Đề tài Nghiên cứu tạo dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng kháng AFP hỗ trợ chẩn đoán sớm bệnh ung thư tế bào gan ở người

nguyên rất chặt chẽ, bởi vì nếu có một thay đổi nhỏ về cấu trúc hóa học của kháng nguyên cũng làm mất tính đặc hiệu, kháng nguyên đã thay đổi không còn khả năng kết hợp với kháng thể do nó kích thích sinh ra trước nó. Ví dụ: đối với kháng nguyên là protein chỉ cần thay đổi một axit amin hoặc axit amin dạng D thay thế cho dạng L đã làm thay đổi tính đặc hiệu của kháng nguyên được nhận biết bởi hệ thống miễn dịch được gọi là nhóm quyết định kháng nguyên hay Epitope. Đó là phần kháng nguyên kết hợp đặc hiệu với kháng thể. - Tính đa trị kháng nguyên Kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể, các tế bào trình diện kháng nguyên bắt giữ và biến chúng thành các Epitope khác nhau, vì thế mà kích thích cơ thể sinh ra nhiều kháng thể tương ứng. Điều này giải thích tại sao khi tiêm chủng vacxin và khuẩn nhược độc A sẽ thu được huyết thanh chứa nhiều loại kháng thể chống lại A được gọi là một họ kháng thể A (Vũ Triệu An và cs, 1998) [1]. 1.2.1.3.3. Phân loại kháng nguyên dựa vào đặc tính và điều kiện kháng nguyên Căn cứ vào đặc tính và điều kiện kháng nguyên mà chia kháng nguyên thành hai loại: kháng nguyên hoàn toàn (antigen) và kháng nguyên không hoàn toàn (hapten). - Kháng nguyên hoàn toàn: Là loại kháng nguyên có đầy đủ hai đặc tính: kích thích cơ thể sinh kháng thể (tính sinh miễn dịch) và kết hợp đặc hiệu với kháng thể do chính kháng nguyên kích thích sinh ra (tính đặc hiệu). Hầu hết các kháng nguyên hoàn toàn thường có bản chất protein như các phần như các phần cấu của cơ thể động vật, thực vật, vi sinh vật, nọc độc động vật. - Kháng nguyên không hoàn toàn (hapten) còn gọi là bán kháng nguyên: Là những kháng nguyên chỉ có tính đặc hiệu, không có tính kháng nguyên. Những kháng nguyên này tự than chúng không có khả năng kích thích cơ thể sinh kháng thể, nhưng có khả năng kết hợp đặc hiệu với kháng thể tương ứng Để trở thành kháng nguyên hoàn toàn, kháng nguyên không hoàn toàn này phải gắn với một chất mang (Carrier), tạo thành phức hợp hapten-carier, phức hợp này kích thích cơ thể sinh kháng thể. Carier là những chất có trọng lượng phân tử lớn như: BSA (Bovine Serum Albumin)…. Dung để kết hợp với hapten tạo ra kháng nguyên hoàn toàn.[2]. 1.2.1.3.4. Điều kiện để kháng nguyên có tính miễn dich - Kháng nguyên phải có kích thước phân tử lớn ( ngưỡng tối thiểu của trọng lượng phân tử là 1000 Dalton). Tuy nhiên có chất có trọng lượng phân tử nhỏ nhưng chúng tìm cách gắn với protein khác để trở thành kháng nguyên hoàn chỉnh, ngược lại một số chất có trọng lượng phân tử lớn như Dextran tới 200000 Dalton nhưng không có tính sinh miễn dịch hoặc có nhưng rất yếu (Lê Văn Hùng, 2002) [5]. - Kháng nguyên phải có ít nhất một Epitope khác loài vì hệ thống miễn dịch không phản ứng với Epitope cùng loại. Epitope là những cấu trúc trên bề mặt tác nhân gây bệnh, có khả năng tác dụng tương hỗ riêng biệt với những thụ thể đặc hiệu trên bề mặt của một số tế bào lympho. Như vậy toàn bộ cấu trúc (tác nhân gây bệnh, những hạt phân tử) mà trên đó những epitope hiện diện được gọi là kháng nguyên. 1.2.1.4. Kháng thể và phản ứng kháng nguyên – kháng thể 1.2.1.4.1. Khái niệm kháng thể (Antibody) Kháng thể còn được gọi là các globulin miễn dịch hay immunoglobulin, kí hiệu là Ig. Ig được sinh ra khi cơ thể bị kháng nguyên kích thích, chúng có khả năng kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên kích thích sinh ra chúng. Trong huyết thanh có nhiều thành phần là α, β,γ globulin và albumin, trong đó kháng thể chủ yếu là γ globulin. 1.2.1.4.2. Cấu trúc của kháng thể Kháng thể dịch thể đặc hiệu có nhiều lớp khác nhau: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD. Trong các lớp globulin miễn dịch có IgG chiếm khoảng 75 – 85% tổng số globulin miễn dịch của cơ thể. Chúng có cấu trúc gần giống nhau gồm chuỗi nặng và nhẹ, cấu trúc chuỗi nhẹ của các loại kháng thể này nói chung là như nhau, chúng chỉ có khác nhau ở chuỗi nặng. Hình 1.3 a Hình 1.3 b Hình 1.3 a Cấu trúc điển hình của một kháng thể 1.3 b Bề mặt của kháng thể IgG (Nguồn: Phân tử kháng thể được cấu tạo từ 4 chuỗi polypeptide, liên kết với nhau bằng cầu nối dissulfur (-s-s).trong đó có 2 chuỗi nặng H cũng giống hệt nhau và 2 chuỗi nhẹ L cũng giống hệt nhau. Chuỗi nhẹ (L): có 2 loại chuỗi kappa (k) và lambda (λ), do đó 2 chuỗi nhẹ của mỗi phân tử immunoglobulin chỉ có thể cùng к hoặc cùng λ. Chuỗi nhẹ có trọng lượng phân tử thấp 23000 Dalton, có 214 axit amin. Chuỗi nhẹ chia làm 2 vùng: (i) Vùng thay đổi VL (Variable Light): có đầu tận cùng NH2 từ axit amin đầu tiên đến axit amin 107. Trong vùng thay đổi có đoạn thay đổi mạnh nhất gọi là vùng siêu biến: (ii) Vùng hằng định C (Constant region): Có đầu tận cùng  –COOH, từ axit amin 108 – 214 trình tự sắp xếp các axit amin vùng này ít thay đổi. Chuỗi nặng H (Heavy chain): có trọng lượng phân tử 50000 Dalton, mỗi chuỗi nặng có khoảng 440 – 446 aa và chia làm 2 vùng: (i) Vùng thay đổi VH (Variable heavy) có khoảng 116 aa, trong đó có những đoạn rất rễ thay đổi (vùng siêu biến) như aa 31-37, 51-68, 86-91;(ii) Vùng hằng định CH (constant heavy) có khoảng 330 aa, được chia làm 3 vùng, mỗi vùng có 110 aa và kí hiệu là CH1, CH2, CH3. Hình 1.4. Sơ đồ các chuỗi của một kháng thể (Nguồn: Hai vùng thay đổi của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ nằm kề nhau tạo vị trí kết hợp với kháng nguyên. 