Đề tài Nghiên cứu sản xuất protease từ chủng nấm mốc Aspergillus. oryzae ứng dụng trong sản xuất nước mắm

tất cả các chất xúc tác hữu cơ và vô cơ khác. Enzyme không những có thể xúc tác cho phản ứng trong cơ thể sống mà sau khi tách khỏi hệ thống sống, ở những điều kiện nhất định chúng vẫn giữ được hoạt tính xúc tác.Các chất tham gia trong phản ứng do enzyme xúc tác gọi là cơ chất của enzyme, ký hiệu là S.E có tính đặt hiệu cao nghĩa là một emzyme chỉ tác dụng trên một hoặc một số cơ chất nhất định. Từ thập kỉ trước enzyme đã được sử dụng trong công nghiệp chế biến nhưng mới chỉ có tính chất kinh nghiệm thuần tuý. Công nghệ enzyme ra đời là một bước bước phát triển ứng dụng của enzyme. Ngày nay việc nghiên cứu enzyme đã bước vào một giai đoạn mới, một giai đoạn của sự tích hợp của nhiều ngành khác nhau như hoá học protein, sinh học phân tử….Do đó, có được những hiểu biết đầy đủ hơn về tính chất hóc học, cấu trúc, động học….Tạo điều kiện để sản xuất enzyme ở qui mô lớn, giảm giá thành sản sản phẩm, hiệu quả ứng dụng ngày càng cao. Sử dụng enzyme trong sản xuất sẽ nâng cao chất lượng, hạ giá thành sản phẩm, cải thiện lao động, giảm ô nhiễm môi trường. Cùng với sự phát triển của khoa học cũng như enzyme học, việc ứng dụng enzyme ngày càng mở rộng, phát triển ở tầm cao hơn, không chỉ trong lĩnh vực truyền thống mà còn cả trong những vực mới tạo ra sản phẩm mới. 1.1. Tình hình nghiên cứu Trước thế kỉ XVII việc sử dụng enzyme có tính chất kinh nghiệm thuần tuý người xưa đã biết dùng vi sinh vật như là nguồn enzyme trong các quá trình lên men như sản xuất bánh mì, sản xuất giấm, rượu vang…. Thế kỉ XVII đến nửa đầu thế kỉ XVIII đã đề ra được khái niệm lên men Vanhemom người Hà Lan lần đầu tiên quan sát được hiện tượng tạo thành chất khí khác không khí trong quá trình lên men. Năm 1659, Silvius lần đầu tiên nêu lên rằng, về cơ bản, tất cả các quá trình sống đều là những quá trình hóc học. Nửa cuối thế kỉ XVIII đã có thí nghiệm đầu tiên về enzyme chẳng hạn như công trình nghiên cứu khả năng tiêu hoá thịt trong dạ dày. Công trình này do Reaumur (người Pháp) bắt đầu và sau đó được Sapallanzani (người Ý) mở rộng. Các tác giả đã cho thịt vào ống kim loại và đưa vào trong nhiều động vật khác nhau và thấy rằng thịt bị tiêu hoá. Năm 1836, Schwann đã gọi chất tiêu hoá thịt này là pepsin (pepxin). Từ năm 1800 người ta còn thấy rằng trong ruột còn có một enzyme phân giải protein khác. Sau đó Kuhne đặt tên enzyme đó là trypsin. Nửa đầu thế kỉ XIX người ta đá tách được một số chế phẩm từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau có tách dụng thuỷ phân các chất tương ứng và bắt đầu tách được các chất tạo nên quá trình lên men. Nửa cuối thế kỷ XIX đã tinh sạch được một số enzyme và nghiên cứu một số tính chất cơ bản của enzyme. Nửa đầu thế kỉ XX đã phát hiện được CoE (Harden và Young, 1906) xác định ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của enzyme (Sorensen, 1909) nghiên cứu động học phản ứng enzyme (Bayliss, 1919) kết tinh được enzyme và xác định được bản chất hoá học của enzyme là protein….Đã áp dụng thành công các phương pháp hiện đại để nghiên cứu enzyme hoàn thiện phương pháp xác định cấu trúc bậc 1 phân tử enzyme. 1.2. Cấu tạo hoá học Các enzyme là những protein được cấu tạo từ 20L – amino acid (Các amino acid kết hợp với nhau qua liên kết peptid (-CO-NH-) được tạo thành do phản ứng kết hợp giữa nhóm α - carboxyl của amino acid đứng trước, với nhóm amoha-amin của amino acid tiếp theo, loại đi một phân tử nước. Theo cách kết hợp này các liên kết peptid nằm trên một mạch thẳng không phân nhánh, có hai đầu tận cùng gọi là “đầu N” (có nhóm α - amin tự do và amino acid thứ nhất), kí hiệu bằng dấu “+”và “đầu C” (có nhóm α - carboxyl tự do của amino acid cuối cùng, kí hiệu bằng dấu “-“. Đánh dấu thứ tự các gốc amino acid trong phân tử bắt đầu từ “đầu N” Trong một số trường hợp đầu N và đầu C có thể kết hợp với nhau, phân tử có cấu trúc vòng. Giống như các protein khác, các enzyme có thể là protein đơn giản, gọi là enzyme một thành phần hoặc protein phức tạp, gọi là protein hai thành phần hay holoenzyme. Phân tử holoenzyme bao gồm 2 thành phần: phần protein gọi là apoenzyme, phần không phải prorein gọi là coenzyme. Coenzyme có vai trò quan trọng để thực hiện chức năng xúc tác, loại bỏ coenzyme sẽ làm mất khả năng xúc tác. Trong một số trường hợp, chỉ riêng coenzyme cũng là chất xúc tác nhưng không hiệu quả bằng khi kết hợp với apoenzyme. Cùng một coenzyme khi kết hợp với apoenzyme khác nhau tạo thành các holoenzyme khác nhau, xúc tác cho các phản ứng chuyển hoá khác nhau nhưng giống nhau về kiểu phản ứng. Coenzyme còn có vai trò làm bền enzyme. Apoenzyme có vai trò quan trọng với tính đặc hiệu của enzyme và tăng hiệu quả xúc tác của coenzyme.Coenzyme thường là các chất dẫn xuất của các vitamin hoà tan trong nước. Vì vậy khi thiếu một vitamin nào đó sẽ ảnh hưởng đến hoạt độ của enzyme tương ứng trong tế bào, vi phạm quá trình trao đổi chất trong cơ thể, gây nên các bệnh đặt trưng. 1.2.1. Phân loại Dựa vào tính đặc hiệu phản ứng của enzyme, năm 1961 tiểu ban enzyme học quốc tế đã trình bày một báo cáo, trong đó có đề nghị những nguyên tắc định tên và phân loại enzyme. Người ta chia enzyme ra làm 6 lớp. 1. Oxydoreductase: các enzyme xúc tác cho các phản ứng oxi hoá-khử. 2. Transferase: các enzyme xúc tác cho các phản ứng chuyển vị. 3. Hydrolase: các enzyme xúc tác cho các phản ứng thủy phân. 4. Lyase: các enzyme xúc tác cho các phản ưng phân cắt không cần nước. 5. Isomerase: các enzyme xúc tác cho các phản ứng đồng phân hoá. 6. Ligase (synthetase): các enzyme xúc tác cho các phản ứng tổng hợp có sử dụng liên kết giàu năng lượng của ATP… Mỗi lớp chia thành nhiều tổ (dưới lớp), mỗi tổ chia thành nhiều nhóm (siêu lớp). Tên enzyme thường được gọi: Tên cơ chất đặc hiệu - loại phản ứng xúc tác cộng thêm tiếp vĩ ngữ ase. 1.3. Tính chất Enzym có bản chất là protein nên có tất cả thuộc tính lý hóa của protein. Đa số enzym có dạng hình cầu và không đi qua màng bán thấm do có kích thước lớn. Tan trong nước và các dung môi hữu cơ phân cực khác, không tan trong ete và các dung môi không phân cực. Không bền dưới tác dụng của nhiệt độ, nhiệt độ cao thì enzym bị biến tính. Môi trường axít hay bazơ cũng làm