Đề tài sản xuất Xanthan Gum

Xanthan Gum 1 MỤC LỤC Lời mở đầu -------------------------------------------------------------------------------- 2 I. Giới thiệu chung về xanthan gum -------------------------------------------- 3 1. Khái niệm -------------------------------------------------------------- 3 2. Lịch sử ra đời -------------------------------------------------------------- 3 3. Cấu tạo -------------------------------------------------------------- 3 4. Tình hình sử dụng một số loại polysaccharide ------------------------ 5 5. Tính chất -------------------------------------------------------------- 6 II. Nguyên liệu ----------------------------------------------------------------------- 8 1. Giống vi sinh vật lên men -------------------------------------------------- 8 2. Nguyên liệu khác ------------------------------------------------------------ 9 III. Quy trình công nghệ sản xuất xanthan gum ------------------------------- 12 Sơ đồ quy trình công nghệ ----------------------------------------------------- 12 Giải thích quy trình ------------------------------------------------------------- 13 1. Nhân giống -------------------------------------------------------------------- 13 2. Chuẩn bị môi trường lên men -------------------------------------------- 13 3. Thanh trùng môi trường lên men ---------------------------------------- 14 4. Lên men ----------------------------------------------------------------------- 15 5. Thanh trùng ------------------------------------------------------------------ 29 6. Tách vi sinh vật -------------------------------------------------------------- 30 7. Kết tủa ------------------------------------------------------------------------- 31 8. Tách nước --------------------------------------------------------------------- 32 9. Sấy ------------------------------------------------------------------------------ 32 10. Nghiền ------------------------------------------------------------------------- 33 11. Đóng gói ----------------------------------------------------------------------- 34 IV. Ứng dụng của xanthan gum --------------------------------------------------- 35 1. Trong thực phẩm ------------------------------------------------------------ 35 2. Trong mỹ phẩm ------------------------------------------------------------- 35 3. Trong công nghiệp dầu mỏ ------------------------------------------------ 35 4. Trong dược phẩm ----------------------------------------------------------- 36 V. Chỉ tiêu chất lượng của xanthan gum --------------------------------------- 37 1. Chỉ tiêu vật lý -------------------------------------------------------------- 37 2. Chỉ tiêu hóa học ------------------------------------------------------------- 37 3. Chỉ tiêu hóa lý -------------------------------------------------------------- 37 4. Chỉ tiêu vi sinh -------------------------------------------------------------- 37 VI. Thành tựu công nghệ ----------------------------------------------------------- 38 1. Giới thiệu thiết bị phản ứng sinh học CPBR -------------------------- 38 2. Hoạt động của thiết bị ------------------------------------------------------ 39 Lời kết -------------------------------------------------------------------------------------- 40 Tài liệu tham khảo----------------------------------------------------------------------- 41 Xanthan Gum 2 LỜI MỞ ĐẦU