hữu cơ đƣợc sinh ra bởi vi khuẩn lactic chủ yếu là axit lactic và axit acetic, các axit này góp phần giảm pH tiêu diệt các vi khuẩn có hại ví dụ nhƣ vi khuẩn E.coli, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus... Do nội bào vi khuẩn có pH = 7 nên khi có sự chênh lệch pH so với môi trƣờng axit bên ngoài, H+ từ môi trƣờng sẽ đi vào bên trong tế bào vi khuẩn làm pH nội bào giảm. Vi khuẩn phải sử dụng cơ chế bơm ATPase để đẩy H+ ra khỏi tế bào làm cho vi khuẩn bị mất năng lƣợng. Mặt khác pH giảm thì cũng ức chế quá trình đƣờng phân (glycolysis), tế bào vi khuẩn cạn kiệt năng lƣợng dẫn đến bị tiêu diệt. Ngoài ra, các anion của axit còn gây rối loạn sự thẩm thấu của màng tế bào. Những nguyên nhân này làm cho vi khuẩn bị chết. Hình 2.13 Vi khuẩn gây bệnh bị ức chế hoạt động ở pH thấp (<3.5) [41]  Khả năng kháng khuẩn của Bacteriocin Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất protein là những phân tử peptide đƣợc riboxom tổng hợp từ các chuỗi peptit hoặc protein ở cả vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dƣơng. Bacteriocin có tác dụng kháng khuẩn đối với các vi khuẩn gây Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic Trang 70 thối rữa và các mầm bệnh trong thực phẩm phổ biến là vi khuẩn Listeria monocytogenes và Staphylococcus aureus. Bacteriocin đƣợc chia thành 4 nhóm: Nhóm I là nhóm lantibiotic, là polypeptit có trọng lƣợng phân tử < 5KDa. Nhóm II gồm các bacteriocin không phải là lantibiotic, có khối lƣợng 30KDa, nhóm IV là các bacteriocin phức tạp, ngoài thành phần chính là protein chúng còn chứa lipid và cacbonhydrat. Cơ chế tác động bacteriocin rất đa dạng: tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, làm giảm thế năng của màng nguyên sinh chất. Nhiều loại bacterioxin còn có khả năng phân giải ADN, ARN và tấn công vào peptidoglycan tạo ra các lỗ thủng không thể khắc phục đƣợc làm suy yếu thành tế bào. Theo những nghiên cứu: hai chủng khuẩn lactic chính chiếm ƣu thế trong hệ vi khuẩn đƣờng ruột, bao gồm 56 loài Lactobacillus và nhiều loài Bifidobacterium. Hầu hết các loài này đƣợc dùng để sản xuất bacteriocin trong ống nghiệm (Avonts và De Vuyst năm 2001; Carr cs. 2002; Cross 2002). Gần đây, một số chủng cũng đã đƣợc chứng minh sản xuất bacteriocin trong cơ thể (Bảng 2.5). Một nghiên cứu đã chứng minh hoạt động trong cơ thể của chủng Lactobacillus salivarius UCC118 có thể sản xuất bacteriocin phổ kháng sinh rộng mạnh (Abp118) hoạt động chống lại tác nhân gây bệnh truyền qua thực phẩm Listeria monocytogenes (Claesson cs. 2006) [32]. Bảng 2.5 Bacteriocin đƣợc sản xuất bởi vi khuẩn probiotic Bacteriocin Chủng sản xuất Chủng bị ức chế Nghiên cứu ABP-118 Lactobacillus salivarius UCC118 Listeria monocytogenes Corr et al. (2007) Bovamine™ Lactobacillus acidophilus E. coli O157:H7 Brashears et al. (2003a) Lacticin B L. acidophilus V. anguillarum Taoka et al. (2006) UNa L. casei L26 E. coli O111, L. monocytogenes UN L. johnsonii