enzym mất khả năng hoạt động. Enzym có tính lưỡng tính: tùy pH của môi trường mà tồn tại ở các dạng: cation, anion hay trung hòa điện. Enzym chia làm hai nhóm: enzym một cấu tử (chỉ chứa protein) như pepsin, amylase... và các enzym hai cấu tử (trong phân tử còn có nhóm không phải protein) 1.4. Cơ chế tác dụng ([5]) Trong phản ứng có sự xúc tác của enzyme, nhờ sự tạo thành phức hợp trung gian enzyme cơ chất mà cơ chất được hoạt hóa, biến đổi tạo thành sản phẩm. Nhiều dẫn liệu thực nghiệm đã cho thấy quá trình tạo thành phức hợp enzyme cơ chất và sự biến đổi phức hợp này thành sản phẩm, giải phóng enzyme tự do thường trải qua ba giai đoạn theo sơ đồ sau. E + S → ES → P + E Hình 1.1. Cơ chế tác dụngcủa enzyme Trong đó: E là Enzyme, S là cơ chất (Substrate), ES là phức hợp enzyme - cơ chất, P là sản phẩm (Product) Giai đoạn thứ nhất: enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức hợp enzyme - cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi hỏi năng lượng hoạt hóa thấp. Giai đoạn thứ hai: xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị trong phân tử cơ chất. Giai đoạn thứ ba: tạo thành sản phẩm, còn enzyme được giải phóng trở lại trạng thái tự do ban đầu để quay vòng xúc tác. Hình 1.2. Một ví dụ minh họa sự tạo thành phức hợp enzyme-cơ chất 1.5. Các yếu tố ảnh hưởng tốc độ đến phản ứng ([5]) Phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: nồng độ enzyme, đặc tính và nồng độ của cơ chất, nhiệt độ, pH môi trường phản ứng, các ion kim loại, các chất vô cơ và hữu cơ khác (có tác dụng kiềm hãm hay hoạt hoá enzyme). Các yếu tố hoá lý không chỉ ảnh hưởng đến phản ứng enzyme theo kiểu như đối với các phản ứng hoá học bình thường mà còn ảnh hưởng đến cấu trúc không gian, độ bền của cấu trúc không gian, độ tích điện của phân tử enzym, làm thay đổi hoạt độ xúc tác của nó. 1.5.1. Ảnh hưởng của nồng độ ([E]) Nói chung, trong điều kiện thừa cở chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào E]:v = k[E] V : vận tốc phản ứng, [E] : nồng độ enzyme [E]3 [E]2 [E]1 v 20 40 60 80 Hình 1.3. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến vận tốc của phản ứng Nồng độ E quá lớn, chỉ sau khoảng thời gian ngắn, vận tốc của phản ứng đã thay đổi theo thời gian. Theo sơ đồ này nên chọn nồng độ [E]3 sẽ có được sự phụ thuộc tuyến tính giữa V vào thời gian trong khoảng thời gian dài hơn, dễ dàng xác định vo. Do đó nên tiến hành lựa chọn nồng độ enzyme trước khi xác định hoạt độ enzyme hoặc nghiên cứu động học phản ứng enzyme 1.5.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất Tốc độ của các phản ứng đơn giản trong ở phương trình hóa học biểu diễn theo phương trình động học Michaelis – Menten. Ở trạng thái đầu, tốc độ phản ứng phụ thuộc vào nồng độ cơ chất. Nếu tại điểm đó, tất cả các phân tử enzyme đã thực hiện chức năng xúc tác của mình thì nó được gọi là tốc độ phản ứng tối đa với một lượng enzyme xác định, nếu tăng dần lượng cơ chất trong dung dịch thì thoạt đầu hoạt tính của enzyme tăng dần nhưng đến một lúc nào đó thì sự gia tăng về nồng độ cơ chất cũng không làm tăng hoạt tính của Enzyme. Đó là vì tất cả các trung tâm hoạt động của enzyme đã được bão hoà bởi cơ chất. 1.5.3. Ảnh hưởng của các chất kiềm hãm Các chất kiềm hãm (I), cũng gọi là chất ức chế, là những chất làm giảm tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác. Cách 1: Kìm hãm cạnh tranh Trong trường hợp kìm hãm cạnh tranh là cơ chất và chất kìm hãm đều tác dụng lên trung tâm hoạt động của enzyme, chất kìm hãm choán chỗ của cơ chất ở enzyme. Hình 1.4. Kiểu kìm hãm cạnh tranh Khi cơ chất dư thừa, nồng độ chất kìm hãm thấp thì có thể loại bỏ tác dụng của chất kìm hãm, còn nồng độ cơ chất thấp và nồng độ chất kìm hãm cao thì lại có tác dụng kìm hãm hoàn toàn. 1/v = (aKm/Vmax) 1/S +1/Vmax a = 1+[I]/KI Hình 1.5. Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất có kiềm hãm cạnh tranh Người ta thấy kìm hãm như vậy phần lớn xảy ra giữa chất kìm hãm và cơ chất có sự tương đồng về mặt hoá học chẳng hạn như malic acid có cấu trúc gần giống với succinic acid nên kìm hãm cạnh tranh enzyme succinatedehydrogenase, là enzyme xúc tác cho sự biến đổi succinic acid thành acid fumaric acid. Đường thẳng có chất kìm hãm thì có độ xiên lớn hơn và cắt trục tung ở một điểm là 1/Vmax Cách 2: Kìm hãm phi cạnh tranh Đặc trưng của kiểu kìm hãm này là chất kìm hãm chỉ liên kết với phức hợp ES, mà không liên kết với enzyme tự do. Hình 1.6. Kiểu kìm hãm phi cạnh tranh Cách 3: Kìm hãm hỗn tạp Hình 1.7. Kiểu kìm hãm hỗn tạp Trong đó, chất kìm hãm không những liên kết với enzmye tự do mà còn liên kết với cả phức hợp ES tạo thành phức hợp EIS không tạo được sản phẩm P. 1.5.4. Ảnh hưởng của chất hoạt hóa Là chất làm tăng khả năng xúc tác nhằm chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm. Thông thường là những cation kim loại hay những hợp chát hữu cơ như các vitamin tan trong nước như Mg2+ hoạt hóa các enzyme mà cơ chất đã được phosphoryl hóa như pyrophosphatase (cơ chất là pyrophosphate), adenosinetriphosphatase (cơ chất là ATP). Các cation kim loại có thể có tính đặc hiệu, tính đối kháng và tác dụng còn tuỳ thuộc vào nồng độ. 1.5.5. Ảnh hưởng cuả nhiệt độ Có thể tăng vận tốc của một phản ứng hóa học bằng cách tăng nhiệt độ môi trừơng, hiện tượng này tuân theo quy luật Vant’- Hoff. Điều này có nghĩa khi tăng nhiệt độ lên 100C thì tốc độ phản ứng tăng lên khoảng 2 lần. Đối với phản ứng do enzyme xúc tác cũng có thể áp dụng được quy luật này nhưng chỉ trong một phạm vi nhất định, vì bản chất enzyme là protein. Khi ta tăng nhiệt độ lên trên 40-500C xảy ra quá trình phá huỷ chất xúc tác. Sau nhiệt độ tối ưu tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác sẽ giảm. Nhờ tồn tại nhiệt độ tối ưu người ta phân biệt phản ứng hoá sinh với các phản ứng vô cơ thông thường. Mỗi enzyme có một nhiệt độ tối ưu khác nhau, phần lớn phụ thuộc nguồn cung cấp enzyme, thông thường ở trong khoảng từ 40-600C , cũng có enzyme có nhiệt độ tối ưu rất cao như các enzyme của những chủng ưa nhiệt. Các chủng vi sinh vật ưa nhiệt, đặc biệt các vi khuẩn chịu nhiệt có chứa enzyme chịu nhiệt cao. 1.5.6. Ảnh hưởng của pH Sự phân li khác nhau của một phân tử protein ở các giá trị pH khác nhau làm thay đổi tính chất của trung tâm liên kết với