Đề tài Nghiên cứu xây dựng công thức viên nang chứa cao Diếp cá

ối thuốc, có thể áp dụng phương pháp xát hạt khô hoặc xát hạt ướt. Kích thước của hạt nên phù hợp để có thể đảm bảo hạt chảy đều vào nang đồng thời hạn chế được sai số khối lượng thuốc trong nang. Các tá dược thông thường dùng để điều chế khối bột gồm: Tá dược độn: Các loại tá dược độn dùng trong viên nén như tinh bột, lactose, dicalci phosphat đều có thể được dùng trong viên nang. Các loại tinh bột dập thẳng như tinh bột tiền gelatin hóa, tinh bột phun sấy có thể được dùng để gia tăng lưu tính và tính chịu nén của khối hạt. Tá dược trơn: tá dược trơn giúp cho hạt chảy đều. Sự trơn chảy của khối hạt hoặc bột cần thiết cho tất cả các máy đóng nang khác nhau.. Độ trơn chảy đặc biệt cần thiết trong trường hợp đóng thuốc theo nguyên tắc đĩa phân liều. Các tá dược trơn thường dùng là Mg stearate, talc, tinh bột bắp,… Tá dược chống dính: các tá dược chống dính vừa có tác dụng làm tăng lưu tính của khối bột (hoặc hạt) vừa tránh sự kết dính của bột thuốc lên các bề mặt kim loại. Tá dược rã: tá dược rã có thể không cần thiết trong trường hợp đóng bột không nén vào nang. Trong trường hợp có xát hạt hoặc trong trường hợp có nén ép (máy có đĩa phân liều hoặc vít phân liều) thì nên có tá dược rã để giúp thuốc phóng thích nhanh. Nên sử dụng các tá dược siêu rã để có thể chọn được kiểu nang nhỏ. 1.2.3. Quy trình bào chế thuốc viên nang cứng từ dược liệu: [1],[2] Điều chế khối thuốc Vỏ nang Đóng nang Lau nang – Đánh bóng Đóng gói Thành phẩm Sơ đồ 1.1. Tóm tắt quy trình sản xuất viên nang cứng. Điều chế khối thuốc: thông thường điều chế khối thuốc bằng phương pháp xát hạt khô hoặc xát hạt ướt. Đối với dược liệu thường tiến hành như sau: Chiết kiệt hoạt chất từ dược liệu bằng phương pháp và dung môi thích hợp. Xử lý dịch chiết để thu được cao đặc hoặc cao khô. Do bột thuốc làm từ dược liệu hút ẩm rất mạnh nên phải khảo sát và phối hợp cao dược liệu với tá dược hút ẩm, tá dược độn theo tỷ lệ phù hợp nhằm giữ ổn định và bảo quản khối bột thuốc. Ép cốm, phối hợp tá dược trơn chảy thích hợp. Sửa hạt và kiểm tra chất lượng hạt. Đóng nang: Trong trường hợp điều chế một lượng nhỏ viên nang để dùng cho một số bệnh nhân hoặc thử nghiệm lâm sàng các thuốc mới, khối thuốc có thể được đóng vào nang bằng tay (không dùng thiết bị). Trong sản xuất có thể sử dụng các máy đóng nang thủ công, bán tự động và máy đóng nang tự động tùy theo quy mô sản xuất khác nhau. Lau nang – đánh bóng: sau khi đóng thuốc vào nang, các viên nang cần được loại bụi và đánh bóng trước khi đóng gói. Tùy theo điều kiện trang thiết bị có sẵn, có thể áp dụng các phương pháp: loại bụi bằng phương pháp thủ công, loại bụi và đánh bóng trong nồi bao, loại bụi bằng hệ thống lau và đánh bóng viên. 1.3. SƠ LƯỢC VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO: [9] Sắc ký lỏng hiệu năng cao đôi khi còn được gọi là sắc ký lỏng áp suất cao (High-Pressure) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ là tùy thuộc vào loại pha tĩnh đã sử dụng. Ngày nay, HPLC đã và đang được sử dụng trong nhiều lĩnh vực phân tích hóa học nói chung cũng như trong kiểm tra chất lượng thuốc và phân tích sinh dược học nói riêng. Trong phân tích thuốc bằng phương pháp sắc ký, phần lớn các dược điển đều sử dụng sắc ký phân bố. Hình 1.3. Sơ đồ cấu tạo chung của một hệ thống HPLC. 1.3.1. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc kí: 1.3.1.1. Hệ số dung lượng k’ (Capacity factor): Hình 1.4. Xác định thời gian chết (t0) và thời gian lưu (tR). Trong đó: k': hệ số dung lượng. tR: thời gian lưu. t’R: thời gian lưu hiệu chỉnh. t0: thời gian chết. Cần chọn cột, pha động,…sao cho k’ nằm trong khoảng tối ưu: 1 ≤ k’ ≤ 8. 1.3.1.2. Hệ số chọn lọc α: Quy ước ở đây B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A nên α > 1. Để tách riêng 2 chất thường chọn 1,05 ≤ α ≤ 2,0. 1.3.1.3. Hệ số bất đối xứng: Trong đó: W1/20: độ rộng đỉnh ở 1/20 chiều cao. f: khoảng cách từ đường cao của đỉnh đến chân trước của đỉnh ở 1/20 chiều cao. 1.3.1.4. Độ phân giải Rs: Trong đó: TRB, tRA: thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (B và A). WB, WA: độ rộng pic đo ở đáy các pic. W1/2B, W1/2A: độ rộng pic đo ở nữa chiều cao pic. 1.3.1.5. Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột: Hiệu lực cột được đo bằng thông số: số đĩa lý thuyết N của cột. Hình 1.5. Cách xác định số đĩa lý thuyết. Trong đó: W: chiều rộng đo ở đáy pic. W1/2: chiều rộng pic đo ở nữa chiều cao pic. 1.3.2. Một số ứng dụng của phương pháp HPLC: 1.3.2.1. Phân tích định tính: Định tính các hợp chất là một phần cốt lõi của bất cứ một phương pháp HPLC nào. Phân tích định tính bằng HPLC chủ yếu thục hiện bằng 3 cách sau đây: Dựa vào các dữ liệu về sự lưu. Phân tích định tính các chất thu được từ HPLC quy mô phân tích. Phân tích phổ nghiệm online các đỉnh HPLC. 1.3.2.2. Phân tích định lượng: Nguyên tắc: việc định lượng các chất bằng HPLC có thể dựa vào sự so sánh chiều cao của đỉnh hay so sánh diện tích đỉnh của chất cần xác định với một hay nhiều mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ. Các phương pháp định lượng: Phương pháp quy về 100% diện tích. Phương pháp dùng chuẩn ngoại. Phương pháp dùng chuẩn nội. Phương pháp thêm chất chuẩn. 1.4. GIỚI THIỆU MỘT SỐ CHẾ PHẨM CHỨA CAO DIẾP CÁ: 1.4.1. An trĩ vương: Công ty Cổ phần sản xuất và Thương mại Hồng Bàng. CÔNG THỨC: Hàm lượng trong một viên: Cao Diếp cá 450 mg Cao Đương quy 150 mg Magie carbonat 108 mg Rutin 25 mg Curcumin Hình 1.6. Chế phẩm An Trĩ Vương. 