La1 H. pylori Cruchet et al. (2003) UN L. acidophilus LB H. pylori, H. felis Coconnier et al. (1998) Enterocin Enterococcus faecium J96 Salmonella pullorum Audisio et al. (2000) [ 32] Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic Trang 71 Một chủng Lactobacillus casei L26 LAFTI biểu hiển khả năng ức chế đáng kể chủng enterohemorrhagic của E. coli và chủng L. monocytogenes ở chuột (Su cs.2007), nhờ chúng có thể sản xuất bacteriocin UNa (Pidcock cs. 2002). Chủng lactobacilli sinh ra bacteriocin ức chế Helicobacter pylori - tác nhân gây bệnh dạ dày nghiêm trọng (Kandulski và cộng sự năm 2008). Hoạt động kháng H.pylori đã đƣợc xác định trong chủng probiotic Lactobacillus johnsonii LA1 (Gotteland và cộng sự năm 2008;. Michetti và cs.1999) và Lactobacillus acidophilus (Coconnier cs. 1998). Trong cả hai trƣờng hợp, hoạt động ức chế đƣợc diễn ra khi H. pylori liên kết với các tế bào biểu mô ruột. L. acidophilus LB còn đƣợc chứng minh bảo vệ chuột không bị nhiễm Helicobacter felis (Coconnier và cs., 1998; Nedrud và Blanchard 2001), điều này ức chế sự xâm nhiễm dạ dày và và do đó giảm chứng viêm dạ dày (Coconnier et al. 1998). Bacteriocin đƣợc sản sinh bởi vi khuẩn lactic là tác nhân sinh học an toàn trong bảo quản thực phẩm thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học, có hoạt tính kìm hãm đặc hiệu hay ức chế mạnh mẽ sự sinh trƣởng và phát triển của một số vi khuẩn gây hại trong thực phẩm [1]. Trong phạm vi nghiên cứu của bài có phân lập chọn giống Lactococcus lactis vào sản xuất kẹo, với mục đích biết đƣợc khả năng kháng khuẩn cũng nhƣ vai trò bảo quản của Lactococcus lactic, tiến hành khảo sát phổ kháng khuẩn trong dịch bacteriocin của chủng Lc.lactis đối với một số chủng vi khuẩn chỉ thị. Từ bảng 2.6 cho thấy dịch bacteriocin từ chủng Lc.lactis có phổ kháng khuẩn khá rộng, có hoạt tính ức chế vi khuẩn Gram dƣơng và ức chế một số vi khuẩn Gram âm gây bệnh nhƣ Sal. typhimurium và E.coli [1]. Bảng 2.6 Khả năng kháng khuẩn của chủng Lactococcus lactis Chủng vi khuẩn chỉ thị Đƣờng kính vòng kháng khuẩn Chủng vi khuẩn chỉ thị Đƣờng kính vòng kháng khuẩn Bacillus subtilis 16 Salmonella typhimurium 11 Bacillus cereus 12 Escherichia coli 10 Bacillus licheniformis 1 15 Streptococcus sp 12 Bacillus licheniformis 2 12 Lactobacillus acidophilus 0 Bacillus 13 Lactobacillus bulgaricus 14 Staphylococcus aureus 11 Lactobacillus plantarum 15 [1] Chƣơng 2: Nghiên cứu sản xuất kẹo synbiotic Trang 72 Salmonella typhimurium Lactobacillus plantarum Hình 2.14 Khả năng kháng khuẩn của dịch bacteriocin của chủng Lc.lactis đối với một số chủng chỉ thị [1] Chƣơng 3: Kết luận và kiến nghị Trang 73 CHƢƠNG 3: KẾT LUẬN VÀ HƢỚNG PHÁT TRIỂN Kết luận: Muốn có đƣợc những lợi ích cho sức khỏe mà probiotic mang lại trƣớc tiên phải duy trì đƣợc sự tồn tại của chúng trong cơ thể, hơn nữa là phải tăng sự phát triển lợi thế và tăng số lƣợng của chúng hơn những chủng vi sinh vật có hại. Nhƣ vậy, tối