Đề tài Tách chiết collagen từ da Cá Tra

CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ Thế giới ngày nay với sự phát triển không ngừng về kinh tế xã hội và con người. Cuộc sống thay đổi theo chiều hướng tốt đẹp hơn, con người được tạo điều kiện phát triển tối đa khả năng của mình, nhu cầu của con người ngày càng được đáp ứng đầy đủ. Ngày xưa chỉ cần cơm no áo ấm là đủ, còn bây giờ cần phải ăn ngon mặc đẹp luôn biết cách làm cho mình đẹp hơn. Không chỉ phụ nữ biết cách làm đẹp, mà nam giới cũng không thua kém, vì vậy các sản phẩm mỹ phẩm phát triển để đáp ứng nhu cầu đó. Con người chú trọng chăm sóc da của họ ai cũng luôn muốn mình xinh đẹp và trẻ trung. Xã hội đã có những nghiên cứu để tạo ra những loại mỹ phẩm tốt cho làn da luôn căng mịn và tươi trẻ, trong những loại mỹ phẩm đó luôn có chứa một loại protein đó là collagen. Collagen có tác dụng làm chậm quá trình lão hóa của da. Collagen được con người sử dụng vào nhiều mục đích như trong y học và thực phẩm. Ở Việt Nam trong những năm gần đây nghề nuôi trồng, khai thác và chế biến thuý sản phát triến đặc biệt là ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long với hai đối tượng thủy sản nước ngọt chủ yếu là cá tra và cá basa của Việt Nam đã mở rộng thị trường xuất sang 24 quốc gia mới, nâng tổng số các thị trường nhập khẩu cá tra, cá basa của Việt Nam lên 110 quốc gia và vùng lãnh thổ. Theo bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn cá tra, cá basa vẫn đang là mặt hàng chiếm tỉ trọng giá trị xuất khẩu cao nhất trong nhóm thủy sản. thị trường tiêu thụ chính của cá tra, basa Việt Nam vẫn là EU với kim ngạch đạt 206 triệu USD trong 6 tháng đầu năm (2009). Riêng thị trường Mỹ, bất chấp khó khăn do khủng hoảng kinh tế, xuất khấu sang nước này đã có sự tăng trưởng vượt bậc đat 45.97 triệu USD, tăng 59.98% so với cùng kì năm 2008. Cá tra và basa đa phần được xuất khẩu dưới hình thức philê vì thế mà phế liệu thải trong quá trình chế biến sẽ rất nhiều (chiếm 50-60%) Hiện nay nước ta đã có nhiều nghiên cứu để dùng da cá làm nguyên liệu sản xuất collagen vì da cá tra và cá basa chứa hàm lượng collagen khá cao, chất lượng của nó không thua kém các loại nguyên liệu khác, vì thế việc sử dụng da cá để sản xuất collagen sẽ đưa ngành thủy sản có hướng đi mới. Tóm lại với những ưng dụng có tầm quan trọng hiện nay, collagen ngày càng được nhiều nhà khoa học dược sĩ, thẩm mỹ quan tâm. Ở Việt Nam chúng ta có nguồn phế liệu da cá rất phong phú rất t giàu collagen. Do vậy, việc nghiên cứu tách chiết collagen từ da cá tra sau khi đã loại được hoàn toàn phần protein phi collagen cũng như màu, mùi, chất béo bằng nhiều phương pháp nhằm thu được hàm lượng collagen cao và có chất lựong tốt là nội dung nghiên cứu của đề tài này MỤC ĐÍCH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI Nghiên cứu quy trình tách chiết nhằm thu nhận collagen ứng dụng trong công nghệ thực phẩm. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình trích ly collagen từ da cá Tra Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân collagen bằng enzyme Đánh giá chất lượng sản phẩm CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN VỀ COLLAGEN 2.1. KHÁI QUÁT VỀ COLLAGENCollagen là protein chính của mô nối động vật và là protein dồi dào nhất ở những động vật có vú[1], chiếm khoảng 25% tới 35% toàn bộ lượng protein trong cơ thể. Collagen tạo nên 1% tới 2% của mô cơ, và chiếm 6% về trọng lượng của gân, xương, dây chằng, sụn và răng trong cơ thể. Gelatin được sử dụng trong thức ăn và các ngành công nghiệp khác nhau và thu được từ quá trình thủy phân một phần Collagen. 