Đề tài Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu các đặc điểm hình thái của một số chủng nấm mốc có khả năng sinh cellulase cao

iên cứu. 2. Mục đích của đề tài 2.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng tổng hợp cellulase. 2.2. Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái của một số chủng nấm mốc phân lập được. 2.3. Bước đầu phân loại sơ bộ một số chủng có hoạt tính cellulase cao nhất. 3 3. Nội dung của đề tài Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh cellulase trên các phế phụ phẩm nông nghiệp ở miền Bắc Việt Nam ( Mỹ Đức- Hà Nội, Tam Dương – Vĩnh Phúc ) Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái của chủng nấm mốc có khả năng sinh cellulase Định loại chủng mốc có khả năng sinh cellulase cao, nhằm chọn những chủng nấm mốc thuộc danh mục an toàn (thường dùng trong công nghệ sinh học). 4. Ý nghĩa của đề tài 4.1. Tìm hiểu sự đa dạng của các chủng nấm mốc có khả năng sinh cellulase trên các phế phụ phẩm nông nghiệp ở miền Bắc Việt Nam. 4.2. Nâng cao khả năng nghiên cứu các đặc điểm phân loại của một số chủng nấm mốc có khả năng sinh cellulase ở Việt Nam. 4.3. Tìm ra những chủng nấm mốc thuộc danh mục an toàn sinh học có khả năng sinh cellulase cao nhằm ứng dụng có các nghiên cứu tiếp theo. 5. Điểm mới của đề tài Trong các chủng nấm mốc phân lập được, dựa theo phương pháp phân loại truyền thống, tôi xác định được chủng M 251 thuộc loài Aspergilus niger, đây là loài thuộc danh mục an toàn sinh học, có tiềm năng ứng dụng cao trong sản xuất enzyme bổ sung vào thức ăn vật nuôi. 4 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đại cƣơng về nấm mốc Phần lớn nấm mốc thuộc nhóm phân loại Deuteromycetes, một số là dạng sinh sản vô tính của các nhóm nấm túi (Ascomycetes) hoặc nhóm nấm đảm (Basidiomycetes). Deuteromycetes bao gồm khoảng 2400 chi trong đó có 1700 chi thuộc nhóm nấm Hyphomycetes và 700 chi thuộc nhóm Ceolomycetes. Theo E.Kiffer, M. Morelet, 2000, trong số các chi nấm thuộc tổ chi Phialoconidiae ( lớp phụ Euhyphomycetidae, lớp Hyphomycetes, ngành phụ Deuteromycetes) thì chi Penicillium có số loài nhiều nhất là khoảng 223 loài, tiếp theo là chi Aspergillus có khoảng 185 loài [16]. 1.1.1. Nấm bất toàn (Deuteromycetes) Nấm bất toàn là giai đoạn vô tính của nấm túi hoặc nấm đảm. Theo hệ thống phân loại căn cứ vào đặc điểm phát sinh của bào tử trần của Hughes (1953). Lớp nấm bất toàn được chia thành 3 nhóm: Nhóm Hyphomycetes: Gồm các nấm bất toàn không có túi giá và đĩa giá (giá sinh bào tử trần ở trên các sợi nấm hoặc các sợi nấm kết lại thành bó sợi, bó giá). Nhóm Coelomycetes: Gồm các nấm bất toàn có túi giá hoặc đĩa giá, giá bào tử trần ở trong các thể quả (Fruit - body) gọi là các conidiomata. Nhóm Agonomycetes: Gồm các nấm bất toàn không có bào tử trần. Ở đây chúng tôi giới thiệu 2 khoá phân loại đến chi của lớp nấm bất toàn. 5 Phân lớp của nấm bất toàn 1.1.1.1. Hyphomycetes (moniliaales- nấm bông, 1700 chi, 11000 loài) Các dạng hệ sợi nấm mang các bào tử trên sợi riêng rẽ hoặc trên cụm sợi nấm (như các đệm nấm, các bó giá), nhưng không ở trong các conidiomata (fruit body) riêng biệt. Hình 1.1. Các dạng Hyphomycetes 1.1.1.2. Coelomycetes (nấm xoang, 700 chi, 9000 spp) riêng rẽ Bào tử trần sinh ra trong các túi giá, đĩa giá, túi giá dạng cốc hoặc đệm giá. Hình 1.2. Giá sinh bào tử Coelomycetes 6 Hình 1.3. Cấu tạo một Coelomycetes 1. Bào tử trần, 2. Tế bào sinh bào tử trần, 3. Cuống sinh bào tử trần, 4. Sợi nấm Những bộ phận sinh sản vô tính Hypha (sợi nấm): Một trong các sợi trong hệ nấm là các tản của một sợi nấm. Các tản khác biệt với các phần sợi sinh dưỡng hấp phụ chất dinh dưỡng Bào tử trần: Một tế bào bất kỳ mà từ đó một bào tử được sinh ra trực tiếp. Các kiểu phát sinh bào tử trần: Tản (a ), nảy mầm ( b). Hình 1.4. Các kiểu phát sinh bào tử trần 7 1.1.1.3. Agonomycetes( mycelia sterilia - nấm bất thụ) Agonomycetes không có khả năng sinh sản bằng bào tử. Một số tạo thành cấu trúc gọi là sclerotina, các bào tử áo (chlamydospore ) hoặc các tế bào dày ( tế bào Hulle). Nói chung đây là nhóm không có các đặc điểm đặc trưng để phân loại ( Erick H.C.Mckenzie, 2004; Michael J.Carlie, Sarah C Watkinson, Graham, 1994) [18], [19]. Năm 1995, Hughes đã đưa ra khóa phân loại có tính liên kết và tổng quát hơn về nhóm Hyphomycetes. Ông chia nhóm này thành 8 tổ chi dựa vào đặc điểm của giá bào tử trần ( conidiophores) và bào tử trần ( conidia). Năm 1968, Baron lại đưa ra một khóa phân loại khác hoàn chỉnh hơn mà ngày này nhiều nhà nấm học vẫn sử dụng (H.L.Barneet & Barry B. Hunter, 1973), trong đó các đặc điểm của conidia, các kiểu tạo thành conidia từ các tế bào sinh ra nó, sự tiến hóa của các tế bào conidia và các tế bào sinh ra nó... là những đặc điểm quan trọng để phân loại ( Erick H.C. Mckenzie, 2004; E. Kifer & N Morelet, Robert K. Noyd, 2000) [18], [16], [21]. Gần đây, trong các khóa phân loại của mình E. Kifer & N. Morelet, Robert K. Noyd ( 2000) [16], [21] đã kết hợp khóa phân loại của Saccardo ( 1880 – 1884) và Grove ( 1919) để phân chia Deuteromycota thành 2 lớp lớn là Hyphomycetes và Coelomycetes dựa vào cách sắp xếp của các giá bào tử trần. Lớp Hyphomycetes: đặc trưng bởi các giá bào tử trần ( condiophores) tạo ra trên sợi nấm, không tạo thể quả vô tính. Lớp Coelomycetes: các giá bào tử trần ( conidiophores) được sinh ra trong các thể quả vô tính (axesual ascomata). 8 1.1.2. Các kiểu phát triển bào tử trần trong sự phát sinh bào tử dạng nảy chồi (blastic) (Theo Katsuhiko Ando, 2002) [15]. Sự phát sinh bào tử phân cắt hoàn toàn: Kiểu bào tử đính (Aleurio - type), một điểm trên tế bào sinh bào tử trần, bào tử đơn độc (H.1.5a ). Kiểu nảy chồi (Blasto - type): Cấu trúc màng đỉnh ở vị trí trên tế bào sinh bào tử trần và chuỗi bào tử với một vị trí để tạo thành mộ chuỗi liên tiếp không phân nhánh (chuỗi gốc già) ( H.1.5b ). Hình 1.5. Các kiểu phát triển của bào tử trần Phát sinh bào tử nội sinh: Dạng bình (Phialo - type), Các chuỗi bào tử ra khỏi tế bào sinh bào tử trần ở cùng một vị trí, đôi khi trong các chuỗi rời tế bào có thay đổi ( H.1.5c). Dạng phân đốt (Annello - type), Các chuỗi bào tử ra khỏi tế bào sinh bào tử trần ở các vị trí cao hơn, thỉnh thoảng trong các chuỗi rời, tế bào có thay đổi (H.1.5d ). 