ƣu lƣợng probiotic trong thực phẩm, cũng nhƣ duy trì đƣợc khả năng sống và hoạt tính của chúng khi đƣa vào cơ thể là một việc quan trọng. Từ những nghiên cứu trong bài để duy trì đƣợc lƣợng probiotic tối đa trong sản phẩm, cần những vấn đề sau: - Quan trọng đầu tiên, bổ sung prebiotic nhằm bảo vệ probiotic đảm bảo sự tồn tại và cung cấp dinh dƣỡng thúc đẩy sự tăng trƣởng. FOS P95 là prebiotic hiệu quả hơn hẳn trong việc tăng trƣởng của probiotic đặc biệt là chủng L.casei LC-01, và inulin thƣơng mại( rau diếp xoăn): INY (GR) tạo đƣợc môi trƣờng acid không tăng cao, thuận lợi cho sự phát triển cho Lactobacillus và Bifidobacterium . - Probiotic cần đƣợc vi gói để đƣợc bảo vệ qua điều kiện sấy, quá trình bảo quản cũng nhƣ trong điều kiện acid thấp của hệ tiêu hóa ngƣời. Vi gói có bổ sung RS sẽ cải thiện khả năng sống cho Lactobacillus đáng kể hơn nhiều so với tế bào tự do, việc vi gói là cải thiện không cao cho Bifidobacterium. - Bổ sung thêm SM và đƣờng (sucrose hoặc lactose) vào quá trình sấy thăng hoa, sẽ cải thiện đƣợc khả năng sống cho L. gasseri CRL1421, L. delbrueckii subsp. delbrueckii CRL1461 - Thực hiện bảo quản sản phẩm kẹo ở chế độ lạnh 4oC và giữ ẩm 11%, nhờ vậy cải thiện thời gian sống của Bifidobacterium và Lactobacilus lên hơn 90 ngày. Sản phẩm kẹo viên là đáp ứng đƣợc chỉ tiêu yêu cầu probiotic của Hiệp Hội sữa Thế giới: đạt lƣợng tế bào 7.37 log CFU/g sản phẩm sau 28 ngày lƣu trữ. Hiện nay, với sự phát triển của khoa học, công nghệ, y họccũng làm phát sinh ra những dòng khuẩn biến thể khá nguy hại, nhƣ gần đây nhất (2011) xuất hiện khuẩn E. coli O104 miễn nhiễm đƣợc hầu hết với các loại kháng sinh chính ( nhƣ đã đề cập đầu bài) gây nguy hiểm cho con ngƣời. Trong khi y học vẫn chƣa khống chế đƣợc những tình huống mới, bất ngờ nhƣ trên, thì rõ ràng việc nâng cao sức đề kháng con ngƣời nhờ vào ngay chính những nguồn thực phẩm hằng ngày là một việc hoàn toàn cần thiết, đặc biệt là tăng cƣờng miễn dịch hệ tiêu hóa bằng bổ sung probiotic. Chƣơng 3: Kết luận và kiến nghị Trang 74 Hƣớng phát triển Trong quá trình thực hiện Đồ án, sinh viên thấy còn nhiều vấn đề còn chƣa khai thác hết, và đây sẽ là hƣớng nghiên cứu phát triển tiếp theo, với mong muốn hoàn thiện hơn những kiến thức về các chủng khuẩn probiotic để có thể phát huy tối đa lợi ích từ chúng, cũng nhƣ tối ƣu sử dụng prebiotic: - Reuterin là một chất chuyển hóa trung gian trong quá trình lên men yếm khí glycerol của lactobacilli. Là một chất kháng khuẩn rộng, chống lại nhiều vi khuẩn hại. Đây là hƣớng sinh viên cần làm rõ hơn, cũng nhƣ vấn đề khảo sát chủng lactis sinh bacteriocin cao bổ sung vào sản phẩm probiotic. Với hƣớng này có thể phát huy hơn nữa lợi ích của probiotic, cũng nhƣ sẽ hoàn thiện tính chức năng của sản phẩm và sẽ mang lại đƣợc hiệu quả cao hơn cho ngƣời sử dụng. - Trong bài sinh viên chỉ mới phối hợp probiotic với prebiotic, cần khảo sát thêm việc vi gói probiotic bằng prebiotic và sấy có dùng prebiotic. Tài liệu tham khảo Trang 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO: Tài liệu Tiếng Việt 1 Nguyễn Thúy Hƣơng, Trần Thị Tƣởng An. Thu nhận bacteriocin bằng phƣơng pháp lên men bởi tế bào Lactococcus lactis cố định trên chất mang BC và ứng dụng trong bảo quản thịt tƣơi sơ chế tối thiểu. Science & Technology Development, Vol 11, No.09 – 2008. 