2.1.1. Thành phần và cấu trúcCollagen có kết cấu rất phức tạp. Tropocollagen hay "phân tử Collagen" là một đơn vị lớn hơn của Collagen gọi là các sợi. Nó dài khoảng là 300 nm với đường kính 1,5 nm, tạo thành bởi ba chuỗi polypeptit (peptit anfa), mỗi chuỗi này đều được sắp xếp theo một đường xoắn ốc phía tay trái./Hình 1, 2: Hình ảnh cấu trúc xoắn ba của collagenBa chuỗi xoắn ốc được cuộn cùng nhau chiều thuận tay phải, "đường xoắn ốc đặc biệt" hoặc đường xoắn ốc bộ ba, một cấu trúc bậc bốn được ổn định bởi nhiều liên kết hydro.Một đặc điểm đặc trưng của collagen là sự sắp xếp đều đặn của các amino axit trong mỗi mắt xích của từng chuỗi xoắn ốc collagen này. Thông thường các chuỗi theo mẫu sau: Gly-Pro-Y hoặc Gly-X-Hyp, ở đây X và Y là các axit amin còn lại. Proline hoặc hydroxyproline tạo nên khoảng 1/6 tổng số chuỗi. Glycine chiếm 1/3 số chuỗi, điều này có nghĩa là khoảng nửa chuỗi collagen không chứa glycine, proline hoặc hydroxyproline, các nhóm GXY khác thường trong các chuỗi peptit collagen anfa. Sự phân bố đều đặn với hàm lượng glycine cao được tìm thấy ở một số ít loại prôtêin dạng sợi, như sợi tơ tằm. Chiếm 75- 80 % của tơ tằm là : Gly - Ala – Gly- Ala với 10% serine. 2.1.2. Phân loạiCollagen tồn tại ở nhiều bộ phận trong cơ thể. Đã có 29 loại collagen được tìm thấy và thông báo trong các tài liệu khoa học. Trên 90% collagen trong cơ thể là dạng I, II, III và IV.• Collagen I: có trong da, gân, mạch máu, các cơ quan, xương (thành phần chính của xương)• Collagen II: có trong sụn xương (thành phần chính của sụn)• Collagen III: có trong bắp (thành phần chính của bắp), tìm thấy bên cạnh collagen I.• Collagen IV: thành phần chính cấu tạo màng tế bàoCác bệnh về collagen thường do sự khiếm khuyết của gene gây nên tác động cho quá trình tổng hợp sinh hóa, sự sắp xếp, sự sao chép bị thay đổi, hoặc các quá trình khác trong việc hình thành của collagen. 2.1.3. Ứng dụng của collagenCollagen là một dạng protein cấu trúc sợi dài và hầu hết các chức năng của nó khác với dạng dạng protein phổ biến khác như enzyme. Những bó collagen hay còn gọi là những sợi collagen là thành phần chính của thể nền màng tế bào cấu tạo nên hầu hết các mô và cấu trúc bên ngoài của tế bào, nhưng collagen cũng được tìm thấy bên trong của tế bào. Collagen có cường độ kéo đứt rất lớn và là thành phần chính của băng trong y học, gân, sụn, xương, dây chằng và da. Cùng với keratin mềm, là nguyên nhân gây ra độ dẻo dai của da và nếu nó thoái hóa sẽ gây ra nếp nhăn dẫn đến tuổi già. Nó tạo nên độ bền của thành mạch máu và đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển mô tế bào. Nó có trong giác mạc, thủy tinh thể của mắt. Collagen cũng được dùng trong phẫu thuật thẩm mỹ và phẫu thuật bỏng. Collagen đã thủy phân có thể đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh cân nặng, giống như protein khi ta dùng nó có cảm giác cung cấp đủ năng lượng. 