1.2.1.4.3. Vai trò của kháng thể Khi một kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể thì phản ứng đáp ứng miễn dịch của cơ thể có vai trò bảo vệ cơ thể, trong đó các kháng thể được sinh ra có 3 chức năng chính. Vai trò của kháng thể là bảo vệ trong đó có 3 chức năng chính là: - Liên kết với kháng nguyên Các immunoglobulin có khả năng nhận diện và gắn một cách đặc hiệu với một kháng nguyên tương ứng nhờ các vùng biến đổi. Trong phản ứng chống đọc của vi khuẩn, kháng thể gắn với độc tố và qua đó trung hòa độc tố, ngăn ngừa bám dính của độc tố lên trên các thụ thể của tế bào. Như vậy, tế bào cơ thể tránh được các rối loạn do độc tố vi khuẩn gây ra (hình 1.5.) Hình 1.5. Các độc tố của vi khuẩn bên cạnh một tế bào cơ thể (Nguồn: Tương tự như vậy, nhiều virus và vi khuẩn chỉ gây bệnh khi bám vào được các tế bào cơ thể. Vi khuẩn sử dụng các phân tử bám dính là adhesine, còn virus sở hữu các protein cố định trên lớp vỏ ngoài. Các kháng thể kháng adhesine và kháng – protein capsid virus sẽ ngăn chặn các vi sinh vật này gắn vào các tế bào đích của chúng. Hoạt hoá bổ thể Hình 1.6.Các độc tố trên bị trung hòa bởi kháng thể (Nguồn: Một trong những cơ chế bảo vệ cơ thể của kháng thể là hoạt hóa bổ thể. Bổ thể là tập hợp các protein huyết tương khi được hoạt hóa sẽ giúp tiêu diệt các vi khuẩn xâm nhập hại vào cơ thể bằng cách: (1) đục các lỗ thủng trên vi khuẩn, (2) tạo điều kiện cho hiện tượng thực bào, (3) thanh lọc các phức hợp miễn dịch và (4) phóng thích các phân tử hóa hướng động. - Hoạt hoá các tế bào miễn dịch Sau khi gắn vào kháng nguyên ở vùng biến đổi (Fab), kháng thể có thể liên kết với các tế bào miễn dịch ở vùng hằng định (Fc). Những tương tác này có tầm quan trọng đặc biệt trong đáp ứng miễn dịch. Như vậy các kháng thể gắn với một vi khuẩn có thể kiên kết với một đại thực bào và khởi động hiện tượng đại thực bào. Các tế bào lympho NK (Natural Killer) có thể thực hiện chức năng độc tế bào và ly giải các vi khuẩn bị opsonine hóa bởi các kháng thể. 1.2.1.4.4.Quy lụât hình thành kháng thể dịch thể đặc hiệu Khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể, kháng thể chưa sinh ra ngay lập tức mà kháng thể chỉ xuất hiện sau 6 – 7 ngày sau đó, rồi sẽ tăng dần, đạt mức độ tối đa sau 2-3 tuần, sau đó từ từ giảm dần và biến mất sau vài tuần, vài tháng hoặc vài năm. Sau khi có kháng nguyên kích thích, các tế bào có thẩm quyền miễn dịch tiếp nhận kháng nguyên và phải mất một thời gian biệt hoá, phân chia thành tế bào sản xuất kháng thể, lúc đó mới có kháng thể xuất hiện, sớm nhấtlà IgM, tiếp sau đó là IgG. Nếu đưa kháng nguyên thêm một lần nữa vào cơ thể có tính chất nhắc nhở, thì thời gian xuất hiện kháng thể sẽ sớm hơn và kháng thể sinh ra cũng nhiều hơn, bởi vì khi bị kháng nguyên lần đầu kích thích một số tế bào có thẩm quyền miễn dịch đã biệt hoá trở thành tế bào tiếp nhận thông tin kháng nguyên, cất giữ lại và trở thành tế bào nhắc nhở miễn dịch. Khi kháng nguyên vào lần sau và tiếp xúc được với các tế bào này, chúng chỉ việc “nhớ lại” và sản xuất kháng thể. Đây là cơ sở của trí nhớ miễn dịch (Nguyễn Như Thanh, 1997) [10]. Sự hình thành và tồn tại kháng thể chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố, đặc biệt là đặc tính, bản chất của kháng nguyên kích thích khả năng đáp ứng miễn dịch của cơ thể và điều kiện ngoại cảnh của cơ thể đó tồn tại. 1.2.1.4.5. Phản ứng kháng nguyên – kháng thể Khi cho kháng nguyên tiếp xúc với kháng thể do kháng nguyên đã kích thích sinh ra chúng thì phản ứng kết hợp kháng nguyên kháng thể sẽ xảy ra một cách đặc hiệu. Phản ứng kháng nguyên – kháng thể là cơ sở để xây dựng những phương pháp, kĩ thuật miễn dịch học thường sử dụng trong mục đích y học như chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm, bệnh kí sinh trùng, kĩ thuật xét nghiệm y học, thú y học, sinh học như xác định, chẩn đoán một kháng nguyên định lượng hiệu giá kháng thể, phát hiện kháng nguyên, kháng thể hoặc các yếu tố khac có tham gia miễn dịch. Những kháng nguyên - kháng thể quan sát được như: quan sát kết tủa hay các phép định tính, định lượng kĩ thuật: kĩ thuật đo độ đục, kĩ thuật miễn dịch khuếch tán kép, kĩ thuật khuếch tán vòng…. Những phản ứng kháng nguyên - kháng thể khác không nhìn thấy được thì phải dùng các kĩ thuật đánh dấu phát hiện: Dùng enzyme gắn với kháng thể rồi cho kết hợp với kháng nguyên, sau đó dùng cơ chất hiện màu thích hợp để phát hiện đánh giá đo màu sử dụng quang phổ kế hoặc quang kế (máy đo mật độ quang học…). Phương pháp này gọi là phương pháp miễn dịch đánh dấu enzyme (phản ứng ELISA). Dùng thuốc nhuộm huỳnh quang để nhuộm kháng thể cho kết hợp với kháng nguyên (trực tiếp hay gián tiếp) và phát hiện phức hợp kháng nguyên – kháng thể bằng kính hiển vi huỳnh quang. Phương pháp này gọi là phương pháp miễn dịch huỳnh quang (FIA: Flourescen Immuno Assay). - Dùng các đồng vị phóng xạ để đánh dấu kháng thể, kháng nguyên rồi cho kết hợp kháng nguyên – kháng thể và đo mức phóng xạ. Phương pháp này được gọi là phương pháp miễn dịch phóng xạ (RIA: Radio Immuno Assay).[2]. 1.2.2. KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG 1.2.2.1. Vài nét lịch sử Một tiến bộ to lớn đã đạt được cuối năm 1970 bởi Cesar Milstein và Georges Kohler với kỹ thuật lai tế bào (hybrid) giữa một tế bào lympho B có khả năng sản xuất kháng thể với một tế bào ung thư có đời sống dài. Nhưng khi nói đến nền tảng của kỹ thuật này, chúng ta phải kể đến các công trình của Nossal và Lederberg (1958) về thuyết chọn lọc đơn dòng (một tế bào – một kháng thể), của Okada dùng virus Sendai để lai các tế bào (1958) và Barski (1960) vì sự liên hợp ngẫu nhiên của các tế bào. Năm 1975, Kohler và Milstein cho là có thể thu được kháng thể đơn dòng có tính đặc hiệu cao từ các dòng tế bào thường trực bằng cách lai tế bào ung thư tủy với tế bào sản xuất kháng thể. Các ông đã dùng tế bào lách của chuột đã được miễn dịch với hồng cầu cừu và lai với tế bào u tủy của chuột dòng P3- X63- Ag8 và dùng virus Sendai là chất tạo liên hợp.Tế bào lai thu được có khả năng sản xuất kháng thể chống hồng cầu cừu và có thể nuôi cấy dài ngày in vitro. Trong hơn 30 năm qua, kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng đã ảnh hưởng nhiều tới các lĩnh vực nghiên cứu khoa khác của miễn dịch học, vi sinh vật học, ký sinh trùng, sinh hóa, sinh lý, và sinh học tế bào. Cho đến nay người ta đã thu được nhiều kháng thể đơn dòng từ nhiều phương pháp sản xuất khác nhau, tuy nhiên về nguyên lý cơ bản các phương pháp này không khác nhau nhiều. Việc ứng dụng kháng thể đơn dòng trong thử nghiệm miễn dịch ngày càng nhiều và giúp cho chẩn đoán miễn dịch cũng như chẩn đoán lâm sàng có bước tiến bộ đáng kể. 1.2.2.2. khái niệm về kháng thể đơn dòng Khi một kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể sẽ được đại thực bào tiếp nhận phân chia thành các quyết định kháng nguyên (epitope). Một kháng nguyên có thể có một hay nhiều epitope. Các tế bào có thẩm quyền miễn dịch (tế bào lympho B và lympho T) khác nhau lại có phản ứng khác nhau với cùng một loại epitope và cho ra các loại kháng thể khác nhau. Cũng vì vậy, một loại kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể, đáp