2 Dƣơng Thanh Liêm (2009), Thực phẩm chức năng và sức khỏe bền vững, NXB ĐH Nông Lâm, Tp. Hồ Chí Minh. 3 Nguyễn Đức Lƣợng . Công nghệ enzyme. Nxb Đại học Quốc gia Tp. HCM 4 Nguyễn Đình Thị Nhƣ Nguyện (2009), Nghiên cứu quá trình tinh sạch Fructooligosaccharide bằng phƣơng pháp lọc nano, Luận văn cao học công nghệ thực phẩm, Đại học Bách Khoa TP. Hồ Chí Minh 5 Hồ Nhân. Reuterin-giải pháp mới thay thế kháng sinh an toàn và hiệu quả 6 Lƣơng Đình Quát (2007), Nghiên cứu các phƣơng pháp xử lý sinh khối vi khuẩn lam S.platensis để sản xuất một số loại nƣớc uống giàu dinh dƣỡng, Luận văn thạc sĩ, ĐH Bách Khoa Tp. Hồ Chí Minh. 7 Trịnh Thị Kim Vân và cộng sự (2004), Nghiên cứu sản xuất đƣờng fructooligosaccharide bằng công nghệ đa enzyme và ứng dụng trong sản xuất thức ăn trẻ em và bánh kẹo chức năng, Báo cáo tổng kết Khoa học và kỹ thuật, Bộ Khoa học và công nghệ - Viện công nghiệp thực phẩm. Tài liệu Tiếng Anh 8 Cherbur C . Inulin and oligofructose in the dietary fiber concept. Brit J Nutr 87:159– 162 9 Chien, C.S., Lee, W.C, Lin, T.J. Immobilization of Aspergillus japonicus by entrapping cells in gluten for production of fructooligosaccharides, Enzyme and Microbial Technology 29, 252 – 257. 10 Claude P Champagne and Patrick Fustier. Microencapsulation for the improved delivery of bioactive compounds into foods. Current Opinion in Biotechnology 2007, 18:184–190 11 Dina Rodrigues a, Teresa A.P. Rocha-Santos. The potential effect of FOS and inulin upon probiotic bacterium performance in curdled milk matrices. Food Science and Technology 12 FAO technical meeting on prebiotic, 2007. Food quality and Standard service 13 Gross D. "Non- reducing oligosaccharides", Methods in Carbohydrate chemistry. Whistler R.L and Wolman M.L. Academic press, New York, Vol. 1. Tài liệu tham khảo Trang 80 14 Gibson G.R., Willis C.L. and Loo J.V. "Non-digestible oligosaccharides and Bifidobacteria- implications for health", Int. Sugar J., 96 pp. 381-387. 15 Gibson GR, Roberfroid MB (1995) Dietary Modulation of the Colonic Microbiota: Introducing the Concept of Prebiotics. J Nutr 125:1401–1412 16 Gibson GR, Probert HM, Van Loo JAE, Roberfroid MB (2004) Dietary Modulation of the human colonic microbiota: Updating the concept of prebiotics. Nutr Res Rev 17:257–259 17 Glenn R Gibson, Christine M William, Functional foods 18 G.R.Gibson, R.A. Rastall . Prebiotic Development and Application 19 G.T. Macfarlane, H. Steed and S. Macfarlane. Bacterial metabolism and health-related effects of galacto-oligosaccharides and other prebiotics. Journal of