2.1.3.1. Ứng dụng trong công nghiệpKhi collagen được thủy phân đủ ta thu được một loại protein dễ tan trong nước, được gọi là gelatin. Gelatin được sử dụng trong thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, và công nghiệp nhiếp ảnh. Trong lĩnh vực dinh dưỡng, collagen và gelatin là nguồn protein nghèo, chúng không cung cấp đầy đủ tất cả các amino axit thiết cho cơ thể con người- chúng là protein chưa đầy đủ. Các nhà sản xuất collagen để làm thực phẩm bổ xung thông báo rằng sản phẩm của họ giúp tái tạo da, móng tay và tăng cường sức khỏe. Tuy nhiên, các định hướng nghiên cứu khoa học hiện nay không chỉ ra những bằng chứng cho điều này. Đặc biệt với vấn đề trong những trường hợp bị thương tổn dưới điều kiện khác (như sự lão hóa, da khô, chứng viêm khớp…) hơn là sự thiếu hụt protein.Xuất phát từ Hy Lạp của từ keo (glue), kolla, collagen trên thế giới có nghĩa là “ nhà sản xuất keo” và cho rằng quá trình nấu da và gân của ngựa và động vật khác có thể thu được keo. Keo dán collagen đã được xử dụng ở Ai Cập từ 4000 năm trước, và người châu Mỹ cổ đã dùng nó trong cung tên từ 1500 năm trước. Collagen thường chuyển hóa thành gelatin nhưng thường đựợc tiến hành trong điều kiện khô. Keo dán từ động vật có tính nhiệt dẻo, mềm trở lại khi gia nhiệt, vì vậy chúng được sử dụng làm dụng cụ âm nhạc như dây đàn violin, đàn guitar. 2.1.3.2. Ứng dụng trong y học và dược phẩm và mỹ phẩmCollagen đã được sử dụng rộng rãi trong phẫu thuật thẩm mỹ, như là hỗ trợ chữa bệnh cho bệnh nhân bỏng làm tái tạo xương và rất nhiều trong nha khoa, phẫu thuật chỉnh hình. Một số điểm đáng chú ý là: -Khi được sử dụng mỹ phẩm, có một số trường hợp gây phản ứng dị ứng đỏ mắt kéo dài, tuy nhiên, điều này hầu như được loại bởi một cách đơn giản là nên thử nghiệm trước khi sử dụng mỹ phẩm, và - Nhất là loại collagen y tế có nguồn gốc từ trâu bò (xương) thả rông nhiễm chứng BSE (Bovine spongiform encephalopathy) . Hầu hết các nhà sản xuất sử dụng động vật từ các trang trại "đóng đàn", hoặc từ các nước đã không bao giờ có trường hợp báo cáo của BSE như Úc, Brazil và New Zealand. - Da, mô (lợn) cũng được sử dụng rộng rãi để sản xuất các tấm collagen cho nhiều mục đích phẫu thuật. - Lựa chọn sử dụng thay thế chất béo, axit hyaluronic hoặc gel polyacrylamide cho các bệnh nhân cũng đã được thực hiện. Collagen đang được dùng rộng rãi để thay thế da nhân tạo, được sử dụng trong việc chữa trị bỏng nặng. Những collagen có thể được bắt nguồn từ bò, ngựa hoặc lợn, thậm chí cả con người, dùng luôn và đôi khi được sử dụng kết hợp với silicones, glycosaminoglycan, nguyên bào sợi, các yếu tố tăng trưởng và các chất khác.Collagen cũng được bán thương mại như là một chất bổ sung tính linh động, bởi vì các protein được phân cắt thành các axit amin trước khi hấp thu, không có lý do collagen ăn uống ảnh hưởng đến mô liên kết trong cơ thể, ngoại trừ thông qua việc bổ sung các axit amin cho cơ thể. Gần đây, một nguồn collagen có sẵn thay thế cho loai collagen động vật đã Collagel được sử dụng. Mặc dù đắt tiền, đó là collagen của con người, bắt nguồn từ xác người hiến tặng, nhau thai và bào thai bị hủy bỏ, có thể giảm thiểu khả năng xảy ra các phản ứng miễn dịch.Mặc dù nó không thể được hấp thụ qua da, collagen đang được sử dụng như là một thành phần chính cho một số mỹ phẩm trang điểm * Các dạng collagen thu được từ da cá Collagen dạng bột Collagen dạng gel 2.2. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ COLLAGEN Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI 2.2.1. Nghiên cứu collagen ở Việt Nam       (TNO) Ngày 8.10, Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn An Giang phối hợp  với trường Đại học Bách khoa TP.HCM tổ chức hội thảo giới thiệu kết quả đề tài “Tách collagen từ da cá tra để ứng dụng trong sản xuất mỹ phẩm” (thuộc dự án Jica Suprem, do Nhật Bản tài trợ). Bằng 2 phương pháp sử dụng acid acetic và sử dụng dung môi kết hợp với enzyme, nhóm nghiên cứu của trường Đại học Bách khoa TP.HCM đã chiết xuất thành công chất collagen từ da cá tra, cá basa. Khi để ở nhiệt độ dưới 39oC, collagen không bị biến tính về cấu trúc nên dễ bảo quản. Trong giai đoạn tiếp theo nhóm sẽ nghiên cứu công nghệ tách chiết collagen từ da và xương cá tra, basa để ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm. Nếu thành công, đề tài này chẳng những giúp xử lý nguồn phế phẩm từ các nhà máy chế biến thuỷ sản, giảm thiểu ô nhiễm môi trường mà còn giúp tăng giá trị cho cá tra, basa... 2.2.2. Những nghiên cứu collagen trên thế giới Trên thế giới, việc tách chiết collagen từ da cá đã được tiến hành từ năm 1990 và từ collagen đã tạo ra nhiều sản phẩm ứng dụng trong y học, mỹ phẩm 2.3. CÁ TRA VÀ TÌNH HÌNH XUẤT KHẨU 2.3.1. Giới thiệu về cá tra Cá tra là tên gọi một họ, một chi và một số loài cá nước ngọt. Ở Việt Nam, cá tra sống chủ yếu trong lưu vực sông Cửu Long và lưu vực các sông lớn cực nam, có thân dẹp, da trơn, có râu ngắn. Cá tra thuộc họ Pangasiidae. Họ Pangasiidae (họ cá tra) theo ITIS có 3 chi: chi Sinopangasius (1 loài), chi Helicophagus (3 loài) và chi Pangasius (27 loài). Tuy nhiên, chi và loài Sinopangasius, theo vài tài liệu như FishBase và một số bảng từ đồng nghĩa, được coi là từ đồng nghĩa của Pangasius kempfi (cá bông lau). Ngoài ra trong chi Pangasius, trong 2 bảng phân loại khoa học nêu trên có 3 cặp tên đồng nghĩa. Như vậy, có thể kể họ Pangasiidae có 2 chi và chi Pangasius có 24 loài. Cá tra (theo Từ điển tiếng Việt, Nhà xuất bản Khoa học Xã hội, 1977) là loài cá nước ngọt, không vảy, giống cá trê nhưng không ngạnh. Sự so sánh giữa cá tra và cá trê càng thêm tối nghĩa vì hai nhóm cá này có nhiều điểm khác biệt. Ngoài ra trong phân loại khoa học chúng thuộc hai họ khác nhau là Pangasiidae và Clariidae.   Cá thuộc họ Pangasiidae (họ cá tra) với tên Việt có những loài sau: Helicophagus waandersii - Cá tra chuột Pangasius gigas - Cá tra dầu Pangasius kunyit - Cá tra bần Pangasius hypophthalmus - Cá tra nuôi Pangasius micronema - Cá tra Pangasius larnaudii - Cá vồ đém Pangasius sanitwongsei - Cá vồ cờ Pangasius bocourti - Cá xác bụng (cá ba sa) Pangasius macronema - Cá xác sọc Pangasius pleurotaenia - Cá xác bầu Pangasius conchophilus - Cá hú Pangasius polyuranodon - Cá dứa Pangasius krempfi - Cá bông lau Trong 13 loài trên có 12 loài thuộc chi Pangasius và 1 loài thuộc chi Helicophasus. Ngoại trừ 3 loài: cá hú, cá dứa và cá bông lau, những loài cá trong họ cá tra có 3 nhóm: nhóm cá tra, nhóm cá vồ và nhóm cá xác. 2.3.2. Tình hình xuất khẩu cá tra Theo tin từ Hiệp Hội thuỷ sản (VASEP), xuất khẩu cá tra của cả nước 8 tháng đầu năm 2009 giảm 7,3% so với 928 triệu USD cùng kỳ năm 2008 đạt 860 triệu USD, chiếm trên 1/4 mức sụt