Đề tài Nghiên cứu ứng dụng nguồn đạm thủy phân từ trùng quế (Perionyx excavatus ) để nuôi cấy vi sinh vật

àn toàn, nếu có tác động của các loại enzyme khác thêm vào thì quá trình a sẽ nhanh hơn. cá trong quá trình lên men nước mắm có bổ sung 10% nấm sợi Aspergillus oryzae 22 tuần xuống còn 14 tuần, tăng hàm lượng đạm tổng số, đạm amin, giảm lượng đạm amôn, có khả năng áp dụng để sản xuất nước mắm nhanh. Nguyễn Mỹ Tín và Nguyễn Văn Bá (1998) nghiên cứu quá trình lên men nước mắm cá trích có bổ sung 10% chế phẩm protease nấm sợi, kết quả trong hai tháng đầu mật số vi sinh vật ưa muối trong nước bổi cao hơn so với nước bổi không bổ sung nấm sợi. Đạm tổng số và đạm amin tăng cao, đồng thời giảm đáng kể lượng đạm amôn. Vũ Ngọc Bội và Đồng Thị Thanh Thu (2003) nghiên cứu thu nhận protease từ canh trường nuôi vi khuẩn Bacillus subtilis (Saurida tumbil) và thử nghiệm sản xuất nước mắm từ cá cơm thường (Stolephorus commersonii  tốt nhất ở nhiệt độ 50 C, pH tự nhiên của cơ chất, nồng độ protease 0,3%, lượng nước bổ sung 20% và có bổ sung 3% muối ăn hoặc 8% ethanol hay 4% sorbitol để ức chế quá trình gây thối, trong đó sử dụng sorbitol cho bột đạm có hàm lượng acid amin cao hơn, mùi thơm hơn và đạt tiêu chuẩn về vi sinh vật. Sử dụng protease B. subtilis , sản phẩm có hàm lượng và thành phần acid amin cao hơn phương pháp truyền thống và các phương pháp bổ sung các enzyme thương mại : NFĐ, Neutrase, Flavourzyme. và ctv. (2005) nghiên cứu thu nhận chế phẩm protease từ một số nguồn khác nhau và ứng dụng để sản xuất chitin từ phế liệu tôm và cải tiến quy trình sản xuất nước chấm từ đậu nành. Kết quả cho thấy nguồn thu nhận có hiệu quả nhất là vi sinh vật. Từ đó đã xây dựng được quy trình thu nhận chế phẩm protease từ Bacillus subtilis  cồn tốt nhất ở nhiệt độ 50  5 giờ. Sản xuất  nước chấm bằng phương pháp kết hợp enzyme-acid cho phép giảm lượng acid sử dụng, rút ngắn chu kỳ sản xuất và hạ giá thành sản phẩm. 2. Ngoài nước Nielsen P.M. el al . Kết quả cho thấy phương pháp OPA dễ thực hiện, cho kết quả nhanh và chính xác hơn, phạm vi áp dụng rộng hơn và ít độc hại hơn so với phương pháp TNBS (trinitro-benzene-sulfonic acid). Hrčková Martina et al  nhau: Flavourzyme, Novozym và Alc  5% bằng ba enzyme protease khác   (19%),  (12,9%). Salem F. M. A. et al. (1995) đã sử dụng tỷ lệ là 0,3% enzyme so với cá gồm papain, trypsin, ficin và bromelain thêm vào cùng với 25% muối ngay từ đầu quá trình sản xuất nước mắm trên năm loại cá (sardine, macaroni, bolti, bourri và shark). Kết quả cho thấy với 0,3% papain cho hàm lượng đạm tổng số cao nhất so với các enzyme còn lại trên mẫu cá mòi (sardine) sau 180 ngày lên men và cao hơn so với mẫu đối chứng lên men cổ truyền là 30%. Aspmo Stein Ivar et al 55 của nó hoặc bổ sung một trong số bảy enzyme protease thương mại . Nakajima Nobuyoshi et al Lumbricus rubellus. - - . PHẦN III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU I. Phương tiện nghiên cứu Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ enzyme - Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học 1. Nguyên liệu Trùn quế đã đông khô trữ lạnh ở -20oC. 2. Thiết bị và dụng cụ Một số thiết bị như: tủ ủ (Ehret), máy quang phổ kế (U-1500, Hitachi), máy ly tâm (Centaur 2, U.K), máy khuấy từ (Heidolph, Germany), máy đo pH (inoLab), bếp điện, cân phân tích, buồng cấy vi sinh vật, máy lắc ủ (Heidolph, Germany), nồi khử trùng.….. Một số dụng cụ như: bình tam giác, dĩa petri, beaker, bình định mức, ống đong, ống nghiệm, micropipet, que cấy… 3. Hóa chất BSA (Biovin Serum Albumin) (Merck), NaCl (Merck), Borax (Disodium tetraborate) (TQ), SDS (Sodium dodecyl sulfat) (Merck), OPA (Ortho- phthaldialdehyde) (Merck), DTT (Dithiothreitol) (Merck), Serine (Merck), Ethanol (Merck), HCl (Merck), Coomassie Blue G-250 (Merck), Acid phosphoric 85% (Merck). Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: pepton (Hà Lan), dịch chiết thịt bò, dịch chiết nấm men, agar, natri clorua, đường… - Môi trường Luria Broth (LB): Pepton 10 gam Yeast extract 5 gam NaCl 10 gam Agar 15-20 gam (nếu dùng môi trường đặc) Pha hỗn hợp trong nước và chỉnh pH 7,2. - Môi trường nuôi cấy nấm men (YEB): Dịch chiết thịt bò 5 gam Dịch chiết nấm men 1 gam Pepton 5 gam Đường 5 gam Pha hỗn hợp trong nước và chỉnh pH = 6 Môi trường đạm dịch trùn quế thủy phân được tính để thay thế dựa trên lượng đạm amin của 10 hoặc 5 gam pepton tùy theo môi trường nuôi cấy. II. Phương pháp nghiên cứu 1. Chuẩn bị mẫu và xác định thành phần đạm nguyên liệu a. Chuẩn bị mẫu - Sử dụng trùn quế đã rửa sạch, sấy đông khô (độ ẩm 0,05). Nghiệm thức thay thế đạm pepton bằng 100% đạm trùn quế có độ đục cao nhất,  khác biệt có ý nghĩa với các nghiệm thức còn lại. Điều này chứng tỏ với môi trường đạm trùn quế thủy phân 100% vi khuẩn E. coli DH 5 đã phát triển tốt nhất và tốt hơn cả môi trường chỉ có đạm pepton thương mại (nghiêm