10 mg CÔNG DỤNG: Hỗ trợ điều trị và giúp phòng ngừa bệnh trĩ, cải thiện các triệu chứng của bệnh trĩ (chảy máu, sa búi trĩ, đau rát, ngứa...) và các biến chứng xuất huyết của bệnh trĩ (sa trực tràng, viêm nứt hậu môn...). Hỗ trợ điều trị và phòng ngừa táo bón. Giúp bảo vệ và tăng sức bền của tĩnh mạch, tăng cường sức khỏe tĩnh mạch và đường tiêu hóa. 1.4.2. Helaf: Công ty cổ phần dược Hậu Giang. CÔNG THỨC: Hàm lượng trong một viên: Cao khô Diếp cá 210 mg Cao khô Rau má 45 mg Kollidon CL - M, sáp ong trắng, dầu nành, vỏ nang gelatin Hình 1.7. Chế phẩm Helaf. CÔNG DỤNG: Helaf có tác dụng hỗ trợ điều trị trĩ, táo bón và kiết lỵ. Helaf giúp giải nhiệt, thông tiểu, mát gan, giải độc, kháng viêm, giúp vết thương chóng lành và mau lên da non, tăng cường hệ miễn dịch của cơ thể. 1.4.3. Cenditan: Công ty cổ phầm dược phẩm 3/2. CÔNG THỨC: Hàm lượng trong một viên: Cao diếp cá 75mg Bột rau má 300mg CÔNG DỤNG: Trị táo bón, trĩ. Giải nhiệt, thông tiểu, mát gan, giải độc. Hình 1.8. Chế phẩm Cenditan. Chương 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU, CHẤT CHUẨN, HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ: 2.1.1. Nguyên liệu và chất chuẩn: Cao Diếp cá được cung cấp bởi công ty TNHH ADC tại Ô Môn, KV Thới Hưng, phường Long Hưng, quận Ô Môn, Thành phố Cần Thơ. Số lô: SE-HCO1-0210. Quercetin chuẩn do Bộ Y Tế – Viện kiểm nghiệm TP.HCM cung cấp, số lô 104050609, hàm lượng 91,34% C15H10O7, nước 8,51%. 2.1.2. Hóa chất: Bảng 2.1. Các hóa chất, tá dược sử dụng trong nghiên cứu. STT Tên nguyên liệu, hóa chất Nguồn gốc Tiêu chuẩn 1 Acetonitril Merck Phân tích HPLC 2 Acid chlohyric Trung Quốc Tinh khiết PA 3 Acid formic Trung Quốc Tinh khiết PA 4 Acid phosphoric Merck Phân tích HPLC 5 Chloroform Trung Quốc Tinh khiết PA 6 Ethanol 96% Việt Nam TCCS 7 Ethyl acetat Trung Quốc Tinh khiết PA 8 Magnesi Trung Quốc Tinh khiết PA 9 Magnesi carbonate Việt Nam TCCS 10 Methanol Merck Phân tích HPLC 11 Natri hydroxyd Trung Quốc Tinh khiết PA 12 Natri sulfat Trung Quốc Tinh khiết PA 13 Sắt (III) clorid Trung Quốc Tinh khiết PA 12 Talc Mỹ USP 30 2.1.3. Trang thiết bị: Bảng 2.2. Các thiết bị dùng trong nghiên cứu. STT Tên thiết bị Số hiệu Nguồn gốc 1 Bếp điện JK 071 Nhật 2 Bể siêu âm Elma Đức 3 Cân phân tích Ep 214C-Ohaus Mỹ 4 Máy đo độ rã Pharma test Đức 5 Máy sát hạt và sửa hạt FGS Đức 6 Máy trộn Misuko JBJ103 Nhật 7 Tủ sấy Memmerk Đức 8 Máy soi UV 2 bước sóng ENF-2400C/EF Mỹ 9 Máy HPLC Hitachi L200 Nhật 10 Cân sấy ẩm hồng ngoại MX-50 Mỹ 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 2.2.1. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng quercetin bằng phương pháp HPLC: 2.2.1.1. Khảo sát các điều kiện sắc ký tối ưu: Tiến hành chạy sắc ký trên quercetin chuẩn để tìm các điều kiện sắc ký tối ưu. Chạy sắc ký với mẫu thử ở điều kiện sắc ký thăm dò, tiến hành thay đổi các điều kiện sắc ký để đỉnh chính (tương ứng với quercetin) đạt các thông số sắc ký. Chuẩn bị mẫu chuẩn: cân chính xác 25mg chuẩn đối chiếu quercetin cho vào bình định mức 50ml, thêm 30ml methanol, siêu âm trong 10 phút và bổ sung methanol đến vạch, lắc đều để có dung dịch mẹ có nồng độ 500µg/ml. Từ dung dịch mẹ, tiến hành pha các dung dịch có nồng độ thấp hơn như sau: lấy chính xác một lượng thể tích dung dịch mẹ cho vào bình định mức, thêm methanol vừa đủ thu được dung dịch có nồng độ theo yêu cầu. Các số liệu pha mẫu được trình bày trong bảng 2.3. Bảng 2.3. Phương pháp pha các dung dịch có nồng độ thấp hơn. STT Dung dịch mẹ (ml) Bình định mức (ml) Nồng độ dung dịch thu được (µg/ml) 1 1 10 50 2 2 10 100 3 3 10 150 4 4 10 200 5 5 10 250 6 6 10 300 Chuẩn bị mẫu thử: tiến hành theo mục 2.2.1.2. 2.2.1.2. Khảo sát phương pháp xử lý mẫu cao Diếp cá và viên nang chứa cao Diếp cá để định lượng quercetin: Tiến hành chiết và theo dõi: Quá trình chiết quercetin từ dịch thủy phân cao Diếp cá. Thời gian để phản ứng thủy phân xảy ra hoàn toàn: dịch thủy phân sau mỗi 1 giờ được chiết kiệt Quercetin bằng CHCl3, theo dõi các dịch thủy phân sau 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ,... Quá trình loại tạp. Theo dõi bằng thuốc thử FeCl3 trong cồn và sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi Chloroform – Ethyl acetat – Acid formic (5:4:1). Phát hiện bằng đèn UV ở bước sóng 254 nm, nhúng thuốc thử FeCl3 trong cồn. Quy trình chuẩn bị mẫu thử cao Diếp cá: Cân chính xác khoảng 1 g cao Diếp cá, hòa tan với 10 ml ethanol 25%, lọc, chuyển vào bình lắng gạn, thêm vào 20 ml chloroform, lắc đều 5 phút, rút bỏ dịch chloroform. Dịch nước còn lại hòa tan với 10 ml dung dịch HCl 10%/cồn 25% đun hồi lưu. Dịch thủy phân thu được lắc với với 20 ml chloroform trong 5 phút, chuyển vào bình lắng gạn để yên 60 phút, rút lấy dịch chloroform. Lặp lại 3 lần. Gộp dịch chloroform lắc với với 20 ml nước. Rút dịch chloroform lọc qua Na2SO4 sau đó đem cô đến dịch CHCl3 đậm đặc (A1). Dịch A1 cho qua cột SPE tự chế để loại tạp. Cho 20 ml chloroform qua cột SPE để loại tạp phân cực, tiếp theo cho 40ml hỗn hợp CHCl3: EtOAc – 6:4 để lấy phân đoạn chứa quercetin. Cô phân đoạn chứa quercetin đến cắn (A2). Hòa tan cắn A2 trong methanol rồi cho vào bình định mức 10ml, bổ sung đủ thể tích, lọc sơ bộ. Sau đó lọc qua màng lọc 0,45µm, bỏ vài ml dung dịch đầu trước khi bơm vào hệ thống. Quy trình chuẩn bị mẫu thử viên nang chứa Cao diếp cá: Cân 20 nang, tính khối lượng trung bình của bột thuốc trong nang, nghiền thành bột mịn. Cân lượng bột thuốc tương ứng với 1g cao Diếp cá, hòa tan trong 10 ml cồn 25%, lọc thu lấy dịch lọc, rửa cắn với khoảng 2 ml cồn 25%, thêm vào 20 ml chloroform, lắc đều 5 phút, chuyển vào bình lắng gạn, rút bỏ dịch chloroform. Dịch nước còn lại hòa tan với 10 ml dung dịch HCl 10%/cồn 25% đun hồi lưu. Dịch thủy phân thu được lắc với 20 ml chloroform trong 5 phút, chuyển vào bình lắng gạn để yên 60 phút, rút lấy dịch chloroform. Lặp lại 3 lần. Gộp dịch chloroform lắc với 20 ml nước. Rút dịch chloroform lọc qua Na2SO4 sau đó đem cô đến dịch CHCl3 đậm đặc (A1). Các bước còn lại xử lý như đối với mẫu thử cao Diếp cá. HCl 10% / cồn 25% Thủy phân 3h Cao Diếp cá (Viên Diếp cá) Dịch cồn 25% Dịch thủy phân Dịch CHCl3 Dịch CHCl3 đậm đặc Hòa tan vào cồn 25%, lọc Lắc với CHCl3, gạn bỏ lớp CHCl3 Lắc với H2O, gạn bỏ lớp nước. Lọc qua Na2SO4 Cô đến dịch CHCl3 đậm đặc Lắc với CHCl3 3 lần Dịch SPE chứa Quercetin Cột SPE tự chế Cắn Cô đến cắn Sơ đồ 2.1. Tóm tắt quy trình xử lý mẫu thử. 2.1.1.3. Thẩm định quy trình định lượng: Tính tương thích hệ thống: Tính tương thích hệ thống của quy trình phân tích được xác định trên giá trị và độ lặp lại của các thông số kỹ thuật của hệ thống khi tiến hành thực hiện quy trình trên mẫu chuẩn và mẫu thử với 6 lần tiêm mẫu liên tiếp. - Tiến hành: Chuẩn bị mẫu thử và mẫu chuẩn. Chạy sắc ký 6 lần với mẫu chuẩn và mẫu