giảm xuất khẩu thuỷ sản của cả nước. Riêng trong tháng 8, xuất khẩu cá tra giảm trên 20% cả về khối lượng và giá trị so với cùng kỳ năm ngoái. Trong đó,  thị trường EU đã sụt giảm mạnh về khối lượng và giá trị nhập khẩu mặt hàng này với tỉ lệ tương ứng là 14% và 19% (các thị trường lớn trong khối như Tây Ban Nha, Đức, Hà Lan và Bỉ đều giảm từ 18 -35% về giá trị nhập khẩu). Ai Cập, vốn được coi là thị trường tiềm năng ở Trung Đông, cũng giảm mạnh NK cá tra Việt Nam trong tháng này, giảm trên 40%. Năm 2009, xuất khẩu cá tra khá lao đao bởi những rào cản từ các nước nhập khẩu chính, trong khi nguồn cung cấp nguyên liệu trong nước không ổn định. Việc Mỹ dự định đưa cá tra của Việt Nam vào danh mục cá da trơn theo luật Farmbill 2008 là một điều bất lợi cho con cá tra vốn đã bị “đánh” bởi thuế chống bán phá giá. Bên cạnh đó, những “chỉ trích” của các phương tiện truyền thông một số nước Châu Âu (Italia, Tây Ban Nha, Na Uy), Trung Đông và Niu Dilân đã làm hạn chế xuất khẩu con cá này. Kim ngạch xuất khẩu cá tra những tháng đầu năm vượt tôm, nhưng 2 tháng gần đây sụt giảm mạnh nên cá tra lại tụt xuống vị trí thứ 2 sau tôm đông lạnh. Riêng trong tháng 8, xuất khẩu cá tra giảm trên 20% cả về khối lượng và giá trị so với cùng kỳ năm ngoái. Trong đó, đáng lo ngại là thị trường EU đã sụt giảm mạnh về khối lượng và giá trị nhập khẩu mặt hàng này với tỉ lệ tương ứng là 14% và 19% (các thị trường lớn trong khối như Tây Ban Nha, Đức, Hà Lan và Bỉ đều giảm từ 18 -35% về GT nhập khẩu). Ai Cập, vốn được coi là thị trường tiềm năng ở Trung Đông, cũng giảm mạnh NK cá tra Việt Nam trong tháng này, giảm trên 40%. Tuy nhiên, 8 tháng đầu năm nay, thị trường EU vẫn giữ ngôi vị quán quân về nhập khẩu cá tra Việt Nam với trên 355 triệu USD, chiiếm 41,4% thị phần, mặc dù giảm 2,4% về GT so với cùng kỳ năm ngoái. Trong đó Đức vẫn duy trì tốc độ tăng trưởng khả quan với gần 14%, trị giá trên 72 triệu USD. Tây Ban Nha vẫn đứng đầu với kim ngạch ổn định gần 90 triệu USD. Đáng chú ý sau 2 năm liên tiếp sụt giảm nhập khẩu,  thị trường Ba Lan đã tụt hạng xuống vị trí thứ 5 với 24,8 triệu USD, giảm gần 36%, nhường chỗ cho thị trường Bỉ với 25,7 triệu USD. Nga và  Ucraina – hai thị trường cùng tụt hạng do ảnh hưởng từ lệnh cấm cá tra Việt Nam tháng 12/2008. Tháng 5/2009, cá tra Việt Nam lại được phép trở lại thị trường Nga, nhưng số DN và khối lượng được phép xuất khẩu hạn chế khiến xuất khẩu sang thị trường này không thể tăng trưởng mạnh. 5 tháng gần đây xuất khẩu cá tra sang Nga chỉ đạt 43 triệu USD, khiến tổng xuất khẩu 8 tháng giảm 67,7% so với cùng kỳ. Xuất khẩu sang Ucraina giảm 44,5% đạt 47,7 triệu USD. Thay thế vị trí của 2 thị trường này là Mỹ và ASEAN với mức tăng trưởng tương ứng là 60,7% và 7,7% đạt 82 triệu USD và 58,8 triệu USD. Mêhicô vẫn đang là thị trường tiềm năng đối với cá tra Việt Nam với mức tăng gần 25% đạt trên 44 triệu USD, đứng vị trí thứ 5. Bên cạnh những biến động về thị trường, vấn đề giá và nguồn cung nguyên liệu không ổn định cũng là một yếu tố tác động giảm xuất khẩu cá tra. Theo tin từ Hiệp hội Nghề nuôi và Chế biến thủy sản An Giang cho biết, giá cá tra, ba sa nguyên liệu thời gian gần đây tăng từ 14.000 đồng- 15.000 đồng/kg (giá thu mua tại ao). Tuy nhiên, theo phản ánh của nhiều người nuôi vẫn còn bị lỗ từ 800 