1.1.3. Sự phát triển của các tế bào sinh bào tử trần Tế bào sinh bào tử trần phát triển theo nhiều kiểu: Kiểu ổn định, kích thước của tế bào sinh bào tử trần là ổn định (H1.6a) . Kiểu kéo dài, tế bào sinh bào tử trần phát triển cùng với sự sản sinh các bào tử trần (H1.6b) . Kiểu giảm 9 dần, độ dài các tế bào sinh bào tử trần giảm đi khi mỗi bào tử trần được sinh ra (H1.6c). Hình 1.6. Các dạng phát triển của tế bào sinh bào tử trần 1.1.4. Cuống sinh bào tử trần Một sợi nấm phân nhánh hoặc đơn giản (một sợi nấm sinh sản) mang hoặc gồm có các tế bào sinh bào tử trần mà từ đó các bào tử trần được sinh ra. Đôi khi được dùng khi mô tả những cấu trúc biến đổi đối với các tế bào sinh bào tử trần. Hình 1.7. Cuống sinh bào tử trần 10 Có nhiều dạng: dạng có hoặc không có vách ngăn đơn giản không phân nhánh ( H1.8c), dạng cuống sinh bào tử trần kéo dài cùng với việc sinh bào tử trần (H1.8d ), dạng cuống có vách ngăn, phát triển đơn độc hoặc phân nhánh (H1.8e). Hình 1.8. Các dạng cuống sinh bào tử trần đặc biệt 1.1.5. Bào tử trần (conidia) Có nhiều hình dạng khác nhau: Hình dạng đơn giản. Ví dụ: Cầu, gần cầu, elip, hình quả thận (H.1.9a) .b. Bào tử sợi, tỷ lệ chiều dài và rộng của bào tử = 15:1 (H1.9b) . Bào tử vách lưới, bào tử được chia nhỏ ra bởi các vách ngăn chéo nhau (H1.9c). Bào tử xoắn ốc trục bào tử uốn cong hơn 1800 (H1.9d ). Bào tử dạng chữ thập, bào tử có nhiều trục, có mấu, có lông mềm chiếm 1/4 chiều dài của bào tử (H1.9e). 11 Hình 1.9. Một số hình dạng bào tử trần 1.2. Chi Aspergillus Micheli ex Fries 1.2.1. Tình hình nghiên cứu phân loại Aspergillus trên thế giới Chi Aspergillus do Micheli mô tả lần đầu tiên năm 1729, sau đó năm 1809, Link đã mô tả loài Aspergillus glaucus và loài nấm túi Eurotiumherbariorum được phát hiện trên cùng một tiêu bản mẫu cây khô. Fries ( 1832) đã công nhận chi nấm này của Micheli. De Bary ( 1850) phát hiện ra rằng, giai đoạn bào tử trần của Eurotium herbariorum chính là Aspergillus glaucus. Như vậy, theo Luật pháp Quốc tế và danh pháp thực vật, chi Aspergillus chính thức mang tên Aspergillus Micheli ex Fries. Chuyên luận về chi Aspergillus xuất bản gần đây nhất và vẫn đang được sử dụng rộng rãi để định loại các loài của chi nấm này là chuyên luận của Raper và Fennell (1965). Hệ thống phân loại chi Aspergillus của Raper và Fennell (1965) [24] gồm 132 loài (đã được chấp nhận) và được xếp vào 18 nhóm loài (Robert A. Samsom, 1999) [25] , đến nay vẫn ổn định và được sử dụng rộng 12 rãi, về cơ bản không sửa đổi, mặc dù cho đến nay một số loài mới thuộc chi nấm này đã được công bố với số loài hiện biết là 185 loài Aspergillus (E. Kifer & N. Morelet; Robert K. Noyd, 2002) [16], [21]. Để có thể xử lý phân loại một số lượng lớn các loài thuộc chi này, các nhà nghiên cứu trước đây đã chia nó ra thành các nhóm loài (group) hoặc các thứ (series) dựa trên màu sắc bào tử, hình dạng và kích thước của bọng đỉnh giá, sự có mặt của trạng thái hữu tính... (Raper và Fennell ,1965) [24]. Năm 1985, Gams và cộng sự đề nghị đổi các nhóm loài (group) thành các chi phụ (subgenera) và các tổ chi (sections) để cho nó phù hợp với danh pháp thực vật hơn. Dưới đây là phần tóm tắt hệ thống phân loại chi Aspergillus hiện đang được sử dụng rộng rãi (Maren A. Klich, 2002) [17]. Ở đây chúng tôi bổ sung tên các nhóm loài ( group) tương đương trong chuyên luận của Raper và Fennell, 1965 [24]. Chi Aspergillus Micheli ex Fries. Chi phụ Aspergillus: thể bình dạng đơn tầng ( uniseriate), ưa khô, bào tử màu lục xám Tổ chi ( Section) Aspergillus ( tương đương với A.glaucus Group): dạng hữu tính eurotium, thể quả (cleistothecia) màu vàng với thành là một lớp tế bào nhu mô giả hình đa giác, bào tử túi (ascospore) trong suốt. Tổ chi ( Section) Restricti ( tương đương vói A.restricus Group): chỉ có dạng vô tính, sinh trưởng chậm trên tất cả các môi trường. Chi phụ Fumigati: dạng thể bình đơn tầng. Bọng đỉnh giá thương có hình quả lê, bào tử màu lục xám, lục xanh đến màu cam. 13 Tổ chi (Section) Fumigati ( tương đương với A.fumigatus Group): bào tử màu lạc xám đến lục xanh. Tổ chi (Section ) Cervini ( tương đương với A.cervinus Group) : bào tử cam nhạt đến cam xám. Chi phụ Ornati : thể bình dạng đơn tầng, bào tử màu lục xám, lục vàng hoặc nâu olive. Tổ chi (Section) Ornati ( tương đương với A.ornatus Group): giống với chi phụ. Chi phụ Clavati: Thể bình dạng đơn tầng, bọng đỉnh giá chủ yếu hình chùy, bào tử có màu lục xám Tổ chi ( Section) Clavati (tương đương với A.nidulans Group): giá bào tử trần ngắn, thường nâu, bào tử lục, thường có tế bào Hulle, đa số các loài có trạng thái hữu tính Emericella. Thể quả có thành mềm, bao quanh bởi tế bào Hulle, bào tử màu đỏ đến tía. Tổ chi (Section ) Versicolores (tương đương với A.versicolor Group): giá bào từ trong suốt đến nâu, bào tử lục, lục xám hoạc lục xanh. Tổ chi (Section ) Usti (tương đương với A.ustus Group): giá bào tử trần màu nâu, bào tử màu đỏ đục, nâu hoặc olive. Tổ chi (Section ) Terrei (tương đương với A.terreus Group): giá bào tử trần trong suốt, bào tử màu da bò, đến cam nâu. 14 Tổ chi (Section) Flavipedes ( tương đương với A. flavipes Group): giá bào tử trần trong suốt đến nâu nhạt, bào tử màu trắng đến da bò. Chi phụ Circumdati: thể bình dạng lưỡng tầng hoặc đơn tầng, bọng giá hình cầu cho đến hình quả lê. Tổ chi (Section) Wentii (tương đương với A.wentii Group): bào tử màu da bò, nâu vàng cho đến nâu olve. Tổ chi (Section) Flavi (tương đương với A .flavus Group): bào tử màu lục vàng đến nâu olive. Tổ chi (Section) Nigri (tương đương với A.niger Group): giá bào tử trần có thành nhẵn, bào tử đen hoặc gần đen. Tổ chi ( Section) Circumdati (tương đương với A.ocharaceus Group): thể bình thường là dạng lưỡng tầng, bào tử vàng Tổ chi ( Section) Candidi (tương đương với A.candidus Group): bào tử trắng hoặc gần trắng. Tổ chi ( Section) Cremel (tương đương với A.cremeus Group): bào tử nâu, vàng hoặc xanh lục. Tổ chi ( Section) Sparsi (tương đương với A.sparsus Group): bào tử xám nhợt đến màu olive. Chi phụ Stilbothamnium: đặc điểm nổi bật là các giá bào tử trần tập hợp thành bó, dạng cụm lớn, thẳng. Chi phụ này được thiết lập bởi Samson và Seifert năm 1985 (J.E.Smith, 1994). Tuy nhiên, sự sắp đặt của một số loài và sự tồn tại 15 của một số nhóm loài này vẫn đang có nhiều tranh cãi ( Ozakiewiez, 1989; Samson & Frisvad, 1991; Peterson, 2000 [25]. 