thử. Khảo sát các thông số: thời gian lưu, diện tích đỉnh. Xử lý thống kê các giá trị thu được. - Yêu cầu: RSD ≤ 2%. Thẩm định quy trình: Tính đặc hiệu - Tiến hành: Chuẩn bị mẫu thử và mẫu trắng (là mẫu chỉ gồm tá dược), mẫu dung môi pha mẫu, mẫu dung dịch nước acid phosphoric 0,2%. Tiến hành chạy sắc ký. - Yêu cầu: Mẫu trắng, mẫu dung môi, mẫu dung dịch nước acid phosphoric 0,2% không có các pic trùng với đỉnh chính (tương ứng với quercetin). Tính tuyến tính - Tiến hành: Chạy sắc ký và xác định hàm lượng 6 dung dịch chuẩn với nồng độ khác nhau. Xây dựng đường chuẩn và xác định R2. Thẩm định lại phương trình đường chuẩn bằng phương pháp thống kê. - Yêu cầu: R2 ≥ 0,99. Độ chính xác - Tiến hành: Xử lý 6 mẫu thử nồng độ bằng nhau. Xác định hàm lượng quercetin trong mỗi mẫu thử. Tính hàm lượng trung bình và RSD%. - Yêu cầu: RSD nằm trong giới hạn cho phép của AOAC. Độ đúng - Tiến hành: Thêm lượng chất chuẩn quercetin tương ứng với khoảng 80%, 100%, 120% hàm lượng quercetin có trong mẫu thử. Định lượng tìm lại hàm lượng hàm lượng quercetin đã thêm vào để xác định tỷ lệ phục hồi. - Yêu cầu: Tỷ lệ phục hồi trong giới hạn cho phép của AOAC. 2.2.2. Xây dựng công thức viên nang chứa cao Diếp cá: Quá trình nghiên cứu như sau: thiết kế công thức → tạo hạt → khảo sát đặc tính của hạt → đóng nang → thử độ rã → lựa chọn công thức chế phẩm. Công thức được thiết kế dựa theo phương pháp cổ điển của Gauss – Geidell. [8] 2.2.2.1. Thiết kế công thức viên nang chứa cao Diếp cá: Lựa chọn hàm lượng cao thích hợp: Cao dược liệu có khả năng hút ẩm rất lớn, hàm lượng cao càng nhiều thì khả năng hút ẩm càng mạnh. Vì vậy, chọn hàm lượng cao thích hợp sao cho giảm bớt lượng tá dược sử dụng mà vẫn đảm bảo độ ẩm thích hợp cho việc đóng nang là điều cần thiết. Để thực hiện điều này chúng tôi tiến hành như sau: Thiết kế các công thức với hàm lượng cao khác nhau, giữ nguyên tỷ lệ tá dược hút tối đa có thể sử dụng trong công thức. Tiến hành tạo hạt và khảo sát độ ẩm lúc cân bằng để tìm hàm lượng cao thích hợp. Hàm lượng cao thích hợp là hàm lượng cao cao nhất và có độ ẩm bột thuốc lúc cân bằng ≤ 5%. Lựa chọn hàm lượng tá dược dính: Cao dược liệu có độ dính khá lớn, vì vậy có thể làm ẩm bằng nước và tiến hành sát hạt, tuy nhiên tỷ lệ bột mịn thường cao. Do vậy chúng tôi chọn PVP K30 làm tá dược dính với hàm lượng là 2%. Lựa chọn hàm lượng tá dược hút: Xây dựng công thức với hàm lượng tá dược hút lần lượt là 0%, 5%, 10%, 15%, xác định độ ẩm lúc cân bằng của khối bột thuốc. Chọn hàm lượng tá dược hút sao cho độ ẩm lúc cân bằng < 5%. Lựa chọn tá còn lại và tối ưu công thức viên nang: Sau khi chọn hàm lượng cao và các loại tá dược, chúng tôi tiến hành thiết kế 10 công thức với 2 loại tá dược độn A và B có tỷ lệ: 3:1, 2:1, 1:1, 1:2,1:3; tỷ lệ tá dược hút ở giá trị tối đa và tối thiểu, cố định tá dược dính và cao. Bảng 2.4. Các công thức thiết kế tối ưu công thức viên nang. T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 Cao Diếp cá A% A% A% A% A% A% A% A% A% A% MgCO3 X1% X1% X1% X1% X1% X2% X2% X2% X2% X2% Tá dược độn A Y1% Y2% Y3% Y4% Y5% Y1% Y2% Y3% Y4% Y5% Tá dược độn B Y5% Y4% Y3% Y2% Y1% Y5% Y4% Y3% Y2% Y1% PVP K30 2% 2% 2% 2% 2% 2% 2% 2% 2% 2% Talc 1% 1% 1% 1% 1% 1% 1% 1% 1% 1% Tiến hành khảo sát các đặc tính của khối bột thuốc: góc chảy, sự phân bố cỡ hạt, độ ẩm; đo độ rã của viên nang thành phẩm và chọn công thức tối ưu. 2.2.2.2. Phương pháp khảo sát đặc tính của khối bột thuốc và đo độ rã của viên nang: Đo độ ẩm của khối bột thuốc: đo độ ẩm bằng cân sấy ẩm hồng ngoại với các thông số như sau - Lượng cân: khoảng 3g. - Nhiệt độ sấy: 105oC. - Tốc độ độ ẩm tới hạn: 0,01%/phút. Khảo sát sự phân bố cỡ hạt: Cân 50g bột thuốc, cho qua bộ rây gồm các rây 0,45mm; 0,3mm; 0,2mm, lắc đều 5 phút, cân lượng bột còn lại trên mỗi rây, vẽ đường phân bố cỡ hạt. Xác định tỷ trọng biểu kiến trước và sau khi gõ: Xác định tỷ trọng biểu kiến trước khi gõ (tỷ trọng thô) và tỷ trọng biểu kiến sau khi gõ (tỷ trọng vỗ) theo công thức sau: Với: : Tỷ trọng biểu kiến của hạt. M: Khối lượng của hạt. Vb: Thể tích biểu kiến của hạt. Tỷ trọng biểu kiến sau khi gõ xác định theo USP30 trên máy đo tỷ trọng biểu kiến Pharma test touch. Xác định lưu tính của hạt: đo góc chảy Cân 50g bột thuốc, đổ hạt chảy liên tục để tạo thành khối chóp và xác định góc nghỉ α biết: Trong đó: h: chiều cao khối bột. r: bán kính đáy của khối bột. 2r h α Hình 2.1. Phương pháp xác định góc nghỉ của bột, hạt thuốc. Độ tan rã: Thực hiện theo DĐVN IV, phụ lục 11.4. 2.2.2.3. Quy trình điều chế viên nang chứa cao diếp cá: - Trộn đều cao Diếp cá với magnesi carbonat, tá dược độn A và B bằng tay sau đó bằng máy trộn, sấy khối bột ở 50oC trong 12 giờ. - Pha tá dược dính: pha PVP K30 nồng độ 7,5% trong cồn 50%. - Trộn đều khối bột thuốc với tá dược dính, sát hạt qua rây 1,2mm, tốc độ vòng 70 vòng/phút, sau đó sấy trong tủ sấy 12 giờ ở 50oC. - Sửa hạt qua rây 0,6mm, tốc độ vòng 50 vòng/phút, thêm bột talc, trộn hành tinh 5 phút. - Đóng nang số 0 bằng máy đóng nang thủ công (the capsule machine). 2.2.3. Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho viên nang chứa cao Diếp cá: 2.2.3.1. Hình thức cảm quan: quan sát bằng mắt thường. 2.2.3.2. Độ đồng đều khối lượng: thử theo DĐVN IV, phụ lục 11.3. 2.2.3.3. Độ tan rã: thử theo DĐVN IV, phụ lục 11.6. 2.2.3.4. Độ ẩm: đo độ ẩm bằng cân sấy ẩm hồng ngoại giống mục 2.2.2.2. 