đồng – 1.000 đồng/ kg, nên nhiều hộ vẫn còn “treo” hầm. Nếu tình trạng “treo” hầm vẫn tiếp diễn, những tháng đầu năm 2010, các doanh nghiệp chế biến thủy sản sẽ có nguy cơ thiếu cá nguyên liệu. Để duy trì sản xuất, một số công ty chế biến thủy sản đã áp dụng hình thức hợp đồng với người nuôi theo phương thức doanh nghiệp cung cấp 1,6kg thức ăn chăn nuôi và 2.500 đồng cho người nuôi để đổi lấy 1kg cá nguyên liệu. Trong thời gian tới xuất khẩu cá tra sang thị trường Châu Âu và Trung Đông đang bị đe doạ bởi những thông tin không tốt về cá tra, basa của VN, cùng với Luật Nông nghiệp 2008 của Mỹ sẽ tiếp tục là những trở ngại đối với XK cá tra, basa của Việt Nam. Tuy nhiên, mặt hàng này đã, đang và sẽ tiếp tục có lợi thế cạnh tranh và được nhiều thị trường mới đón nhận. CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN THỰC HIỆN 3.1.1. Địa điểm Thực hiện tại phòng thí nghiệm hóa sinh của trung tâm sau thu hoạch, thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản 2 3.1.2. Thời gian thực hiện Từ ngày 21/3/2011 tới ngày 21/7/2011 3.2. NGUYÊN LIỆU - HÓA CHẤT – DỤNG CỤ 3.2.1. Nguyên liệu Da cá tra được mua từ các công ty cổ phần Vĩnh Hoàn, Quốc lộ 30, phường 11, thành phố Cao Lãnh, tỉnh Đồng Tháp Da cá được tách ra bằng phương pháp cơ học nhà máy. Sau khi mua về, rửa sạch bằng nước, loại bỏ sơ bỏ các phần thịt, mỡ còn sót lại trên da và tồn trữ ở -20oC cho đến khi sử dụng Xử lý nguyên liệu: trước khi đưa vào sử dụng, tiến hành rã đông, trộn đều rồi chia ngẫu nhiên thành từng phần với lượng vừa đủ cho mỗi mẫu đem đi khảo sát 3.2.2. Enzyme Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chế phẩm enzyme Alcalase 2.4L do Novozymes cung cấp Alcalase 2.4L là loại endopeptidase thủy phân protein được sản xuất bằng quá trình lên men bề sâu của loài vi khuẩn Bacillus lichenifomis. Alcalase dễ bị ảnh hưởnh bởi nhiệt. Nó duy trì hoạt tính ít nhất 24 tháng kể từ ngày sản xuất khi bảo quản kín và nhiệt độ dưới 10oC. Alcalase 2.4L có hoạt tính riêng là 2.4 AU/g (đơn vị Anson), tên thường gọi là subtilisin Carlsberg 3.2.3. Dụng cụ thiết bị - Máy chưng cất đạm - Máy đo màu UV - Tủ sấy - Giấy lọc - Máy so màu cầm tay - Một số dụng cụ phân tích khác 3.3. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.3.1. Quy trình nghiên cứu Xử lý tách béo, protein tạp Chiết ra dịch collagen(gelatin lỏng, thô) 3.3.2. Bố trí thí nghiệm 3.3.2.1.Thí nghiệm 1. Khảo sát quá trình trích ly collagen Thí nghiệm 1.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hiệu suất chiết collagen chiết từ da cá sử dụng hóa chất NaOH 0.01% Yếu tố thí nghiệm: nhiệt độ Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: hiệu suất chiết =hàm lượng collagen trong dung dịch sau khi chiết/hàm lượng collagen trong da cá ban đầu Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Bảng 1.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hiệu suất chiết collagen chiết từ da cá sử dụng hóa chất NaOH 0.01% Lặp lại (n)  Nhiệt độ (oC)    55  60  65   1 2 3      Các yếu tố cố định: Tỉ lệ NaOH/da = 2:1 Thời gian: 2h Thí nghiệm 1.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên lên hiệu suất chiết collagen chiết từ da cá sử dụng hóa chất NaOH 0.01% Yếu tố thí nghiệm: thời gian Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: hiệu suất chiết =hàm lượng collagen trong dung dịch sau khi chiết/hàm lượng collagen trong da cá ban đầu Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Bảng 1.