Applied Microbiology 2008; 104: 305–344 20 Gerald W.T. probiotic and prebiotic: where are we going 21 Kieran M. Tuohy, Hollie M. Probert, Chris W. Smejkal and Glann R. Gibson. Using probiotics and prebiotics to improve gut health. DDT Vol. 8 22 K.N. CHEN1, C.Y. KUO2, J.S. SHIU3 and M.J. CHEN. Process optimization for a novel kefir candy with high probiotic viability. Journal of Food Process Engineering (2010) 23 John H Cummings, George T Macfarlane, and Hans N Englyst. Prebiotic digestion and fermentation. Am J Clin Nutr 2001; 73: 415 – 420.(d) 24 Juffrie M (2002) Fructooligosaccharides and diarrhea. Biosci Microflora 21:31–34 25 Jurgen Schrezenmeir and Michael de Vrese. Probiotics, prebiotics, and synbiotics— approaching a definition. Am J Clin Nutr 2001;73:361–364. 26 Jong won Yun. Fructooligosaccharides- occurrrence preparation and application. Enzyme and microbial Technology 19: 107- 117 27 Marıa Claudia Otero, Maria Carolina Espeche. Optimization of the freeze-drying media and survival throughout storage of freeze-dried Lactobacillus gasseri and Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii for veterinarian probiotic applications. Process Biochemistry 42 (2007) 1406–1411 28 Michael de Vrese,. J. Schrezenmeir. Probiotics, Prebiotics, and Synbiotics. Adv Biochem Engin/Biotechnol (2008) 111: 1–66 29 Marcel Roberfroid. Prebiotics: The Concept Revisited. The Journal of Nutrition 2007; 137: 830 – 837. 30 Nyman M (2002) Fermentation and bulking capacity of indigestible carbohydrates: the case of Inulin and oligofructose. Brit J Nutr 87:163–168 31 Nopchinda S, Varavithya W, Phuapradit P, Sangchai R, Suthutvoravut U,. Effect of bifidobacterium Bb12 with or without Streptococcus thermophilus supplemented formula on nutritional status. J Med Assoc Thai 85:1225–1231 Tài liệu tham khảo Trang 81 32 O. Gillor & A. Etzion & M. A. Riley. The dual role of bacteriocins as anti- and probiotics. Appl Microbiol Biotechnol (2008) 81:591–606 33 43 [f] Playne MJ, Crittenden R (1996) Commercially available oligosaccharides. IDF Bulletin 313:10–22 34 Robert A. Rastall . Prebiotic and Probiotic science and technology, tập 1 35 Solange I. Mussatto ,Ismael M. Mancilha. Non-digestible oligosaccharides: A review. Carbohydrate Polymers 68 (2007) 587–597 36 Susanna Rokka, Pirjo. R. Protecting probiotic bacteria by microencapsulation: challenges for industrial application. Eur food Res Tech (2010) 37 Thomas Heidebach, Petra Forst, Ulrich Kulozik. Influence of casein-based microencapsulation on freeze-drying and storage of probiotic cells . Journal of Food Engineering 98 (2010) 309–316 38 Tatdao Paseephol, Frank Sherkat. Probiotic stability of yoghurts containing Jerusalem artichoke inulins during refrigerated storage. Journal of functional ( 2 0 0 9 ) 311 –318 Trang web tham khảo: 39 ứng-dụng-trong-sấy-thăng-hoa 40 41 ebook.edu.net.vn/resources/iportal/ebook/.../Chuong%2013.pdf 42 Ecoli.html 43