1.2.2. Đặc điểm sinh học của Aspergillus Các đặc điểm đặc trưng của chi Aspergillus Micheli ex Friex Hệ sợi nấm gồm các sợi có vách ngăn phân cách,, không màu, màu nhạt, hoặc một số trường hợp trở nên nâu hay màu sẫm khác ở vùng nhất định của khuẩn lạc. Sinh sản vô tính bằng bào tử trần (conidia). Cũng như các loại nấm bất toàn khác, hình thái cơ quan sinh bào tử trần là một đặc điểm chủ yếu, đặc trưng dùng trong phân loại chi nấm này. Các đặc điểm cơ quan sinh bào tử trần Cơ quan sinh bào tử trần phát triển tử một tế bào đặc biệt gọi là tế bào chân (foot- cell) có đường kính lớn hơn, màng dày hơn các tế bào lân cận của sợi nấm. Tử tế bào chân phát triển thành giá bào tử trần ( condiophore hay stipe). Giá bào tử trần có thể có vách ngăn, bề mặt nhẵn hoặc không nhẵn, trong suốt hoặc có màu, dài hay ngắn tùy thuộc vào loài. Phần ngọn của giá bào tử phình rộng tạo thành bọng định giá ( versicle). Bọng định giá có thể có nhiều hình thái khác nhau, đây là một đặc điểm đặc trưng đế phân loại Aspergillus với các loại nấm Hyphomycetes khác, đặc biệt với các chi Penicillium. Bọng đỉnh giá có thể có hình cầu, hình bán cầu, hình chùy, hình quả bầu, hình bàn chang. 16 Từ bọng đỉnh giá sinh ra các tế bào sinh bào tử trần gọi là thể bình ( phialide). Nếu các thể bình sinh ra trực tiếp từ bọng đỉnh giá thì gọi là dạng đơn tầng (uniseriate). Nếu các thể bình được sinh ra qua một lớp tế bào gốc xuất phát từ bọng đỉnh giá ( lớp cuống thể bình, metulae) thì gọi là dạng lưỡng tầng ( biseriate). Philade hoặc metulae mọc trên bọng đỉnh giá cũng là đặc điểm đặc trưng để phân biệt Aspegillus với các chi có quan hệ gần gũi với nó. Từ thể bình sinh ra các bào tử trần (conidia). Bào tử trần không có vách ngăn, khác nhau về hình dạng, kích thước, màu sắc... ở các loài khác nhau. Hình 1.10. Các kiểu cuống bào tử đính của Aspergillus: a. 1 lớp - b. 2 lớp - c. phiến - d. tia, e. tể (theo Samson và ctv., 1995) Ở một số loài Aspergillus người ta đã tìm thấy hình thức sinh sản hữu tính (telrmorph) của chúng, các loài này được xếp vào các chi của nấm túi như 17 Emercella, Eurtium, Neosartorya và một số chi khác (Raper & Fennell, 1965; Samson, 1979) [17]. Đặc điểm đặc trưng của nhóm loài Aspergillus niger Theo khóa phân loại chi Aspergillus (Raper & Fennell, 1965; Al- Musallam, 1980; Domsch et al; 1980; Klich & Pitt; Kozakiewiez, 1989; Tzean et al., 1990; Parenicova, 2000 và Maren A Krick, 2002) [17], [24] thì nhóm loài Aspergillus niger có những đặc điểm nổi bật sau: Bông nấm (conidial head): dạng màu đen tối, đen hơi lục, đen hơi nâu, đen tía hoặc đen cacbon; có hình cầu hoặc phóng xạ hoặc chia ra thành các cột không đều, đặc. Giá bào tử trần ( conidiophore, stipe): thường nhẵn hoặc hơi ráp ở một số loài, thành thường dày. Bọng đỉnh giá (vesicle): hình cầu hoặc gần cầu.Các lớp thể bình (seriation): đơn tầng hoặc lưỡng tầng tùy ở từng loài. Bào tử trần (conidia): hình cầu, gần cầu, elip, nhẵn hoặc gần nhẵn, hơi ráp hoặc ráp.Hạch nấm: hình cầu đến cầu, màu kem khi non, khi già màu lông bò hoặc hồng hoặc nâu. 1.3. Sơ lƣợc về Penicillium Theo E. Kiffer, M. Morelet, 2000, trong số các chi nấm thuộc tổ chi Phialoconidiae ( lớp phụ Euhyphomycetidae, lớp Hyphomycetes, ngành phụ Deuteromycotina) thì chi Penicillium có số loài nhiều nhất là khoảng 223 loài, chúng phân bố khắp nơi trên trái đất, cư trú ở trên rất nhiều các ổ sinh thái.[16]. Theo Bùi Xuân Đồng và Nguyễn Huy Văn (2001: 186-187) [1] chi Penicillium đặc trưng bởi các đặc điểm: 18 Sợi nấm ngăn vách, phân nhánh, không màu hoặc màu nhạt, đôi khi màu sẫm. Khuẩn lạc màu lục, vàng lục, xanh lục, lục xám, xám, đôi khi có màu vàng, đỏ, tím hoặc trắng. Mặt trái khuẩn lạc không màu hoặc có màu sắc khác nhau, môi trường thạch nuôi cấy không màu hoặc có màu sắc do có mặt các sắc tố hòa tan tương ứng. Bộ máy mang bào tử trần (còn gọi là "chổi", penicillius) hoặc chỉ gồm giá bào tử trần với một vòng thể bình ở đỉnh giá, hoặc gồm giá bào tử trần với hai đến nhiều cuống thể bình (metulae) ở phần ngọn giá, trên đỉnh của mỗi cuống thể bình đó có các thể bình (cấu tạo hai vòng, biverticillate). Giá bào tử trần có thể phát triển từ các sợi nấm nằm sát cơ chất, sát mặt môi trường thạch nuôi cấy (các sợi nền), khi đó thường có chiều dài đều nhau và khẩn lạc có dạng mặt nhung (velutinate). Bào tử trần cũng như giá bào tử trần, các nhánh, các cuống thể bình, các thể bình tùy từng loại có mặt ngoài nhẵn, ráp, có gai hoặc sần sùi, gồ ghề. Hình 1.11. Chi Penicillium Link ex Fries. Các thành phần của chổi (bộ máy mang bào tử trần). 19 1.4. Cellulose va cellulase 1.4.1. Cellulose Cellulose là polysaccarit chủ yếu của thành tế bào thực vật. Trong bông nó chiếm trên 90%, còn trong gỗ hơn 50%. Ngoài ra, người ta còn thấy chúng có nhiều ở tế bào một số loài VSV. Ở tế bào thực vật và ở tế bào một số loài VSV, chúng tồn tại ở dạng sợi. Khi đun sôi với axit sulfuric đặc, cellulose sẽ chuyển thành glucose còn khi thủy phân trong điều kiện nhẹ nhàng sẽ tạo thành disacarit cellobiose [12]. Cellulose không có trong tế bào động vật. Chúng là một homopolimer mạch thẳng, được cấu tạo bởi các β-D-glucose-pyranose. Các thành phần này liên kết với nhau bởi liên kết β-1,4 glucoside. Tinh bột cũng được cấu tạo bởi các glucose này và bằng liên kết β-1,4 glucoside. Điểm khác biệt là tinh bột chứa các gốc glucose phân nhánh còn cellulose chứa các glucose không phân nhánh. Các gốc glucose trong cellulose thường lệch một góc 1800 và có dạng như một chiếc ghế bành. Cellulose thường chứa 10.000-14.000 gốc đường và được cấu tạo như sau: [12] Hình 1. 