thức A1). Bảng 5: Kết quả đo độ đục các nghiệm thức thay thế pepton khác nhau nuôi cấy E. coli DH 5 . Nghiệm thứcA1A2A3A4A5OD* 600nm0,518b0,517b0,530ab0,518b0,540a* Các giá trị trung bình có cùng chữ thì không khác biệt có ý nghĩa (p< 0,05) Kết quả thí nghiệm cũng tương tự của Nakajima và ctv (2000) dùng dịch đạm tự thủy phân trùn đất Lumbricus rubellus nuôi cấy vi khuẩn E. Coli XL 1-Blue cho sự tăng trưởng vi khuẩn bình thường so với bột pepton đối chứng trên môi trường LB với tỉ lệ bột pepton là 1% (w/v) sau 30 giờ nuôi cấy. Như vậy có thể khẳng định dung dịch đạm trùn quế thủy phân 100% hoàn toàn có thể thay thế đạm pepton trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật phổ biến LB. Hình 2 sau đây mô tả sự phát triển của vi khuẩn E. coli DH 5 sau 16 giờ nuôi cấy. A1 A2 A3 A4 A5 A1 A2 A3 A4 A5 Hình 2: Môi trường lỏng trước và sau khi nuôi vi khuẩn E. coli DH 5 16 giờ b. Kết quả theo dõi sự phát triển của vi khuẩn E. coli DH 5 theo thời gian Trong môi trường lỏng Sau thí nghiệm xác định lượng đạm amin trùn quế thay thế lượng pepton thích hợp cho nuôi cấy vi khuẩn E. coli DH 5 , nhận thấy dịch trùn quế thủy phân hoàn toàn có thể thay thế bột đạm pepton, nên trong thí nghiệm theo dõi sự tăng trưởng nhóm vi khuẩn này theo thời gian được nuôi cấy trên hai môi trường 100% dịch thủy phân trùn quế và 100% lượng pepton theo môi trường LB. Kết quả hình 3 cho thấy đường tăng trưởng của vi khuẩn E. coli DH 5theo thời gian trên hai môi trường đều như nhau. Ở thời điểm ban đầu vi khuẩn có mật số bằng nhau, nhưng sau 3 giờ tăng trưởng vi khuẩn bắt đầu tăng sinh khối mạnh (giai đoạn log) và đạt đến cực đại ở móc thời gian 18 giờ. Sau đó thì chuyển sang giai đoạn cân bằng và chết. Tuy nhiên, trong môi trường đạm trùn quế thủy phân, vi khuẩn phát triển mạnh hơn khoảng 1,5 lần so với môi trường đạm pepton. Ngay từ đầu giai đoạn log, E. coli DH 5 trong môi trường đạm trùn quế đã có xu hướng phát triển vượt trội và đạt giá trị OD600nm tối đa (0,650) ở 18 giờ. Trong khi đó, nếu sử dụng đạm pepton thì giá trị OD600nm chỉ đạt 0,436. Sau thời điểm này thì ở cả hai môi trường đạm khác nhau vi khuẩn đều chuyển sang giai đoạn cân bằng. Kết quả thống kê ở từng thời điểm từ 6 giờ đến 30 giờ giữa hai nghiệm thức đều có sự khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) (bảng 11, phụ lục 1).Từ kết quả trên, một lần nữa khẳng định khả năng thay thế đạm trùn quế trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn là rất khả thi, mở ra một hướng ứng dụng mới từ trùn quế. Đây là nguồn đạm dồi dào vừa rẻ tiền lại vừa cho hiệu quả cao. 0.7 0.6 OD 600nm 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0  0 5 10 15 20 25 30 Thời gian tăng trưởng (giờ)  Pepton Trùn quế thủy phân  Hình 3: Sự tăng trưởng của vi khuẩn E. coli DH 5 trên hai môi trường đạm pepton và đạm trùn quế thủy phân theo thời gian Môi trường thạch đĩa Trong cùng điều kiện nuôi cấy, mật số vi khuẩn, thành phần dinh dưỡng là như nhau, hai môi trường chỉ khác nhau ở nguồn đạm pepton và đạm từ trùn quế. Sự khác biệt về kích thước tăng trưởng của vi khuẩn trên hai loại đạm pepton và đạm trùn quế được thể hiện rõ trên hình 4, 5 và 6 nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa LB. Môi trường đạm pepton Môi trường đạm trùn quế Hình 4: Khuẩn lạc vi khuẩn E. coli DH 5X sau 16 giờ Môi trường đạm pepton Môi trường đạm trùn quế Hình 5: Khuẩn lạc vi khuẩn E. coli DH 5 sau 24 giờ  Môi trường đạm pepton Môi trường đạm trùn quế Hình 6: Khuẩn lạc vi khuẩn E. coli DH 5 sau 36 giờ Quan sát khuẩn lạc trên hai đĩa môi trường ở mỗi điểm thời gian, nhận thấy chúng to dần từ 16 giờ đến 36 giờ. Khuẩn lạc trên môi trường đạm trùn quế luôn luôn có kích thước lớn hơn trên môi trường đạm pepton. Như vậy kết quả này đã kiểm chứng lại về mặt dinh dưỡng nhờ thành phần đạm amin có mặt trong dịch trùn quế thủy phân cao hơn bột pepton nên đã giúp cho khuẩn lạc phát triển tốt. c. Kết quả xác định lượng đạm amin từ trùn quế thay thế pepton thích hợp cho môi trường YEB nuôi cấy nấm men Saccharomyces cerevisiae. Tương tự như thí nghiệm 1, tính toán lượng đạm amin dịch thủy phân trùn quế đưa vào chuẩn bị môi trường nuôi cấy ở các nghiệm thức thay thế đạm pepton từ 0%, 25%, 50%, 75% và 100% (C1, C2, C3, C4 và C5), không thay đổi các thành phần khác. Kết quả đo OD600nm (bảng 6) cho thấy với hàm lượng đạm amin của trùn quế thay thế cho đạm pepton tăng dần thì mức độ tăng trưởng của nấm men cũng tăng theo và hoàn toàn khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (p<0,05). Nghiệm thức 100% đạm trùn quế thủy phân (nghiệm thức C5) cho giá trị OD cao nhất (0,975), khác biệt có ý nghĩa với tất cả các nghiệm thức còn lại. Do đó, C5 vẫn là nghiệm thức được chọn thay thế cho đạm pepton hiệu quả nhất. Bảng 6: Kết quả đo độ đục các nghiệm thức thay thế pepton khác nhau nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae . Nghiệm thức C1 C2 C3 C4 C5OD* 600nm 0,802e 0,850d 0,902c 0,942b 0,975a * Các giá trị trung bình có cùng chữ thì không khác biệt có ý nghĩa (p< 0,05) C1 C2 C3 C4 C5 C1 C2 C3 C4 C5 Hình 7: Môi trường trước và sau khi nuôi Saccharomyces cerevisiae 24 giờ Với kết quả này một lần nữa chứng tỏ dịch đạm thủy phân từ trùn quế tương tự dịch đạm từ loài trùn đất Lumbricus rubellus, đều cho sự tăng trưởng tốt cả trên môi trường nuôi cấy nấm men bánh mì với tỉ lệ bột pepton thay thế 0,2%. d. Kết quả theo dõi sự phát triển của nấm men Saccharomyces cerevisiae theo thời gian Môi trường lỏng Thí nghiệm xác định lượng đạm amin trùn quế sử dụng trong môi trường YEB nuôi cấy nấm men Saccharomyces cerevisiae cho thấy có thể thay thế 100% lượng pepton Hà Lan. Vì vậy, trong thí nghiệm theo dõi sự tăng trưởng chủng nấm men này theo thời gian được thực hiện với nghiệm thức 100% dịch thủy phân trùn quế và nghiệm thức 100% lượng pepton làm đối chứng. Kết quả được thể hiện ở hình 8 cho thấy giữa hai môi trường đạm trùn quế thủy phân và pepton đều có đường tăng trưởng theo thời gian như nhau và có sự khác biệt không nhiều về độ đục được đo OD600nm ở các thời điểm giữa hai nghiệm thức có thể do trong thí nghiệm này nguồn đạm từ trùn quế trong môi trường YEB sử dụng không nhiều (0,5% theo w/v). Kết quả được thống kê ở bảng 14 (phụ lục 1) cũng cho thấy nhận định trên là chính xác vì chỉ có các thời điểm 6, 9, 21, 27 và 30 giờ  khác biệt có ý nghĩa. Nhìn chung, các thời điểm ở nghiệm thức sử dụng đạm từ trùn quế thủy phân đều cao hơn so với nghiệm thức nuôi cấy trên môi trường đạm pepton Hà lan nhưng độ lệch không rõ như thí nghiệm nuôi cấy vi khuẩn E.Coli DH 5 có thể do môi trường LB sử dụng nguồn đạm khá cao (1% theo w/v). Như vậy, một lần nữa chứng minh nguồn đạm thủy phân từ trùn quế có thể thay thế cho đạm pepton để nuôi cấy nấm men hiệu quả hơn, đồng thời giảm giá thành cho môi trường nuôi cấy. 1.0 0.9 0.8 OD 600nm 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0  0 5 10 15 20 25 30 Thời gian tăng trưởng (giờ)  Pepton Trùn quế thủy phân  Hình 8: Sự tăng trưởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae trên 2 môi trường đạm pepton và đạm thủy phân trùn quế theo thời gian Môi trường thạch đĩa Quan sát khuẩn lạc nấm men Saccharomyces cerevisiae sau 24 và 36 giờ ủ trên môi trường YEB nhưng có thêm agar 2% ở hình 9 và 10 cho thấy các khuẩn lạc trên môi trường đạm trùn quế có kích thước từ bằng đến to hơn trên môi trường đạm pepton. Từ đó, khẳng định rằng nguồn đạm từ trùn quế hoàn toàn có khả năng thay thế cho đạm pepton để nuôi cấy vi sinh vật với hiệu quả tối ưu.  Môi trường đạm pepton Môi trường đạm trùn quế Hình 9: Khuẩn lạc Saccharomyces cerevisiae sau 24giờ Môi trường đạm pepton Môi trường đạm trùn quế Hình 10: Khuẩn lạc Saccharomyces cerevisia sau 36 giờ 3. Hiệu quả kinh tế giữa bột đạm từ trùn quế và bột pepton Hà Lan 1 lít môi trường LB và môi trường YEB. Nếu dựa vào bảng kết quả đo protein và đạm amin của dịch đạm thủy phân và pepton (bảng 4). Tính toán lượng đạm amin tương đương nhau khi pha môi trường, trong 10 gam pepton có khoảng 270mgN thì lượng trùn quế sử dụng để thủy phân có lượng đạm amin tương đương chỉ cần có 5,5 gam. Kết quả bảng 7 và 8 cho thấy giá thành giảm gần một nửa cho 1 lít môi trường nuôi cấy, chủ yếu cho các hóa chất khác. Vì thế việc sử dụng nguồn dịch đạm thủy phân từ trùn quế để thay thế bột pepton mang lại hiệu quả kinh tế đồng thời nâng cao giá trị thương mại của loài trùn đất nuôi công nghiệp này góp phần mở rộng và phát triển mô hình nuôi trùn quế phục vụ người dân vùng đồng bằng sông Cửu Long. Bảng 7: Giá thành 1 lít môi trường LB Thành phần Số lượng Đơn giá (đồng/gam) Thành tiền (đồng) Pepton Dịch chiết nấm men NaCl 10 gam 5 gam 10 gam 3.000 4.000 200 30.000 20.000 2.000  Môi trường LB 1 Lít TỔNG 52.000 Bột trùn quế Dịch chiết nấm men NaCl 5,5 gam 5 gam 10 gam 300 * 4.000 200 1.650 20.000 2.000  Môi trường LB 1 Lít TỔNG 23.650 Bảng 8: Giá thành 1 lít môi trường YEB Thành phần Số lượng Đơn giá (đồng/gam) Thành tiền (đồng) Dịch chiết thịt bò Pepton Dịch chiết nấm men Sacarose 5 gam 5 gam 1 gam 5 gam 4.000 3.000 4.000 500 20.000 15.000 4.000 2.000  Môi trường YEB 1 Lít TỔNG 41.000 Dịch chiết thịt bò Bột trùn quế Dịch chiết nấm men Sacarose 5 gam 2,75 gam 1 gam 5 gam 4.000 300* 4.000 500 20.000 830 4.000 2.000  Môi trường YEB 1 Lít TỔNG 26.830 * Theo Phạm Thị Quỳnh Trâm để được 1 kg bột trùn quế sau khi thủy phân, trừ mọi chi phí khấu hao máy móc, tiêu tốn năng lượng, nhân công, sấy phun giá thành khoảng 300.000 đồng. PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ I. Kết luận Từ các kết quả thí nghiệm, rút ra được kết luận sau: 1. Có thể thay thế đạm pepton hoàn toàn bằng đạm thủy phân từ trùn quế trong môi trường LB nuôi cấy vi khuẩn E. coli DH 5 và môi trường YEB nuôi cấy nấm men Saccharomyces cerevisiae. 