ứng miễn dịch của cơ thể sẽ sản xuất ra nhiều loại kháng thể khác nhau, được gọi là kháng thể đa dòng hay một họ kháng thể. Theo học thuyết “clon” thì mỗi tế bào lympho trong cơ thể có khả năng nhận diện một loại “quyết định kháng nguyên” và mỗi một loại “ quyết định kháng nguyên” sau khi nhận diện đều có thể kích thích tế bào lympho tăng sinh và biệt hoá thành dòng tế bào lympho có khả năng sinh ra kháng thể chống lại quyết định kháng nguyên tương ứng (hay kháng thể đơn đặc hiệu tương ứng). Như vậy, kháng thể đơn là một “clon” tế bào lympho sản xuất và tiết ra chống lại một loại quyết định kháng nguyên nhất định Hình 1.7. Các kháng thể đa dòng, mỗi kháng thể liên kết với một epitope khác nhau Hình 1.8. Kháng thể đơn dòng, liên kết với epitope đặc hiệu (Nguồn: 1.2.2.3. Ứng dụng của kháng thể đơn dòng Hiện nay, ứng dụng của kháng thể đơn dòng (KTĐD) rất đa dạng. So với kháng thể đa dòng thì KTĐD có tính đặc hiệu (quyết định sự chọn lọc) và ái lực của kháng nguyên – kháng thể (quyết định độ nhạy) rất cao. Vì thế khả năng ứng dụng của KTĐD cũng đa dạng hơn nhiều so với kháng thể đa dòng. Một vài ví dụ về ứng dụng của KTĐD là: Xác định mức hormone trong máu, nước tiểu, nước bọt để chẩn đoán các bệnh liên quan đến nội tiết như định lượng các nội tiết như LH, FSH, AFP, Progesteron, Oestrogen….có thể chẩn đoán được khối u qua việc xác định hàm lượng hormone và đánh giá hoạt động của tuyến nội tiết hoặc hoạt động của các protein đặc hiệu cho sự hình thành khối u. Ví dụ như: Hàm lượng α – fetoprotein tăng cao đột biến ở bệnh nhân ung thư gan, hàm lượng PSA (prostate specific antigen) cũng tăng cao bất thường ở người bị ung thư tiền liệt tuyến, hoặc protein HCG (Human chorionic gonadotropin) có mặt ở nhiều bệnh nhân ung thư khác, virus gây ung thư họng, hầu tủy, tủy… Xác định các type vi khuẩn, virus, nấm gây bệnh, gây dịch cho người, động vật và thực vật. Phát hiện các thuốc bị cấm (doping, ma túy…) các chất độc đối với cơ quan trong cơ thể trong lương thực thực phẩm. Nghiên cứu dược động học của thuốc. Ức chế phản ứng loại thải mảnh ghép: sau khi ghép mổ, ghép cơ quan, người ta cần phải uống thuốc chống đào thải và kèm theo đó là ức chế hệ miễn dịch, làm cho hệ thống phòng ngự của cơ thể yếu đi, rất dễ bị nhiễm khuẩn kế phát. Với KTĐD, khi đưa vào cơ thể chúng chỉ ức chế các yếu tố gây hiện tượng đào thải mảnh ghép mà không ức chế hệ thống miễn dịch của cơ thể vì vậy mà hệ thống miễn dịch của cơ thể không bị suy giảm. Ngoài ra, KTĐD hiệu quả hơn các loại dược phẩm thông thường trong việc điều trị bệnh, do các dược phẩm tấn công không chỉ với mầm bệnh với các tế bào bình thường trong cơ thể. Do đó, dược phẩm thông thường hay gây phản ứng phụ như buồn nôn, dị ứng…còn KTĐD chỉ tấn công vào phần tử mục tiêu mầm bệnh do đó không gây nên phản ứng phụ hay phản ứng phụ không đáng kể. ( Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1. Động vật thí nghiệm Chuột nhắt trắng dòng BALB/c được nuôi trong điều kiện tiêu chuẩn ở khu chăn nuôi của Viện Công nghệ sinh học. 2.1.2. Dòng tế bào ung thư tủy (Myeloma) của người Dòng Sp2/0 – Ag14 (gọi tắt là Sp2/0) và dòng P3X – Ag18 (gọi tắt là P3X) nhận từ ngân hàng tế bào ATCC của Hoa Kỳ (American Type Culture Collection). 2.1.3. Thiết bị thí nghiệm - Tủ nuôi tế bào (Sanyo, Nhật Bản) có điều hoà nhiệt độ và CO2 tự động - Tủ cấy vô trùng sử dụng đèn cực tím và màng lọc 0,25μm (Microflow, Anh). - Chai lọ nuôi cấy, pipet các loại của costar và corning, ống falcon - Kính hiển vi soi ngược (Olympus, Nhật) với độ phóng đại 5- 20 x 20 - Buồng đếm tế bào phản quang (Fisher, Hoa Kỳ). - Máy đo ELISA (Thermo labsytem, Đức). - Máy ly tâm lạnh (Hermje, Đức). - Tủ lạnh thường và tủ lạnh sâu các loại. - Bình nito lỏng để cất giữ tế bào (Gold Eagle, Trung Quốc). 2.1.4. Hóa chất thí nghiệm - Môi trường nuôi cấy các loại (GIBCO, Hoa Kỳ) DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium). - RPMI 1640. FBS (Fetal Bovine Serum). 10% HAT (Hypoxanthine aminoterin thymidine) medium. HT (Hypoxanthine thymidine) medium. Sodium bicacbonat 0,6% (stock:0,75%) L – glutamin 1% - Hoá chất thí nghiệm: Cồn tuyệt đối dùng 90o để đốt khử trùng Sodium pyruvat 1%. PEG (Polyethylene glycol – singma, Hoa Kỳ). IFA (Incomplete Freund’s Adjuvant – Sig, Hoa Kỳ). Các hóa chất thông thường khác được mua từ các hãng Sigma (Hoa kỳ), Fisher (Hòa Kỳ), Merck (Đức), Trung Quốc v..v.. - Kháng nguyên FSH mua từ hãng CALBIOTECH (Hoa Kỳ) 2.1.5 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian từ 23/ 02 /2011 đến 22/ 05/ 2011 tại phòng thử nghiệm sinh học – Viện Công Nghệ Sinh Học, Viện khoa Học Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy Hà Nội. 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Nghiên cứu và tìm điều kiện tối ưu để gây miễn dịch hiệu quả trên chuột BALB/c bằng AFP. - Nhân nuôi và phát triển tế bào myeloma dòng Sp2/0 và P3X để sử dụng cho quá trình lai với tế bào lympho B. - Nghiên cứu và xác lập quy trình lai tạo dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng kháng AFP. - Nghiên cứu điều kiện tách dòng hiệu quả để thu được 1-2 dòng tế bào lai sinh sản hiệu quả kháng thể đơn dòng kháng AFP. - Kiểm tra một số đặc tính quan trọng của kháng thể đơn dòng thu được như độ đặc hiệu, hiệu giá kháng thể..v.v. 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn dòng và việc tìm ra liều lượng kháng nguyên thích hợp để gây được đáp ứng miễn dịch cho chuột là rất quan trọng. Đây là tiền đề cho việc thu nhận tế bào lympho B sản sinh kháng thể đơn dòng sau này. Trong thí nghiệm nghiên cứu của chúng tôi, có 6 chuột cái BALB/c 6 tuần tuổi được chia làm ba lô thí nghiệm và gây miễn dịch với liều lượng kháng nguyên AFP khác nhau: Lô số 1 gồm chuột số 1.1 và 1.2 sử dụng liều lượng 1,25 mg/con/lần Lô số 2 gồm chuột số 2.1 và 2.2 sử dụng liều lượng 2,5 mg/con/lần Lô số 3 gồm chuột số 3.1 và 3.2 sử dụng liều lượng 5 mg/con/lần Sau khi những con chuột này được tiêm kháng nguyên để gây đáp ứng miễn dịch, lại tiếp tục được đem nuôi trong điều kiện bình thường để phục vụ cho những thí nghiệm tiếp theo. Sơ đồ quy trình sản xuất kháng thể đơn dòng Kháng nguyên X Dung hợp tế bào Đại thực bào Tế bào Lympho B mẫn cảm kháng nguyên Tế bào Myeloma Động vật thí nghiệm Quần thể tế bào lai Kháng thể đơn dòng kháng nguyên X Dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng Một tế bào lai sinh kháng thể kháng kháng nguyên X Tiêm chủng Cloning Chọn lọc dòng tế bào Nhân invitro Tách chiết 2.3.1.Gây miễn dịch cho chuột Theo phương pháp của Milstenin và Kohler đưa ra năm 1975, có cải tiến. Trộn kháng nguyên AFP với một dung lượng cùng thể tích của tá dược CFA có tác dụng làm tăng hoạt tính kháng nguyên và kích thích hệ thống miễn dịch. Lượng kháng nguyên AFP được pha chế ở nồng độ cao sao cho thể tích tiêm cho mỗi chuột mỗi làn là 0,2ml. Ban đầu chuột cái BALB/c (6 tuần tuổi) được tiêm dưới da ở 4 vị trí dọc theo lưng. Chuột được tiêm nhắc lại vào dưới da bụng với cùng một lượng kháng nguyên trộn với cùng thể tích IFA để có nồng độ tiêm cho mỗi chuột trên là 0,2 ml vào tuần thứ 2 và thứ 4 sau lần tiêm thứ nhất. Các mẫu máu được lấy từ tĩnh mạch đuôi hoặc hốc mắt, tách huyết mạch để theo dõi hình thành kháng thể ELISA. Chuột được tiêm lần cuối cùng với một số lượng kháng nguyên AFP trong 0,1ml dung dịch nước sinh lý không trộn với tá dược vào tĩnh mạch đuôi lúc 3-4 ngày trước khi lấy tế bào lách dung hợp với tế bào myeloma. 2.3.2.Phương pháp lấy đại thực bào Theo phương pháp của Oliver JP.Leger và Jose. Wsaldanha, 2000. Giết chuột, khử trùng chuột trong cồn 700 Tiêm vào xoang bụng 3ml đung dịch PBS Dùng bơm tiêm hút dung dịch trong xoang bụng ra, đưa vào ống ly tâm. Lặp lại như trên 3 lần. Dịch hút ra từ xoang bụng có chứa tế bào được kiểm tra dưới kính hiển vi. Cho dịch tế bào li tâm ở tốc độ 1000 vòng/phút trong 5 phút. Sau ly tâm, hút bỏ dịch nổi, hòa lại cặn tế bào với 10 ml dung dịch PBS. Lặp lại bước rửa tế bào 3 lần. Lần cuối cùng cặn tế bào được hòa trong 1 ml DMEM có FBS 10% Đếm tế bào, pha điều chỉnh sao cho dịch tế bào có mật độ cần thiết là 103 tế bào/ml, trong môi trường DMEB 10% FBS. 2.3.3.Phương pháp đếm tế bào 2.3.3.1. Chuẩn bị Trypan blue 0,4% - Trypan blue: 0,1g - Màng lọc Millipore : 0,45µl Lấy 25ml NaCl 0,85% hòa tan 0,1g Trypan blue, cho dung dịch qua màng lọc Millipore được trypan blue 0,4% 2.3.3.2. Đếm tế bào Dung dịch tế bào được li tâm, hút hết dịch nổi hòa cặn vào 1 ml dung dịch môi trường.Dùng Pipet hút 100µl dung dịch tế bào với 100µl Trypan blue. Các tế bào chết có màu xanh, tế bào sống không bắt màu. Đưa vào dung dịch tế bào đã trộn với Trypan blue vào buồng đếm. Trừ những tế bào nằm trên 2 cạnh của ô vuông, đếm tế bào sống có trong 8 ô. Tính tế bào trung bình của 8 ô sẽ được số tế bào trung bình trong 1 ô. Số tế bào được tính theo WHO: N= m x tb x V x 104 Trong đó: N: số lượng tế bào/ml m: số tế bào trung bình của 8 ô tb: độ pha loãng V: Tổng thể tích trong buồng đếm 2.3.4. Phương pháp lấy tế bào LymphoB của tế bào chuột Theo phương pháp của Oliver JP.Leger và Jose. Wsaldanha Giết chuột đã được gây miễn dịch bằng kháng nguyên AFP, khử trùng chuột bằng cồn 700. Tách lấy thùy lách và các hạch vào đĩa petri có sẵn 10ml dung dịch PBS. Dùng kéo cắt lách và các hạch thành từng mảnh nhỏ, dùng kẹp gạt nhẹ để các tế bào rời nhau ra. Chuyển hỗn hợp tế bào sang ống ly tâm, dùng pipet pasteur hút lên, đẩy xuống cho cụm tế bào rời nhau ra. Để dung dịch lắng cặn, hút lấy dung dịch tế bào sang một ống ly tâm khác. Ly tâm dung dịch tế bào ở tốc độ 1000 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó loại bỏ hết dung dịch nổi và hòa cặn tế bào trong 10 ml dung dịch PBS. Lặp lại thao tác này 3 lần, lần cuối cùng hòa cặn tế bào với DMEM với bổ sung 10% FBS sao cho có mật độ tế bào 108 tế bào/ml. 2.3.5 Nuôi cấy tế bào Myeloma dòng Sp 2/0 và P3X 2.3.5.1. Đánh thức và nhân nuôi tế bào Sp 2/0 và P3X Chuyển ống tế bào từ trong Nito lỏng vào cốc nước có nhiệt độ 36- 370 C. Khi dung dịch bên trong ống cất đã tan đá hoàn toàn, lau khử trùng phía ngoài bằng cồn 700. Chuyển dung dịch bên trong ống sang một ống ly tâm, tiến hành ly tâm với tốc độ 1000 vòng/phút trong 5 phút. Gạn bỏ lớp dung dịch nổi chứa DMSO. Hòa tan cặn tế bào bằng môi trường nuôi cấy rồi chuyển tế bào sang chai nuôi cấy thích hợp. Sau đó để chai nuối cấy vào tủ ấm 370 C, 5% CO2. Sau khi tế bào được đánh thức thành công, phát triển bình thường, không bị nhiễm khuẩn, nhân nuôi để đạt lượng tế bào cần thiết 104 – 105 tế bào/ml môi trường nuôi cấy trung bình sau 2- 3 ngày môi trường phải được thay mới. Vì lúc này pH và chất dinh dưỡng cần cho sự phát triển tế bào đã thay đổi. Nếu môi trường không được thay đúng lúc, tế bào sẽ bị chết. Để thay đổi môi trường trước hêt cần lya tâm, hút bỏ môi trường cũ, tiếp đó đưa từ 5-7 ml môi trường nuôi cấy phù hợp. Để tủ ấm 370C, 5% CO2 và tiếp tục nuôi. 2.3.5.2. Bảo quản tế bào trong Nito lỏng Chọn chai tế bào khỏe, tỷ lệ sống trên 95%, không bị nhiễm tạp nấm, vi khuẩn. Đổ bỏ môi trường cũ thay vào đó là môi trường mới, dùng pipet hút lên đẩy xuống nhẹ nhàng cho tế bào rời đều trong môi trường. Hút dung dịch tế bào sang ống li tâm, ly tâm ở 1000 vòng/phút trong 5 phút. Gạn bỏ dịch nổi, hòa cặn vào tế bào môi trường 10% FBS và 5% DMSO, cho dung dịch này vào ống cất. Tiến hành làm lạnh từ từ cho tới khi đạt được -250C thì đưa nhanh ống cất vào lạnh -700C, sau 20h chuyển vào bình Nito lỏng. 2.3.6. Dung hợp Tế bào và tách dòng 2.3.6.1. Dung hợp Hỗn hợp dịch tế bào Lympho B (nồng độ 106/ml) được đưa vào phối hợp với tế bào Myeloma dòng Sp 2/0 và P3X. Sau đó cho thêm vào 1 ml PEG khuấy trong một phút, 5 phút sau thêm vào 3,5ml môi trường huyết thanh có bổ sung HAT và ủ qua đêm ở 370C, 5% CO2, ly tâm hỗn dịch tế bào, hòa cặn vào 30 ml môi trường huyết thanh có bổ sung HAT và phân phối vào các giếng của đĩa nhựa Falcon 0,1 ml. Sau dung hợp từ 5- 7 ngày thêm vào mỗi giếng 0,1 ml môi trường huyết thanh có bổ sung HAT. Sau 10 ngày dung hợp lấy dịch nổi và dùng phản ứng ELISA để phát hiện kháng thể mong muốn. Sau đó chọn tế bào từ các giếng có hiệu giá có kháng thể cao để tách dòng. 2.3.6.2. Tách dòng Sau khi kiểm tra khả năng tạo kháng thể bằng ELISA, ta biết được giếng nào có kháng thể, tuy nhiên đây là kháng thể đa dòng do nhiều dòng tế bào lai tạo thành. Để có kháng thê đơn dòng ta phải tiến hành tách dòng như sau: - Chọn 1 giếng mà dịch nổi có hiệu giá kháng thể cao nhất trộn đều các tế bào trong giếng đã chọn thành hỗn dịch tế bào thuần nhất. Hút hỗn dịch tế bào sang ống ly tâm có chứa môi trường phát triển để pha loãng tế bào sao cho nồng độ chỉ đạt 1 tế bào/100µl. - Chuyển tế bào