2.2.3.5. Định tính: Bằng phản ứng hóa học: Cho bột thuốc trong nang vào cối chày và nghiền thành bột mịn. Cân một lượng bột thuốc tương ứng khoảng 0,5g cao Diếp cá hòa tan trong khoảng 15ml cồn 96%, đun nóng nhẹ. Lọc lấy dịch lọc chia làm 3 ống nghiệm làm các phản ứng. Bảng 2.5. Định tính viên nang chứa cao Diếp cá bằng phản ứng hóa học. Thuốc thử Cách tiến hành Yêu cầu NaOH 1% Nhỏ vào ống nghiệm vài giọt NaOH 1%. Dung dịch chuyển sang màu vàng sáng. FeCl3 1% Nhỏ vào ống nghiệm vài giọt FeCl3 1%. Dung dịch chuyển sang màu xanh đen. Mg + HCl đậm đặc Cho dịch chiết vào ống nghiệm lớn đã chứa sẵn một ít bột Mg kim loại. Thêm từ từ theo thành ống nghiệm 1 – 2 ml HCl đậm đặc. Xuất hiện màu đỏ. Bằng sắc ký lớp mỏng: Mẫu chuẩn: cho một ít tinh thể quercetin vào ống nghiệm, thêm vài giọt methanol để hòa tan. Mẫu thử: cân một lượng bột thuốc đã nghiền mịn tương ứng với khoảng 0,5g cao Diếp cá, hòa tan trong 5ml cồn 96%, lọc thu lấy dịch lọc. Thêm vào 5ml dung dịch HCl 10% rồi đun cách thủy để thủy phân. Lắc dịch đã thủy phân với 10ml chloroform, lấy dịch thủy phân chấm sắc ký. Bản mỏng: silicagel F254 (Merck). Hệ dung môi: Chloroform – Ethyl acetat – Acid formic (5:4:1). Phát hiện: bằng đèn UV ở bước sóng 254nm, nhúng thuốc thử FeCl3 trong cồn. 2.2.3.6. Định lượng: Định lượng bằng phương pháp HPLC. Các điều kiện HPLC thực hiện theo các điều kiện tối ưu đã khảo sát, dung dịch chuẩn và thử thực hiện theo mục 2.2.1.2. Hàm lượng quercetin trong một nang: Trong đó: St: diện tích đỉnh mẫu thử. Sc: diện tích đỉnh mẫu chuẩn. Cc: nồng độ chất chuẩn trong dung dịch (µg/ml). m: khối lượng bột thuốc đã cân (gam). P: khối lượng trung bình của viên (gam). a: Hàm lượng cao trong viên nang. Yêu cầu: hàm lượng quercetin nằm trong giới hạn 218,25 µg đến 266,76 µg tính theo khối lượng trung bình của bột thuốc trong nang. Chương 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG QUERCETIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC: 3.1.1. Khảo sát các điều kiện sắc ký tối ưu: Hình 3.1. Sắc ký đồ 3D mẫu thử ở bước sóng từ 250nm – 450nm. Hình 3.2. Sắc ký đồ contour mẫu thử. Nhận xét: ở bước sóng 370nm, quercetin có đỉnh cực đại hấp thu ít bị ảnh hưởng bởi các tạp khác có trong mẫu thử. Qua thực nghiệm chúng tôi đề xuất các điều kiện sắc ký tối ưu như sau: Cột: LiChrospher RP-18 (250 x 4mm, 5mm). Dung môi pha động: MeOH - dịch ước acid phosphoric 0,2% (60:40). Bước sóng phát hiện: 370nm. Tốc độ dòng: 0,8ml/phút. Nhiệt độ: 25oC. 3.1.2. Khảo sát quy trình xử lý mẫu cao Diếp cá và viên nang chứa cao Diếp cá: 1h 2h 3h C 1h 2h 3h C UV 254 Thuốc thử FeCl3 Hình 3.3. Sắc ký đồ các dịch thủy phân quercetin sau 1h, 2h và 3h. Nhận xét: qua 3 giờ thủy phân đã thủy phân hết các quercetin dạng glycosid có trong mẫu thử. 3 1 2 C 3 2 1 C UV 254 Thuốc thử FeCl3 Hình 3.4. Sắc ký đồ mẫu thử trước và sau khi loại tạp bằng SPE tự chế. Chú thích: 1. Dịch CHCl3 trước khi qua cột SPE 2. Dịch CHCl3 loại tạp 3. Dịch chứa Quercetin Nhận xét: sau khi qua SPE tự chế đã loại được phần lớn các tạp kém phân cực và các tạp phân cực trong mẫu thử. 3.1.3. Thẩm định quy trình định lượng quercetin: 3.1.3.1. Xác định tính tương thích hệ thống: Kết quả thực nghiệm để đánh giá tính tương thích hệ thống của phương pháp HPLC định lượng quercetin được trình bày trong bảng 3.1. và bảng 3.2. Bảng 3.1. Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống trên 6 lần tiêm mẫu chuẩn. STT Thời gian lưu (tR) Diện tích đỉnh (S) Hệ số dung lượng (k’) Số đĩa lý thuyết (N) 1 7,567 29435569 1,410 629 2 7,467 28338432 1,417 600 3 7,580 28285507 1,442 618 4 7,693 28461905 1,478 628 5 7,727 29062188 1,440 633 6 7,527 28337809 1,457 622 TB 7,594 28653568,330 1,441 622 SD 0,098 479523,498 0,025 12 RSD% 1,29 1,673 1,735 1,929 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống trên 6 lần tiêm mẫu thử. STT Thời gian lưu (tR) Diện tích đỉnh (S) Hệ số dung lượng (k’) Số đĩa lý thuyết (N) 1 7,633 60625893 1,461 653 2 7,427 58274555 1,400 660 3 7,400 58195873 1,418 677 4 7,487 59030548 1,421 679 5 7,573 59311624 1,427 675 6 7,647 59127296 1,457 678 TB 7,528 59094298,170 1,431 669 SD 0,015 477612,043 0,024 14 RSD% 0,199 0,808 1,677 1,644 3.1.3.2. Thẩm định phương pháp phân tích: a. Tính đặc hiệu: Hình 3.5. Sắc ký đồ mẫu chuẩn. Hình 3.6. Sắc ký đồ mẫu thử. Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu trắng. Hình 3.8. Sắc ký đồ mẫu dung môi. Hình 3.9. Sắc ký đồ mẫu dung dịch nước acid phosphoric 0,2%. Hình 3.10. Kết quả chồng phổ mẫu chuẩn, mẫu dung môi, mẫu tá dược và mẫu dung dịch nước acid phosphoric 0,2%. Nhận xét: mẫu trắng, mẫu dung môi, mẫu nước acid không có đỉnh hấp thu tại thời gian lưu 7,727 phút. Quy trình đạt tính đặc hiệu. b. Tính tuyến tính và miền giá trị: Bảng 3.3.Kết quả khảo sát tính tuyến tính của phương pháp định lượng bằng HPLC. Mẫu chuẩn Nồng độ (µg/ml) Diện tích đỉnh 1 50 28285507 2 100 60085198 3 150 90543111 4 200 121819257 5 250 161937814 6 300 191125387 Diện tích đỉnh Nồng độ (µg/ml) y = 657733,368x – 6137293,733 R2 = 0,9991 y = 657733,368x – 6137293,733 R2 = 0,9991 Hình 3.11. Biểu đồ tính tuyến tính của phương pháp định lượng bằng HPLC. Nhận xét: R2 = 0,9991 > 0,99 trong khoảng [50µg/ml, 300µg/ml]. Có sự tương quan rõ rệt giữa độ hấp thu và nồng độ trong khoảng [50µg/ml, 300µg/ml]. Khảo sát thống kê bằng phần mềm Ms-Excel với công cụ Regression cho thấy: F = 1205,280 > 6,61. Phương trình hồi quy có tính tương thích. Hệ số Bo = - 6137293,733, to = -2,033 < t0,05 = 2,571. Hệ số Bo không có ý nghĩa. Hệ số B = 657733,368, t = 34,717 > t0,05 = 2,571. Hệ số B có ý nghĩa. Phương trình hồi quy có dạng: y = 657733,368x c. Độ chính xác: Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp định lượng bằng HPLC. Mẫu Hàm lượng (µg) quercetin/1g cao Diếp cá Kết quả thống kê 1 928,48 N = 6, f = 5, = 970,02 SD = 37,76 RSD% = 3,89% P = 95% (α = 0,05) t = 2,57, e = ± 39,62 2 925,46 3 990,12 4 959,73 5 1008,35 6 1007,96 Kết luận: RSD% = 3,89% < 5,3%. Quy trình đạt độ chính xác theo AOAC. d. Độ đúng: Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng bằng HPLC. Mẫu Mức khảo sát Lượng thêm vào (µg) Lượng tìm thấy (µg) Tỷ lệ phục hồi (%) Tỷ lệ phục hồi TB (%) 1 80% 800 784,293 98,037 95,863 2 800 742,214 92,777 3 800 774,210 96,776 4 100% 1000 909,080 90,908 90,509 5 1000 914,122 91,412 6 1000 892,058 89,206 7 120% 1200 1145,754 95,479 96,191 8 1200 1152,425 96,035 9 1200 1164,682 97,057 TB 94,187 Kết luận: tỷ lệ hồi phục là 94,187% trong khoảng (90 – 107%), quy trình đạt độ đúng theo AOAC. 3.2. THIẾT KẾ CÔNG THỨC VIÊN NANG CHỨA CAO DIẾP CÁ: 3.2.1. Lựa chọn hàm lượng cao: Bảng 3.6. Các công thức thiết kế để xác định hàm lượng cao thích hợp. C1 C2 C3 C4 Cao Diếp cá 30% 40% 50% 60% MgCO3 9% 12% 15% 18% Tá dược độn A 58% 45% 32% 19% PVP K30 2% 2% 2% 2% Talc 1% 1% 1% 1% Bảng 3.7. Độ ẩm các công thức C1, C2, C3, C4. Lần đo 1 Lần đo 2 Lần đo 3 Trung bình C1 3,62% 3,73% 3,80% 3,72% C2 