cơ chất và tính chất hoạt động của phân tử enzyme. Điều này dẩn đến giá trị xúc tác khác nhau phụ thuộc vào giá trị pH. Như đã biết mỗi enzyme có một pH tối ưu, mỗi enzyme có đường biểu diễn ảnh hưởng pH lên vận tốc phản ứng do chúng xúc tác. 1.5.7. Các yếu tố khác Ánh sáng: có ảnh hưởng khác nhau đến từng loại enzyme, các bước sóng khác nhau có ảnh hưởng khác nhau, thường ánh sáng trắng có tác động mạnh nhất, ánh sáng đỏ có tác động yếu nhất Ánh sáng vùng tử ngoại: có thể gây nên những bất lợi, enzyme ở trạng thái dung dịch bền hơn khi được kết tinh ở dạng tinh thể, nồng độ enzyme trong dung dịch càng thấp thì càng kém bền, tác động của tia tử ngoại sẽ tăng lên khi nhiệt độ. Sự chiếu điện: Điện chiếu với cường độ càng cao thì tác động phá huỷ càng mạnh. Tác động sẽ mạnh hơn đối với dịch enzyme có nồng độ thấp. Có thể do tạo thành những gốc tự do, từ đó tấn công vào phản ứng enzyme. Sóng siêu âm: Tác động rất khác nhau đối với từng loai enzyme, có enzyme bị mất hoạt tính, có enzyme lại không chịu ảnh hưởng. 1.6. Nguồn thu nhận ([4]) Các loại enzyme hiên nay rất phong phú và đa dạng có thể thu từ nhiều nguồn khác nhau như thực vật, động vật và vi sinh vật. + Động vật: có mặt trong tuyến tụy và nước bọt của động vật + Thực vật: có nhiều trong cây dứa, đu đủ xanh, trong dịch ép thân cây sung + Vi sinh vật: Bacillus, Penicillium, Pseudomonas, Rhizopus…. 1.7. Ứng dụng 1.7.1. Trong thực phẩm Từ năm 1970, tách enzyme ra khỏi tế bàovà sử dụng trong sản xuất công nghiệp,hiện tại có it nhất 60 enzyme đã được thương mại hoá, đa số là các enzyme ngoại bào như sản xuất sữa, bánh mì, bia, công nghệ dệt, sản xuất bột giặt và các chất tẩy rửa…… 1.7.2. Trong nông nghiệp Tăng hiệu suất sử dụng thức ăn, sản xuất thức ăn dễ tiêu hoá cho động vật, đặc biệt là động vật còn non để tăng hiệu quả sử dụng thức ăn, sản xuất các loại chế phẩm để chuyển hóa phế thải nông nghiệp cải tạo đất. 1.7.3. Trong y học Dùng trong chuẩn đoán bệnh, điều trị bệnh….. CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN VỀ PROTEASE 2.1. Tình hình nghiên cứu Sử dụng enzyme trong sản xuất và đời sống là một vấn đề được các nhà khoa học và kỹ thuật chú ý từ lâu. Ngày nay, việc sử dụng này đã trở thành phổ biến ở nhiều nước và đã mang lại lợi ích kinh tế khá lớn. Enzyme là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của thực vật mà nó còn đóng vai trò rất quan trọng trong chế biến thực phẩm, trong y học, trong kỹ thuật phân tích, trong công nghệ gen và bảo vệ môi trường. Trong những năm gần đây giá trị của enzyme công nghiệp trên toàn thế giới đạt khoảng 1 tỷ USD trong đó chủ yếu là các enzyme thuỷ phân (75%) và protease là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công nghiệp (59%) 2.2. Cấu tạo Nhóm enzyme protease (peptitd – hidrolase) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết peptitd (-CO-NH-) trong phân tử protein, từ poly peptitd đến sản phẩm cuối cùng là acid amind. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển acid amin. Hình 2.1. Cấu trúc không gian của protease Protease được phân thành 2 loại: endopeptitlase và exopeptidase. ([7]) Dựa vào vị trí tác động trên mạch poly peptid, exopeptidase được phân thành 2 loại: Amino peptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptid ở đầu N tự do của chuỗi poly peptid để giải phóng ra một amino acid, một dipeptid hoặc một tripeptid. Carboxy peptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptid ở đầu C của chuỗi poly peptid và giải phóng ra một amino acid hoặc một đipepti. Dựa vào động lực hcọ của cơ chế xúc tác, endo peptidase được chia thành 4 nhóm: Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm 2 nhóm nhỏ chymotripsin và subtilisin. Nhóm chymotripsin bao gồm các enzyme động vật như chymotripsin, tripsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm 2 loại enzyme vi khuẩn như subtilisin carlsberg, subtilisin BPN. Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện đặc hiệu cơ chất tương đối rộng. Cyteim proteinase: các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Cystein protease bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài proteinase động vật và proteinase ký sinh trùng. Các Cystein proteinase thường hoạt động ở vùng PH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng. Aspatic proteinase: hầu hết các asportic proteinase thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hoá như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin…. Các asportic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở PH trung tính. Metallo proteinase metallo proteinase: là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường hoạt động ở vùng PH trung tính và giảm hoạt động mạnh dưới tác dụng của EDTA. Ngoài ra, proteinase được phân loại đơn giản hơn thành 3 nhóm Proteinase acid: pH từ 2 – 4, Proteinase trung tính: pH từ 7 – 8, Proteinase kiềm: pH từ 9 – 10 2.3. Cơ chế tác dụng Protease là enzyme xúc tác thủy phân protein, về cơ bản cơ chế xúc tác sinh học của enzym người ta đề ra nhiều giả thuyết để giải thích, nhưng đều thống nhất ở chỗ quá trình xúc tác bắt đầu bằng sự kết hợp giữa enzym và cơ chất thành hợp chất trung gian. E (enzym) + S (cơ chất)→ ES(hợp chất trung gian) 2.4. Nguồn thu nhận Hiện chúng ta sử dụng 3 nguồn sinh học cơ bản để thu nhận protease chẳng hạn như các mô và cơ động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật… Động vật: Thông thường protease động vật có ở tuyến tiêu hóa (niêm mạc dạ dày niêm mạc ruột non, tuyến tụy)…. Pepsin từ niêm mạc dạ dày và dịch vị của động vật bậc cao, Chymosin “ rennin” có trong ngăn thứ tư dạ cỏ bê non dưới 5 tháng tuổi. Thực vật: Papain từ mủ thu đủ xanh, Bromelin từ thân cây dứa, Ficin tách từ dịch ép thân cây sung Vi sinh vật: phân bố chủ yếu ở nấm mốc vi khuẩn và xạ khuẩn…gồm các loại thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clostridium….. CHƯƠNG 3 TỔNG QUAN VỀ ASPERGILLUS OZYZAE 3.1. Đặc điểm cấu tạo([3]) Aspergillus gồm hơn 185 loài khoảng 20 loài cho đến đã được báo cáo là tác nhân gây bệnh nhiễm trùng cơ dụng để sản xuất thực phẩm, hóa chất và các enzyme . Trong số này, Aspergillus fumigatus là phổ biến nhất, tiếp theo là Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus clavatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus terreus, versicolor, Aspergillus oryzae… - Nấm mốc Aspergillus oryzae sinh ra các enzym amylase, invertase, maltoase, protease và catalase có khả năng phân giải tinh bột, protein thành đường, acid amin.  