Xanthan gum, không một ai trong nhóm biết một tí gì về nó, chỉ biết nó có trong danh sách phụ gia thực phẩm, có bản chất là polysaccharide được sinh tổng hợp từ vi sinh vật. Có rất nhiều loại polysaccharide được sinh tổng hợp bởi vi sinh vật như alginate, curlane, dextran, gellan, glucan, pullulan và xanthan. Trong số những loại này thì xanthan gum có vai trò vượt trội hơn bởi nó có tính định hướng, ứng dụng nhiều. Trong công nghiệp polysaccharide thì xanthan gum là một trong những đại diện phát triển nhanh nhất. Đối với ngành thực phẩm, những nhu cầu về gum tự nhiên đang có xu hướng giảm xuống, trong khi đó xanthan lại có xu hướng tăng lên. Đây là một điểm đến hứa hẹn cho những nhà kĩ sư thực phẩm tương lai. Bài báo cáo sẽ cung cấp một phần nào kiến thức căn bản nhất về xanthan gum. Hy vọng sau bài báo cáo này, đề tài xanthan gum sẽ thật thu hút mọi người cùng quan tâm và cùng tìm hiểu. Xanthan Gum 3 I. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ XANTHAN GUM 1. Khái niệm Xanthan gum là một polysaccharide được sử dụng như là một phụ gia thực phẩm và chất điều chỉnh lưu biến. Là sản phẩm lên men của glucose và saccharose bởi vi khuẩn Xanthomonas campestris. Xanthomonas campestris là loại vi khuẩn gây ra bệnh mục đen trên cải, hoa lơ và các loại rau lá mỏng khác. 2. Lịch sử ra đời của xanthan gum Cách đây rất lâu, con người đã tìm hiểu được rằng các loài Xanthomonas có thể sản xuất ra những khối sền sệt. Cuối năm 1950, xanthan đã được phát minh tại Northern Reaseach Center (NRRC), Peoria, Illinois. Bà Allene Rosalind Jeanes và cộng sự của bà ở Viện Nông Nghiệp Hoa Kỳ (United States Department of Agriculture) đã tổ chức cuộc kiểm tra các loài vi sinh vật có khả năng sản xuất ra các loại gum tan trong nước, trong số đó, xanthan là một polysaccharide tổng hợp bằng phương pháp sinh học mà có tiềm năng ứng dụng rất lớn so với các loại gum tan trong nước được sản xuất bằng phương pháp tự nhiên. Đầu những năm 1960, xanthan trở thành sản phẩm thương mại bởi công ty Kelco với tên thương mại là Kelzan (theo Whistler) nhưng không thích hợp cho thương mại mãi đến năm 1964. Năm 1969, xanthan đã được tổ chức FDA (the American Food and Drug Administration) cho phép sử dụng làm phụ gia thực phẩm sau những nghiên cứu và thử nghiệm trên động vật. Nó được phép sử dụng ở các nước: Hoa Kỳ, Canada, Châu Âu (1982). Số kí hiệu là E415. Các công ty sản xuất xanthan nổi tiếng: Merck, Pfizer và Kelco của Mĩ, Rhône Poulenc và Sanofi-Elf của Pháp, Jungbunzlauer của Úc. 3. Cấu tạo hóa học của xanthan gum a. Cấu tạo phân tử Xanthan bao gồm những cụm 5 gốc đường được lặp lại, mỗi cụm gồm 2 gốc đường D - glucose, 2 gốc đường D - mannose, 1 gốc đường D - glucoronate và các gốc acetate, pyruvate với số lượng thay đổi. Mỗi cụm đơn vị của mạch chính trong chuỗi polysaccharide bao gồm các gốc β – D – glucose, liên kết với nhau bằng liên kết – 1, 4 glycoside. Yếu tố này giống với cấu trúc của cellulose. Mạch nhánh gồm 1 gốc glucoronate nằm ở giữa liên kết với 2 gốc mannose. Vị trí thứ nhất của gốc D-glucoronate liên kết với vị trí thứ hai của 1 gốc D - mannose, còn vị trí thứ tư của gốc D-glucoronate liên kết với vị trí thứ nhất của một gốc mannose khác. Mạch nhánh liên kết với mạch chính tại vị trí thứ 3 trên gốc cellulose của mạch chính và vị trí thứ nhất trên gốc mannose của mạch nhánh. Khoảng một nửa số gốc mannose ở cuối