2. Cùng một lượng đạm amin, nguồn đạm thủy phân từ trùn quế cho sự tăng trưởng nấm men Saccharomyces cerevisiae và vi khuẩn E. coli DH 5 và từ bằng đến tốt hơn khi nuôi cấy trên môi trường chứa đạm pepton Hà Lan. 3. Khi thay thế bột đạm từ trùn quế có thể giảm giá thành xuống 1/2 lần cho 1 lít môi trường nuôi cấy so với bột đạm pepton từ Hà lan. Điều này sẽ tiết kiệm được chi phí rất lớn một khi sử dụng môi trường nuôi cấy vi sinh vật với quy mô công nghiệp. II. Đề nghị 1. Thử nghiệm trên một số môi trường nuôi cấy vi sinh vật khác để kiểm chứng bột đạm thủy phân cho độ tin cậy cao hơn. 2. Bổ sung chất phụ gia vào sản phẩm thủy phân dịch trùn quế trước khi sấy phun để có độ ẩm thích hợp nhằm bảo quản bột đạm trong thời gian dài mà không ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Dương Thị Hương Giang. 2008. Bài giảng protein và enzyme. Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ .2005. Thu nhận chế phẩm protease từ một số nguồn khác nhau và ứng dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm, Luận án tiến sĩ kỹ thuật, Đại học Đà Nẵng. 3. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty. 2007. Vi sinh vật học. NXB Giáo Dục. 4. Nguyễn Hữu Hiệp. 2007. Giáo trình vi sinh vật đại cương. Viện nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học, Đại học Cần Thơ. 5. Nguyễn Đức Lượng. 1996. Công nghệ vi sinh vật, Tập 1: cơ sở vi sinh vật công nghiệp. Trường Đại học Bách khoa TP. HCM 6. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết. 2003. Thí nghiệm công nghệ sinh học, tập 2: Thí nghiệm vi sinh vật học. NXB ĐH Quốc gia TP.HCM. 7. Nguyễn Mỹ Tín và Nguyễn Văn Bá. 1998. Sử dụng chế phẩm protease nấm sợi sản xuất nhanh nước mắm, Luận án thạc sĩ Khoa học Sinh học, Trường Đaị học Cần Thơ. , Nhà xuất bản Nông nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh. 9. Phan Thị Bích Trâm, Dương Thị Hương Giang, Hà Thanh Toàn và Phạm Thị Ánh Hồng. 2006. Nghiên cứu chiết tách và tinh sạch protease từ trùn quế, Hội nghị Khoa học lần thứ 5- Tóm tắt nội dung báo cáo khoa học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh. 10. Phan Thị Bích Trâm, Phạm Thị Quỳnh Trâm, Hà Thanh Toàn, Phạm Thị Ánh Hồng, 2008. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tạo đạm amin của quá trình tự phân giải trùn quế (Perionyx excavatus), Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 121(4), 53-56 11. Phạm Thị Quỳnh Trâm. 2008. Khả năng sử dụng sản phẩm tự phân giải (autolysis) của trùn quế (Perionyx excavatus) làm thức ăn cho ấu trùng tôm sú. Luận án thạc sĩ chuyên ngành công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. 12. Phạm Thị Ánh Hồng, 2003. Kỹ thuật sinh hóa. NXB ĐH Quốc gia TP HCM. 13. Trần Thị Loan, Nguyễn Văn Bá và Lê Thanh Hùng. 1995. trong lên men nước mắm nhanh, , Trường Đại học Cần Thơ. 14. Vũ Ngọc Bội và Đồng Thị Thanh Thu. 2003. Nghiên cứu quá tr protein cá bằng enzyme protease từ B. subtilis S5, Luận án tiến sĩ Sinh học Trường đại học khoa học tự nhiên, Đại học quốc gia TP.Hồ Chí Minh, TP.Hồ Chí Minh. 15. Aspmo Stein Ivar, Svein Jarle Horn and Vicent G. H. Eijsink .2004. “Enzymatic hydrolysis of Atlantic cod (Gadus morhua L.) viscera”, Process Biochemistry, pp 1-9. .2002. “Enzymatic hydrolysis of defatted soy flour by three different proteases and their effect on the functional properties of resulting protein hydrolysates”, Czech J. Food Sci 20(1), pp 7-14. 17. Nakajima N, Sugimoto M, Ishihara K. 2000. “Stable earthworm serin protease: Application of the protease function and usefulness of the earthworm autolysate”. J Biosci Bioeng 90(2), pp 174-179. 18. Nielsen.P.M. 2001. Improved method for determinining food protein degree of hydrolysis. Journal of food science.66(5), pp 642-646 19. Nielsen S. S, 2003. Food analysis, Third Eddition, Purdue University, West Lafayette, Indiana. 20. Salem F. M. A., M. A. A. Somaya and E. I. Seliem (1995), Manufacturing of fish sauce by proteolytic enzymes, Department of food technology in national research centre, Dokki, Cairo, Egypt. Trên internet: HYPERLINK  www.google.com.vn  HYPERLINK www.trunque.net  HYPERLINK  PHỤ LỤC 1: SỐ LIỆU VÀ KẾT QUẢ THỐNG KÊ Thí nghiệm 1: Xác định lượng đạm amin thay thế pepton thích hợp môi trường nuôi cấy vi khuẩn E. coli DH 5 Bảng 9: Kết quả đo OD 600nm xác định lượng bột đạm thay thế pepton thích hợp môi trường nuôi cấy vi khuẩn E. coli DH 5 Nghiệm thứcĐộ pha loãng Đối chứng Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bìnhA150,0370,5170,5080,5280,518A250,0380,5330,5150,5030,517A350,0390,5310,5180,5420,530A450,0400,5180,5240,5130,518A550,0390,5470,5400,5330,540 ANOVA Table for OD600nm by Nghiem thuc Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 0.00124533 4 0.000311333 2.82 0.0836 Within groups 0.001104 10 0.0001104 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 0.00234933 14 Multiple