Nấm mốc Aspergillus oryzae là tác nhân chủ yếu lên men trong sản xuất nước tương theo phương pháp vi sinh vật. Trong công nghiệp người ta nhân giống nấm mốc này để sản xuất tương. Nấm Aspergillus orzae có cấu tạo đa bào thuộc loại vi hoàn khuẩn, các khuẩn ty có nhiều vách ngăn, khi khuẩn ty mới mọc có màu trắng xám và khi phát triển có màu xanh lợt có ít vàng. Nấm Aspergillus oryzae có hình dáng là đính bào tử, màu thay đổi từ xanh vôi sang màu xanh thẩm. dưới kính hiển vi đính bào tử có dạng hình cầu có tia. Một số enzyme quan trọng được tổng hợp bởi nấm Aspergillus oryzae. Protease: Ứng dụng trong công nghiệp da giày, y học, công nghiệp chế biến thức an gia súc Amylase: Ứng dụng trong công nghiệp dệt, sản xuất các chế phẩm sinh học bổ sung vào thức ăn gia súc, sản xuất glucose, dixtrin, malt….. Cellulose: ứng dụng trong công nghiệp dệt,công nghệ giấy, xử lý ô nhiễm môi trường…. 3.2. Vai trò của giống ([3]) Trong công nghệ enzyme từ vi sinh vật, giống đống vai trò quyết định đến: Năng suất của nhà máy, chất lượng sản phẩm sinh học (hay là hoạt tính của enzyme), vốn đầu tư cho sản xuất, giá thành sản phẩm, có ý nghĩa to lớn trong phát triển công nghệ vi sinh vật. 3.3. Yêu cầu của giống ([3]) Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại và được sản xuất theo qui mô công nghiệp. Do đó, giống vi sinh vật ứng dụng trong công nghệ enzyme cần có những yêu cầu và mục đích nhất định. Giống vi sinh vật phải cho ra sản phẩm mà ta mong muốn. Sản phẩm phải có số lượng và chất lượng cao.Vì trong quá trình trao đổi chất, để chuyển hóa một lượng sinh khối khổng lồ gấp hàng ngàn lần cơ thể mình trong khoảng thời gian ngắn thì cơ thể vi sinh vật cần tổng hợp rất nhiều chất. + Giống phải cho năng suất sinh học cao + Giống phải có khả năng thích nghi nhanh và phát triển mạnh trong điều kiện sản xuất công nghiệp. + Giống vi sinh vật phải có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm tại địa phương. + Giống sử dụng trong quá trình sản xuất hiện đại phải là những vi sinh vật thuần khiết, có tốc độ sinh sản nhanh. + Tốc độ trao đổi chất mạnh để tạo nhanh các sản phẩm mong muốn, dễ dàng tách chiết, tinh sạch + Dễ dàng bảo quản và ổn định Để tạo thuận lợi lớn nhất về chủng giống vi sinh vật cung cấp cho quá trình lên men công nhiệp, ta cần tiến hành phân lập giống vi sinh vật thuần khiết. 3.4. Phương pháp thu nhận protease từ chủng nấm mốc Asp.oryzae [9] 3.4.1. Nuôi cấy bề mặt Phương pháp này rất thích hợp để nuôi cấy các loại nấm mốc do khả năng phát triển nhanh, mạnh nên ít bị tạp nhiễm. Khi nuôi nấm mốc phát triển bao phủ bề mặt hạt chất dinh dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triển đậm, sâu vào lòng môi trường đã được tiệt trùng, làm ẩm. Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh… Có chất phụ gia là trấu. Cám, trấu có bề mặt tiếp xúc lớn, mỏng, tạo được độ xốp nhiều, không có những chất gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc. Tỷ lệ các chất phụ gia phải đảm bảo sao cho hàm lượng tinh bột trong khối nguyên liệu không được thấp hơn 20% có thể bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ (NH4)2 SO4, (NH4)2 10, phospho, nitơ hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu. Với phương pháp này nồng độ enzyme cao hơn nhiều lần so với dịch nuôi cấy chìm sau khi đã tách tế bào vi sinh vật.Chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm giảm đáng kể hoạt tính enzyme, chế phẩm khô dễ bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp nếu không cần khâu tách và làm sạch enzyme, tốn ít năng lượng, thiết bị, dụng cụ nuôi cấy đơn giản, có thể thực hiện quy mô gia đình. Nuôi cấy trong điều kiện vô trùng tuyệt đối và trong quá trình nuôi cấy nếu có nhiễm trùng phần nào, khu vực nào thì chỉ cần loại bỏ canh trường phần đó. Tuy nhiên, phương pháp bề mặt có năng suất thấp, khó cơ khí hóa, cần diện tích nuôi lớn, chất lượng chế phẩm ở các mẻ không đồng đều. 3.4.2. Nuôi cấy chìm Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng, với có chất chủ yếu trong đa số trường hợp là tinh bột. Chỉ có một số ít giống vi sinh vật dùng nguồn cơ chất cacbon là đường glucoza, saccharoza. Phương pháp nuôi cấy bề sâu đòi hỏi phải được vô trùng tuyệt đối ở các khâu vệ sinh tổng hợp, thanh trùng môi trường dinh dưỡng, thao tác nuôi cấy, không khí cung cấp cho quá trình nuôi cấy. Các giai đoạn của quá trình nuôi cấy chìm một bước gồm: chuẩn bị môi trường nuôi cấy, nuôi cấy nấm men giống, nuôi cấy nấm mốc sản xuất. Phương pháp nuôi cấy hiện đại, dễ cơ khí hóa, tự động hóa năng suất cao, dễ tổ chức sản xuất. Có thể nuôi cấy dễ dàng các chủng vi sinh vật đột biến có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao và lựa chọn tối ưu thành phần môi trường, các điều kiện nuôi cấy, enzyme thu được tinh khiết hơn, đảm bảo điều kiện vệ sinh vô trùng.Tuy nhiên do thu được canh trường và nồng độ enzyme thấp nên khi tách thu hồi enzyme sẽ có giá thành cao. Tốn điện năng cho khuấy trộn, nếu không bảo đảm vô trùng sẽ bị nhiễm hàng loạt, toàn bộ gây tổn thương lớn. 3.5. Nguyên liệu sản xuất Cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Trong thành phần môi trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme. Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện tượng cảm ứng. Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì chất đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng kìm hãm của chất kìm hãm nhằm đảm bảo khả năng tổng hợp enzyme đã cho không bị cản trở. Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường thường là cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp. Thành phần chính của môi trường: C, H, ON. Ngoài ra các chất vô cơ: Mn, Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác như. 3.5.1. Nguồn cacbon ([8]) Đối với Asp.oryzae: frucfoza saccroza maltoza glucoza manit arabinoza glactoza. Tinh bột là nguồn cacbon của nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme protease. Chảng hạn như: vi khuẩn Bac. Subtilis có khả năng sinh tổng hợp protease ở môi trường tinh bột lớn hơn 8%. Nhiều xạ khuẩn ưa nhiệt, trong đó Micromonos pora vulgaris 42, mọc tốt và sinh tổng hợp protease cao ở môi trường có tinh bột. Tăng nồng độ tinh bột từ 0,25 – 1,5% sinh khối cũng tăng đồng thời với hiệu suất tổng hợp enzyme. 