đã pha loãng sang nuôi trong các giếng đã có tế bào nuôi, sau đó chuyển vào nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện tiêu chuẩn. - Sau khi tế bào phát triển tốt(gần kín đáy), kiểm tra lai hiệu giá kháng thể. Chọn ra giếng có hiệu giá kháng thể cao nhất nhân lên với lượng lớn để bảo quản hoặc tiêm vào ổ bụng chuột, thu dịch báng. 2.3.7.Phương pháp ELISA * Nguyên lý: Dùng kháng thể( kháng thể 1) liên kết với kháng nguyên sau đó liên kết với kháng thể 2- gắn enzyme, tiếp đó cho cơ chất vào, cơ chất sẽ bị enzyme tác động tạo nên màu( do enzyme phân hủy cơ chất). * Phản ứng ELISA gián tiếp gồm các bước sau: 1- Phủ bản bằng 100µl kháng nguyên Myelona trong coating buffer ở 400C qua đêm( nồng đọ khoảng 125 ng KN/giếng) kháng nguyên AFP sẽ gắn cố định trên bè mặt của bản. Rửa bản 5 lần bằng washing buffer để loại bỏ những kháng nguyên không gắn vào bề mặt bản. Che chắn bằng 300µl washing buffer + 1% skim milk trong 1h ở 370C. Rửa bản 5 lần bằng washing buffer 2- Bổ sung kháng thể 1( dịch nổi của môi trường nuôi cấy ) đã pha loãng 5000 lần bằng washing buffer + 1% sữa. Ủ ở 370C trong 1h. Rửa bản 5 lần bằng washing buffer lạo bỏ khán thể không liên kêt đặc hiệu với kháng nguyên. 3- Đưa vào mỗi giếng 100µl kháng thể 2 gắn enzyme peroxirase được pha loãng 10000 lần trong đệm washing buffer + 1% sữa. Đem ủ 370C trong 1h. Rửa bản 10 lần bằng washing buffer. 4- Đưa vào mỗi giếng 100µl dung dịch cơ chất TMB. Ủ bản ở 370C trong 10 phút. 5- Dừng phản ứng bằng cách bổ sung 50µl H2SO4 1N. 6- Đo giá trị OD450( độ quang học) bằng ELISA reader. Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ GÂY ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH TRÊN CHUỘT BẰNG KHÁNG NGUYÊN AFP Sau khi tiến hành nghiên cứu gây đáp miễn dịch trên chuột bằng kháng nguyên AFP, chúng tôi tiến hành lấy mẫu máu của từng chuột thí nghiệm và tách huyết thanh để thực hiện phương pháp ELISA gián tiếp. Để tiến hành phản ứng ELISA gián tiếp cần phải có 4 yếu tố là kháng nguyên đã biết, kháng thể 1 cần kiểm tra, kháng thể 2 gắn enzyme và cơ chất hiện màu. Trong thí nghiệm được thực hiện, chúng tôi sử dụng cơ chất là TMB, enzym gắn kháng thể là peroxydase. Khi cơ chất và enzyme gặp nhau thì ứng sinh màu xanh da trời, màu vàng xuất hiện khi dừng phản ứng bằng H2SO4. Kết quả của phản ứng ELISA (giá trị mật độ quang học OD) được đo ở bước sóng 450 nm bằng máy Microplate Reader (Biorad) nhằm kiểm tra sự có mặt của kháng thể kháng đặc hiệu kháng nguyên AFP. Kết quả phản ứng ELISA xác định tương đối hàm lượng kháng thể kháng AFP trong huyết thanh được trình bày ở bảng 3.1 và hình 3.1 Chuột thí nghiệm Chuột số 1.1 Chuột số 1.2 Chuột số 2.1 Chuột số 2.2 Chuột số 3.1 Chuột số 3.2 ĐC âm Giá trị OD 1,749 1,815 2,405 2,305 2,746 2,805 0,534 1,681 1,886 2,341 2,241 2,638 2,857 0,593 1,692 1,783 2,309 2,209 2,709 2,791 0,576 OD tbình 1,707 1,828 2,352 2,252 2,698 2,818 0,567 ±0,037 ±0,053 ±0,049 ±0,049 ±0,055 ±0,035 ±0,031 Bảng 3.1. Kết quả gây đáp ứng miễn dịch cho chuột với kháng nguyên AFP Ghi chú: Đối chứng âm là BSA - bovine serume albumin 1% Biểu đồ 3.1. Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của các chuột thí nghiệm bằng phương pháp ELISA Kết quả từ bảng 3.1 và hình 3.1 cho thấy: Cả 6 chuột thí nghiệm đều có ĐƯMD tốt khi tiêm kháng nguyên AFP, tuy nhiên sự đáp ứng có khác nhau. Chuột số 1.1 và 1.2 có giá trị OD thấp nhất trong 3 lô chuột thí nghiệm tương ứng với ĐƯMD thấp nhất. Trong đó, chuột số 1.1 có OD trung bình là 1,707 và chuột số 1.2 có OD trung bình là 1,828 tương ứng với liều kháng nguyên 1,25 mg kháng nguyên/con/lần. Kết quả phản ứng ELISA của hai chuột 2.1 và 2.2 có giá trị OD lần lượt là 2,352 và 2,252, cao hơn so với hai chuột ở lô 1 nhưng lại thấp hơn so với lô 3. Như vậy, ĐƯMD ở chuột lô 2 tốt hơn so với lô 1 nhưng lại kém hơn so với chuột ở lô 3. Hai chuột 3.1 và 3.2 cho giá trị OD cao nhất lần lượt là 2,698 và 2,818 tức là lượng kháng thể có trong huyết thanh nhiều nhất. Điều này cũng đồng nghĩa với việc 2 chuột ở lô 3 có khả năng đáp ứng miễn dịch tốt nhất. Như vậy liều 5 mg kháng nguyên AFP/con/lần là phù hợp và tạo được đáp ứng miễn dịch tốt nhất ở chuột thí nghiệm. Bước nghiên cứu này là cơ bản nhưng hết sức quan trọng. Vì cơ thể nào tiết ra nhiều kháng thể khi một kháng nguyên lạ xâm nhập có nghĩa là hệ miễn dịch có xảy ra sự đáp ứng miễn dịch, các tế bào lympho hoạt động tốt, có sức sống cao. Căn cứ vào đó chúng tôi chọn ra được các cá thể có đáp ứng miễn dịch tốt nhất, các tế bào lympho có chất lượng cao để tách lấy tế bào lympho phục vụ cho việc lai tế bào sau này. Từ các kết quả và nhận xét trên đây có thể rút ra kết luận là đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên AFP phụ thuộc nhiều vào: Liều lượng kháng nguyên đưa vào cơ thể Từng cá thể khác nhau sẽ cho đáp ứng miễn dịch khác nhau với cùng tmột liều lượng kháng nguyên Sau những kết quả kiểm tra bằng ELISA ở bước đầu tiên, hai chuột 3.1 và 3.2 được lựa chọn để thu tế bào lympho B dùng cho dung hợp với tế bào Myeloma. 3.2. KẾT QUẢ DUNG HỢP TẠO TẾ BÀO LAI SINH KHÁNG THỂ KHÁNG AFP Dung hợp tế bào lympho B và tế bào myeloma là quá trình quan trọng trong sản xuất kháng thể đơn dòng. Để quá trình dung hợp tạo tế bào lai diễn ra thuận lợi và đạt kết quả cao cần có 2 loại tế bào chủ yếu là tế bào Meyloma và tế bào lympho B. Ngoài ra cần bổ sung các yếu tố thúc đẩy quá trình dung hợp như: tế bào đại thực bào, PBS, polyethylenglycol (PEG). Trong đó, tế bào đại thực bào sinh Interleukin có tác dụng kích thích tế bào lai phát triển. PEG là một chất có trọng lượng phân tử 4000 Dalton, có tác dụng làm thay đổi màng tế bào để tế bào kết hợp với nhau dễ hơn. FBS là thành phần cung cấp nhiều chất dinh dưỡng quan trọng cho tế bào như các amino axit, tiền chất của axit nucleic, các yếu tố sinh trưởng v.v. Tế bào Myeloma dòng Sp2/0, P3X: là tế bào ung thư tủy của chuột dòng BALB/c. Ở điều kiện nuôi cấy in vitro thích hợp, tế bào sinh sản và phát triển rất nhanh, có thể đạt nồng độ gấp 5 lần chỉ trong khoảng thời gian 30 giờ. Vì vậy, chúng đòi hỏi nguồn dinh dưỡng lớn từ môi trường. Để có được tế bào Myeloma khỏe mạnh và sẵn sàng cho việc dung hợp tế bào, chúng tôi thấy môi trường có bổ sung 10% FBS (Fetal Bovine Serum) là phù hợp. Và môi trường nuôi cấy cần được tiến hành thay thường xuyên 3 ngày