Range Tests for OD600nm by Nghiem thuc -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- A230.517XA130.517667XA430.518333XA330.530333XXA530.54X-------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- A1- A20.0006666670.0191153A1- A3-0.01266670.0191153A1- A4-0.0006666670.0191153A1- A5*-0.02233330.0191153A2- A3-0.01333330.0191153A2 - A4 -0.00133333 0.0191153A2- A5*-0.0230.0191153A3- A40.0120.0191153A3 - A5 -0.00966667 0.0191153A4 - A5 *-0.0216667 0.0191153 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Thí nghiệm 2: Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn E. coli DH 5 theo thời gian Bảng 10: Kết quả đo OD 600nm so sánh sự tăng trưởng của vi khuẩn Escherichia coli DH 5 theo thời gian trên hai môi trường đạm pepton và đạm của trùn quế. Môi trườngThời gian tăng trưởng (giờ)Độ pha loãng Đối chứng Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB Môi trường đạm pepton (A1)360,0350,0040,0040,0040,00460,0350,0390,0440,03990,1820,1850,1870,185150,4210,4000,4110,411180,4380,4290,4410,436210,4160,4090,4240,416240,4090,4070,4000,405 270,4000,4010,3860,396300,3860,3950,3670,383 Môi trường đạm trùn quế (A5)360,0420,0040,0040,0030,00460,1100,1050,1270,11490,2570,2530,2460,252150,6160,6150,6210,617180,6520,6430,6560,650210,6020,5960,5900,596240,5440,5390,5350,539270,5140,5130,5090,512300,5060,5000,4860,497 Thời gian tăng trưởng (giờ) Pepton (OD*600nm)Trùn quế thủy phân (OD*600nm)30,004a0,004a60,039b0,114a90,185b0,252a150,411b0,617a180,436b0,650a210,416b0,596a240,405b0,539a270,396b0,512a300,383b0,497a Bảng 11: Kết quả thống kê theo từng thời điểm tăng trưởng của vi khuẩn E. coli DH 5 . *Các giá trị trung bình trong cùng một hàng có cùng chữ thì không khác biệt có ý nghĩa, (p<0,05) ANOVA Table for OD600NM by NGHIEM THUC Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups Within groups 0.00836267 0.000306667 1 0.00836267 109.08 0.0005 4 0.0000766667 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 0.00866933 5 Multiple Range Tests for OD600NM by NGHIEM THUC -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD NGHIEM THUC Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- A1 3 0.0393333 X A5 3 0.114 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- A1 - A5 *-0.0746667 0.0198494 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. ANOVA Table for OD600NM by NGHIEM THUC Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 0.00680067 1 0.00680067 364.32 0.0000 Within groups 0.0000746667 4 0.0000186667 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 0.00687533 5 Multiple Range Tests for OD600NM by NGHIEM THUC -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD NGHIEM THUC Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- A1 3 0.184667 X A5 3 0.252 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- A1 - A5 *-0.0673333 0.00979441 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. ANOVA Table for OD600NM by NGHIEM THUC Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups Within groups 0.0640667 0.000241333 1 0.0640667 1061.88 0.0000 4 0.0000603333 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 0.064308 5 Multiple Range Tests for OD600NM by NGHIEM THUC -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD NGHIEM THUC Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- A1 3 0.410667 X A5 3 0.617333 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- A1 - A5 *-0.206667 0.0176085 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. ANOVA Table for OD600NM by NGHIEM THUC Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 0.0689082 1 0.0689082 1653.80 0.0000 Within groups 0.000166667 4 0.0000416667 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 0.0690748 5 Multiple Range Tests for OD600NM by NGHIEM THUC -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD NGHIEM THUC Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- A1 3 0.436 X A5 3 0.650333 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- A1 - A5 *-0.214333 0.0146332 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. ANOVA Table for OD600NM by NGHIEM THUC Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 0.0484202 1 0.0484202 1048.81 0.0000 Within groups 0.000184667 4 0.0000461667 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 0.0486048 5 Multiple Range Tests for OD600NM by NGHIEM THUC -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD NGHIEM THUC Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- A1 3 0.416333 X A5 3 0.596 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- A1 - A5 *-0.179667 0.0154031 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. ANOVA Table for OD600NM by NGHIEM THUC Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 0.026934 1 0.026934 1262.53 0.0000 Within groups 0.0000853333 4 0.0000213333 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 0.0270193 5 Multiple Range Tests for OD600NM by NGHIEM THUC -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD NGHIEM THUC Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- A1 3 0.405333 X A5 3 0.539333 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- A1 - A5 *-0.134 0.0104707 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference.  