3.5.2. Nguồn nitơ ([2]), ([8]) Trong số các nguồn nitơ vô cơ thì NH4, H2PO4 là tốt hơn cả. Các nguyên liệu đã chuẩn bị làm môi trường tự nhiên bao gồm: cám và bột hạt cốc, nước chiết ngô, dịch ép quả, rau, khô dầu, bã rượu, rỉ đường, sản phẩm phân hủy, nấm, men bia, trấu, lõi ngô. Khi lựa chọn sử dụng môi trường cần chú ý đến các chất có tác dụng điều hòa sinh tổng hợp enzyme, đặc biệt các chất cảm ứng. 3.6. Phương pháp phân lập Vi sinh vật phân bố rất rộng trong tự nhiên, đâu đâu cũng có vi sinh vật. Ở những nơi giàu chất hữu cơ, trong không khí, trong cơ thể động vật, thực vật….Chính vì vậy mà vi sinh vật có khả năng tồn tại và phát triển ở những điều khắc nghiệt nhất. Thông thường chủng vi sinh vật để thu nhận enzyme thường có 3 cách phân lập: + Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên + Phân lập giống trong điều kiện sản xuất + Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng Tùy thuộc vào khả năng và điều kiện thực tế mà chọn cách phân lập phù hợp nhất.Mỗi cách có những ưu điểm riêng . 3.6.1. Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên Ở điều kiện tự nhiên và trong điều kiện sản xuất công nghiệp thì có sự khác biệt đáng kể các giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme trong điều kiện tự nhiên, được gọi là các chủng vi sinh vật hoang dại. Chúng đã quen với các điều kiện tự nhiên, khi chúng ta đưa chúng vào điều kiện sản xuất công nghiệp với điều kiện môi trường cố định đòi hỏi các loài vi sinh vật cũng có thời gian thích nghi. Huấn luyện chúng thích nghi với điều kiện sản xuất công nghiệp là điều kiện rất cần thiết. 3.6.2 . Phân lập giống trong điều kiện sản xuất Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường đã thích nghi với điều kiện sản xuất. Nhờ đó sau khi phân lập các giống này không qua giai đoạn huấn luyện. Các giống này đã được chọn lọc hoặc đã qua quá trình biến đổi gen và có những đặc điểm sinh hoá hơn hẳn các giống vi sinh vật hoang dại. Mật độ tế bào vi sinh vật thường rất cao, do đó khả năng thu nhận đã sinh tổng hợp cao 3.6.3. Phân lập giống trong điều kiện hư hỏng Các ống giống có thể bị nhiễm do quá trình bảo quản. Do bị nhiễm nhiều tế bào vi sinh vật đã bị thoái hoá nhưng cũng có nhiều tế bào không bị thoái hoá. 3.7. Phương pháp phân lập nấm mốc Asp. oryzae Qui trình lấy mẫu: khoai tây cắt lát đem chôn xuống đất.Sau 8 ngày lấy những miếng khoai tây lên cho vào bao nilon và mang về phòng thí nghiệm. Tiến hành thí nghiệm: Mẫu khoai tây đã xay nhuyễn cho vao 90ml nước cất vô trùng và trộn đều mẫu.Lấy pipet hút 10ml từ dung dich ban đầu sang ống nghiêm khác chứa 90ml nước cất vô trùng. Tiếp tục pha loãng tới nồng độ 10-3, 10-4. Hút 0,1 ml mẫu ở các nồng độ pha loãng cho vào môi trường PDA Dùng que trang trang đều mãu trên bề mặt thạch Mốc sẽ sử dụng nguồn tinh bột làm cơ chất, nên sẽ xuất hiện những quầng sáng quanh khuẩn lạc Nhận biết bằng cách bổ sung Iodine vào trong môi trường trước khi cấy. Cấy chuyền những mớc đặc trưng vào trong môi trường Pda trong ống thạch nghiêng với 1% tinh bột cho phép mốc phát triển trong vòng 72h. Nhân giống vi sinh vật trong bình tam giác: cho10ml nước cất vo trùng vào ống thạch nghiêng có chứa bào tử. Lắc đều cho bào tử trộn lẫn với môi trường Hút 0,1ml dung dịch cho vào bình tam giác chứa môi trường sinh trưởng của nấm KH2PO4 1,4g MgSo4 0,1g NH4NO3 10g FeSo4 0,01g KCL 0,5 Hồ tinh bột 20g pH=6,5 Sau khi nhân giống thành công có thể sử dụng ngay hoặc mang đi bảo quản, dự trữ. Để có hiệu quả cao cần lựa chon các phương pháp bảo quản thích hợp. 3.8. Phương pháp bảo quản Khi sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzyme cần chọn giống thuần chủng đã được kiểm tra đầy đủ về các đặc tính hoá sinh, vi sinh và cần đặc biệt lưu ý đến điều kiện bảo quản giống. Thực tế khi bảo quản giống gốc trong một thời gian có thể tạo ra các biến dị ngẫu nhiên không mong muốn do đó định kỳ phải cấy chuyền và kiểm tra lại các đặc tính ban đầu. 3.8.1 .Phương pháp cấy chuyền Đây là phương pháp phổ biến nhất dễ thực hiện bằng cách giữ giống trên môi trường thạch (thạch nghiêng, hợp petri…) với thành phần môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho giống vi sinh vật đó. Sau khi giống đã mọc tốt cần bảo quản ở nhiệt độ lạnh 3 – 4 và sau mỗi tuần phải cấy chuyền lại. Khi cấy chuyền chỉ lấy bào tử hoặc khuẩn lạc mà không chuyền các sản phẩm trao đổi chất vào môi trường mới (có thể gây biến đổi bất lợi không thể lường hết được). Nếu là xạ khuẩn thì không nên bảo quản giống trên môi trường thạch mà nên giữ trong đất để khử trùng. Để kéo thời gian bảo quản giống từ hàng tháng đến một năm, người ta phủ một lớp paraphin lỏng để tiệt trùng trên bề mặt giống để hạn chế sự phát triển của nó. Cần lưu ý chỉ phủ một lớp đầu sau khi cấy vi sinh vật đạt đến độ chín sinh lý. Phương pháp cấy chuyền rất có hiệu quả để bảơ quản các giống nấm men, vi khuẩn và rất hữu hiệu dễ dàng triển khai giống ra sản xuất lớn, hạn chế các tai biến có thể dẫn đến hư hỏng giống gốc. 3.8.2. Phương pháp làm khô Bằng cách giữ giống trên cát đất, silicagen trong điều kiện khô ráo (tất cả đều được khử trùng cẩn thận). Trong điều kiện như vậy sẽ hạn chế sự phát triển tiếp tục của giống khi bảo quản. Phương pháp này rất hay được sử dụng để bảo quản nấm mốc, xạ khuẩn, một vài loại nấm men, vi khuẩn thời gian giữ giống có thể được một năm. Phương pháp làm khô cũng thực hiện đơn giản không cần dụng cụ đắt tiền. Tuy nhiên, giống như phương pháp cấy chuyền thời gian bảo quản tương đối ngắn. 3.8.3. Phương pháp đông khô Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng thái lạnh sâu. Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp và được làm lạnh trong môi trường chân không. Thiết bị động khô sẽ hút nước và cuối cùng mẫu được làm khô đến mức nhất định. Mẫu được hàn kín để cho môi trường chứa mẫu là chân không. Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao cho bảo quản các nấm men, vi khuẩn và một số virut. Tuy nhiên, phương pháp này ít được ứng dụng, đối với tảo, động vật nguyên sinh và tế bào động vật. 3.8.4. Phương pháp bảo quản lạnh sâu Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì vi sinh vật được bảo quản trong môi trường dịch thế và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở nhiệt độ lạnh sâu (-1960C đến -800C). Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol, DMSO (dimethyl sulfo xide). Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu này được thực hiện ở các thang nhiệt độ khác nhau như: -200C, - 300C, -400C, -700C, -400C và -1960C. Nói chung mức nhiệt cao hơn - 300C cho hiệu quả thấp do tế bào chịu nồng độ muối cao sinh ra từ các chất điện giải. Phương pháp bảo quản này có hiệu quả với nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn và virut. CHƯƠNG 4 QUY TRÌNH SẢN XUẤT PROTEASE TỪ CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE 4.1. Sơ đồ quy trình Môi trường Asp.oryzae Nuôi cấy Sử dụng enzyme thô Chế phẩm thô Bã Thức ăn chăn nuôi Trích ly Kết tủa enzyme Ly tâm Thu nhận kết tủa Sấy Nghiền và bảo quản Chế phẩm enzyme 4.2. Thuyết minh qui trình 4.2.1. Môi trường Mục đích: Chuẩn bị môi trường cho nuôi cấy cho phép vi sinh vật phát triển tốt Cách tiến hành: Nguồn tinh bột như cám gạo, chứa khoảng 20% tinh bột, 10- 20% chất béo, 10–14% protein, 8 – 16% cellulose, các chất hòa tan không chứa nitơ 37– 59%.Cám không được chứa hàm lượng tinh bột dưới 20%, không có vị chua hay đắng, không hôi mùi mốc, độ ẩm không quá 15%, tạp chất độc không quá 0,05%, có thể bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ ((NH4)2SO4, (NH4)2CO), photpho, nitơ hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu. Các phụ phẩm thêm vào để thoáng khí cho môi trường nuôi cấy bề mặt như trấu , mùn cưa……. 4.2.2. Nuôi cấy Mục đích: Tạo điều kiện tối ưu cho vi sinh vật phát triển và sinh enzyme Cách tiến hành: Sau khi đã trộn giống, môi trường được rải đều ra các khay với chiều dài 2 -3cm, rồi được vào phòng nuôi cấy, đặt trên các giá đỡ. Các giá đỡ này được thiết kế sao cho lượng không khí được lưu thông thường xuyên. Phòng nuôi cấy phải có hệ thống điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm không khí, nhiệt độ thích hợp cho sợi nấm phát triển là từ 280C – 32oC. Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp đều ảnh hưởng đến sự phát triển của sợi nấm. Trong quá trình nuôi cấy ta không cần phải điều chỉnh pH. Môi trường bán rắn là môi trường tĩnh nên sự thay đổi pH ở một vùng nào đó ít ảnh hưởng đến cả khối môi trường Thời gian nuôi sợi nấm thu nhận enzyme vào khoảng 36-60 giờ. Điều này còn phụ thuộc vào chủng mốc Asp. oryza, điều kiện môi trường cùng như kĩ thuật nuôi cấy Thiết bị: Khay nuôi cấy bề mặt Hình 4.1. Khay nuôi cấy Thông số kĩ thuật: + Dày 4-5cm + Cao 1-1,2m Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài từ 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy. Ở giai đoạn này có những thay đổi sau như nhiệt độ tăng rất chậm, sợi nấm bắt đầu hình thành có màu trắng hoặc màu sữa, thành phần chất dinh dưỡng cũng bắt đầu thay đổi, khôi môi trường còn rời rạc, enzyme mới bắt đầu được hình thành. Trong giai đoạn này không được đưa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kì đầu giống rất mẫn cảm với nhiệt độ. Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài từ 14-18 giờ. Trong giai đoạn này có những thay đổi cơ bản sau: Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và phát triển mạnh tạo thành những mạng chằng chịt bao quanh các hạt môi trường, có thể nhìn rõ sợi nấm màu trắng xám bằng mắt thường, môi trường kết lại khá chặt, độ ẩm môi trường giảm dần, nhiệt độ môi trường có thể tăng nhanh lên 40-500C, các chất dinh dưỡng giảm nhanh do sự đồng hóa của sợi nấm, enzyme prorease được tổng hợp mạnh, lượng O2 trong không khí giảm và lượng CO2 tăng dần, cần phải thông khí mạnh và duy trì mức nhiệt độ từ 29-300C là tốt nhất. Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài từ 10-20 giờ. Trong giai đoạn này có những thay đổi như sau. Quá trình trao đổi chất yếu dần, do đó mức độ tiêu hao chất dinh dưỡng sẽ giảm lại, nhiệt độ của môi trường giảm, lượng enzyme tạo ra sẽ giảm xuống. Do đó cần xác định thời gian để thu nhận enzyme hiệu quả nhất 4.2.3. Chế phẩm thô Mục đích: Thu được chế phẩm enzyme protease, chế phẩm này được gọi là enzyme thô vì ngoài thành phần enzyme chúng còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và nước. Cách tiến hành: Để đảm bảo enzyme không bị mất hoạt tính nhanh người ta thường sấy enzyme đến một độ ẩm thấp (Thường dùng là máy sấy chân không).Nhiệt độ sấy vào khoảng 38-400C ,enzyme protease bị mất hoạt tính ở 60-760C, độ ẩm sau khi kết thúc sấy nhỏ hơn 10%. Tùy thuộc vào mục đích sử dụng mà ta có thể sử dụng ngay enzyme này mà không cần phải tinh sạch. Trong những trường hợp khác ta phải tiến hành tinh sạch enzyme để bảo quan lâu hơn. 4.2.4. Trích ly Mục đích: Tách enzyme enzyme ra khỏi khối môi trường. Cách tiến hành: Sau khi nghiền mịn người ta cho nước vào để trích ly enzyme. Các loại enzyme thủy phân có khả năng tan trong nước nên người ta sử dụng chúng như dung môi hòa tan. Cứ 1 phần chế phẩm thô cho 4-5 phần nước, khuấy nhẹ và lọc lấy dịch, phần bã được loại bỏ để làm thức ăn cho gia súc. Thiết bị: Thiết bị trích ly kiểu thùng quay Hình 4.2. Máy trích ly Thông số kĩ thuật: + Nhiệt độ trích ly 250C  + Thời gian 40-60 phút 4.2.5. Kết tủa enzyme Mục đích: Thu nhận dung dịch enzyme Cách tiến hành: Trong công nghiệp tinh chế enzyme người ta sử dụng cồn hoặc sunfatmon. Trong quá trình này người ta làm lạnh cả dung dịch thô và các tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính của enzyme. Cứ 1 phần dung dịch enzyme thô cho 2-2.5 phần cồn hoặc sunfat amon, cần nhẹ nhàng để tránh hiện tượng biến tính, khuấy nhẹ và để trong điều kiện lạnh từ 4-70C trong một thời gian, các enzyme tạo thành kết tủa và lắng xuống, người ta thu nhận kết tủa (Độ ẩm > 70%). Người ta tiếp tục sấy kết tủa ở 400C và độ ẩm giảm xuống 5-8%.  