có nhóm acid pyruvic liên kết do nhóm ketal tạo vòng tại vị trí 4 – 6 trên gốc mannose. Xanthan Gum 4 Gốc mannose còn lại liên kết với một acetyl tại vị trí thứ 6. Xanthan gum cũng chứa các ion dương hóa trị một như là Na, K. Mạch nhánh và mạch thẳng xoắn chặt với nhau tạo thành hình dạng bền chặt. Hình 1: Cấu trúc một đơn vị của xanthan gum b. Khối lượng phân tử Có thể từ 0.9 triệu đến 1.6 triệu Dalton, nó phụ thuộc vào nguồn vi sinh vật và điều kiện thực hiện quá trình lên men. Đôi khi khối lượng phân tử xanthan cũng có thể lên đến 13 - 50 triệu Dalton. Hình 2: cấu tạo của xanthan gum Xanthan Gum 5 c. Trang thái phân tử Xanthan là phân tử sinh học xoắn đôi nhưng không đối xứng nhau. Mạch nhánh và mạch thẳng xoắn chặt với nhau tạo thành hình dạng bền chặt. Các phân tử có thể co lại hình xoắn ốc kép hình thành nên cấu trúc đặc quánh, khi gặp một số điều kiện sẽ bị duỗi mạch làm thay đổi tính chất. Mạch chính được mạch bên bảo vệ nên làm cho xanthan tương đối bền với acid, kiềm và enzyme. d. Thành phần cấu tạo Acid pyruvic là một thành phần rất quan trọng do nó tác động đến khả năng hòa tan trong nước của polymer. Thành phần acid pyruvic trong xanthan khác nhau phụ thuộc vào chủng Xanthomonas campestris (có những chủng sản xuất ra hàm lượng acid pyruvic rất cao, có những chủng lại sản xuất ra với hàm lượng rất thấp), điều kiện lên men và điều kiện thu hồi sản phẩm. Bảng 1: thành phần % của D – glucose, D – mannose, D – glucuronic acid, pyruvate, acetate trong polysaccharide do một số chủng vi khuẩn khác nhau tạo ra Vi khuẩn D-Glucose D- Mannose D-Glucuronic Acid Pyruvate Acetate X.campestris 30.1 27.3 14.9 7.1 6.5 X.vasculorum 34.9 30.2 17.9 6.6 6.3 X.faseoli 30.9 28.6 15.3 1.8 6.4 X.juglandis 33.2 30.2 16.8 6.9 6.4 X.gummisudans 34.8 30.7 16.5 4.7 10.0 X.fragaria 24.6 26.1 14.0 4.9 5.5 4. Tình hình sử dụng một số loại polysaccharide Có rất nhiều loại polysaccharide được sinh tổng hợp bởi vi sinh vật như alginate, curlane, dextran, gellan, glucan, pullulan và xanthan. Trong số những loại này thì xanthan có vai trò vượt trội hơn bởi dễ dàng sản xuất và được ứng dụng nhiều. Thực vậy, nó đang dần được sử dụng nhiều trong thực phẩm và trong việc tạo ra chất độn cho mỹ phẩm. Trong công nghiệp polysaccharide thì xanthan là một trong những đại diện phát triển nhanh nhất. Đối với ngành thực phẩm, những nhu cầu về gum tự nhiên đang có xu hướng giảm xuống, trong khi đó xanthan lại có xu hướng tăng lên. Xanthan Gum 6 Khoảng 20.000 tấn xanthan được sản xuất theo phương pháp công nghiệp từ giống vi khuẩn X. campestris mỗi năm. Nhu cầu tiêu thụ xanthan trên toàn thế giới là khoảng 23 triệu kg/ năm và được dự đoán là sẽ tiếp tục tăng lên 5-10% theo hằng năm. Bảng 2: tỉ suất tăng trung bình hàng năm của những polysaccharide thương mại chủ yếu: những dự báo và phân tích thị trường Mỹ TỈ SUẤT TĂNG TRUNG BÌNH HẰNG NĂM (%) POLYSACCHARIDE THỰC PHẨM DẦU MỎ MỸ PHẨM STARCHES NATURAL GUM: GUAR ALGINS ARABIC CARRAGEENAN LOCUST BEAN CELLULOSICS: CMC HPG HEC MC XANTHAN PECTIN 2.5 2.1 2.7 2.6 4.5 1.9 3.5 --- --- 3.5 8.3 5.2 1.5 --- --- --- --- --- 0.5 1.5 0.5 --- 2.0 --- --- --- 3.7 3.7 3.7 3.1 3.0 --- --- 3.7 5.9 --- Chú thích: Bảng số liệu được cung cấp bởi văn phòng trung tâm truyền thông kinh doanh (Business Communication Co.). CMC: carboxymethylcellulose; HPG: hydroxypropyl guar; HEC: hydroxylethylcellulose; MC: methylcellulose. 