Đề tài Nhân giống cây trồng in vitro

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘIKHOA: CÔNG NGHỆ SINH HỌC******************TIỂU LUẬNĐỀ TÀI: " NHÂN GIỐNG CÂY TRỒNG IN VITRO" Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS. Nguyễn Thị Lý Anh Nhóm sinh viên thực hiện: 1.Nguyễn Thị Vân Anh 2.Phạm Thị Dung 3.Chu Thùy Dương 4.Ngô Thị Hồng Giang 5.Nguyễn Thị Hòa (510245) 6.Nguyễn Thị Hương (510248) 7.Nguyễn Thị Liên (510265) 8.Vũ Thị Vĩnh HÀ NỘI - 2/2009 MỤC LỤC: 1. Đặt vấn đề 2. Nội dung 2.1. Khái niệm nhân giống in vitro 2.2. Các phương pháp nhân giống vô tính 2.3. Quy trình nhân giống in vitro 2.4. Ứng dụng nhân nhanh in vitro 2.5. Quy trình nhân giống in vitro trên cây chuối 2.6. Khó khăn của kỹ thuật nhân giống in vitro 3. Kết luận 1. Đặt vấn đề: Trong chiến lược phát triển nông nghiệp hiện nay, việc nhân nhanh giống cây trồng bằng in vitro nhằm sản xuất giống cây trồng có chất lượng cao, sạch bệnh ngày càng được quan tâm và có nhiều thành tựu đáng kể. 1. Đặt vấn đề: Trên thế giới: Giống cây trồng , vật nuôi nhân vô tính và chuyển gen mang những đặc điểm nông sinh quí giá mà các phương pháp truyền thống không tạo ra được là một trong những mục tiêu hàng đầu của quá trình phát triển công nghệ sinh học của nhiều nước công nghiệp trên thế giới   1. Đặt vấn đề: Việt Nam: Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được du nhập từ những năm 1960 tại miền Nam và vào đầu những năm 1970 tại miền Bắc. Tuy nhiên chỉ từ cuối những năm 1980 trở lại đây công nghệ nuôi cấy mô - tế bào mới phát triển mạnh mẽ và nhanh chóng, nhiều phòng thí nghiệm, nghiên cứu đã được xây dựng và triển khai ở hầu khắp các tỉnh thành trong cả nước. Lĩnh vực áp dụng rộng rãi công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật là lĩnh vực nhân giống, bảo quản nguồn gen cây trồng. 1. Đặt vấn đề: Sản xuất chuối xuất khẩu 1. Đặt vấn đề: Sản xuất giống dứa mới phục vụ chế biến, xuất khẩu 1. Đặt vấn đề: Sản xuất hoa thương mại 2. Nội dung 2.1.Khái niệm nhân giống in vitro: Nuôi cấy mô tế bào thực vật (nuôi cấy in vitro) là phạm trù khái niệm để chỉ chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo trong điều kiện vô trùng Nhân giống in vitro là quá trình sản xuất một lượng lớn cây hoàn chỉnh từ các bộ phận, cơ quan như chồi, mắt ngủ, vảy củ, đoạn thân, lá…của cây mẹ ban đầu thông qua kĩ thuật nuôi cấy in vitro 2.2. Các phương pháp nhân giống vô tínhNhân giống vô tính có 5 phương pháp: Tách cây, chiết cành, giâm cành,ghép cành và nuôi cấy mô.  Tách cây: Đào cây lên, bỏ đất để lộ rễ, cắt rời các bộ phận rễ cây con từ cây mẹ, hoặc không đào hết cây mẹ lên mà chỉ đào bên cạnh rồi cắt lấy cây con đem trồng. 2.2. Các phương pháp nhân giống vô tính Chiết cành là phương pháp nhân giống vô tính cây trồng bằng cách cho một cành hay một đoạn cành ra rễ trên cây, sau đó tách khỏi cây mẹ, đem trồng thành cây mới 2.2. Các phương pháp nhân giống vô tính Phương pháp giâm hom có: giâm cành, giâm lá, giâm chồi và giâm rễ. Trong đó giâm cành tốc độ sinh sản nhanh hơn, hiệu quả tốt hơn cả. 2.2. Các phương pháp nhân giống vô tính Phương pháp ghép cành là lấy mô từ một phần cây (cành hoặc chồi…) nối ghép vào một cây khác (gọi là gốc ghép). 