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên hiệu suất chiết collagen từ da cá sử dụng hóa chất NaOH 0.01% Lặp lại (n)  Thời gian (giờ)    2  2.30  3   1 2 3      Các yếu tố cố định: Tỉ lệ NaOH/da = 2:1 Nhiệt độ: lấy nhiệt đô tối ưu từ TN 1.1 3.3.2.2.Thí nghiệm 2. Khảo sát quá trình thủy phân collagen bằng enzyme Thí nghiệm 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hiệu suất thủy phân collagen chiết từ da cá Yếu tố thí nghiệm: nhiệt độ Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: trọng lượng phân tử sau thủy phân, xác định bằng cách đo độ nhớt Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hiệu suất thủy phân collagen chiết từ da cá Lặp lại (n)  Nhiệt độ (oC)    55  60  65   1 2 3      Các yếu tố cố định: Tỉ lệ enzyme/dung dịch= 0,1% Thời gian: 4h pH: 8 Thí nghiệm 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên hiệu suất thủy phân collagen chiết từ da cá Yếu tố thí nghiệm: thời gian Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: trọng lượng phân tử sau thủy phân, xác định bằng cách đo độ nhớt Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên hiệu suất thủy phân collagen chiết từ da cá Lặp lại (n)  Thời gian (giờ)    2  3  4   1 2 3      Các yếu tố cố định: Tỉ lệ enzyme/dung dịch = 0,1% Nhiệt độ: nhiệt độ tối ưu từ tN trên pH: 8 Thí nghiệm 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hiệu suất thủy phân collagen chiết từ da cá Yếu tố thí nghiệm: thời gian Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: trọng lượng phân tử sau thủy phân, xác định bằng cách đo độ nhớt Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hiệu suất thủy phân collagen chiết từ da cá Lặp lại (n)  pH    7.5  8.0  8.5   1 2 3      Các yếu tố cố định: Tỉ lệ enzyme/dung dịch = 0,1% Nhiệt độ: nhiệt độ tối ưu từ tN trên Thời gian: thời gian tối ưu từ TN trên Thí nghiệm 2.4. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme/dung dịch lên hiệu suất thủy phân collagen chiết từ da cá Yếu tố thí nghiệm: thời gian Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: trọng lượng phân tử sau thủy phân, xác định bằng cách đo độ nhớt Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Bảng 2.4. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme/dung dịch lên hiệu suất thủy phân collagen chiết từ da cá Lặp lại (n)  Tỷ lệ    0,1  0,3  0,6   1 2 3      Các yếu tố cố định: pH: tối ưu từ TN trên Nhiệt độ: nhiệt độ tối ưu từ tN trên Thời gian: thời gian tối ưu từ TN trên 3.2.2.3. Đánh giá chất lượng sản phẩm Dung dịch sau thủy phân được cô đặc rồi sấy phun hoặc đông khô sau đó đi đánh giá các chỉ tiêu: đạm, collagen, béo, tro, ẩm, khối lượng phân tử 3.3.3. Phương pháp đánh giá phân tích 3.3.1.1. Xác định độ nhớt trong nguyên liệu Nguyên tắc: nếu cho chất lỏng chảy qua các mao quản, chất lỏng có độ nhớt càng cao thì chảy càng chậm, vì vậy có thể dựa vào tính chất đó để đo độ nhớt của chúng. Các dung dịch keo và dung dịch cao phân tử thường có độ nhớt cao. Độ nhớt của chúng phụ thuộc vào khối lượng phân tử và nồng độ dung dịch. Độ nhớt tăng nếu hai yếu tố này tăng. 3.3.1.2. Xác định hàm lượng ẩm Nguyên tắc: áp dụng phương pháp sấy khô đến