3,94% 4,04% 4,03% 4,00% C3 4,57% 4,63% 4,60% 4,60% C4 5,30% 5,44% 5,59% 5,44% Nhận xét: Công thức với hàm lượng cao 60% có độ ẩm > 5%, vì vậy công thức với hàm lượng cao 50% được chọn. 3.2.2. Lựa chọn hàm lượng tá dược hút: Bảng 3.8. Các công thức thiết kế để xác định hàm lượng tá dược hút. H1 H2 H3 H4 Cao Diếp cá 50% 50% 50% 50% MgCO3 0% 5% 10% 15% Tá dược độn B 47% 42% 37% 32% PVP K30 2% 2% 2% 2% Talc 1% 1% 1% 1% Bảng 3.9. Độ ẩm các công thức H1, H2, H3, H4. Lần đo 1 Lần đo 2 Lần đo 3 Trung bình H1 - - - - H2 5,52% 5,38% 5,00% 5,30% H3 4,86% 4,75% 4,73% 4,78% H4 4,40% 4,52% 4,43% 4,45% Chú thích: (-) các công thức không thực hiện được. Nhận xét: Khi chọn hàm lượng MgCO3 ≥ 10% thì công thức đạt độ ẩm ≤ 5%. Vì vậy, chúng tôi chọn hàm lượng MgCO3 ở 2 mức 10% và 15% để đưa vào thiết kế công thức. 3.2.3. Lựa chọn công thức tối ưu cho viên nang chứa cao Diếp cá: Bảng 3.10. Các công thức thiết kế tối ưu công thức viên nang. Công thức Cao Diếp cá Magnesi carbonat Tá dược độn A Tá dược độn B PVP K30 Talc T1 50% 10% 27,7% 9,3% 2% 1% T2 50% 10% 24,7% 12,3% 2% 1% T3 50% 10% 18,5% 18,5% 2% 1% T4 50% 10% 12,3% 24,7% 2% 1% T5 50% 10% 9,3% 27,7% 2% 1% T6 50% 15% 27,7% 9,3% 2% 1% T7 50% 15% 24,7% 12,3% 2% 1% T8 50% 15% 18,5% 18,5% 2% 1% T9 50% 15% 12,3% 24,7% 2% 1% T10 50% 15% 9,3% 27,7% 2% 1% 3.2.3.1. Độ ẩm: Bảng 3.11. Độ ẩm các công thức khảo sát (T1 – T10). T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 Lần 1 4,73% 4,71% 4,80% 4,70% 4,75% 4,52% 4,54% 4,60% 4,53% 4,60% Lần 2 4,70% 4,68% 4,73% 4,75% 4,80% 4.51% 4,51% 4,70% 4,56% 4,56% Lần 3 4,76% 4,71% 4,72% 4,71% 4,87% 4,47% 4,45% 4,68% 4,56% 4,67% TB 4,73% 4,7% 4,75% 4,72% 4,81% 4,50% 4,50% 4,66% 4,55% 4,61% Nhận thấy các công thức đều có độ ẩm <5% , đạt yêu cầu về độ ẩm. 3.2.3.2. Góc chảy: Bảng 3.12. Góc chảy các công thức khảo sát (T1 – T10). T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 h 3,4 3,8 3,5 3,5 3,5 3,4 3,1 3,5 3,4 3,5 r 4,5 4,8 4,7 4,5 4,6 5 4,7 4,5 4,5 4,6 tgα 0,756 0,792 0,745 0,778 0,761 0,680 0,660 0,778 0,756 0,761 α 37,1o 38,4o 36,7o 37,9o 37,3o 34,2o 33,4o 37,9o 37,1o 37,3o Nhận xét: các công thức khảo sát đều có góc chảy tốt, phù hợp để đóng nang. 3.2.3.3. Tỷ trọng biểu kiến: Bảng 3.13. Tỷ trọng biểu kiến của các công thức khảo sát (T1 – T10). T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 Vtvđ (ml) 78 80 78 75 72 81 76 74 76 76 Vsvđ (ml) 67 68 69 66 64 70 67 66 67 67 dtvđ (g/ml) 0,64 0,63 0,64 0,67 0,69 0,62 0,66 0,68 0,66 0,66 dsvđ (g/ml) 0,75 0,74 0,72 0,76 0,78 0,71 0,75 0,76 0,75 0,75 Nhận xét: các công thức đều có tỷ trọng sau va đập trong khoảng 0,71 – 0,78. Từ đó tính được phân suất nén < 5%. 3.2.3.4. Phân bố cỡ hạt: Bảng 3.14. Phân bố cỡ hạt của các công thức khảo sát (T1 – T10). <0,2 mm 0,2 – 0,3 mm 0,3 – 0,45 mm 0,45 – 0,6 mm T1 42,80% 26,60% 23,30% 7,30% T2 34,58% 25,66% 28,04% 11,72% T3 27,50% 29,10% 31,72% 11,68% T4 9,98% 18,04% 45,14% 26,84% T5 7,04% 22,20% 45,58% 21,44% T6 28,20% 30,72% 32,56% 8,52% T7 20,74% 27,50% 40,02% 11,74% T8 13,36% 25,06% 42,64% 18,84% T9 17,68% 30,00% 37,50% 14,82% T10 13,02% 26,94% 44,36% 15,68% Hình 3.12. Biểu đồ phân bố cỡ hạt của các công thức từ T1 đến T5. Hình 3.13. Biểu đồ phân bố cỡ hạt của các công thức từ T6 đến T10. Từ các biểu đồ 3.12. và biểu đồ 3.13. cho thấy: Các công thức T1, T2, T3, T6, T7 có tỷ lệ hạt mịn tương đối lớn (> 20%). Các công thức T4, T5, T8, T9, T10 có tỷ lệ hạt mịn nhỏ (< 20%) và phân bố cỡ hạt phù hợp cho đóng nang. 3.2.3.5. Độ tan rã: Bảng 3.15. Độ tan rã các công thức khảo sát (T1 – T10). Công thức T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 Thời gian rã (phút) 10 10,5 9,5 9 9 8,5 8,5 8 7,5 7,5 Các công thức đều có thời gian rã < 30 phút, đạt yêu cầu về độ tan rã của viên nang theo DĐVN IV. Trong đó công thức T9 và T10 có thời gian rã ngắn nhất. Từ các kết quả trên chúng tôi chọn công thức T9 làm công thức tối ưu cho viên nang chứa cao Diếp cá. 3.3. KIỂM NGHIỆM VIÊN NANG CHỨA CAO DIẾP CÁ: 3.3.1. Hình thức cảm quan: Viên nang cứng số 0, đầu xanh đậm, đầu xanh nhạt. Bột thuốc trong nang màu nâu đen, vị đắng hơi ngọt, mùi đặc trưng. 3.3.2. Độ đồng đều khối lượng: Bảng 3.16. Kết quả kiểm nghiệm độ đồng đều về khối lượng. STT Khối lượng nang thuốc Khối lượng nang rỗng Khối lượng bột thuốc % So với KLTB % Chênh lệch so với KLTB 1 0,5855 0,0969 0,4886 98,74 1,26 2 0,5976 0,0976 0,5000 101,04 1,04 3 0,5732 0,0947 0,4785 96,69 3,31 4 0,5901 0,097 0,4931 99,65 0,35 5 0,5771 0,0956 0,4815 97,30 2,70 6 0,5651 0,089 0,4761 96,21 3,79 7 0,5972 0,0959 0,5013 101,30 1,30 8 0,5812 0,0972 0,4840 97,81 2,19 9 0,5991 0,0989 0,5002 101,08 1,08 10 0,6050 0,0963 0,5087 102,80 2,80 11 0,5942 0,0954 0,4988 100,80 0,80 12 0,5723 0,0922 0,4801 97,02 2,98 13 0,6129 0,0992 0,5137 103,81 3,81 14 0,6053 0,096 0,5093 102,92 2,92 15 0,6135 0,0952 0,5183 104,74 4,74 16 0,5876 0,0997 0,4879 98,59 1,41 17 0,6112 0,0967 0,5145 103,97 3,97 18 0,5783 0,0947 0,4836 97,73 2,27 19 0,5933 0,0901 0,5032 101,69 1,69 20 0,5699 0,0942 0,4757 96,13 3,87 KLTB = 0,4949 3.3.3. Độ tan rã: Thời gian rã: 7,5 phút ð đạt. Bảng 3.17. Kết quả đo độ rã. Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB 7,5 phút 7,5 phút 7,5 phút 7,5 phút 3.3.4. Độ ẩm: Kết quả trung bình của 3 lần đo là 4,52% ð đạt. Bảng 3.18. Kết quả đo độ ẩm. Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB 4,45% 4,6% 4,51% 4,52% 3.3.5. Định tính: 3.3.5.1. Bằng phản ứng hóa học: Bảng 3.19. Kết quả định tính viên nang chứa cao Diếp cá. Thuốc thử Kết quả NaOH 10% Màu vàng sáng (+) FeCl3 5%/ cồn 96% Màu xang đen (+) Mg + HCl đậm đặc Màu đỏ (+) 3.3.5.2. Bằng SKLM: Kết quả: T C T C Hình 3.14. Kết quả định tính bằng SKLM viên nang chứa cao Diếp cá. UV 254 Thuốc thử FeCl3 3.3.6. Định lượng: Kết quả định lượng viên nang chứa cao Diếp cá: áp dụng công thức ở mục 2.2.3.6. Sc = 60085198; St = 62727371; Cc = 100 (µg/ml); m = 1,0334g; P = 0,4959g ð Hàm lượng trong 1 viên: 249,98 µg ð Đạt. 3.4. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN VIÊN NANG CHỨA CAO DIẾP CÁ: 3.4.1. Tiêu chuẩn kỹ thuật: 1. YÊU CẦU KỸ THUẬT: 1.1. Công thức pha chế cho một viên nang: Cao Diếp cá 250mg Tá dược vừa đủ 1 viên 1.2. Nguyên liệu: Cao Diếp cá Đạt tiêu chuẩn cơ sở Tá dược A Đạt tiêu chuẩn Tá dược B Đạt tiêu chuẩn Magnesi carbonate Đạt tiêu chuẩn cơ sở Talc Đạt tiêu chuẩn USP 27 Povidon K30 Đạt tiêu chuẩn USP 27 Cồn 96% Đạt tiêu chuẩn DĐVN IV 1.3. Chất lượng thành phẩm: 1.3.1. Tính chất: Viên nang cứng số 0, đầu xanh đậm, đầu xanh nhạt. Bột thuốc trong nang màu nâu đen, vị đắng hơi ngọt, mùi đặc trưng. 1.3.2. Độ đồng đều khối lượng: ± 7,5% so với khối lượng trung bình của bột thuốc trong nang. 1.3.3. Độ tan rã: không quá 30 phút. 1.3.4. Độ ẩm: không quá 5%. 1.3.5. Định tính: Phải có phản ứng đặc trưng của Diếp cá. 1.3.6. Định lượng: mỗi viên phải chứa quercetin trong giới hạn 218,25 µg đến 266,76 µg tính theo khối lượng trung bình của bột thuốc trong nang. 2. PHƯƠNG PHÁP THỬ: 2.1. Tính chất: kiểm tra bằng cảm quan chế phẩm phải đạt các yêu cầu đã nêu. 2.2. Độ đồng đều khối lượng: thử theo DĐVN IV, phụ lục 11.3. 2.3. Độ tan rã: thử theo DĐVN IV, phụ lục 11.6. 2.4. Độ ẩm: đo độ ẩm bằng cân sấy ẩm hồng ngoại với các thông số như sau: - Lượng cân: khoảng 3g. - Nhiệt độ sấy: 105oC. - Tốc độ độ ẩm tới hạn: 0,01%/phút. 2.5. Định tính: A. Bằng phản ứng hóa học: Cho bột thuốc trong nang vào cối chày và nghiền thành bột mịn. Cân một lượng bột thuốc tương ứng khoảng 0,5g cao Diếp cá hòa tan trong khoảng 15ml cồn 96%, đun nóng nhẹ. Lọc lấy dịch lọc chia làm 3 ống nghiệm làm các phản ứng. Nhỏ vào ống nghiệm thứ nhất vài giọt Natri hydroxyd 1% (TT). Dung dịch chuyển sang màu vàng sáng. Nhỏ vào ống nghiệm thứ hai vài giọt Sắt (III) clorid 1% (TT). Dung dịch chuyển sang màu xanh đen. Cho dịch chiết vào ống nghiệm thứ 3 đã chứa sẵn một ít bột Magnesi kim loại. Thêm từ từ theo thành ống nghiệm 1 – 2 ml dung dịch HCl đậm đặc. Dung dịch xuất hiện màu đỏ. B. Bằng sắc ký lớp mỏng: Bản mỏng Silicagel F254 (Merck). Dung môi khai triển: Chloroform – Ethyl acetat – Acid formic (5:4:1). Dung dịch chuẩn: cho một ít tinh thể quercetin vào ống nghiệm, thêm vài giọt methanol để hòa tan. Dung dịch thử: cân một lượng bột thuốc đã nghiền mịn tương ứng với khoảng 0,5g cao Diếp cá, hòa tan trong 5ml cồn 96%, lọc thu lấy dịch lọc. Thêm vào 5ml dung dịch HCl 10% (TT) rồi đun cách thủy để thủy phân. Lắc dịch đã thủy phân với 10ml chloroform, lấy dịch chloroform chấm sắc ký. Cách tiến hành: chấm riêng biệt lên bản mỏng 20µl mỗi dung dịch. Triển khai sắc ký cho đến khi dung môi đi được khoảng 10cm. Làm khô bản mỏng, kiểm tra dưới ánh sáng đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm và bằng dung dịch Sắt (III) clorid 1%/ cồn 96% (TT). Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có vết trùng với sắc ký đồ của dung dịch chuẩn. 2.6. Định lượng: Tiến hành bằng phương pháp sắc ký lỏng. Pha động: Methanol – dung dịch nước acid phosphoric 0,2% (60:40). Dung dịch chuẩn: cân chính xác khoảng 50mg quercetin chuẩn vào trong bình định mức 50ml, hòa tan và pha loãng bằng methanol (TT) đến định mức, trộn đều. Pha loãng 5ml dung dịch thu được thành 50ml với methanol (TT), trộn đều. Lọc qua màng lọc 0,45µm. Dung dịch thử: Cân 20 nang, tính khối lượng trung bình của bột thuốc trong nang, nghiền thành bột mịn. Cân lượng bột thuốc tương ứng với 1g cao Diếp cá, hòa tan trong 10ml cồn 25% (TT), lọc thu lấy dịch lọc, rữa cắn với khoảng 2ml cồn 25% (TT), thêm vào 20ml chloroform, lắc đều 5 phút, chuyển vào bình lắng gạn, rút bỏ dịch chloroform. Dịch nước còn lại hòa tan với 10ml dung dịch HCl 10%/cồn 25% đun hồi lưu. Dịch thủy phân sau đó lắc với 15ml chloroform trong 5 phút, chuyển vào bình lắng gạn để yên 60 phút, rút lấy dịch chloroform. Lặp lại đến khi chiết kiệt quercetin. Gộp dịch chloroform lắc với 20ml nước. Rút dịch chloroform lọc qua natri sulfat khan sau đó đem cô đến dịch chloroform đậm đặc. Dịch Chloroform đậm đặc cho qua cột SPE tự chế (1,0g silica kích thước hạt 40µm – 63µm, chiều dài cột 70mm, đường kính 12mm) để loại tạp. Cho 20ml chloroform qua cột SPE để loại tạp phân cực, tiếp theo cho 40ml hỗn hợp CHCl3: EtOAc – 6:4 để lấy phân đoạn chứa quercetin. Cô phân đoạn chứa quercetin đến cắn. Hòa tan cắn trong methanol rồi cho vào bình định mức 10ml, bổ sung đủ thể tích, lọc sơ bộ. Sau đó lọc qua màng lọc 0,45µm. Điều kiện sắc ký: Cột thép không gỉ (25cm x 4,0mm) được nhồi pha tĩnh C (5µm). Nhiệt độ cột: 25oC. Detector DAD, bước sóng phát hiện 370nm. Tốc độ dòng: 0,8ml/phút. Thể tích tiêm: 20µl. Cách tiến hành: Kiểm tra khả năng thích hợp của hệ thống sắc ký: Tiến hành sắc ký đối với dung dịch chuẩn. Phép thử chỉ có giá trị khi độ lệch chuẩn tương đối của diện tích peak quercetin trong 6 lần tiêm lặp lại nhỏ hơn 2,0%. Tiến hành sắc ký lần lượt đối với dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Tính hàm lượng quercetin có trong một viên nang dựa vào diện tích peak trên sắc ký đồ thu được của dung dịch thử, dung dịch chuẩn và hàm lượng quercetin có trong mẫu chuẩn. 3. ĐÓNG GÓI – GHI NHÃN - BẢO QUẢN: Đóng gói: Đóng trong chai nhựa có chất hút ẩm, mỗi chai 100 viên hoặc ép vĩ bấm, mỗi vĩ 10 viên. Nhãn: đúng quy chế. Bảo quản: Nơi khô mát, tránh ánh sáng, nhiệt độ không quá 30oC. 3.4.2. Kết quả kiểm nghiệm: Bảng 3.20. Kết quả kiểm nghiệm viên nang Diếp cá. Chỉ tiêu Tiêu chuẩn Kết quả Tính chất Viên nang cứng số 0, đầu xanh đậm, đầu xanh nhạt. Bột thuốc trong nang màu nâu đen, vị đắng hơi ngọt, mùi đặc trưng. Đúng Độ đồng đều khối lượng Khối lượng trung bình ±7,5% Đạt (0,4949 ± 4,79%) Độ tan rã Không quá 30 phút Đạt (7,5 phút) Độ ẩm Không quá 5% Đạt (4,52%) Định tính A. Bằng phản ứng hóa học Dd NaOH 1% Dd FeCl3 1% Mg/HCl đậm đặc B. Bằng SKLM Màu vàng sáng Màu xanh đen Màu đỏ Dung dịch thử phải cho một vết tương đương về màu sắc và Rf với dung dịch chuẩn. Đúng Đúng Đúng Đúng Định lượng Mỗi viên phải chứa quercetin trong giới hạn 218,25 µg đến 266,76 µg tính theo khối lượng trung bình của bột thuốc trong nang. Đạt (249,98µg/viên) Kết luận: Viên nang Diếp cá đạt tiêu chuẩn cơ sở. Chương 4 - BÀN LUẬN 4.1. VỀ xây dỰng và thẨm đỊnh quy trình đỊnh lưỢng quercetin trong cao DiẾp cá và viên nang chỨa cao DiẾp cá: Diếp cá chứa phần lớn các flavonoid có aglycon là quercetin. Vì vậy, dùng quercetin như là chất đánh dấu để kiểm soát chất lượng cao Diếp cá và viên nang chứa cao Diếp cá là phù hợp. Mẫu cao Diếp cá và mẫu viên nang chứa cao Diếp cá được xử lý để đảm bảo quá trình thủy phân các flavonoid được xảy ra hoàn toàn, quá trình loại tạp được triệt để, đảm bảo an toàn cho hệ thống HPLC. Với kết quả thu được sau khi thẩm định, các yêu cầu về tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác, tính tuyến tính và miền giá trị của phương pháp HPLC cho cao Diếp cá và viên nang chứa cao Diếp cá cho thấy phương pháp đáp ứng quy trình định lượng và không bị ảnh hưởng bởi sự hiện diện của chất khác như tá dược, dung môi hòa tan mẫu,... 