một lần là điều kiện thích hợp cho tế bào. Tế bào lympho B mẫn cảm kháng nguyên AFP: Là những tế bào Lympho B đã mẫn cảm, thu từ lách chuột số 3.1 và 3.2 khi chuột được gây miễn dịch bằng kháng nguyên AFP với liều 5 µg AFP/con/lần. Tế bào lympho B sau khi thu được của mỗi chuột đem chia làm 2 phần theo đó 1 phần đem lai với tế bào Sp2/0, 1 phần đem lai với tế bào P3X. Chúng tôi sử dụng 3 đĩa 96 giếng để lai tế bào lympho B với mỗi loại tế bào Myeloma nên sẽ có tổng là 6 đĩa Hình 3.1 Hình ảnh tế bào Sp2/0 và P3X, độ phóng đại 10x20 Dung hợp tế bào lai được thực hiện theo quy trình như đã trình bày ở phương pháp. Tế bào sau dung hợp được nuôi trên 6 đĩa nhựa 96 giếng của Corning (tổng số là 576 giếng). Sau 5- 7 ngày dung hợp, chúng tôi tiến hành sàng lọc tế bào bằng môi trường chọn lọc HAT và HT để thu được tế bào lai (Hybrioma). Vì thế, tế bào Myeloma không có enzyme HPRT (Hypoxanthin – phospho – ribosyl – transferase) dẫn đến không tổng hợp được ADN. Vì vậy, khi môi trường có HAT và HT, tế bào myeloma sẽ không tổng hợp được ADN do bazơ cung cấp cho quá trình tổng hợp ADN ở dạng liên kết nên đòi hỏi phải có enzyme để thủy phẩn liên kết này. Như thế, tế bào myeloma sẽ chết sau vài ngày. Tế bào lympho B vẫn phát triển bình thường trong môi trường HAT do nó có enzyme HPRT nhưng tế bào lympho B cũng chết sau 1-2 ngày vì không tiếp tục sinh sản. Do đó, chỉ các tế bào lai (vì nó có một mặt tiếp thu khả năng sinh sản của tế bào myeloma, một mặt nó tiếp thu được enzyme HPRT của tế bào lympho B). Hình 3.2. Tế bào Lympho B và tế bào Sp2/0 dung hợp và phát triển trên nền tế bào feeder, độ phóng đại 10×20 Sau 15 ngày nuôi cấy (sau khi dung hợp và đã chọn lọc bằng môi trường HAT và HT), chúng tôi tiến hành kiểm tra toàn bộ số giếng dưới kính hiển vi soi ngược với độ phóng đại 10 x 20 và đánh dấu những giếng có tế bào lai. Tiếp theo, các giếng có tế bào lai được thu nhận dịch nổi để kiểm tra sự có mặt của kháng thể kháng AFP bằng phương pháp ELISA gián tiếp. Kết quả thu được về tỷ lệ giếng có tế bào lai dương tính trên tổng số giếng thu được về tế bào lympho B của chuột với 2 dòng tế bào Sp2/0 và P3X được trình bày tóm tắt ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Kết quả dung hợp tạo tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng kháng AFP trên 2 dòng tế bào myeloma Chuột Chuột số 3.1 Chuột số 3.2 Tổng số Các chỉ số thí nghiệm P3X Sp 2/0 P3X Sp2/0 P3X Sp2/0 Số giếng thực hiện dung hợp tế bào 144 144 144 144 288 288 Số giếng có tế bào lai 89 103 94 107 183 210 Tỷ lệ % giếng có tế bào lai 61,81% 71,53% 65,28% 74,31% 63,54% 72,92% Số giếng có kháng thể 67 76 74 81 141 157 Tỷ lệ % giếng có tế bào lai sinh kháng thể 46,53% 52,78% 53,39% 56,25% 48,96% 54,51% Kết quả từ bảng trên cho thấy cả hai chuột khi lai với dòng Sp2/0 đều cho hiệu quả lai cao hơn, tỷ lệ phần trăm số giếng có tế bào lai lần lượt là 74,34% và 71,53% so với tỷ lệ số giếng có tế bào lai của dòng P3X là 61,81% và 65,28%. Sau khi thu dịch nổi và kiểm tra bằng phản ứng ELISA, chúng tôi nhận thấy trong số các giếng có kết quả dương tính với AFP, tỷ lệ số giếng có tế bào lai sinh kháng thể của dòng Sp2/0 cũng cao hơn so với dòng P3X. Trong tổng số 288 giếng thí nghiệm của mỗi dòng tế bào, số giếng có tế bào lai sinh kháng thể của dòng Sp2/0 chiếm 54,51% còn dòng P3X chỉ chiếm 48,96%. Từ đó ta có thể rút ra kết luận dòng tế bào u tuỷ Sp2/0 cho hiệu quả lai cao hơn và tế bào lai có khả năng sinh kháng thể tốt hơn. Từ kết quả kiểm tra ELISA, giếng có giá trị OD cao nhất được lựa chọn để thu nhận, làm sạch dòng bằng phương pháp pha loãng tới hạn. Sau khi tiến hành tách dòng bằng phương pháp pha loãng tới hạn, 09 dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng kháng AFP tốt nhất kí hiệu AFP_1 đến AFP_9 tương ứng với 9 giếng có giá trị OD cao nhất nằm trong khoảng từ 2,10 đến 2,801 đã được lựa chọn. Các dòng nói trên được nhân nuôi ở cấp độ lớn hơn. Tuy nhiên, trong quá trình nhân nuôi, 5 dòng tế bào lai AFP_2, AFP _1, AFP_5, AFP_6, và AFP_9 đã chứng minh khả năng sinh kháng thể với hiệu suất tốt hơn hẳn 4 dòng còn lại. Vì vậy, 05 dòng trên được lựa chọn nhân nuôi để thu kháng thể đơn dòng nhằm tiếp tục quá trình sàng lọc khi kiểm tra tính đặc hiệu trên các kháng nguyên khác nhau. 3.3. KẾT QUẢ TÁCH DÒNG TẾ BÀO LAI SINH KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG AFP Sau khi kiểm tra bằng ELISA sẽ biết được những giếng nào là có tế bào lai sinh kháng thể. Vì nhận thấy tế bào lai của dòng Sp2/0 có khả năng sinh kháng thể tốt hơn nên chúng tôi chọn lấy các giếng có chứa các tế bào đó để phục vụ cho những bước nghiên cứu tiếp theo. Trong mỗi giếng mật độ tế bào khá cao, kháng thể sinh ra vẫn là kháng thể đa dòng. Các quần thể tế bào dương tính cần được tách dòng để sản xuất ra một loại kháng thể đặc hiệu. Hơn nữa, việc tách dòng nhanh còn để tách các tế bào dương tính ra khỏi sự phát triển quá mạnh của các tế bào lai không sản xuất kháng thể. Vì vậy cần tiến hành tách dòng để tạo ra các dòng tế bào riêng rẽ sau đó chúng nhân lên và sản xuất kháng thể. Phương pháp thường được sử dụng là tách dòng bằng pha loãng tới hạn. Với nhận định như trên, chúng tôi chọn giếng A5 của đĩa 5 (lai với dòng Sp2/0) là giếng có giá trị OD cao nhất (OD = 2,35) trong phản ứng ELISA đồng nghĩa với việc là giếng có tế bào sản xuất kháng thể tốt nhất, pha loãng để đạt được nồng độ là 1tb/100 ml môi trường/giếng. Pha loãng bằng môi trường nuôi cấy, sau đó chia ra 3 đĩa 96 giếng sao cho đạt nồng độ tế bào như mong muốn. Để kiểm tra hiệu quả tách dòng chúng tôi soi trên kính hiển vi, kết quả được tổng hợp ở bảng sau: Bảng 3.3. Tổng hợp kết quả tách dòng để chọn dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng kháng AFP Số clone/giếng Đĩa thí nghiệm 0 clone/giếng 1 clone/giếng ≥ 2 clone/giếng Đĩa 1 25/96 54/96 17/96 Đĩa 2 22/96 59/96 15/96 Đĩa 3 15/96 62/96 19/96 Tổng số 62/288 175/288 51/288 Hiệu quả 21,53% 60,76% 17,71% Kết quả tách dòng cho các giếng như sau: Tổng số giếng không có cụm tế bào nào ở cả 3 đĩa chiếm 21,53% Giếng có hơn 2 cụm tế bào trở lên chiếm 17,71% Số giếng có 1 cụm tế bào chiếm tỷ lệ cao nhất. Trên đĩa 1 số giếng có một dòng tế bào là 54/96 giếng, ở đĩa 2 là 59/96 giếng, đĩa 3 là 62/96 giếng. Như vậy trong tổng số 288 giếng thí nghiệm, có 175/288 giếng có 1clone, hiệu