sản phẩm không đổi. 3.3.1.3. Xác định hàm lượng tro Nguyên tắc: tro hoá mẫu bằng nhiệt. Sau đó xác định hàm lượng tro bằng phương pháp khối lượng và xác định độ kiềm của tro bằng phương pháp chuẩn độ. 3.3.1.4. Xác định hàm lượng lipid tổng Nguyên tắc: Dùng dung môi kị nước trích li hoàn toàn lipid từ nguyên liệu đã được cắt nhỏ. Một số thành phần đã được hòa tan trong chất béo cũng được trích ly theo bao gồm sắc tố, các chất mùi…tuy nhiên hàm lượng của chúng thấp. Do có lẫn tạp chất, phần trích ly được gọi là lipid tổng hay dầu thô Hàm lượng lipid tổng có thể tính bằng cách cân trực tiếp dầu sau khi chưng cất các loại dung môi hoặc tính gián tiếp từ khối lượng bã còn lại. Ưu điểm của cách tính gián tiếp là đồng thời có thể trích ly nhiều mẫu trong cùng một trụ chiết 3.3.1.5. Xác định hàm lượng nitơ và protein tổng Nguyên tắc: Khi đốt nóng mẫu vật cần phân tích với H2SO4 đậm đặc thì các hợp chất hữu cơ sẽ bị õy hóa. Các nguyên tố carbon và hydro lần lượt tạo thành khí CO2 và H2O, còn nguyên tố nitơ được giải phóng ra dưới dạng khí NH3 sẽ kết hợp với H2SO4 tạo thành muối (NH4)2SO4 tan trong dung dịch. Kế đến , đuổi khí NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH đồng thời cất và thu NH3 bằng một lượng dư H2SO4 0.1N chuẩn. Sau đó, tiến hành định phân lượng H2SO4 còn lại bằng dung dịch NaOH 0.1N chuẩn, qua đó gián tiếp tính được lượng Nitơ có trong nguyên liệu phân tích ban đầu 3.3.1.6. Xác định tổng lượng gián tiếp collagen Nguyên tắc: Trong tổng lượng amino acid có trong collagen, hydroxyproline chiếm khoảng 14%. Loại amino acid này gần như được thấy trong collagen mà không trong bất kì một loại protein nào khác của cơ thể, ngoại trừ một lượng nhỏ trong elastin. Do đó, có thể định lương collagen thong qua định lương hydrxyproline Cấu trúc của hydrxyproline có chứa vòng pyrrolidine, nó có thể bị oxy hóa để hình thành pirrole. Vòng pirrole này có tác dụng với tác chất Ehrlich, 4-(N,N-dimethylamino) bezaldehyde tạo thành hợp chất quinoid có màu (màu sắc phụ thuộc vào nhóm thế và thay đổi từ màu cam đến màu hoa cà) thực hiện phương pháp so màu để tính hàm lượng hydroxyproline CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. KẾT QUẢ 4.1.1. Thí nghiệm 1. Khảo sát quá trình trích ly collagen Thí nghiệm 1.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hiệu suất chiết collagen chiết từ da cá sử dụng hóa chất NaOH 0.01% (Chọn được nhiệt độ tối ưu Thí nghiệm 1.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên lên hiệu suất chiết collagen chiết từ da cá sử dụng hóa chất NaOH 0.01% (Chọn được thời gian tối ưu 4.1.2.Thí nghiệm 2. Khảo sát quá trình thủy phân collagen bằng enzyme Thí nghiệm 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hiệu suất thủy phân collagen chiết từ da cá (Chọn được nhiệt độ tối ưu Thí nghiệm 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên hiệu suất thủy phân collagen chiết từ da cá (Chọn được thời gian tối ưu Thí nghiệm 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hiệu suất thủy phân collagen chiết từ da cá (Chọn được pH tối ưu 4.2. THẢO LUẬN Thí nghiệm 2.4. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme/dung dịch lên hiệu suất thủy phân collagen chiết từ da cá (Chọn được tỉ lệ enzyme/dung dịch tối ưu TÀI LIỆU THAM KHẢO www.thanhnien.com.vn