4.2. VỀ nghiên cỨu xây dỰng công thỨc cho viên nang chỨa cao DiẾp cá: Bào chế viên nang thường không quá phức tạp như viên nén, thành phần khối thuốc tương đối đơn giản, không phải dùng nhiều loại tá dược như viên nén. Mặt khác, bào chế viên nén từ dược liệu không cho cảm quan tốt. Viên sau khi nén phải được bao đường hoặc bao phim, đòi hỏi kỹ thuật và thiết bị phức tạp. Vì vậy, đề tài chọn dạng bào chế là viên nang. Để bào chế viên nang thì yếu tố quan trọng nhất của khối bột thuốc là hàm ẩm và khả năng hút ẩm vì chúng có thể làm hư vỏ nang. Ngoài ra, cần phải chọn tá dược phù hợp sao cho lượng tá dược sử dụng là ít nhất. Bằng các thiết kế nghiên cứu đơn giản của Gauss – Geidell, đề tài đã chọn được tá dược hút ẩm là MgCO3 với hàm lượng là 15%, tá dược độn phù hợp, hàm lượng cao trong khối bột thuốc là 50%. Để đảm bảo chắc chắn viên nang sau khi bào chế đạt độ đồng đều khối lượng thì khối bột thuốc bào chế được phải có tỷ lệ hạt mịn nhỏ, phân bố kích thước hạt phù hợp và độ trơn chảy tốt. Để thực hiện điều đó, đề tài đã sử dụng povidon K30 làm tá dược dính để giảm tỷ lệ bột mịn, sử dụng talc để khối bột thuốc trơn chảy tốt đồng thời thiết kế lựa chọn công thức có phân bố cỡ hạt phù hợp. Về độ tan rã, viên nang bào chế được có độ tan rã tốt. Thời gian rã là 7,5 phút, thấp hơn nhiều so với tiêu chuẩn độ tan rã của viên nang theo DĐVN IV là không quá 30 phút. 4.3. VỀ xây dỰng tiêu chuẨn kiỂm nghiỆm cho viên nang chỨa cao diẾp cá: Việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghệm viên nang chứa cao Diếp cá được dựa trên tiêu chuẩn kiểm nghiệm thuốc viên nang theo DĐVN IV bao gồm các chỉ tiêu: Hình thức cảm quan, độ đồng đều khối lượng, độ tan rã, độ ẩm, định tính, định lượng. Viên nang bào chế được đạt các chỉ tiêu trên. Tuy nhiên, tiêu chuẩn kiểm nghiệm cần bổ sung thêm chỉ tiêu độ nhiễm khuẩn và độc tính bất thường để đảm bảo rằng quá trình chuyển dạng bào chế không làm phát sinh độc tính bất thường cũng như sự xâm nhập của các vi khuẩn, nấm mốc gây bệnh. Chương 5 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN: Đề tài đã xây dựng và thẩm định quy trình định lượng quercetin trong cao Diếp cá và viên nang chứa cao Diếp cá đạt các yêu cầu về tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ chính xác và độ đúng. Về nghiên cứu xây dựng công thức viên nang chứa cao Diếp cá: đã xây dựng được công thức và bào chế thành công viên nang chứa cao Diếp cá đạt các chỉ tiêu đề ra. Công thức cho một viên nang như sau: Cao Diếp cá 250mg Tá dược A 61,5mg Tá dược B 123,5mg Magnesi carbonate 75mg Talc 5mg Povidon K30 10mg Về xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho viên nang chứa cao Diếp cá: đã xây dựng được bản dự thảo tiêu chuẩn kiểm nghiệm dựa vào các tiêu chuẩn kiểm nghiệm viên nang theo DĐVN IV. Các tiêu chuẩn kiểm nghiệm bao gồm: 1. Tính chất: Viên nang cứng số 0, đầu xanh đậm, đầu xanh nhạt. Bột thuốc trong nang màu nâu đen, vị đắng hơi ngọt, mùi đặc trưng. 2. Độ đồng đều khối lượng: ± 7,5% so với khối lượng trung bình của bột thuốc trong nang. 3. Độ tan rã: không quá 30 phút. 4. Độ ẩm: không quá 5%. 5. Định tính: Phải có phản ứng đặc trưng của Diếp cá. 6. Định lượng: mỗi viên phải chứa quercetin trong giới hạn 218,25 µg đến 266,76 µg tính theo khối lượng trung bình của bột thuốc trong nang. 5.2. KIẾN NGHỊ: Đưa thêm chỉ tiêu độc tính bất thường và chỉ tiêu độ nhiễm khuẩn vào tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho viên nang chứa cao Diếp cá. Nghiên cứu sự ổn định của chế phẩm. Tiến hành sản xuất một số mẻ ở quy mô pilot để thẩm định lại các thông số công nghệ trước khi triển khai sản xuất lớn. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt: 1. Bộ môn Bào chế - Trường Đại Học Dược Hà Nội (2008), Bào chế và sinh dược học các dạng thuốc tập 2, NXB Y Học, Hà Nội. 2. Bộ môn Bào chế - Trường Đại Học Y Dược TP.HCM (2007), Bào chế học tập 2, NXB Y Học chi nhánh TP. Hồ Chí Minh, TP. Hồ Chí Minh. 3. Bộ môn Hóa phân tích, Kiểm nghiệm, Độc chất - Trường Đại Học Y Dược Cần Thơ (2010), giáo trình Kiểm nghiệm thuốc, tài liệu lưu hành nội bộ, Cần Thơ. 4. Bộ môn Hóa phân tích, Kiểm nghiệm, Độc chất - Trường Đại Học Y Dược Cần Thơ (2009), Hóa phân tích 2, Tài liệu lưu hành nội bộ, Cần Thơ. 5. Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y Học, Hà Nội. 6. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương,… (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Khoa học và Kĩ thuật, Hà Nội, tr. 321-323. 7. Võ Thị Kim Chi (2008), Nghiên cứu bào chế viên nang Linh chi - Đương quy, luận văn tốt nghiệp Dược sĩ đại học, Trường Đại Học Y Dược TP.HCM, TP. Hồ Chí Minh. 8. Nguyễn Thị Chung (2007), Ứng dụng tối ưu hóa thống kê trong nghiên cứu phát triển dược phẩm, Tài liệu lưu hành nội bộ, TP. Hồ Chí Minh. 9. Nguyễn Minh Đức (2006), Sắc ký lỏng hiệu năng cao và một số ứng dụng vào nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu và hợp chất tự nhiên, NXB Y Học chi nhánh TP. Hồ Chí Minh, TP. Hồ Chí Minh. 10. Trần Thị Việt Hoa, Lê Thi Kim Oanh (2008), “Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất từ cây Diếp Cá (Houttuynia cordata Thumb.) của Việt nam”, Tạp chí phát triển KH&CN, 11 (07), tr. 73-77. 11. Hoàng Ngọc Hùng, Vũ Chu Hùng (2006), Tá dược và chất phụ gia dùng trong dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm, NXB Y Học, Hà Nội. 12. Hoàng Thanh Hương, Trần Quỳnh Hoa, Hà Việt Bảo, Nguyễn Danh Thục (2002), “Góp phần nghiên cứu thành phần flavonoid chiết xuất từ lá cây Diếp cá - Houttuynia cordata Thunb. của Việt Nam”, Tạp chí dược học, (9), 13-15. 