5. Tính chất của xanthan a. Tạo dung dịch có độ nhớt Khi hòa tan trong nước, bị hidrate hóa một cách nhanh chóng, không bị đóng cục tạo dung dịch có độ nhớt cao. Xanthan gum có độ nhớt cao. Dung dịch có nồng độ khoảng 1% có độ nhớt xấp xỉ 1000 cP khi đo ở 60 v/ph với thiết bị đo độ nhớt Brookfield model LVF ở 250C. Xanthan Gum 7 Ảnh hưởng của muối: độ nhớt không bị ảnh hưởng khi thêm một lượng lớn muối, như trong 250 g/l dung dịch NaCl chỉ làm tăng không đáng kể độ nhớt của dung dịch xanthan. b. Tính tương hợp của xanthan  Với alcohol Tuy xanthan không hòa tan trực tiếp được trong alcohol nhưng lại có khả năng tương thích với nó. Những sản phẩm có chứa xanthan trong công thức thành phần thường chiếm đến 60% dung môi alcohol như ethanol. Ta có thể sử dụng tính chất này để làm cho cocktail, rượu có mùi chocolate trở nên đặc hơn.  Với các loại enzyme Hầu hết các dung dịch keo đều bị thoái hóa ở một giới hạn nào đó bới các enzyme có mặt trong thực phẩm như cellulase, pectinase, amylase, protease. Tuy nhiên, xanthan không bị thoái hóa bới chúng. Khả năng kháng lại tác động của enzyme là do sự xắp xếp các nhánh chính và nhánh phụ, sự xắp xếp này chống lại tác động của enzyme lên liên kết 1,4 trong nhánh chính. Nhờ đó mà ngăn cản được sự ngưng trùng hợp do enzyme, acid và kiềm. Ứng dụng thực tế, khả năng xanthan chống lại tác động của enzyme đã được sử dụng trong một số sản phẩm thực phẩm như bánh mứt táo, thực phẩm có chứa tinh bột, gia vị trộn… c. Gel thuận nghịch về nhiệt độ Gel tạo thành khi làm nguội các hỗn hợp. Xanthan gum ở trạng thái keo có thể thực hiện sự chuyển đổi cấu hình xoắn ốc đôi thành chuỗi đơn bằng cách tôi luyện ở nhiệt độ 40 - 800C. Ở cấu hình chuỗi đơn, mạng lưới liên kết yếu đi, hình thành nên trạng thái giả dẻo (pseudoplastic) làm giảm độ nhớt của dung dịch. Xanthan gum có khả năng kết hợp được với nhiều chất tạo gel, tạo sệt khác nhau như locust bean gum, konjac, guar gum. d. Khả năng hydrate hóa Sự hiện diện của những chuỗi tích điện âm trong phân tử xanthan gum làm tăng khả năng hydrate hóa và tạo nên dung dịch xanthan trong nước lạnh. Xanthan gum là một chất háo nước, tan được trong nước nóng và nước lạnh. Điều kiện lạnh đông/rã đông: nhờ khả năng liên kết với nước nên dung dịch xanthan gum rất bền khi lạnh đông cũng như rã đông. Xanthan Gum 8 II. NGUYÊN LIỆU 1. Giống vi sinh vật lên men Xanthan được sản xuất từ vi khuẩn Xanthomonas campestris được cô lập từ cây cải bắp, nó chính là loại vi khuẩn gây ra bệnh nấm làm cho cây có màu đen. Hình 3:Vi khuẩn Xanthomonas campestris Hình 4: Vi khuẩn Xanthomonas campestris gây bệnh ở cây cải bắp Vi khuẩn Xanthomonas campestris: Giới: Vi khuẩn Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Xanthomonadales Họ: Xanthomonadaceae Giống: Xanthomonas  Có dạng hình que đơn, thẳng. Rộng 0,4 - 0,7  m, dài 0,7 – 1,8  m.  Vi khuẩn Gram âm. Xanthan Gum 9  Có khả năng di động nhờ có tiên mao mọc ở cực.  Là loại vi khuẩn dị dưỡng, hiếu khí bắt buộc.  Không có khả năng khử nitơ, phản ứng catalase dương tính, oxidase âm tính.  