12. Cấu trúc không gian của Cellulose Trọng lượng phân tử của cellulose khoảng từ 50000-2500000 Dalton. Các phân tử cellulose kết hợp với nhau nhờ lực hút Vandervan và liên kết 20 hydro.Các phân tử cellulose tạo nên sợi sơ cấp có đường kính khoảng 3nm. Các sợi sơ cấp kết hợp với nhau tạo thành vi sợi. Trong điều kiện tự nhiên, các vi sợi thường không đồng nhất, chúng thường tồn tại 2 vùng: Vùng kết tinh: các mạch cellulose kết với nhau theo một trật tự đều đặn nhờ liên kết hydro nối nhóm hydroxyl thứ nhất của mạch này với nhóm hydroxyl ở mạch cacbon của mạch khác. Ở vùng này cellulose rất bền vững dưới tác động của điều kiện bên ngoài. Enzym cellulase chỉ có tác dụng ở bề mặt hệ sợi ở vùng này. Vùng vô định hình: các mạch liên kết với nhau nhờ lực Vandervan. Ở vùng này cellulose có cấu trúc không chặt và dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài. Khi gặp nước, chúng dễ bị trương phồng lên, enzym cellulase rất dễ tác động, làm thay đổi toàn bộ cấu trúc của chúng. Trong phân tử cellulose có nhiều liên kết hydroxyl tồn tại dưới dạng tự do, hydrogen của chúng dễ bị thay thế bởi một số gốc hoá học như metyl hoặc gốc acetyl tạo nên các dẫn xuất ete hoặc este của cellulose. Một trong những dẫn xuất được ứng dụng rất nhiều là CMC, trong đó một số nhóm hydroxyl của cellulose được thay thế bằng gốc –OCH2COOH Hình 1.13. Cấu trúc không gian của CMC 21 Trong tự nhiên celulose khá bền vững, không tan và bị trương lên khi hấp thụ nước. Cellulose bị thủy phân khi đun nóng với axit hay kiềm ở nồng độ khác cao, hoặc bị phân giải dưới tác dụng của cellulase được tổng hợp bởi các vi sinh vật [3]. 1.4.2. Cellulase Tên gọi cellulase dùng để chỉ chung cho các enzym tham gia phân cắt hợp chất cellulose. Tất cả các enzym cellulase đều có tác dụng phân cắt liên kết -1,4 giữa 2 đơn vị glucose và được các nhà khoa học phân ra làm 3 nhóm chủ yếu sau đây: 1,4 -D-glucan cellobiohydrolase (EC.3.2.1.91) (CBH). Enzym cắt đầu cuối của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose. Enzym này còn có một loạt các tên khác như: cellobiohydrolase, cellobiosidase và avicellase. Ngày nay nó được coi là enzyme chủ đạo phân giải cellulose, bởi nó có khả năng phân cắt cellulose ở cả vùng kết tinh. 1,4 -D-glucan –4- glucanohydrolase (EC.3.2.1.4) (EG). Enzym này tham gia phân giải liên kết -1,4 glucoside trong cellulose và -D-glucanase. Sản phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose, và glucose. Enzym này còn có một loạt tên khác như: endoglucanase, endo 1,4 -D-glucanase, C-cellulase. β- 1,4 -D-glucoside glucohydrolase (EC.3.2.1.21). Enzym này tham gia phân hủy cellobiose tạo thành glucose. Chúng không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy. Trong các tài liệu khoa học, chúng có tên là cellobiase và glucosidase [3]. 22 1.4.3. Ứng dụng của cellulase 1.4.3.1. Ứng dụng enzyme cellulase trong chế biến thực phẩm Trong quá trình sản xuất các loại nước quả và nước uống không cồn dựa trên việc trích li dịch quả từ thịt nghiền. Các loại quả sau khi tách vỏ bỏ hạt được nghiền, thu được thịt quả nghiền có dạng dịch nhuyễn. Từ thịt quả nghiền đã ép bã thu được dịch quả. Dịch này thường chứa các thành phần tế bào thịt quả và các thành phần của polysaccharide làm cho dịch quả có độ nhớt cao. Để tăng hiệu suất trích li dịch quả, giảm bớt độ nhớt, tăng mức cảm quan nước quả và giảm bớt một số công đoạn, việc bổ sung endoglucanase rất quan trọng. Enzyme này là điểm mấu chốt cải thiện hiệu suất dịch hóa. Sự kết hợp của glucanase và pectinase sẽ phá hủy hoàn toàn màng tế bào. Trong quá trình sản xuất, ở giai đoạn dịch hóa bổ sung hỗn hợp các enzyme cellulase, hemicellulase sẽ đem lại hiệu quả của chế phẩm, làm cho độ đồng thể của nước quả có thịt sẽ tốt hơn [2], [3]. Trong công nghệ sản xuất bia, các chế phẩm enzyme amylase, protease và glucanase đã được sử dụng để ngăn chặn sự tạo thành các diacetyl, do đó giảm lượng diacetyl được tạo thành, rút ngắn thời gian cần thiết để ủ bia. Trong dịch lên men có chứa một lượng β-glucan, chất này ảnh hưởng tới khả năng lọc và gây đục cho bia (Đặng Thị Thu et al., 2004) [3]. Trong quá trình sản xuất cà phê ở Việt Nam, cà phê chủ yếu được sản xuất bằng phương pháp khô, phương pháp này cho chất lượng cà phê không cao. Để tiến hành nâng cao chất lượng cà phê, phương pháp lên men đã được áp dụng. Đó là quá trình sử dụng phức hệ enzyme cellulase và pectinase để xử lý bóc vỏ cà phê và làm tăng khả năng ly trích dịch quả. Trong khâu bóc vỏ, cellulose gây hiện tượng thẫm mầu, làm giảm chất lượng sau khi sấy, đồng thời cản trở cho việc bóc vỏ. Khi sử dụng chế phẩm A. niger có tên thương mại là Biovina-09 có hoạt tính pectinase và cellulase cho 23 thấy số lượng cà phê được bóc vỏ tăng, hạt cà phê được bóc vỏ bằng chế phẩm không còn nhớt như hạt không sử dụng chế phẩm enzyme và hiệu suất bóc vỏ khá cao. Trong quá trình ly trích dịch quả, cellulose và pectin cản trở sự thoát các chất hòa tan trong tế bào ra ngoài tế bào. Khi sử dụng chế phẩm Biotin-09 hiệu suất trích ly cao hơn mẫu không sử dụng là 46% (Nguyễn Đức Lượng, 2003) [5]. 1.4.3.2. Trong công nghệ sử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh Rác thải là nguồn chính gây nên ô nhiễm môi trường dẫn tới mất cân bằng sinh thái và phá hủy môi trường sống, đe dọa tới sức khỏe và cuộc sống con người. Thành phần hữu cơ chính trong rác thải là cellulose, nên việc sử dụng công nghệ vi sinh trong xử lý rác thải cải thiện môi trường rất có hiệu quả. Hiện nay, có rất nhiều những nghiên cứu về việc sử dụng cellulase do các chủng vi sinh vật tiết ra nhằm thủy phân cellulose trong rác thải. [2], [6]. Phức hệ cellulase được sử dụng để xử lý nguồn nước thải do các nhà máy giấy thải ra. Nguyên liệu làm giấy là gỗ (sinh khối của thực vật bậc cao). Sinh khối này chứa rất nhiều loại polysaccharide, trong đó các polysaccharide quan trọng quyết định tới chất lượng, số lượng giấy là cellulose. Vì vậy, nước thải của các nhà máy giấy, các cơ sở chế biến gỗ, các xưởng mộc khi bổ sung cácchế phẩm chứa phức hệ cellulase đem lại hiệu quả cao [3]. 