quả tách dòng đạt 60,76%. Hình 3.3. Các cụm tế bào lai (clone) đang phát triển, độ phóng đại 10×20 và 10×10 Sau khi đã xác đinh được các giếng có 1 clone ở mỗi đĩa, tiếp tục nuôi cấy tế bào trong điều kiện phù hợp để các clone có thể nhân lên, phát triển thành một cụm tế bào lớn và sản sinh kháng thể. Trong quá trình nuôi cấy có những tế bào có sức sống yếu không thể phát triển thành cụm tế bào hoặc có thể bị chết. Để xác định các giếng chứa một dòng tế bào đó có sản sinh kháng thể hay không chúng tôi sử dụng phương pháp ELISA gián tiếp. Trong kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng, phương pháp ELISA thường được dùng nhiều vì nó dễ thực hiện, có độ nhạy cao và có thể kiểm tra được một lượng mẫu lớn trong cùng một thời gian. Thu dịch nổi của môi trường nuôi cấy làm phản ứng ELISA, mỗi giếng được kiểm tra với độ lặp lại là 3 lần sau đó đo OD để ước lượng tương đối lượng kháng thể trong dịch nổi ở mỗi giếng của một dòng tế bào. Giá trị OD phản ánh nồng độ kháng thể có trong dịch nổi. Giá trị OD cao tức là lượng kháng thể nhiều, chứng tỏ dòng tế bào đó có khả năng sản xuất kháng thể tốt và ngược lại. Trong phản ứng ELISA giếng đối chứng dương chúng tôi sử dụng huyết thanh của chuột số 3.1. Giếng đối chứng âm chỉ sử dụng BSA 1%. Khi kiểm tra dịch nổi của 175 giếng có 1 clone tế bào duy nhất, chúng tôi nhận thấy chỉ có 30 giếng có kháng thể được sinh ra, thể hiện ở giá trị OD cao hơn đối chứng âm. Như vậy chỉ có 30 clone tế bào sản xuất kháng thể kháng lại AFP. Đây chính là kháng thể đơn dòng được tạo ra từ 1 tế bào ban đầu mà chúng ta mong muốn. Kết quả tách dòng với 30 giếng có phản ứng dương tính cho thấy sự có mặt của kháng thể kháng AFP được trình bày ở bảng sau: Bảng 3.4. Giá trị OD của dịch nổi các giếng có 1 dòng tế bào dương tính STT Giếng Đĩa Giá trị OD OD Trung bình Sai số 1 A1 1 1.625 1.651 1.598 1.625 ±0.027 2 A10 1 0.803 0.695 0.739 0.739 ±0.056 3 B3 1 1.378 1.358 1.295 1.344 ±0.043 4 B5 1 0.698 0.669 0.726 0.698 ±0.029 5 B9 1 1.544 1.576 1.503 1.541 ±0.037 6 E2 1 1.207 1.350 1.292 1.283 ±0.072 7 E5 1 2.509 2.516 2.485 2.503 ±0.016 8 E10 1 0.892 0.906 0.885 0.894 ±0.011 9 F2 1 1.246 1.251 1.198 1.232 ±0.029 10 F8 1 2.523 2.562 2.475 2.520 ±0.044 11 G7 1 1.741 1.746 1.693 1.727 ±0.029 12 C2 1 1.152 1.251 1.187 1.197 ±0.050 13 C9 2 0.789 0.694 0.707 0.730 ±0.052 14 A7 2 1.843 1.792 1.852 1.829 ±0.032 15 E7 2 1.597 1.605 1.612 1.605 ±0.008 16 E11 2 1.307 1.278 1.342 1.309 ±0.032 17 F3 2 2.387 2.409 2.456 2.417 ±0.035 18 F6 2 1.463 1.435 1.386 1.428 ±0.039 19 G2 2 2.092 2.125 2.109 2.109 ±0.017 20 G11 2 0.736 0.654 0.708 0.699 ±0.042 21 H1 2 1.059 1.078 1.146 1.094 ±0.046 22 H6 2 0.745 0. 789 0.843 0.794 ±0.069 23 A4 3 1.973 1.852 1.904 1.910 ±0.061 24 A5 3 0.807 0.791 0.826 0.808 ±0.018 25 A9 3 1.734 1.685 1.753 1.724 ±0.035 26 C6 3 2.745 2.721 2.726 2.731 ±0.013 27 C12 3 1.843 1.804 1.751 1.799 ±0.046 28 D5 3 2.619 2.578 2.657 2.618 ±0.039 29 E3 3 0.869 0.876 0.785 0.843 ±0.051 30 E10 3 1,032 1,089 1,030 1.050 ±0.059 ĐC+ 1.831 1.799 1.816 1.815 ±0.016 ĐC- 0.482 0.437 0.454 0.458 ±0.023 Như vậy, khi kiểm tra bằng ELISA, dịch nổi ở các giếng có chứa kháng thể đơn dòng nhưng lượng kháng thể ở mỗi giếng lại khác nhau. Trong 30 giếng dương tính, đĩa 1 có 12 giếng, đĩa 2 có 10 giếng và đĩa 3 có 8 giếng cho giá trị OD cao. Kết quả trên cũng cho thấy: Trong các giếng dương tính này, các giếng khác nhau có giá trị OD khác nhau. Điều này chứng tỏ mỗi dòng tế bào khác nhau thì khả năng sinh kháng thể cũng khác nhau. Có thể thấy các giếng có tế bào lai sinh kháng thể có chất lượng cao phụ thuộc vào dòng tế bào lympho B có đáp ứng miễn dịch tốt với kháng nguyên hay không. Từ kết quả bảng trên, chúng tôi đã chọn ra 05 dòng tế bào sinh kháng thể đơn dòng kháng đặc hiệu AFP tốt nhất tương ứng với 05 giếng có giá trị OD cao nhất là: Giếng C6 của đĩa 3 có giá trị OD = 2,731 được đặt tên là dòng AFP-1 Giếng D5 của đĩa 3 có giá trị OD = 2,618 được đặt tên là dòng AFP-2 Giếng F8 của đĩa 1 có giá trị OD = 2,520 được đặt tên là dòng AFP-3 Giếng F3 của đĩa 2 có giá trị OD = 2,417 được đặt tên là dòng AFP-4 Giếng E5 của đĩa 1 có giá trị OD = 2,503 được đặt tên là dòng AFP-5 Với 05 dòng tế bào lai đã chọn lọc AFP - 1,2,3,4,5, chúng tôi tiến hành nhân nuôi in vitro để có số lượng lớn tế bào. Để quá trình nhân nuôi đạt kết quả tốt, từ 05 dòng tế bào được chọn chúng tôi đưa vào 5 chai nuôi cấy sao cho đạt nồng độ 1x105 tế bào/ml. Các chai nuôi cấy được bổ sung môi trường thích hợp cho các tế bào lai phát triển tốt và nuôi trong tủ ấm 370C, 5%CO2. Môi trường nuôi cấy chúng tôi sử dụng gồm các thành phần: DMEM bổ sung FBS 10%. Việc tiếp theo cần làm là kiểm tra độ đặc hiệu của kháng thể đơn dòng thu được từ các dòng tế bào ở trên. * Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của dịch nổi thu từ 05 dòng tế bào Để kiểm tra độ đặc hiệu của các dòng tế bào này đối với dấu ấn ung thư AFP, chúng tôi sử dụng thêm các chất có bản chất là protein, có đầy đủ điều kiện để trở thành kháng nguyên gồm dấu ấn ung thư của tế bào ung thư như CEA (Carcinogen A). Kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên sẽ chỉ kết hợp với kháng nguyên đã kích thích sinh ra nó mà không kết hợp với một kháng nguyên nào khác. Từ đó có thể đưa ra kết luận kháng thể đơn dòng tạo ra có đặc hiệu với kháng nguyên cần xác định hay không. Vì thế, dịch nổi nuôi cấy 5 dòng tế bào nói trên sẽ được thu nhận và kiểm tra tính đặc hiệu bằng phản ứng ELISA đối với các kháng nguyên khác nhau đã được đề cập ở trên. Dịch nổi của dòng tế bào nào chỉ dương tính với kháng nguyên AFP sẽ cho thấy dòng tế bào đó sản sinh kháng thể đơn dòng kháng đặc hiệu với AFP mà chúng ta mong muốn. Dịch nổi của 5 dòng tế bào này đóng vai trò là kháng thể 1 trong phản ứng ELISA gián tiếp. Dịch nổi của các dòng AFP-1, 2, 3, 4, 5 đươc chúng tôi ủ với từng loại kháng nguyên khác nhau. Giếng đối chứng âm chỉ cho BSA 1% và coating buffer. Kết quả được trình bày ở bảng 3.5 Bảng 3.5. Kiểm tra độ đặc hiệu của dịch nổi của các dòng tế bào Kháng nguyên Dòng tế bào PSA AFP BSA CEA AFP _1 + + + + AFP _2 - + - - AFP _3 + + - - AFP _4 - + + - AFP _5 - + - + BSA 1% (đối chứng âm) - - - - Kết quả trên cho thấy: Dòng AFP-1 cho kết quả dương tính với tất cả các kháng nguyên kiểm tra. Như vậy, dòng AFP-1 cho kháng thể không