2.2. Các phương pháp nhân giống vô tínhƯu, nhược điểm của các phương pháp trên Ưu điểm: - Đơn giản, dễ làm - Chi phí thấp - Sử dụng phổ biến Nhược điểm: - Hệ số nhân giống thấp - Cây con không đảm bảo sạch bệnh virus - Phụ thuộc vào mùa vụ - Tốn công lao động, đất đai và thời gian - Một số cây trồng không áp dụng được - Cây giống dễ bị thoái hoá qua một số thế hệ 2.2. Các phương pháp nhân giống vô tính Ưu điểm của nhân giống in vitro: - Hệ số nhân giống nhanh - Cho ra các cá thể tương đối đồng nhất về mặt di truyền - Có thể nhân giống cây trồng ở quy mô công nghiệp (kể cả trên các đối tượng khó nhân bằng phương pháp thông thường) - Chủ động kế hoạch sản xuất - Tạo được cây sạch virus - Các cây sau nhân in vitro có xu hướng được trẻ hóa nên nâng cao hiệu quả nhân bằng các phương pháp thông thường sau đó Hạn chế của kĩ thuật nhân giống in vitro - Chi phí cao so với các phương pháp nhân giống vô tính khác nên giá thành không cạnh tranh - Không phải bất cứ loại cây nào cũng có thể vi nhân giống - Một số loài cây trồng rất dễ bị biến dị khi nhân giống in vitro Phòng thí nghiệm đòi hỏi trang thiết bị, hóa chất với chi phí cao 2.3. Quy trình nhân giống in vitro b1 b2 b6 b4 b3 b5 Quy tr×nh c«ng nghÖ nu«i cÊy m« TB 2.3. Quy trình nhân giống in vitro Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu sẽ làm giảm tỉ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro. Bước 2: Nuôi cấy khởi động. Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây: mô non, ít chuyên hóa (đỉnh chồi, mắt ngủ, lá non, vảy củ…) Xác định chế độ khử trùng mẫu cấy thích hợp: thường dùng các chất: HgCl2 0.1% xử lý trong 5- 10 phút, Na0Cl, Ca(0Cl)2 5-7% xử lý trong 15- 20 phút, hoặc H2O2, dung dịch Br… Bước 3: Nhân nhanh  Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính. Vấn đề là phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả là cao nhất. Theo nguyên tắc chung môi trường có nhiều cytokinin sẽ kích thích tạo chồi. chế độ nuôi cấy thường là: 25-27o C, 16h chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng 2000-4000lux  Sự phát Protocom và sinh chồi trong môi trường BAP sau 4 tuần  Sinh trưởng của Lan Hồ điệp trong môi trường bổ sung α-NAA Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ. Môi trường tạo rễ thường được bổ sung một lượng nhỏ auxin. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng. Đối với các phôi vô tính thường chỉ cần gieo chúng trên môi trường không có chất điều tiết sinh trưởng hoặc môi trường có chứa nồng độ thấp của xytokinin để phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh. Tạo rễ, cho cây in vitro hoàn chỉnh Ra rễ cho chồi Cây in vitro hoàn chỉnh Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên. Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu: Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định( số lá, số rễ chiều cao cây). Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước. Phải chủ động điều chỉnh được ẩm độ, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng như có chế độ dinh dưỡng phù hợp. Ra cây bằng than củi và rêu 2.4. Ứng dụng nhân nhanh in vitro Duy trì, nhân nhanh các dòng bố, mẹ và các dòng lai để tạo hạt giống cây rau, cây hoa và cây trồng khác Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus Bảo quản nguồn gen in vitro 2.4. Ứng dụng nhân nhanh in vitro Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý làm vật liệu cho công tác giống Ví dụ: nhân giống cây trầm hương (Aquilaria crassna) 2.4. Ứng dụng nhân nhanh in vitro Nhân nhanh các loài hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt. Ví dụ: nhân nhanh hoa lan 2.4. Ứng dụng nhân nhanh in vitro Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus Ví dụ: nhân nhanh khoai tây sạch bệnh virus 2.4.Quy trình nhân giống in vitro trên cây chuối 2.4. Quy trình nhân giống in vitro trên cây chuối Bước 1: Chọn lọc cây mẹ và giám định bệnh. Chọn lọc cây mẹ đầu dòng ưu tú bao gồm chọn các đặc tính tốt của cây như: sinh trưởng khoẻ mạnh, năng suất cao, chất lượng quả ngon và phải đúng giống. Cây sau đó được giám định kiểm tra các loại bệnh do virus như BBTV, CMV, BSV..... bằng kỹ thuật PCR. Các cây được chọn lọc phải hoàn toàn sạch các bệnh nêu trên, sau đó, được trồng trong nhà lưới để thu chồi nhân giống. 