1.5. Các nhóm vi sinh vật phân giải cellulose Cellulase được thu từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau như động vật (các nhóm thân mềm, lợn, bò, gà); thực vật (trong hạt ngũ cốc nảy mầm là đại mạch, yến mạch, lúa mì, mạch đen) và vi sinh vật (nấm sợi, nấm men, xạ khuẩn và vi khuẩn). Tuy nhiên, vi sinh vật là nguồn thu enzyme chủ yếu vì thời gian 24 sống ngắn nên thu được nhiều lần trong năm và chủ động sử dụng nguồn nguyên liệu rẻ tiền để nuôi cũng như dễ dàng điều khiển có định hướng nguồn enzyme hoặc gia tăng lượng enzyme. Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật nên dễ dàng áp dụng các phương pháp sinh học phân tử để tạo ra những chủng mới mang những đặc điểm nổi bật mà các đối tượng động vật, thực vật ít áp dụng như gây đột biến nhân tạo.Trong vi sinh vật, rất nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và một số loài nấm men có khả năng sinh tổng hợp cellulase. Các loài vi khuẩn cả hiếu khí lẫn kị khí đều có khả năng cellulase như Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. pumilis (Gordon et al.,1973), Acidothermus cellulobuticus (Bergquist et al., 1999,) [8]. Ngoài ra còn có các loài ưa kiềm như Cephalosporium sp. RYM-202 ( Kang and Rhee, 1995) [13]. Các nhóm xạ khuẩn thuộc chi Actinomyces griseus (Nguyễn Đức Lượng and Đặng Vũ Bích Hạnh, 1999, Lê Thị Thanh Xuân et al., 2005) và Streptomyces reticuli cũng có khả năng tổng hợp mạnh enzyme. Các loại nấm mốc thuộc chi Aspergillus như A.niger (Coral et al., 2002, Omojasola and Jilani, 2008) [10] ,[23], A. Candidus (Hong et al., 2001, Milala et al., 2009) [20], A. flavus (Ojumu et al., 2003) [22], A. fumigatus (Dahot and Noomrio, 1996) [11] , A. oryzae và các chủng Trichoderma (Claeyssens et al., 1989, de la Mata et al., 1992, Cao Cường và Nguyễn Đức Lượng, 2003) [5], [9] đều có khả năng sinh enzyme. Các nhóm thuộc chi Penicillium (Claeyssens et al., 1989, Bhat et al., 1990, Trịnh Đình Khá, 2006, Chinedu et al., 2008) [6] cũng có khả năng tổng hợp enzyme cao. 25 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Mẫu phân lập Rác thải, lá cây mục, gỗ cây mục, rơm rạ mục được lấy ở huyện Tam Dương (Vĩnh Phúc) và huyện Mỹ Đức ( Hà Nội). 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng cho nghiên cứu Thiết bị: Buồng cấy, tủ ấm, nồi sấy, máy lắc, máy lắc li tâm, cân điện tử, kính hiển vi quang học, máy ảnh kỹ thuật số, nồi hấp và các thiết bị khác trong phòng thí nghiệm vi sinh vật khoa Sinh – KTNN trường ĐH Sư phạm Hà Nội 2. Hóa chất: NaNO3, K2HPO4, MgSO4.7H2O, FeSO4, Agar, Nước cất, NaCl, saccarose, CMC (cacboxyl methyl cellulose), thuốc thử lugon 1%, cồn, dầu soi kính... và các hóa chất thông dụng khác. 2.2. Môi trƣờng Môi trường phân lập, nuôi cấy và giữ giống: môi trường Crapek- Dox cơ sở, thành phần môi trường như sau: Saccarose : 30 g/l FeSO4 : 0.001 g NaNO3 : 10 g/l Thạch Agar : 20 g/l MgSO4 : 0,5 g/l H2O : 1 lít KCl : 0,5 g/l KH2PO4 : 2 g/l NaCl : 1% pH : 5 – 6 26 Môi trường lỏng: để nuôi cấy thu enzyme, tôi sử dụng môi trường có thành phần giống với môi trường Crapek – Dox cơ sở nhưng không có thạch Agar và thay đường saccarose bằng bột giấy (có bản chất là cellulose). Môi trường thử hoạt tính: sử dụng môi trường có thành phần giống vơi môi trường Crapek – Dox cơ sở nhưng thay nguồn cacbon bằng CMC (cacboxylmethylcellulose) để đánh giá hoạt tính cellulase của các chủng nấm mốc, thành phần môi trường như sau: CMC : 10 g/l FeSO4 : 0.001 g NaNO3 : 10 g/l Thạch Agar : 20 g/l MgSO4 : 0,5 g/l H2O : 1 lít KCl : 0,5 g/l KH2PO4 : 2 g/l NaCl : 1% pH : 5 – 6 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp phân lập 2.3.1.1. Thu thập mẫu Lấy các cành, lá cây mục, rơm rạ mục, đất mùn và rac thải ở những nơi khô ráo, mỗi loại mẫu lấy khoảng 20g mỗi lần, tiến hành lấy ở các vùng khác nhau. Mẫu sau khi lấy sẽ được cho vào túi nilon rồi đánh dấu và ghi đầy đủ thông tin, thời gian và địa điểm mẫu được lấy. 2.3.1.2. Chuẩn bị môi trường phân lập và bảo quản Khử trùng : khử trùng thiết bị, dụng cụ thí nghiệm và môi trường dinh dưỡng 27 Mục đích : Tiêu diệt toàn bộ vi sinh vật ngoại lai hiện diện trong môi trường, tạo điều kiện vô trùng cho môi trường để kết quả phân lập, nuôi cấy chính xác Nguyên tắc khử trùng : Không làm biến tính môi trường, không làm biến tính một số chất trong môi trường, Sau khi khử trùng, trong môi trường không sản sinh ra các chất độc gây chết vi sinh vật nuôi cấy, phải đảm bảo điều kiện vô trùng tuyệt đối sau khi khử trùng, bảo đảm an toàn đối với người sử dụng. Phương pháp : đối với các dụng cụ (nút bông, ống nghiệm, que chang, hộp petri..,) sẽ được bọc bằng giấy báo sau khi rửa sạch và làm khô, tiến hành khử trùng bằng nồi hấp ở áp suất khoảng 1 atm trong khoảng 30- 45 phút rồi chuyển sang tủ sấy (1700C, 2 giờ). Đối với buồng cấy thì được khử trùng bằng tia UV, một số dụng cụ khác thì khử trùng bằng cồn. Chuẩn bị môi trường Sau khi vô trùng dụng cụ xong, tiến hành cân môi trường (Crapek – Dox cơ sở) để làm môi trường phân lập. Môi trường được hấp thanh trùng ở 1210C trong khoảng 20 phút, sau đó phân phối khoảng 25ml môi trường và mỗi hộp lồng đã vô trùng, để có môi trường thạch nghiêng thì ta rót khoảng 3 - 4 ml môi trường (chưa thành trùng) vào ống nghiệm rồi đậy nút bông, đem hấp thanh trùng ở 1210C trong khoảng 20 phút sau đó đặt nghiêng ống nghiệm chứa môi trường khi còn đang nóng. 28 2.3.1.3. Tiến hành phân lập Pha loãng mẫu Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhưng rất quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh vật. Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều trong quá trình định lượng cũng như phân tích vi sinh vật. Đối với mẫu chất lỏng: dùng pipet hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ được nồng độ pha loãng là 10-1. Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1 hút tiếp 1ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng  độ pha loãng 10-2. Tiếp tục như vậy đến nồng độ cần thiết. Đối với mẫu rắn: cân chính xác 10 g mẫu, sau đó cho vào 90 ml dung dịch pha loãng  nồng độ pha loãng 10-1. Tiếp tục pha loãng tương tự như mẫu chất lỏng. Phân lập Dùng pipet hút lấy 1 ít dung dịch mẫu đó, nhỏ 1 giọt vào hộp lồng đầu tiên, lấy que chang chang đều, rồi vẫn dùng que chang đó ta chang tiếp vào khoảng 6-7 hộp lồng tiếp theo mà không cần nhỏ thêm dung dịch mẫu vào. Làm lần lượt như vậy đối với từng mẫu. Sau khi chang mẫu vào các hộp lồng xong đánh giấu và gói cẩn thận lại rồi đem nuôi trong tủ ấm khoảng 300C. Thường xuyên kiểm tra các hộp lồng mỗi ngày. Nếu thấy có khuẩn lạc mới mọc lên thì lập tức cấy chủng đó sang môi trường thạch nghiêng rồi đánh dấu cho vào tủ ấm để nuôi, theo dõi sau 3 – 4 ngày. Chủng nào không lên thì loại 29 bỏ, chủng nào lên thì giữ lại , bảo quản trong tủ lạnh ở 0 – 400 C để giữ giống dùng cho việc nghiên cứu tiếp theo, cấy truyền định kỳ và liên tục. Cứ theo dõi các hộp lồng liên tục như vậy khoảng 4 -5 ngày mà không thấy có thêm khuẩn lạc mới nào xuất hiện thì đem hấp bẩn và vô trùng các hộp lồng này để tiến hành làm thí nghiệm với các mẫu khác. Phương pháp cấy truyền bảo quản giống trên môi trường thạch nghiêng Dán nhãn ghi: tên giống vi sinh vật và ngày cấy. Một tay cầm 2 ống nghiệm: một ống giống và 1 ống môi trường. Tay còn lại cầm que cấy và đốt đỏ dây cấy trên ngọn lửa đèn cồn để khử trùng. Dùng ngón út và ngón áp út rút nút bông của ống giống ra. Hơ nóng khử trùng miệng ống nghiệm. Đợi que cấy nguội, đưa que cấy vào ống nghiệm lấy khuẩn lạc trong ống giống. Rút que cấy ra và tiến hành cấy truyền trong ống môi trường. Khử trùng lại phần không khí nơi miệng ống nghiệm rồi đậy nút bông. Khử trùng lại que cấy sau khi sử dụng xong. 2.3.2. Phương pháp thử hoạt tính 2.3.2.1. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp cấy chấm điểm Định tính cellulase bằng phương pháp cấy chấm điểm. Dùng que cấy lấy một ít chủng nuôi cấy trong môi trường thạch nghiêng. Sau đó cấy chấm một điểm vào môi trường đĩa thạch chứa 1 % cơ chất CMC, nuôi trong tủ ấm 3 – 4 ngày. Hiện hình vòng phân giải bằng dung dịch thuốc thử liugon đỏ 1 %, hoạt tính enzyme được xác định bằng hiệu số ( D - d, cm). Với D : là đường kính vòng phân giải d : là đường kính khuẩn lạc. 30 2.3.2.2. Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch ( William, 1983) Dùng khoan nút chai khoan các lỗ trên môi trường thử hoạt tính, tương ứng với từng loại enzyme. Nhỏ vào một lỗ khoan 100 µm dung dịch enzyme đã chuẩn bị sẵn, để tủ lạnh 6h- 8h cho enzyme khuếch tán vào môi trường thạch sau đó cho vào tủ ấm ở 300C trong 24h. Hiện hình vòng phân giải bằng dung dịch thuốc thử lugon đỏ 1 %. Hoạt tính enzyme được xác định bằng hiệu số ( D - d, cm). Với D là đường kính vòng phân giải ; d là đường kính lỗ đục 2.3.3. Phương pháp nghiên cứu định loại (Maren A. Klich, 2002) 2.3.3.1. Phương pháp cấy chấm điểm các chủng nấm mốc lên môi trường Crapek- Dox cơ sở để nghiên cứu các đặc điểm vĩ mô Để hạn chế hiện tượng bào tử nấm phát tán và mọc linh tinh trên bề mặt đĩa thạch, úp ngược đĩa thạch xuống rồi tiến hành cấy chấm 3 điểm khi đĩa thạch vẫn úp ngược, đánh dấu lại và không lật đĩa thạch lên, cứ thế đem nuôi ủ ở 320C trong 7 ngày. Sau đó lấy ra quan sát và chụp hình và mô tả các đặc điểm của nấm. 2.3.3.2. Phương pháp cấy trên khối thạch để quan sát các đặc điểm vi mô (Robert A. Samson and Ellen S. Hoekstra, Jens C. Frisvad àn Filtenborg, 1996) Chuẩn bị hộp lồng, lam kính, lamen, bông ướt, khoan nút chai vô trùng. Đổ môi trường định loại nghiên cứu vào các hộp lồng sao cho độ dày đạt gần 1mm, dùng khoan nút chai khoan lấy các khối thạch. 31 Đặt khối thạch ở 2 điểm cách đều nhau trên một lam kính. Cấy một ít bào tử vào khối thạch đó. Đậy lamen lên từng khối thạch đó. Đặt bông ướt vô trùng vào để giữ ẩm cho mẫu. Sau khi cấy xong dùng kính hiển vi theo dõi từng ngày sự phát triển của hệ sợi, các hạch nấm. 2.3.4. Phương pháp quan sát các đặc điểm phân loại 2.3.4.1. Quan sát các đặc điểm vĩ mô sau đây bằng mắt thường hoặc dưới kính hiển vi soi nổi. Màu sắc bào tử (conidial color): Chính là màu sắc của bông nấm, đây là đặc điểm qan trọng để phân loại đến mức chi phụ. Đường kính khuẩn lạc (colony diameter): kích thước lớn nhất của một trong 3 khuẩn lạc nuôi trên cùng một hộp lồng. Màu sắc hệ sợi (mycelial color): Thường có màu trắng nhưng một số loại có màu khác. Dịch tiết trên bề mặt hệ sợi (exudate) : là các giọt lỏng nhỏ, được hình thành trên bề mặt hệ sợi Màu của mặt sau khuẩn lạc (reverse color): là màu sắc quan sát được phía dưới khuẩn lạc bằng cách nhìn phía dưới đĩa thạch. Màu sắc này thường phụ thuộc vào môi trường. Sắc tố hòa tan (Soluble pigment): là sắc tố khuếch tán vào agar theo viền khuẩn lạc. 32 Hạch nấm (Sclerotia): là khối cứng gồm các sợi nấm, thường hình cầu, gần cầu hoặc elip, không chứa bào tử. Thể quả (cleistothecia): đây là các thể quả không tự mở, nó chứa các túi bào tử mà bên trong là các bào tử túi. 2.3.4.2. Quan sát các đặc điểm vi mô dưới kính hiển vi quang học và chụp ảnh qua kính hiển vi ( Axioskop) Giá bào tử trần (conidiophore, tipe) : xác định chiều dại màu sắc và cấu trúc bề mặt của giá bào tử trần, đây là các đặc điểm quan trọng để phân loại. Bọng đỉnh giá (versicle) : là đỉnh phồng lên của cuống bào tử nấm. Quan sát hình dạng và đo kích thước. Các lớp thể bình (Seriation): quan sát số tầng thể bình Bào tử trần (conidia): hình thái, kích thước và cấu trúc bề mặt là đặc điểm quan trọng. Bông nấm (conidial head): Quan sát hình dạng bông nấm. Tế bào Hule: thành dày, có tính khúc xạ cao. Bào tử túi: màu sắc, kích thước, cách trang trí của bào tử túi, bao gồm các gờ nổi, hoặc các đường rãnh bao xung quanh bào tử núi và cấu trúc bề mặt của thành lồi. 33 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân lập Bảng 3.1. Kết quả và đăc điểm các chủng nấm mốc phân lập đƣợc Mẫu STT Chủng mốc Đặc điểm của chủng Màu của khuẩn lạc Thời gian xuất hiện Lá cây mục 1 M1-51 Đen 2 ngày 2 M1-52 Nâu trắng 3 ngày 3 M1-61 Đen 2 ngày 4 M1-62 Tím đen 3 ngày 5 M1-9 Xanh rêu 2 ngày 6 M1-10 Trắng 2 ngày Gỗ cây mục 7 M2 -1 Xám 3 ngày 8 M2-3 Xám đậm 3 ngày 9 M2-4 Xanh 3 ngày 10 M2-51 Nâu đậm 1 ngày 11 M2 -52 Nâu 2 ngày 12 M2-6 Nâu 3 ngày 13 M2-7 Xám nhạt 2 ngày 14 M2-8 Nâu đậm 3 ngày Đất mùn 15 M3-4 Xanh Đen 1 ngày 16 M3-8 Trắng vàng 2 ngày 17 M3-10 Nâu 3 ngày Rơm dạ mục 18 M4-1 Vàng 3 ngày 19 M4-2 Trắng xanh 2 ngày 20 M4-3 Xanh mốc 2 ngày 21 M4 D Đen 2 ngày 22 M4 XT Xanh trắng 1 ngày 23 M4-V Vàng xanh 2 ngày 24 M4 -7 Nâu nhạt 3 ngày 25 M4- 8 Xanh rêu 3 ngày 34 Từ lá cây mục, đất mùn, gỗ cây mục, rơm rạ mục được thu từ huyện Mỹ Đức (Hà Nội), Tam Dương ( Vĩnh Phúc) chúng tôi đã chia làm 4 mẫu và tiến hành phân lập trên 50 hộp petri, quan sát trong 5 ngày và thu được được 25 chủng nấm mốc. Đặc điểm của 25 chủng nấm mốc được nghi ở bảng 3.1. Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy: Trong các mẫu khác nhau thì sự phân bố nấm cũng khác nhau, trong đó hai mẫu gỗ cây mục và rơm dạ mục thu được nhiều chủng mốc hơn so với lá cây mục và đất mùn. Kết quả cũng cho thấy các chủng nấm mốc ở Tam Dương ( Vĩnh Phúc), Mỹ Đức (Hà Nội) mà tôi nghiên cứu khá là đa dạng, có tiềm năng cho nhiều ứng dụng thực tế như sản xuất enzym, xử lý nước thải,... 3.2. Kết quả thử hoạt tính Nhằm kiểm tra khả năng sinh cellulase của 25 chủng nấm mốc phân lập được, chúng tôi sử dụng phương phấp cây chấm điểm trên môi trường Crapex- dox được có 1% CMC, sau 3 ngày đo đường kính phân giải cellulase. Kết quả thử hoạt tính được thể hiện ở bảng 3.2. 35 Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính 25 chúng nấm mốc phân lập đƣợc Mẫu STT Chủng mốc Hoạt tính cellulase D-d (cm) Mẫu STT Chủng mốc Hoạt tính cellulase D-d (cm) Lá cây mục 1 M1-51 1.7 Đất mùn 15 M3-4 0.5 2 M1-52 1.0 16 M3-8 0.8 3 M1-61 0.6 17 M3-10 0.5 4 M1-62 0.5 Rơm dạ mục 18 M4-1 1.4 5 M1-9 0.6 19 M4-2 0.5 6 M1-10 0.7 20 M4-3 0.4 Gỗ cây mục 7 M2 -1 1.2 21 M4 D 1.0 8 M2-3 0.5 22 M4 XT 0.4 9 M2-4 0.3 23 M4-V 2.0 10 M2-51 1.9 24 M4 -7 0.6 11 M2 -52 1.2 25 M4- 8 0.6 12 M2-6 1.2 13 M2-7 0.6 14 M2-8 0.7 Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy: khả năng sinh tổng hợp cellulase ở các chủng nấm mốc ở các mẫu thu thập ở Tam Dương ( Vĩnh Phúc), Mỹ Đức ( Hà Nội ) là rất đa dạng. Trong đó mẫu rơm dạ mục là thu được đa dạng nhất các chủng mốc. Khả năng sinh tổng hợp cellulase ở các mẫu, chủng khác nhau là không như nhau, trong số 25 chủng có tới 9 chủng đường kính phân giải cellulose lớn hơn 1 cm, 16 chủng còn lại có đường kính phân giải cellulose nhỏ hơn 1 cm. Trong đó có ba chủng có hoạt tính cellulase cao là chủng M4-V có đường kính phân giải là 2 cm, chủng M2-51 đường kính phân giải 1,9 cm và chủng M1-51 có đường kính phân giải là 1,7 cm. So sánh với các nghiên cứu khác ở trong nước như Lê Thị Hồng Nga (2005), Trịnh Đình Khá (2007) [6] thì ba chủng mà chúng tôi thu được là có hoạt tính cellulase cao. Do đó chúng tôi chọn ba chủng này để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. 36 M151 M251 M4V Hình 3.1. Hoạt tính cellulase của 3 chủng mạnh nhất 3.3. Kết quả định loại sơ bộ 3.3.1. Bản mô tả chủng M4V Bằng phương pháp nhận diện nấm mốc truyền thống (Maren A. Klich, 2002), tôi đã bước đầu xác định được chủng M4V thuộc chi Penicillium do nó có các đặc điểm hình thái rât giống với các đặc điểm hình thái của chi Penicillium trong khóa phân loại Samson và cs (1995) [25]. Những đặc điểm hình thái của chủng M4V được miêu tả cụ thể như sau: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Đường kính khuẩn lạc trên môi trường Crapek – Dox cơ sở: 35 mm sau 7 ngày nuôi cấy. Đặc điểm mặt trước khuẩn lạc: Khuẩn lạc có màu xanh lục ở giữa, ở rìa màu xám xanh. Khuẩn lạc hình trứng thon dài. Đặc điểm mặt sau khuẩn lạc : có màu nâu tối, không nhăn. 37 Cấu tạo cơ quan sinh sản vô tính Giá bào tử trần (condiophore, tipe): phát triển hầu hết từ hệ sợi, không có nhánh hoặc mang 1-2 nhánh. Nhánh nếu có nhẵn. Bào tử: Khi riêng rẽ, các bào tử trần không màu hoặc màu nhạt. khi tụ họp thành đám, thường có màu lục, vàng lục, lục xanh, lục xám, xám. Các bào tử trần này tạo thành chuỗi dài trên miệng thể bình, xếp thành các chuỗi song song hay dạng cột Bông nấm (conidial head): hình cái chổi. Bọng đỉnh giá (vesicle): hình đế, bàn chang. Bào tử trần (conidia): có hình ovan, cầu. Các lớp thể bình (seriation): lưỡng tầng. Cuống thể bình thành vòng 3-6 cái trên đỉnh giá bào tử trần hoặc trên đỉnh mỗi nhánh Hình thái khuẩn lạc Bào tử trần (X400) 38 Bào tử trần ( X1000) Bọng đỉnh giá ( X1000) Giá bào tử ( X100) Giá bào tử ( X1000) Bông nấm ( X100) Bông nấm ( X400) Hình 3.2. Một số đặc điểm hình thái của chủng M 4V 39 3.3.2. Bản mô tả chủng M 151 Bằng phương pháp nhận diện nấm mốc truyền thống (Maren A. Klich, 2002), tôi đã bước đầu xác định được chủng M 151 thuộc chi Aspergillus do nó có các đặc điểm hình thái rất giống với các đặc điểm hình thái của chi Aspergillus trong khóa phân loại Samson và cs (1995). Những đặc điểm hình thái của chủng M 151 được miêu tả cụ thể như sau: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Đường kính khuẩn lạc trên môi trường Crapek – Dox cơ sở là 40mm sau 7 ngày nuôi cấy. Đặc điểm mặt trước khuẩn lạc: bào tử màu vàng hoa cau, vàng tươi, hệ sợi khí sinh tử trắng đến vàng nhạt Đặc điểm mặt sau khuẩn lạc: màu vàng tối, không nhăn. Cấu tạo cơ quan sinh sản vô tính Giá bào tử trần (condiophore, tipe): không phân nhánh, hơi ráp, thành dày, dài 1,5 đến 3 cm. Bông nấm (conidial head): hình bán cầu, gần cầu. Bọng đỉnh giá (vesicle): hình bán cầu, hình cầu. Bào tử trần (conidia): có hình cầu. Khối bào tử trần đỉnh bọng hình cầu, sau hình tia tỏa tròn hoặc tách thành các cột, đôi khi có các khối bào tử trần nhỏ màu nâu đen. Các lớp thể bình (seriation ): đơn tầng bao phủ 70- 90%, Cuống thể bình lớn 40 Mặt trước khuẩn lạc Mặt sau khuẩn lạc Bông nấm ( X100) Bông nấm ( X400 ) Bông nấm ( X1000) Bọng đỉnh giá (X400) 41 Bào tử trần (X1000) Bào tử trần ( X400) Hình 3.3 .Một số đặc điểm hình thái của chủng M 151 3.3.3. Bản mô tả chủng M 251. Bằng phương pháp nhận diện nấm mốc truyền thống (Maren A. Klich, 2002), tôi đã bước đầu xác định được chủng M 251 thuộc loài Aspergillus niger do nó có các đặc điểm hình thái rât giống với các đặc điểm hình thái của loài Aspergillus niger trong khóa phân loại Samson và cs (1995). Những đặc điểm hình thái của chủng M 251 được miêu tả cụ thể như sau: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Đường kính khuẩn lạc trên môi trường Crapek – Dox cơ sở là 55 mm sau 7 ngày nuôi cấy. Đặc điểm mặt trước khuẩn lạc: bào tử màu đen hơi nâu,có vòng trắng ngăn cách phần giữa khuẩn lạc với rìa khuẩn lạc. hệ sợi khí sinh vàng nhạt Đặc điểm mặt sau khuẩn lạc: màu đỏ cam, nhăn. Cấu tạo cơ quan sinh sản vô tính Giá bào tử trần (condiophore, tipe): không phân nhánh, thẳng, thành rất dày 42 Bông nấm (conidial head): hình cầu. Bọng đỉnh giá (vesicle): hình bán cầu, hình cầu, hơi thon dài, mang cuống thể bình và thể bình Bào tử trần (conidia): đa số hình ovan, elip, một số hình cầu. Các lớp thể bình (seriation ): đơn tầng, bao phủ 50- 80%. Mặt trước khuẩn lạc Mặt sau khuẩn lạc Bào tử trần ( X400) Bào tử trần (X1000) 43 Giá bào tử (X400) Bọng dỉnh giá ( X1000) Bông nấm ( X100) Bông nấm ( X1000) Hình 3.4 .Một số đặc điểm hình thái của chủng M 251 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1. Từ các mẫu lá mục, gỗ mục, đất mùn và rơm dạ mục, được lấy ở Mỹ Đức ( Hà Nội), Tam Dương (Vĩnh Phúc) chúng tôi đã phân lập được 25 chủng nấm mốc, tất cả 25 chủng nấm mốc này đều có khả năng tổng hợp cellulase phân giải cellulose. 