Phát triển trên môi trường dinh dưỡng agar, bị ức chế bởi 0,1% triphenyltetrazolium chloride. Phần lớn chúng sống một mình hoặc theo từng cặp. X. campestris làm thành đám mucoid màu vàng, trơn nhẵn sống trên môi trường rắn, và những tế bào được bao quanh bởi xanthan gum (polysaccharide ngoại bào). Công thức hóa học của sắc tố vàng được xác định là mono hoặc dibromoaryl polyene. Theo như cơ sở của sự phân loại, kích cỡ gene trung bình của Xanthoonas là 2.5 × 109 Da. Phần trăm G + C (guanine + cytosine) có chứa trong chuỗi AND là 63 - 71%. Tính không ổn định thuộc về di truyền của vi khuẩn X. campestris sẽ ảnh hưởng đến chất lượng cũng như số lượng xanthan xuất hiện khi nuôi cấy nó. Sự đột biến gene có liên quan đến việc hình thành 2 dạng khác nhau: L (large) và S (small). Trong khi dạng L sản xuất ra một lượng lớn xanthan với những tính chất lưu biến học mong muốn thì dạng S lại cho lượng sản phẩm ít và chất lượng thì kém. Những chức năng của xanthan chưa được nhận biết đầy đủ, nhưng có một bằng chứng chắc chắn rằng có một lớp polysaccharide ở xung quanh màng tế bào, bảo vệ tế bào tránh khỏi những tác động của môi trường xung quanh. Ví dụ như khả năng giữ nước của xanthan, nó sẽ cung cấp một lớp màng bảo vệ dưới điều kiện môi trường hanh khô. Để sinh sản và phát triển, vi sinh vật nào cũng phải hấp thụ những chất dinh dưỡng cần thiết để xây dựng màng, thành tế bào và bào quan bên trong tế bào. Mỗi một loại tế bào khác nhau thì sử dụng nguồn năng lượng khác nhau, chính vì thế cấu tạo hoá học bên trong mỗi cơ thể sinh vật cũng khác nhau. X.campestris là loại vi khuẩn sản xuất ra xanthan gum chủ yếu, tuy nhiên một số loài khác như Xanthomonas phaseolis, Xanthomonas malvacearum, Xanthomonas carotae, Xanthomonas manihotis và Xanthomonas jugandlis cũng được biết đến là có khả năng sản xuất ra polysaccharide ngoại bào tốt. Nhưng do sự đa dạng về dinh dưỡng của X. campestris nên nó được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp.  Tiêu chí chọn giống: - Không có khả năng sinh độc tố. - Do cần thu nhận sản phẩm trao đổi chất ngoại bào của vi khuẩn nên phải chọn giống có khả năng sinh tổng hợp xanthan cao, số lượng lớn không quan tâm đến các sản phẩm khác - Giống được chọn phải có khả năng thích nghi và tốc độ sinh trưởng nhanh, lấn át được vi sinh vật tạp nhiễm. - Môi trường nuôi cấy dễ kiếm, rẻ tiền. - Hoạt tính trao đổi chất của giống được chọn phải ổn định, lâu thoái hóa. 2. Nguyên liệu khác  Nguồn carbon Trong tiến trình sản xuất công nghiệp, tinh bột và glucose được sử dụng ở mức độ thương mại làm nguồn carbon. Saccharose và dịch whey cũng được sử dụng. Hàm lượng glucose lên Xanthan Gum 10 khoảng 5% được coi là môi trường cho chất lượng sản phẩm tốt nhất, nếu hàm lượng glucose cao hơn mức này thì chất lượng của xanthan lại giảm đi. Trên thực tế, hàm lượng glucose cao nhất bị giới hạn bởi tính chất lưu biến học của canh trường lên men. Bảng 3: Ảnh hưởng của nguồn carbon lên sản lượng xanthan Các nguồn Cacbon Sản lượng xanthan (g/l) Glucose Saccharose Maltose Fructose Xylose Arabinose 14,744 13,234 15,321 5,232 5,531 10,958 Ở châu Âu người ta dùng syrup bắp để làm nguồn nguyên liệu sản xuất xanthan. Syrup bắp còn được gọi là high fructose corn syrup (HFCS) do có hàm lượng fructose rất cao, được sử dụng phổ biến trong các loại kẹo và đồ uống. Syrup bắp không phải là loại đường tự nhiên như đường mía hay đường củ cải. Vì HFCS có được sau quá trình xử lý công nghiệp phức tạp. Người ta sử dụng 3 loại enzyme là - amylase, glucose amylase thủy phân tinh bột bắp thành đường glucose và enzyme isomerase chuyển hóa glucose thành fructose, tăng độ ngọt và khả năng hòa tan. Sau đó, glucose tinh khiết được thêm vào hỗn hợp tạo ra HFCS. Giá trị tỉ lệ fructose : glucose trong HFCS là 90 : 10, 42 : 43 hoặc 55 : 45.  