Thiết bị: Thiết bị kết tủa Hình 4.3. Thiết bị kết tủa Thông số kĩ thuật: + Nhiệt độ:tiến hành ở nhiệt độ phòng + Muối:amoni sunfat 80% + Thời gian: 10-18 giờ + Hoạt độ riêng: 162 IU/mg + Hiệu suất: 74% 4.2.6. Ly tâm Mục đích : Tách sinh khối vi sinh vật và bã của canh trường Các biến đổi: Sự thay đổi về thể tích, khối lượng riêng, nhiệt độ của dung dịch, sự thay đổi hàm lượng chất khô và chất hòa tan trong 2 pha rắn-lỏng, tách huỳnh phù ra thành 2 pha rắn-lỏng Các yếu tố ảnh hưởng: Sự chênh lệch khối lượng riêng của 2 pha rắn lỏng:chênh lệch nhiều thì quá trình diễn ra dễ dàng hơn, tốc độ quay của roto: Tốc độ càng nhanh quá trình diễn ra càng tốt. Thiết bị: Thiết bị ly tâm lắng Hình 4.4. Thiết bị ly tâm lắng Thông số công nghệ: + Tốc độ quay 10000 rpm +Thời gian 10 phút + Nhiệt độ 40C + Hoạt độ riêng 80.1IU/mg + Độ tinh sạch: 1 4.2.7. Hệ thống sấy phun Mục đích: Tách nước ra khỏi dung dich mà không làm thay đổi tính chất của enzyme nhằm bảo quản lâu hơn. Các yếu tố ảnh hưởng: Nồng độ chất khô của nguyên liệu, nồng độ cao làm giảm thời gian bốc hơi, tăng độ nhớt của nguyên liệu gây khó khăn cho quá trình sấy phun. Nồng độ thấp làm tốn nhiều thời gian và năng lượng cho quá trình. Nhiệt độ sấy lưu ý đến nhiệt độ biến tính của enzyme để điều chỉnh nhiệt độ sấy thích hợp. Hình 4.5. Thiết bị sấy phun Thông số kĩ thuật: + Nhiệt độ: 30-3000C + Điện thế: 380V-50Hz-3 pha + Điều kiện: Chống quá nhiệt + Chế độ làm việc: Liên tục CHƯƠNG 5 NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT PROTEASE TỪ CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS. ORYZAE ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT NƯỚC MẮM 5.1. Giới thiệu chung về nước mắm Nước mắm là dung dịch đạm mà chủ yếu là các acid amin được tạo thành do quá trình thủy phân protein có trong cá nhờ enzyme protease. Ngoài ra, nước mắm còn dùng điều trị một số bệnh như đau dạ dày, phỏng, cơ thể suy nhược, cung cấp năng lượng. Nước mắm được sản xuất trên tất cả hầu hết các nước châu Á. Giá trị dinh dưỡng của nước mắm: Các chất đạm chiếm chủ yếu và quyết định giá trị dinh dưỡng của nước mắm, gồm 3 loại: + Đạm tổng số. + Đạm amin. + Đạm amon. Ngoài ra trong nước mắm còn chứa đầy đủ các acid amin, đặc biệt là các acid amin không thay thế: valin, bucin, methienin, isokucin, phenylalanin, alanin…Và cũng có những chất trung gian làm cho nước mắm bị hư hỏng do hoạt động của vi sinh vật. Các chất bay hơi quyết định hương vị của nước mắm: + Các chất cacboxyl bay hơi: 407 – 512 mg/100g nước mắm. + Các acid bay hơi: 404 – 533 mg/100g nước mắm. + Các amin bay hơi: 9,5 – 11,3 mg/100g nước mắm. + Các chất trung tính bay hơi: 5,1 – 13,2 mg/100g nước mắm. Mùi của nước mắm được hình thành chủ yếu do hoạt động của vi sinh vật yếm khí trong quá trình sản xuất tạo ra. Và một số chất khác: + Các chất vô cơ: NaCl chiếm 250 – 280 g/l và một số các chất khoáng như: S, Ca, Mg, P, I, Br. + Vitamin: B1, B12, B2, PP. 5.2. Bản chất của quá trình sản xuất nước mắm Bản chất của quy trình sản xuất nước mắm là: Ủ Cá + muối nước mắm. Bản chất của quá trình này chính là quá trình thủy phân protein trong cá nhờ hệ Enzyme protease pepton polypeptid peptid acid amin 5.3. Các hệ enzyme trong sản xuất nước mắm 5.3.1. Hệ enzyme Metalo-protease Hệ enzyme này tồn tại trong nội tạng của cá và chịu được nồng độ muối cao nên ngay từ đầu nó đã hoạt động mạnh, giảm dần từ tháng thứ 3 trở về sau. Loại enzyme có hoạt tính khá mạnh, có khả năng thủy phân rộng rãi đối với các loại peptid. Đây là nhóm enzyme thủy phân trung tính pH tối thích từ 5-7, pI từ 4-5, nó ổn định với ion Mg2+, Ca2+ và mất hoạt tính với Zn2+, Ni2+, Pb2+, Hg2+. 5.3.2. Hệ enzyme serin-protease Điển hình là enzyme tripsin tồn tại nhiều trong nội tạng của cá. Hệ enzyme luôn bị ức chế bởi chuỗi acid amin trong cấu trúc của enzyme. Để tháo gỡ chuỗi này phải nhờ đến hoạt động của men cathepsin B. Nhưng nó lại dễ bị ức chế bởi nồng độ muối cao.Vì vậy để men cathepsin B hoạt động nguời ta thực hiện cho muối nhiều lần. Enzyme serin-protease hoạt động mạnh ở pH từ 5-10, mạnh nhất ở pH= 9. 5.3.3. Hệ enzyme acid-protease Có trong thịt và nội tạng cá điển hình là enzyme cathepsin D. Hệ enzyme bị ức chế bởi nồng độ muối khoảng 15% nên thường tồn tại trong một thời gian ngắn ở thời kì đầu của quá trình thủy phân. Loại men này đóng vai trò thiết yếu trong sản xuất nước mắm. 5.4. Vi sinh vật trong sản xuất nước mắm Nguồn gốc: + Có từ nguyên liệu, dụng cụ, thiết bị, môi trường ( nước, không khí..) + Bổ sung hệ enzyme protease được sản xuất từ vi khuẩn Asp.oryzae + Ngày nay với sự phát triển của ngành công nghệ sinh học nói chung và ngành công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme nói riêng thì người ta thường sử dụng phương pháp bằng sinh vật bằng cách cho thêm một ít chế phẩm enzyme vào nguyên liệu trong quá trình ủ chượp sẽ làm tăng rõ rệt quá trình thủy phân và rút ngắn thời gian sản xuất từ 6 – 12 tháng xuống còn 15 – 30 ngày [2]. Tuy nhiên phương pháp này cũng có những nhược điểm lớn như không có hương vị thời gian sản xuất ngắn, bị chua do tinh bột lên men lactic hoặc do sinh ra acid dễ bay hơi khi cá bị ươn, đắng do xác vi sinh vật còn tồn tại hoặc do chất lượng của muối kém có nhiều ion Ca2+, Mg2+. Và một điều cần lưu ý khi cho thêm vào nguyên liệu một lượng enzyme thì đảm bảo môi trường không ức chế sự hoạt động của enzyme cho vào hoặc cấy vào một lượng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp protease cao thì vi khuẩn đó phải chống chịu được với điều kiện bất lợi trong quá trình ủ chượp. 5.5. Qui trình sản nước mắm 5.6. Nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 5.6.1. Hải sản Nguyên liệu hải sản dùng trong sản xuất nước mắm: cá, tôm, phế thải đông lạnh… Nguyên liệu rửa sạch mùn, cát, chọn nguyên liệu càng tươi thì chất lượng nước mắm càng tốt, các loại hải sản quá to thì phải cắt nhỏ. 5.6.2. Nước Để sản xuất thực phẩm nói chung và nước mắm nói riêng nước cần đạt các tiêu chuẩn sau: + Độ cứng trung bình đạt từ 8 – 17% nếu quá cứng sẽ làm ảnh hưởng tới sự thủy phân protein và tinh bột. + Các chất khoáng và chất hữu cơ không vượt quá mức 500 – 600 mg/l nước. + Số lượng vi sinh vật không quá 20 – 100 con/cm2 nước đặc biệt không chứa vi sinh vật gây bệnh. + Chỉ số E. coli có trong một lít nước không vượt quá 20 và độ chuẩn E. coli phải lớn hơn 50 . + Trong sản xuất nước mắm thì tỷ lệ nước cho vào là 5 – 10% là đủ. 5.6.3. Muối Sử dụng muối có tinh thể nhỏ, màu sáng, độ trắng cao, không vón cục, không bị chát, lượng muối cho vào trong sản xuất nước mắm là 4 – 6% so với khối lượng cá. Thành phần hóa học của muối