13. Đỗ Tất Lợi (2000), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, tr. 40-41. 14. Nguyễn Nhật Thành (2001), Nghiên cứu kỹ thuật điều chế viên nang đại bổ âm từ bài thuốc cùng tên, luận văn tốt nghiệp thạc sỹ dược học, Trường Đại Học Y Dược TP.HCM, TP. Hồ Chí Minh. 15. Nguyễn Đăng Thoại, Trần Ngọc Dân, Đỗ Thị Minh Thuận, Hoàng Minh Châu, Nguyễn Thiện Hải, Nguyễn Đức Tuấn (2009), “Xây dựng quy trình định lượng flavonoid toàn phần trong cao Bạch quả, viên bao phim O.P.Can và quercetin trong huyết tương người bằng phương pháp HPLC”, Y học TPHCM-Chuyên đề Dược, 13 (1), tr.78-83. 16. Trường Đại học Dược Hà Nội (2002), Bài giảng dược liệu. NXB Y học, Hà Nội, tr. 205-207. Tiếng Anh 17. Chang Jung - San, Chiang Lien - Chai, Chen Chi - Chain, Liu Li - The, Wang Kuo - Chih, Lin Chun - Ching (2001), “Antileukemic activity of Bidens pilosa L. var. minor (Blume) Sherff and Houttuynia cordata Thunb”, The American journal of Chinese medicine, 29 (2), pp. 303-312. 18. Cho E. J., Yokozawa T., Rhyu D. Y., Kim S. C., Shibahara N., and Park J. C. (2003), “Study on the inhibitory effects on korean medicinal plants and their main compounds on the 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical”, Phytomedicine, 10 (6-7), pp. 544-551. 19. Cho E. J., Yokozawa T., Rhyu D. Y., Kim S. C., Shibahara N., and Park J. C. (2003), “The inhibitory effects of 12 medical plants and their compoment compound no lipid peroxidation ”, Am. J. Chin. Med, 31 (6), pp. 907-917. 20. Corlett J. L., Clegg M. S., Keen C. L., Grivetti L. E. (2002), “Mineral content of culinary and medicinal plants cultivated by Hmong refugees living in Sacramento, Califonia”, Int. J. Food Sci. Nutr., 53 (2), pp. 117-128. 21. Hayashi, Kyoko; Kamiya, Mioko; Hayashi, Toshimitsu (1995), “Virucidal Effects of the Steam Distillate from Houttuynia cordata and its Components on HSV-1, Influenza Virus, and HIV”, Planta Med, 61(03), pp. 237-241. 22. In Sik Kim, Joo-Hwan Kim, Jin Sook Kim, Chi-Young Yun, Dong-Hee Kim and Ji-Sook Lee (2007), “The inhibitory effect of Houttuynia cordata extract on stem cell factor-induced HMC-1 cell migration”, Journal of Ethnopharmacology, 112 (1), pp. 90-95. 23. Kim SK, Ryu SY, No J, Choi SU, Kim YS (2001), “Cytotoxic alkaloids from Houttuynia cordata, Korea Research Institute of Chemical Technology”, Taejeon, Arch Pharm Res, 24(6), pp. 518-21. 24. Ladislav Kokoska và Vojtech Rada (2001), “Antibacterial Activity of Houttuynin Sodium Bisulphate (HSB)”, Czech J. Food Sci, 19 (1), pp. 37-40. 25. Li C, Zhao Y, Liang C, An H (2001)., “Observations of the curative effect with various liquid for post operative irrigation of ESS of treating chronic sinusitis and nasal polyps”, Lin Chuang Er Bi Yan Hou Ke Za Zhi, 15(2), pp. 53-54. 26. Lien-Chai Chiang, Jung-San Chang, Chi-Chain Chen, Lean-Teik Ng, Chun-Ching Lin (2003), “Anti-Herpes Simplex Virus Activity of Bidens pilosa and Houttuynia cordata”, The American Journal of Chinese Medicine, 31 (3), pp. 355-362. 27. Meng J., Dong X. P., Zhou Y. S., Jiang Z. H., Leung S. Y., Zhao Z. Z. (2006), “study on chemical constituents of flavonoid in fresh herb of Houttuynia cordata”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 32 (16), pp. 1335-1337. 28. Ng L. T., Yen F. L., Liao C. W., Lin C. C. (2007), “Protective effect of Houttuynia cordata extract on bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rate”, Am. J. Chin. Med., 35 (3), pp. 465-475. 29. S. H. Hu và A. F. Du (1997), “Treatment of Bovine Mastitis with Houttuynin Sodium Bisulphate”, Journal of Veterinary Medicine Series B, 44, pp. 365-370. 30. Tutupalli L. V., Chaubal M. G. (1975), “Saururaceae. V. Composition of essential oil from foliage of Houtuynia cordata and chemo systematics of Saururaceae”, Lioydia, 38 (2), pp. 92-96. Bài báo: 31. Bộ Tài nguyên và Môi trường Việt Nam (2010), “Cây dược liệu cần được quan tâm bảo tồn”, ngày 15/06/2010. 32. Viện Khoa học nghiên cứu Nhân tài Nhân lực (2009), “Sản xuất thuốc từ nguồn gốc thiên nhiên: đi tắt đón đầu cách nào?”, ngày 19/06/2009. PHỤ LỤC 1 TIÊU CHUẨN QUERCETIN CHUẨN PHỤ LỤC 2 TIÊU CHUẨN CAO DIẾP CÁ PHỤ LỤC 3 KẾT QUẢ 6 MẪU THẨM ĐỊNH ĐỘ CHÍNH XÁC Mẫu Lượng cân Diện tích đỉnh Nồng độ Hàm lượng 1 1.0428 58175756 96.82 928.48 2 1.0132 56340463 93.77 925.46 3 1.0147 60366326 100.47 990.12 4 1.0253 59124310 98.40 959.73 5 1.0102 61205139 101.86 1008.35 6 1.0036 60781545 101.16 1007.96 Trung bình 970.02 PHỤ LỤC 4 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH PHƯƠNG TRÌNH HỒI QUY Nồng độ (µg/ml) Diện tích đỉnh 50 28285507 100 60085198 150 90543111 200 121819257 250 161937814 300 191125387 SUMMARY OUTPUT Regression Statistics Multiple R 0.998757795 R Square 0.997517132 Adjusted R Square 0.99668951 Standard Error 3037521.572 Observations 5 ANOVA df SS MS F Significance F Regression 1 1.11206E+16 1.11206E+16 1205.280226 5.25464E-05 Residual 3 2.76796E+13 9.22654E+12 Total 4 1.11482E+16 Coefficients Standard Error t Stat P-value Lower 95% Upper 95% Lower 95.0% Upper 95.0% Intercept -8287879 4075262.831 -2.033704167 0.134861715 -21257184.14 4681426.139 -21257184.14 4681426.139 50 666950.162 19210.97322 34.71714599 5.25464E-05 605812.2713 728088.0527 605812.2713 728088.0527 PHỤ LỤC 5 KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH ĐỘ ĐÚNG Mức khảo sát Lượng cân Lượng có sẵn Lượng thêm vào Diện tích đỉnh Nồng độ đo Lượng tổng cộng tìm được Lượng tìm thấy Tỷ lệ hồi phục Tỷ lệ hồi phục trung bình 80% 1.032 1,001.061 800 108745246 178.535 1785.35 784.293 98.037 95.863 1.069 1,036.951 800 108368284 177.917 1779.17 742.214 92.777 1.079 1,046.652 800 110907977 182.086 1820.86 774.210 96.776 100% 1.052 1,020.461 1000 117527613 192.954 1929.54 909.080 90.908 90.509 1.095 1,062.172 1000 120375323 197.629 1976.29 914.122 91.412 1.044 1,012.701 1000 116018134 190.476 1904.76 892.058 89.206 120% 1.073 1,040.831 1200 133184101 218.659 2186.59 1,145.754 95.479 96.191 1.049 1,017.551 1200 132172426 216.998 2169.98 1,152.425 96.035 1.032 1,001.061 1200 131914554 216.574 2165.74 1,164.682 97.057 94.187