PAGE 42 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 0.0203002 1 0.0203002 525.00 0.0000 Within groups 0.000154667 4 0.0000386667 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 0.0204548 5 Multiple Range Tests for OD600NM by NGHIEM THUC -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD NGHIEM THUC Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- A1 3 0.395667 X A5 3 0.512 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- A1 - A5 *-0.116333 0.0140966 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. ANOVA Table for OD600NM by NGHIEM THUC Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 0.0197227 1 0.0197227 127.38 0.0004 Within groups 0.000619333 4 0.000154833 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 0.020342 5 Multiple Range Tests for OD600NM by NGHIEM THUC -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD NGHIEM THUC Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- A1 3 0.382667 X A5 3 0.497333 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- A1 - A5 *-0.114667 0.0282083 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference.   PAGE 43 Thí nghiệm 3: Xác định lượng bột đạm thay thế pepton thích hợp môi trường nuôi cấy nấm men YEB Bảng 12: Kết quả đo OD 600nm xác định lượng bột đạm thay thế pepton thích hợp môi trường nuôi cấy nấm men Sacharomyces cerevisia YEB Nghiệm thứcĐối chứng Lần 1 Lần 2 Lần 3Trung bìnhC10,0350,7910,8030,8120,802C20,0350,8620,8440,8450,850C30,0360,8920,8940,9200,902C40,0360,9290,9380,9590,942C50,0360,9690,9810,9740,975 ANOVA Table for OD 600nm by Nghiem thuc Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 0.0577371 4 0.0144343 98.77 0.0000 Within groups 0.00146133 10 0.000146133 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 0.0591984 14   PAGE 44 Multiple Range Tests for OD 600nm by Nghiem thuc -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 130.802X230.850333X330.902X430.942X530.974667X-------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 1 - 2*-0.04833330.02199241 - 3*-0.10.02199241 - 4*-0.140.02199241 - 5*-0.1726670.02199242 - 3*-0.05166670.02199242 - 4*-0.09166670.02199242 - 5*-0.1243330.02199243 - 4*-0.040.02199243 - 5*-0.07266670.02199244 - 5*-0.03266670.0219924-------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Thí nghiệm 4: Theo dõi sự phát triển của nấm men YEB theo thời gian Bảng 13: Kết quả đo OD600nm theo dõi sự phát triển của nấm men Sacharomyces cerevisia YEB theo thời gian Môi trườngThời gian (giờ) Độ pha loãng Đối chứng Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Trung bình Môi trường đạm pepton (C1)3100,0360,0080,0080,0080,0080,00860,0740,0750,0780,0700,07490,2470,2480,2560,2070,240150,7140,7020,7180,6870,705180,8020,7980,8320,7950,807210,8260,8200,8580,8020,827240,8440,8240,8810,8290,845  PAGE 48 0,865 0,869 0,882 0,868 270,856300,9040,9010,9060,9170,907 Môi trường đạm trùn quế (C5)3100,0370,0080,0080,0080,0080,00860,0810,0810,0810,0850,08290,2830,2820,2680,2760,277150,7460,7190,6910,7140,718180,8600,8090,8320,8030,826210,8510,8620,9050,9060,881240,9160,8560,8750,8480,874270,8890,9050,8920,9400,907300,9550,9840,9710,9290,960 Bảng 14: Kết quả thống kê theo từng thời điểm tăng trưởng của nấm men S. cerevisiae. Thời gian tăng trưởng (giờ) Pepton (OD*600nm)Trùn quế thủy phân (OD*600nm)30,008a0,008a60,074b0,082a90,240b0,277a150,705a0,718a180,807a0,826a210,827b0,881a240,845a0,874a270,868b0,907a300,907b0,960a*Các giá trị trung bình trong cùng một hàng có cùng chữ thì không khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) ANOVA Table for OD 600nm by Nghiem thuc Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 0.000120125 1 0.000120125 16.11 0.0070 Within groups 0.00004475 60.00000745833 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 0.000164875 7 Multiple Range Tests for OD 600nm by Nghiem thuc -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- C1 4 0.07425 X C5 4 0.082 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- C1 - C5 *-0.00775 0.00472526 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. ANOVA Table for OD 600nm by Nghiem thuc Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 0.00285012 1 0.00285012 10.69 0.0170 Within groups 0.00159975 6 0.000266625 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 0.00444987 7 Multiple Range Tests for OD 600nm by Nghiem thuc -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- C1 4 0.2395 X C5 4 0.27725 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- C1 - C5 *-0.03775 0.0282524 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference.  Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 0.0002645 1 0.0002645 0.75 0.4191 Within groups 0.0021095 6 0.000351583 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 0.002374 7 Multiple Range Tests for OD 600nm by Nghiem thuc -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- C1 4 0.70525 X C5 4 0.71675 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- C1 - C5 -0.0115 0.0324428 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. ANOVA Table for OD 600nm by Nghiem thuc Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 0.000741125 1 0.000741125 1.54 0.2607 Within groups 0.00288475 6 0.000480792 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 0.00362587 7 Multiple Range Tests for OD 600nm by Nghiem thuc -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- C1 4 0.80675 X C5 4 0.826 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- C1 - C5 -0.01925 0.0379387 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference.  Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 0.0059405 1 0.0059405 8.70 0.0256 Within groups 0.004097 6 0.000682833 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 0.0100375 7 Multiple Range Tests for OD 600nm by Nghiem thuc -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- C1 4 0.8265 X C5 4 0.881 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- C1 - C5 *-0.0545 0.0452128 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. ANOVA Table for OD 600nm by Nghiem thuc Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 0.00171113 1 0.00171113 2.16 0.1922 Within groups 0.00475775 6 0.000792958 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 0.00646888 7 Multiple Range Tests for OD 600nm by Nghiem thuc -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- C1 4 0.8445 X C5 4 0.87375 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- C1 - C5 -0.02925 0.0487225 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference.  PAGE 49 Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 0.0029645 1 0.0029645 8.93 0.0244 Within groups 0.001991 6 0.000331833 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 0.0049555 7 Multiple Range Tests for OD 600nm by Nghiem thuc -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- C1 4 0.868 X C5 4 0.9065 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- C1 - C5 *-0.0385 0.0315184 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. ANOVA Table for OD 600nm by Nghiem thuc Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 0.00556512 1 0.00556512 18.26 0.0052 Within groups 0.00182875 6 0.000304792 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 0.00739387 7 Multiple Range Tests for OD 600nm by Nghiem thuc -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- C1 4 0.907 X C5 4 0.95975 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- C1 - C5 *-0.05275 0.0302069 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference.   PAGE 50 PHỤ LỤC 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH I. Định lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl 1. Nguyên tắc Tất cả các dạng nitơ có trong cơ thể hay trong các mô được gọi là nitơ tổng số, nitơ có trong thành phần acid amin của protein là nitơ protein. Nitơ không có trong thành phần protein như các muối vô cơ, acid nitric, các acid amin tự do, các peptid, ure…. là nitơ phi protein. Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein Trước tiên mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4 đậm đặc ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác. Các phản ứng của quá trình vô cơ hóa xảy ra như sau: 2H2SO4 2H2O + 2SO2 + O2 Oxy tạo thành trong phản ứng lại oxy hóa các nguyên tố khác. Các phân tử chứa nitơ dưới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3. NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch. NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 Đẩy NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH, hấp thụ NH3 bằng dung dịch H3BO3 có chứa chất chỉ thị, sau đó đem chuẩn độ bằng dung dịch H2SO4 0,1N (NH4)2SO4 + NaOH Na2SO4 + H2O + 2NH3 2NH4OH + 4H3BO3 (NH4)2B4O7 + 7H2O (NH4)2B4O7 + H2SO4 (NH4)2SO4 + H3BO3 2. Tiến hành a. Vô cơ hóa mẫu Cân khoảng 0,3-0,5 gam mẫu cho vào bình Kjeldahl, thêm vào 10ml H2SO4 đậm đặc và một ít bột xúc tác đun trên bếp. Nhiệt độ và thời gian gia nhiệt được chọn tuỳ thuộc vào mẫu phân tích (nhiệt độ 300-4000C). Vô cơ hóa mẫu đến khi thu được dung dịch trong suốt không màu hoặc có màu xanh lơ của CuSO4, để nguội đến nhiệt độ phòng.   