2. Trong 25 chủng nấm mốc này có 3 chủng M4V, M251, M151 có hoạt tính cellulase mạnh nhất, hoạt tính của 3 chủng này lần lượt là 2.0 cm, 1.9 cm, 1.7 cm. 3. Bước đầu định loại sơ bộ 3 chủng nấm mốc M4V, M251, M151. Trong đó, M4V thuộc chi Penicillium, M51 thuộc chi Aspergillus, M251 thuộc loài Aspergillus niger. KIẾN NGHỊ 1. Các chủng M4V, M151, M251, chỉ được định loại sơ bộ trên phương pháp quan sát các đặc điểm hình thái là chủ yếu. Kiến nghị kết hợp thêm phương pháp phân loại bằng kĩ thuật sinh học phân tử 2. Tiếp tục nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh cellulase của các chủng ( nhiệt độ, nguồn cacbon, nguồn nitơ, độ pH thích hợp, độ ẩm....) bằng phương pháp lên men rắn. 3. Nghiên cứu đánh giá tiềm năng ứng dụng của 3 chủng M4V, M251, M151. 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT [1] Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn, (2001). Vi nấm dùng trong công nghệ sinh học, NXB KH & KT Hà Nội, trang: 13 – 16, 154 – 168. [2] Chu Thị Thanh Bình, Nguyễn Lân Dũng, Lương Thùy Dương. “Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu các chủng nấm men có khả năng phân giải cellulose nhằm ứng dụng trong xử lý bã thải hoa quả là thức ăn chăn nuôi”. [3] Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm (2004) Công nghệ enzyme, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. [4] Hoàng Quốc Khánh, Ngô Đức Duy, Nguyễn Duy Long (2003) Khả năng sinh tổng hợp và đặc điểm cellulase của Aspergillus niger RNNL- 363, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 304-307. [5] Nguyễn Đức Lượng (2003) Sản xuất cà phê theo phương pháp enzyme, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 318-320. [6] Trịnh Đình Khá (2006) Tuyển chọn, nuôi cấy chủng vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase và đánh giá tính chất lý hóa của cellulase, Luận văn thạc sĩ khoa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội. 46 [7] Vũ Duy Giảng (2009) Sử dụng enzyme để tăng hiệu quả sử dụng năng lượng và giảm giá thành thức ăn chăn nuôi, Tạp chí Khoa học Công nghệ chăn nuôi- Viện chăn nuôi quốc gia: 16. TIẾNG ANH [8] Bergquist P, Gibbs M, Morris D, Teo V, Saul D, Morgan H (1999) Molecular diversity of thermophilic cellulolytic and hemicellulolytic bacteria, FEMS Microbiol Ecol 28: 99-110. [9] Bhat KM, Hay AJ, Claeyssens M, Wood TM (1990) Study of the mode of action and site-specificity of the endo-(1-4)-beta-D-glucanases of the fungus Penicillium pinophilum with normal, 1-3H-labelled, reduced and chromogenic cello oligosaccharides, Biochem J, 266: 371-378. [10] Coral G, Burhan A, Unaldi M, Guvenmez H (2002) Some properties of crude carboxymethyl cellulase of Aspergillus niger Z10 wild-type strain, Turk J Biol, 26: 209-213. [11] Dahot M, Noomrio M (1996) Microbial production of cellulase by Aspergillus fumigatus using wheat straw as a carbon source, J Islamic Acad Sci, 9: 119-124. [12] Ekperigin MM, Preliminary studies of cellulase production by Acinetobacter anitratus and Branhamella sp, African Journal of Biotechnology Vol. 6, pp. 028-033, 4 January 2007. [13] Kang M, Rhee Y (1995) Cacboxymethyl cellulases active and stable at alkaline pH from alkalophilic cephalosporium sp. RYM-202, Biotechnol Lette, 17: 507-512. 47 [14] Katsuhiko Ando at al, 2004, Sampling and Isolation Methods of Fungi, Department of Biotechnology, National Institute of Technology and Evaluation (NITE), Japan. [15] Katsuhiko Ando, 2002, Identification of Fungi Imperfecti, NITE Biological Resource Center National Intitute of Technology and Evaluation. [16] Kiffer E., M. Morelet, (2000), the Deuteromycetes (Mitosporic Fungi), Science Publishers TNC, U.S.A., 115pp. [17] Maren A. Klich, 2002. Identification of Common Aspergillus Speceies, Pulished by the Central bureau voor Schimmelcutues, Utrecht, The Nethrlands, 107 pp. [18] Mc Kenzie Erick H.C., (2004), Fungal Taxonomy Workshop, Landcare Research Private Bag 92170 Auckland New Zealand, p. 3,6. [19] Michael J.Carlie, Sarah C Watkinson, Graham, 1994, The Fungi. [20] Milala M, Shehu B, Zanna H, Omosioda V (2009) Degradation of Agaro- Waste by Cellulase from Aspergillus candidus, Asian Journal of Biotechnology, 1: 51-56. [21] Noyd R.K., (2002), Mycology Reference Card, The American Phytopathological Society 3340 Pilot Knob Road. St Paul, Minnesota 55121 – 2079, USA, 18pp. [22] Ojumu TV, Solomon BO, Betiku EL, Stephen K, Amigun B (2003) Cellulase production by Aspergillus flavus Linn Isolate NSPR 101 fermented in sawdust, bagasse and corncob, Afr Biotechnol, 2: 150-152. 48 [23] Omojasola P, Jilani O (2008) Cellulase production by Trichoderma longi, Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisae cultured on waste from orange, Pakistan Biol Sci, 11: 2382-2388 [24] Raper K B, Fennell D L (1965), the Gennus Aspergillus, Baltimore USA William and Wilkins, Preston street baltimore, Md 21202 U S A, p 570. [25] Robert A. Samson and Ellen S.Hoekstra, Jens C. Frisvad and Filtenborg (1996). Introduction to Food- borne Fungi, Centraalbureau voor Schimmelcutues Baarl Delft, Pg : 3,4, 52- 83. [26] Robert A. Samson, John I. Pitt (2000). Integration of modern taxonomic methods for Penicillium and Aspergillus classification, p: 83- 113.