cũng rất quan trọng. Nếu trong muối chứa hàm lượng Mg và Ca cao nó sẽ làm ức chế hoạt động của enzyme làm chất lượng nước mắm không tốt chính vì vậy cần phải lựa chọn loại muối tốt nhất. 5.6.4. Nấm mốc Asp.oryzae Yêu cầu: Chế phẩm có thể sử dụng ở dạng thô hoặc đã được tinh sạch Tỷ lệ giữa mốc và cá: từ 3 – 4% tính theo chế phẩm enzyme thô, cá xay nhỏ trộn với enzyme protease. Các thành phần nguyên liệu trên trộn đều với nhau theo tỷ lệ và tiên hành vỉ chượp và theo dõi đến khi dung dịch có màu nâu tươi nâu xám hoặc xám. Riêng nước cốt có màu vàng rơm đến cánh gián. Có mùi thơm đặc trưng không có mùi chua, lạ là chướp đã chín hoặc lấy dung dịch đó phơi nắng hoặc sấy ở 500C nếu dung dịch không có biến đổi gì so với mẫu đối chứng là nước mắm đã chín. Nếu màu từ vàng rơm hoặc cánh gián chuyển sang vàng nhạt, mất hương vị đặc trưng vẫn đục thì chượp chưa chín. Hoặc ta có thể dùng một phương pháp nữa để kiểm tra độ chín của chượp: lắc mạnh mẫu nước mắm, lắc 30 – 40 lần sau đó để yên 20 phút nếu mẫu nước mắm đó không biến đổi gì so với mẫu đối chứng là chượp chín 5.7. Một số nguyên nhân dẫn đến nước mắm kém chất lường và cách phòng chữa 5.7.1. Chượp chua Hiện tượng: chượp bốc mùi chua, màu xám đượm mùi tanh hôi khó chịu Nguyên nhân: + Chua vì mặn đầu: Do lượng muối lúc đầu quá nhiều, lượng muối này ngấm vào lớp thịt cá phía bên ngoài, bên trong và nội tang chưa kịp ngấm muối, làm cho thịt cá bị nhạt muối, xảy ra quá trình phân giải sinh ra nhiều acid bay hơi phức tạp như: glycogen, glucose bị phân giải yếm khí tạo ra acid lactic. Các chất này phân giải hiếu khí tạo acid acetic acd butytic. Ngoài ra các chất béo bị thủy phân tạo glycerin và acid béo hoặc chất đạm khứ amin thành acid béo + Chua vì nhạt đầu: Cá nhạt muối không đủ sức kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật phân giải tạo nhiều acid bay hơi phức tạp, làm phát sinh mùi chua, tanh thối nhanh chóng chuyển sang hư thối Cách phòng chữa: + Cần phải cho muối đều đủ + Náo đảo, phơi nắng và kéo rút qua bã chượp tốt + Dùng rượu chuyển các acid sang dạng ester có mùi thơm hoặc trung hòa bằng NaHCO3 + Dùng thính để hấp thụ mùi + Chua vì mặn đầu tiến hành cho thêm nước lã vào chượp và tiến hành chế biến chượp tiếp theo 5.7.2. Chượp đen Hiện tượng: Nước bị xám đen, cá nhợt nhạt và ở mức độ cao hơn nữa là cá bị đen Nguyên nhân: + Do cá có bùn đất tạp chất không những ở mang nhớt bên ngoài mà ngay ở nội tạng cá + Do các sắc tố có trong da, thịt và nội tạng của cá + Do sự phân hủy các chất khác + Do trộn muối không đều gây ngưng tụ nhóm amin và nhóm aldehyde + Sự oxy hóa các chất béo chưa bão hòa Cách phòng chữa: + Xử lý nguyên liệu ban đầu tốt + Cần chọn lựa nguyên liệu ban đầu cho kỹ, tránh nhiễm bẩn + Cho một ít thíng rang kỹ và bã chượp tốt vào trong bã chượp đen tiến hành đánh khuấy và tăng cường phơi nắng + Dùng chất chống oxy hóa KmnO4, KclO3, H2O2 để oxy hóa các chất đen + Khi chượp trở mùi kịp thời cho muối vào để ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật. + Đun sôi nước bổi, màu đen sẽ bị phá hủy do bay hơi, vi sinh vật bị tiêu diệt 5.7.3. Chượp thối Hiện tượng: chượp thối bao giờ cũng đen và có mùi hôi thối nhưng chượp đen chưa chắc đã thối Nguyên nhân: chủ yếu do muối quá nhạt hoặc sau khi có đòi muối ta không kịp thời cho muối vào. Khi đó các vi sinh vật hoạt động phân hủy các chất có đạm chủ yếu là các acid amin thành các sản vật cấp thấp làm chượp bị thối Cách phòng chữa: + Cần xử lý nguyên liệu cho tốt, tránh nước mưa vào + Dụng cụ chế biến phải sạch sẽ, không để chượp ở nơi ẩm thấp, bẩn thỉu + Cần áp dụng đúng kỹ thuật chế biến, đồng thời cần nắm vững hiện tượng cá đòi muối để cho muối đủ đúng và kịp thời + Có thể trộn với chượp khác và đem nấu + Chượp bị nước mưa nhiểu vào thì có thể múc riêng phần đó ra cho muối vào, tăng cường phơi nắng náo đảo 5.7.4. Nước mắm thối Hiện tượng: Nước mắm thối nổi lên những bọt nhỏ và dần dần nước bị đục, cá màu nâu xám đến xanh và xông lên mùi hôi thối Nguyên nhân: + Chượp chưa chín chỉ mới phân giải đến sản vật trung gian, dễ bị đóng von keo tụ mà ta đem kéo rút + Do nước mắm lọc không trong + Do nước hâm bị nhạt muối hay quá nóng tạo nhiệt độ và môi trường thích hợp cho vi sinh vật phát triển + Do bể thùng lọc hoặc dụng cụ chứa không sạch sẽ có khi lẫn cả chượp sống + Do nước mắm bị nước mưa hay nước lã đổ vào Cách phòng chữa: + Cần tránh những nguyên nhân trên + Cách chữa duy nhất hiện nay là dùng nhiệt độ làm bay hơi mùi hôi thối 5.8. Bảo quản Bảo quản: Nhờ muối và hàm lượng đạm cao tạo áp suất thẩm thấu lớn ức chế hoạt động của vi sinh vật. Hàm lượng đạm cao, thời gian bảo quản rất dài từ hàng năm đến hàng chục năm nhưng hương vị kém dần. Dụng cụ chứa phải vệ sinh sạch sẽ KẾT LUẬN VÀ KIẾN NHỊ Kết luận Công nghệ sinh học ở nuớc ta đã và đang phát triển, đã và đang tiếp thu những thành tựu của nền công nghệ sinh học trên thế giới. Do vậy việc đi sâu tìm hiểu về enzyme protease, nguồn thu nhận protease từ vi sinh vật nói chung và chủng nấm mốc Asp. Oryzae và những ứng dụng của nó mang lại là một nhiệm vụ cấp thiết từ đó làm tiền đề để tìm ra những enzyme mới và nâng cao hoạt lực của chúng góp phần đưa nền kinh tế Việt Nam hội nhập với nền kinh tế thế giới. Kiến nghị Với khả năng kì diệu mà enzyme mang lại cho con người, tôi mong muốn rằng trong thời gian tới các nhà khoa học sẽ tiếp tục nghiên cứu để tìm ra nhiều loại enzyme mới, có tính đặt hiệu và độ tinh sạch cao, tận dụng những lợi ích mà vi sinh vật mang lại để thay thế cho các loại enzyme được lấy từ động vật, thực vật nhằm thiết lập một nền sản xuất sinh thái bền vững, hòa hợp với thiên nhiên, bảo vệ các loài đông vật, giảm ô nhiễm môi trường TÀI LIỆU THAM KHẢO I. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1]. Nguyễn Thị Diệu Bích (2007), Chế biến thức ăn từ đậu nành và lạc, NXB Thanh Hóa [2]. Nguyễn Đức Lương (2004), Công nghệ enzyme, NXB Đại học quốc gia Hà Nội [3]. Trần Thị Ngạch (2007), Công nghệ enzyme, Trường đại học bách khoa Đà Nẵng [4]. Lương Đức Phẩm (2004), Công nghệ vi sinh vật, NXB nông nghiệp Hà Nội [5]. PGS TS Đặng Thị Thu (2004), Công nghệ enzyme, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội II. TÀI LIỆU INTERNET [6]. [7]. [8]. thuvien.violet.vn/present/show?entry_id=7748438 [9].