PAGE 51 b. Chuẩn bị chưng cất đạm Chuẩn bị dung dịch ở bình hứng NH3, dùng pipet cho vào bình hứng 20ml acid boric, có thêm 6 giọt chất chỉ thị (Bromocresolgreen và metyl đỏ) đặt bình vào hệ thống sao cho đầu ống sinh hàn ngập trong dung dịch . Sau khi vô cơ hóa mẫu hoàn toàn, lắp bình Kjeldahl vào hệ thống cất đạm. Sau đó thêm vào khoảng 10ml NaOH 30%. Quan sát khi dung dịch trong bình chuyển sang màu xanh đen, chứng tỏ dung dịch trong bình cất đã đủ kiềm để đẩy NH3 ra khỏi (NH4)2SO4. Bắt đầu chưng cất đạm cho đến khi dung dịch trong bình hứng đạt 80-100ml (thời gian khoảng 5 phút). Dùng nước cất để rửa đầu ống sinh hàn, lấy bình hứng ra và đem đi chuẩn độ bằng H2SO4 0,1N 3. Tính kết quả Hàm lượng nitơ tổng số (%) =  0,00142 x VH2SO4 x 100 m  Trong đó: V: thể tích H2SO4 0,1 N dùng để chuẩn độ (ml) m: khối lượng nguyên liệu vô cơ hoá (g) 0,00142: Số g nitơ tương đương với 1 ml H2SO4 0,1N Xác định hàm lượng protein: Dựa vào tỷ lệ Nitơ tương đối trong thành phần protein để xác định hệ số protein. Hàm lượng nitơ toàn phần trong protein động vật khoảng 16 %, khi đó hệ số protein K là: K = 100/16 = 6,25 Hàm lượng protein tổng số (CP) được tính theo công thức: % protein tổng số = %N * K 4. Kết quả xác định đạm tổng số của bột trùn quế đông khô. Lần 1Lần 2Trung bìnhNitơ tổng số (%)11,1311,0411,09Protein tổng số (%)69,5869,0169,30  PAGE 52 II. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford 1. Nguyên tắc: Khi Coomassie Brilliant Blue G 250 kết hợp với protein, thuốc nhuộm thay đổi màu từ hơi đỏ sang xanh xanh và hấp thụ cực đại ở bước sóng từ 465nm đến 595nm. Sự thay đổi hấp thụ ở 595nm tương ứng với nồng độ protein có trong mẫu. 2. Tiến hành: a. Chuẩn bị dung dịch Bradford: Hòa tan 100mg Coomassie Blue G250 trong 50ml ethanol 95%. Sau đó cho thêm 100ml acid phosphoric 85% khuấy đều. Bổ sung thêm nước cất cho đến một lít. Sau đó lọc bằng giấy lọc Whatman No1và trữ trong chai tối ở nhiệt độ phòng. Thuốc thử có thể sử dụng trong hai tuần nhưng trong thời gian này thuốc thử có thể bị tủa nên khi sử dụng cần phải lọc lại. b.Chuẩn bị dung dịch protein chuẩn: Cân 3mg BSA, hòa tan trong 3ml nước cất. Ta thu được dung dịch BSA mẹ có nồng độ 1mg/ml. Giữ ở -20oC. c. Xây dựng đường chuẩn Chuẩn bị dãy protein BSA chuẩn với nồng độ tăng dần từ 0, 30, 60, 120, 180, 240, 300 µg/ml. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Chuẩn bị các ống nghiệm và thêm vào các chất theo bảng sau : Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 [BSA]( µl) 0 30 60 120 180 240 300 V buffer (H2O cất) (µl) 1000 970 940 880 820 760 700 Lắc đều các ống. Lấy 100 µl dung dịch từ các ống nghiệm trên cho vào một dãy ống nghiệm được đánh số tương tự. Cho vào mỗi ống 2 ml thuốc thử. Lắc đều ống bằng máy vortex. Tránh để có bọt. Sau 10 phút tiến hành đo OD.   PAGE 53 Định chuẩn máy quang phổ với dung dịch đệm (ống 1) ở bước sóng 595nm. Chỉnh OD về giá trị 0. Tiến hành đo các ống còn lại. Ghi nhận kết quả. Tính giá trị trung bình 3 lần lặp lại thí nghiệm. Vẽ biểu đồ đường chuẩn BSA thể hiện mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 595nm d. Định lượng protein có trong mẫu : Hàm lượng protein có trong mẫu cũng được tiến hành đo đồng thời với việc dựng đường chuẩn. Cũng lấy 10 µl và cho vào 2 ml thuốc thử. Ghi nhận kết quả, lấy giá trị trung bình của 3 ống Từ phương trình đường chuẩn ta suy ra được hàm lượng protein trong dung dịch đo. 3. Kết quả xây dựng đường chuẩn BSA. BSA (ug/ml) 0 30 60 120 180 240 300OD 595nm 0,001 0,069 0,187 0,354 0,51 0,654 0,757  0.8 0.7 OD 595nm 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 Đường chuẩn BSA y = 0.0026x + 0.0174 R2 = 0.9919 0 50 100 150 200 250 300 350 Nồng độ BSA (ug/ml)   PAGE 54 III. Xác định hàm lượng đạm amin bằng phương pháp OPA 1. Nguyên tắc Các nhóm amin của acid amin hoặc peptide phản ứng với ortho-phthaldialdehyde với sự có mặt của -SH của dithiothreitol (DTT) hoặc -mercaptoethanol sẽ tạo ra hợp chất có khả năng hấp thụ ở bước sóng 340 nm. 2. Tiến hành * Pha dung dịch OPA: + Dung dịch 1: 25,4 g Borax + 667 mg SDS + nước cất = 500 ml. + Cân chính xác 40 mg OPA pha trong 1 ml etanol để hòa tan hết, thêm vào 44 mg dithiothreitol (DTT), sau đó thêm 37,5 ml dung dịch 1 rồi pha thành 50 ml ta được dung dịch OPA (chỉ pha trước khi dùng). * Pha serine chuẩn: Cân 10 mg serine pha trong bình định mức 100 ml được nồng độ 0,1 mg/ml. * Đo mẫu : + 200 l dd serine chuẩn + 1,5 ml OPA + 200 l nước + 1,5 ml OPA. + 200 l dd thủy phân đã pha loãng + 1,5 ml OPA, rồi để yên 2 phút, đem đo ở bước sóng 340 nm 3. Tính kết quả Hàm lượng đạm amin được tính theo công thức: VS MN = CS x 14,2 x  x 100 (mgN/g) 1000 m Trong đó : MN: hàm lượng đạm amin  CS = ODS – ODO ODSD – ODO  x 0,9516 (mMol/L)   PAGE 55 0,9516: mMol/L Serine (tương đương 0,9516 Mmol/L Nitơ) VS : Thể tích dịch thuỷ phân (ml) m: khối lượng mẫu(g) 100: hệ số pha loãng . ODSD,ODS,ODO:độ hấp thụ 340 nm mẫu chuẩn serine, mẫu thật, mẫu không  Hiệu suất thuỷ phân (N%) = MN x100 MN tổng số  Trong đó : N: hiệu suất thuỷ phân (%). MN : đạm amin trong dịch thủy phân. MN tổng số: đạm amin tổng số