đặc hiệu với kháng nguyên AFP mà chúng ta mong muốn. Dòng AFP-2 cho kết quả dương tính với kháng nguyên AFP và âm tính với các kháng nguyên đem thử còn lại. Dòng AFP-3 cho kết quả dương tính với kháng nguyên PSA và AFP. Như vậy, kháng nguyên do dòng tế bào này sinh ra có khả năng kết hợp với cả hai loại kháng nguyên đó. Như vậy dòng AFP-3 có tính đặc hiệu không cao. Dòng AFP-4 cũng cho kết quả dương tính với kháng nguyên AFP và BSA, âm tính với hai kháng nguyên còn lại. Dòng tế bào này cũng có tính đặc hiệu không cao. Dòng AFP-5 cho kết quả dương tính vớí hai kháng nguyên là AFP và CEA. Dòng tế bào này cũng có tính đặc hiệu không cao. Như vậy trong 5 dòng tế bào có hoạt tính cao, khả năng sinh kháng thể tốt nhất đem thử chỉ có duy nhất dòng AFP-2 tạo ra kháng thể có tính đặc hiệu với kháng nguyên AFP và không phản ứng chéo với các khác nguyên kiểm tra. Dòng tế bào này được chúng tôi thu nhận và đưa ra nuôi cấy ở qui mô lớn để thu nhận kháng thể đơn dòng và lưu giữ lâu dài trong nitơ lỏng. 3.4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 3.4.1 Kết Luận Sau một thời gian tiến hành nghiên cứu chúng tôi đưa ra một số kết luận sau: Liều lượng kháng nguyên AFP cho đáp ứng miễn dịch tốt nhất là 5mg/con/lần tiêm. Đáp ứng miễn dịch của cơ thể phụ thuộc vào liều lượng kháng nguyên gây miễn dịch và chính cá thể động vật. Hiệu quả dung hợp giữa tế bào Myeloma và tế bào lympho B thu từ lách của hai chuột 3.1 và 3.2 đạt 68,33% (393/576 giếng) với số giếng sinh kháng thể mong muốn là 75,83% (298/393 giếng). Với hiệu quả tách dòng đạt 60,76% thì có 30/175 giếng có phản ứng dương tính với kháng nguyên AFP. Chúng tôi chọn ra 05 dòng tế bào có khả năng sinh kháng thể đơn dòng kháng AFP cao nhất nhưng chỉ có dòng AFP-2 là dòng sinh kháng thể có độ đặc hiệu cao nhất . 3.4.2 Đề Nghị Thời gian nghiên cứu ngắn nên đề tài chỉ thực hiện nghiên cứu trên 3 kháng nguyên gây miễn dịch. Vì thế, chúng tôi muốn có những nghiên cứu tiếp theo để tìm ra được liều kháng nguyên tối ưu. Tại đó, chuột có đáp ứng miễn dịch mạnh nhất, các tế bào lympho có sức sống mạnh nhất. Từ kết quả nghiên cứu trên của đề tài chúng tôi mới chỉ là bước đầu. Vì vậy chúng tôi rất hy vọng đề tài sẽ được tiếp tục nghiên cứu trong thời gian tới để sớm tạo ra được sản phẩm cuối cùng là bộ kít chuẩn để định lượng AFP trong dịch sinh học hỗ trợ cho việc chẩn đoán sớm cũng như theo dõi điều trị bệnh ung thư tế bào gan ở người. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Vũ Triệu An, Jean Claude Homber (1998), Miễn dịch học, NXB Y học Hà Nội, 1998. 2. Nguyễn Thị An, khóa (2010).Khóa Luận Tốt Nghiệp.Nghiên cứu tạo dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng kháng hormone FSH. 3. Phạm Hoàng Anh. Ung thư gan ở người Hà Nội. Hội nghị quốc tế về ung thư: Chẩn đoán, điều trị, nghiên cứu và quản lý, tháng 4/1998. 4. Huỳnh Đình Chiến (1999), Miễn dịch học lâm sàng, NXB Giáo dục, H.1999 5. Trần Thị Minh Diễm (2001), Miễn dịch học cơ bản, NXB Đại Học Huế 2001 6. Nguyễn Thanh Đạm, Dương Thị Cương, Hà Văn Mạo và cs (1991), Định lượng AFP ở bệnh nhân ung thư gan bằng phương pháp miễn dịch phóng xạ RIA, Y học Việt Nam, 1991.(158).13-16. 7. Nguyễn Bá Đức (2009), Ung thư học đại cương, NXB Giáo dục Việt Nam, 2009. 8. Trần Văn hợp, Đào Văn Long và cộng sự (2000), "Kết quả chẩn đoán tế bào học ung thư biểu mô gan bằng chọc hút kim nhỏ có hướng dẫn của siêu âm trong 10 năm (1990- 1999)”, Tạp Chí thông tin Y Dược 11/2000, tr.80-83. 9. Nguyễn Chấn Hùng (1984), Tìm hiểu bệnh ung thư, NXB Thành phố Hồ Chí Minh, 1984. 10. Phùng Hướng, Nguyễn Văn Câu, Nguyễn Trân Trúc Huân (1998), Đại cương về ung thư, NXB Y học (1998) 11. Vũ Văn Khiên (2000), Giá trị chẩn đoán theo dõi và tiên lượng bệnh ung thư biểu mô tế bào gan của Alpha- fetoprotein (AFP) và AFP có ái lực với lectin, Luận án tiến sĩ y học, Hà Nội 2000. 12. Hà Văn Mạo, Góp phần nghiên cứu bệnh ung thư biểu mô tế bào gan: đặc điểm lâm sàng, giấ trị một số phương pháp chẩn đoán và thăm dò tác dụng phòng chống của biệt dược Gacavit, Luận án PTS khoa học y dược, Hà Nội 1992. 13. Đỗ Thị Tính, Nghiên cứu yếu tố nguy cơ Aflatoxin và một số yếu tố nguy cơ khác ở bệnh nhân ung thư gan nguyên phát, Luận án tiến sĩ y học, Hà Nội 1998. 14. Đ T Thảo, Đ T Phương, Đ K Hiếu, H T Thu, Đ T Vân, Đ D Kháng, L T Bình, 2008. "Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng protein vỏ VP 28 của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú”. Tạp chí Công nghệ sinh học 6(2): 203-208. 15. Nguyễn Đỗ Quyên (2004), Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất kháng kháng thể đơn dòng, Luận án tiến sĩ khoa học y dược 6.2. Tiếng Anh 16. Maher Albitar (2007). Monoclonal antibodies: Method and Protocols. Humana Press Inc, Tasawa, NJ 2007. 17. Ball D, Rose E, Alpert E (1992). "Alpha-fetoprotein levels in normal adults". Am. J. Med. Sci. 303 (3): 157–159. 18. J. Eryl Liddell, A. Cryer (1991). A practical guide to monoclonal antibodies. John Wiley & Sons Ltd. 19. Gilin D(1975), “Normal biology of Alpha- fetoprotein”. Ann Ny Acad Sci (5):327-338 20. LaBrecque DK (1992). Neoplasia of the liver. Chapter 23, in “Liver and Biliary Disease” Edited by Neil Kaplowitz, 391- 439. 21. Mizejewski GJ (May 2001). “Alpha-fetoprotein structure and function. Relevance to isoform, epitops, and conformational variant”. Experimental biology and medicine (Maywood, N.J.) 226, 377–408. 22. Silver HKB, Gold B, Feder S, et al: “Radioimmunoassay for human Alpha – fetoprotein”. Proc Natl Acad Sci 1973, 70-256. 23.Shimizu K, Tanichi T, Taketa K, et al: “Establishment of assay kits for the determination of microheterogeneity of Alpha fetoprotein using lectin- affinity electrophoresis”. Clinical Chimica Acta 1993 (214): 3-12. 24. Taketa K. “Alpha- fetoprotein. Revaluation in hepatology”. Hepatology 1990 (12): 1420- 1432. 25. Tomasi TB (1977). "Structure and function of alpha-fetoprotein". Annual review of medicine 28: 453–65 26. Sizaret P, Martel N, Tuyns A, Reynaud S (1977). "Mean alpha-fetoprotein values of 1,333 males over 15 years by age groups". Digestion 15 (2): 97–103 27. Oliver JP. Leger và Jose wsaldanha (2000), Monoclonal antibodies,Cell feeder, (150):10-30 Tài liệu từ internet 28. part3.pdf 29. 30. medicine.com/liver_cancer.htm. 31. -2-6x history- of- cancer-72.asp) 32. 33. 34. 35.