2.4.Quy trình nhân giống in vitro trên cây chuối Bước 2: Tạo chồi ban đầu và nhân chồi in-vitro. - Con chuối có chiều cao từ 0,5-1,0 m lấy từ cây mẹ đầu dòng (bước 1), tách bỏ những lớp thân giả và phần rễ củ bên ngoài, khử trùng bằng dung dịch cồn 70%. - Mẫu cấy có kích thước 1,5 x 1,5 x 1,0 cm được đưa vào môi trường tái sinh chồi (MS + 4 mg/l BA + 0,5 mg/l IAA + 30g/l sucrose +0,9 % agar Hạ Long). - Sau 4-5 tuần, khoảng 10-12 chồi/ mẫu cấy sẽ được tái sinh. - Tách mẫu cấy đã tái sinh ra từng cụm nhỏ mang 3-4 chồi, cấy sang môi trường nhân nhanh cụm chồi (MS +5mg/l BA +0,1 mg/l IAA + Ademin 80 mg/ l+ 30g/l sucrose + 0,9 % agar Hạ Long), cấy chuyền sau 4-5 tuần/ lần. Số lần cấy chuyền không vượt quá 6 lần. 2.4.Quy trình nhân giống in vitro trên cây chuối Bước 3: Tái sinh cây hoàn chỉnh. Môi trường tái sinh (MS BAP 2 mg/l + 20g/l sucrose + than hoạt tính 0,1-0,15%) sẽ được bổ sung vào bình nuôi cấy nhằm giúp chồi vươn dài và ra rễ sau 3-4 tuần nuôi cấy. 2.4.Quy trình nhân giống in vitro trên cây chuối Bước 4: Ra ngôi cây trong nhà lưới. Cây tái sinh trong bình cấy sẽ được chuyển ra nhà lưới giữ trong điều kiện mát sau 2-3 tuần trước khi ra ngôi. Cây ra ngôi cao trên 5 cm sẽ được trồng trực tiếp trong bầu đất phân gà + bao trái, xơ dừa + cát (1:1:1:1) còn những cây nhỏ hơn sẽ được chăm sóc tập trung trong khay nhựa khoảng 2-3 tuần rồi mới chuyển ra bầu đất. Cây con trước khi trồng phải đạt tiêu chuẩn cao từ 20-30 cm và mang 6-7 lá. 2.4. Quy trình nhân giống in vitro trên cây chuối 2.4. Quy trình nhân giống in vitro trên cây chuối 2.4. Quy trình nhân giống in vitro trên cây chuối 2.6. Khó khăn của kĩ thuật nhân giống in vitro Sự tạp nhiễm: vi khuẩn,nấm,côn trùng đặc biệt là ve bét thường nhiễm vào hệ thống mô mạch và gây nhiễm môi trường sau 1 tuần nuôi cấy. Vài loài vi khuẩn thường gây nhiễm: Acinebacter, Aerococcus, Agrobacterium, Bacillus, Clostridium, Curtobacterium, Erwinia, Pseudomonas…. 2.6. Khó khăn của kĩ thuật nhân giống in vitro Tính bất định về mặt di truyền: Kỹ thuật nhân giống vô tính áp dụng với mục đích tạo quần thể cây trồng đồng nhất với số lượng lớn nhưng phương pháp cũng tạo ra những biến dị tế bào soma qua nuôi cấy mô sẹo. Hiện tượng thủy tinh thể: Trong nuôi cấy mô cũng thường gặp hiện tượng thủy tinh thể mẫu nuôi cấy. Khi chuyển ra khỏi bình nuôi cấy, cây con dễ bị mất nước và tỷ lệ sống sót thấp. Dạng này thường thấy khi nuôi cấy trên môi trường lỏng hay môi trường bán rắn, đặc biệt khi sự trao đổi khí thấp, quá trình thoát hơi nước tập trung trong cây. 2.6. Khó khăn của kĩ thuật nhân giống in vitro Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cấy: Thường chúng ta hay thấy hiện tượng hóa nâu hay hoá đen mẫu làm sinh trưởng của mẫu bị ngăn chặn hay hư mẫu. Hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy có chứa các hợp chất Tannin và Hydroxyphenol, có nhiều trong mô già hơn trong mô non. Các phân tử Phenol làm nâu mẫu Cattleya là Eucomic acid và Tyramina. Để khắc phục hiện tượng đó ta dùng: Than hoạt tính, Polyvinylpyrolidone (PVP),chất khử: ascorbic acid, citric acid, L-cystein hydrochloride, ditheithreitol, glutathione và mecaptoethanol 3. Kết luận: Với lợi thế tạo ra lượng cây giống lớn, đồng đều, sạch bệnh…. nhân giống cây trồng ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật đã mở ra hướng mới cho nền sản xuất nông nghiệp hàng hóa hiện nay. Nhân giống in vitro là một hướng phát triển mới cần phải được quan tâm, đầu tư và phát triển thêm. Nhiệm vụ của các nhà nuôi cấy mô tế bào thực vật là tiếp tục xây dựng và hoàn thiện các quy trình nhân giống in vitro với các cây trồng mang lại hiệu quả kinh tế cao, đáp ứng nhu cầu thị trường.