Nguồn nitơ Đối với nguồn nitơ, ta có thể dùng nước ngâm hạt ngũ cốc, dịch thủy phân casein,dịch chiết nấm men, dịch chiết từ đậu nành, tuy nhiên nguồn nitơ thường được dùng nhất là muối amoni. Xanthan được sản xuất có chất lượng tốt nếu như X. campestris được nuôi dưỡng trong một môi trường tổng hợp đơn giản bao gồm NH4Cl, glucose và muối. Nhóm khoa học Letisse đã đưa ra một mô hình lên men xanthan với: - Nguồn cacbon là saccharose. - Nguồn nitơ là NH4Cl hoặc NaNO3. - Tốc độ phát triển tương ứng của tế bào là 0,13 h-1 và 0,07h-1. - Tốc độ hình thành xanthan tương ứng là 0,52 mmol/h.g tế bào và 0,79 mmol/h.g tế bào - Lượng acid hữu cơ bên trong xanthan (acetate và pyruvate) là 6% và 4,6% . Điều này cho thấy rằng ion amoni là cơ chất thích hợp cho việc tích lũy sinh khối còn nitrat thì thích hợp cho sản lượng xanthan tạo thành. Nếu thiếu nguồn nitơ vô cơ, ta có thể thay thế bằng nguồn nitơ hữu cơ như sản phẩm thuỷ phân đậu nành. Xanthan Gum 11  Các nguyên tố vi lượng Bên cạnh nguồn carbon và nitơ, sự sinh tổng hợp xanthan đòi hỏi phải có một vài nguyên tố vi lượng như kali, sắt, muối calci… Lợi ích của việc sử dụng môi trường tổng hợp tăng lên gấp đôi vì ta có thể điều khiển được tính không ổn định của gene cũng như cải tiến được chất lượng của sản phẩm. Mặc dù cấu trúc của sự tổng hợp xanthan về cơ bản độc lập với môi trường nuôi cấy, nhưng có một vài điểm khác biệt về nhóm thế acyl, đặc tính lưu biến học và cả lượng của sản phẩm đạt được. Xanthan Gum 12 III. QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT XANTHAN GUM  Sơ đồ quy trình công nghệ Nguyên liệu (syrup bắp, glucose…) Chuẩn bị môi trường Vi khuẩn Xanthomons campestris Nhân giống Lên men Thanh trùng Kết tủa Sấy Nghiền Đóng gói Sản phẩm Tách nước Thanh trùng Tách vi sinh vật Xác vi sinh vật Xanthan Gum 13 Hình 5: Quy trình sản xuất xanthan bằng thiết bị lên men có cánh khuấy  Giải thích quy trình 1. Nhân giống Mục đích: chuẩn bị cho quá trình lên men Biến đổi: sinh học - tăng sinh khối Môi trường nhân giống: dịch malt trong ống thạch nghiêng chứa  10g/l glucose  5g/l peptone  3g/l dịch chiết nấm men  20g/l agar Xanthan Gum 14  bảo quản ở điều kiện 40C Cấy chuyền 2 tuần 1 lần để đảm bảo tính ổn định cho sản phẩm xanthan. 2. Chuẩn bị môi trường lên men Mục đích: chuẩn bị cho quá trình lên men. Dưới đây là môi trường dinh dưỡng trong lên men tĩnh:  Glucose: 30g/l  MgSO4.7H2O: 0,24g/l  (NH4)2SO4: 3,33g/l  H3BO3: 0,0072g/l  FeCl3.6H2O: 0,0042g/l  KH2PO4: 7,2g/l  CaCO3: 0,029g/l  Acid citric: 2g/l  ZnO: 0,006g/l  Dịch chiết nấm men: 0,75 g/l  Peptone: 0,34 g/l  Chất chống bọt: 0,06 g/l  HCl: 0,16 ml/l  pH ban đầu: 7,0  0,1 Lên men tĩnh được thực hiện trong bình erlen 500ml có chứa 100ml môi trường lên men được cấy chuyền từ môi trường 10% (v/v) trước nuôi cấy 24h. Sau đó canh trường được ủ ở 300C trong thiết bị khuấy với tốc độ 200 v/ph trong 96h. Mẫu sẽ được lấy ra thường xuyên để kiểm tra sinh khối, nồng độ xanthan và đường sót Chuẩn bị môi trường nuôi cấy bao gồm nhiều giai đoạn với những yêu cầu khác nhau. Canh trường nhân giống ban đầu là 10L, sau đó nâng lên 100m3 để đưa vào sản xuất. Ở 2 cấp nhân giống liên tiếp, thể tích của môi trường sẽ được nhân lên 10 lần. 3. Thanh trùng môi trường lên men  Mục đích: Chuẩn bị, đảm bảo về mặt vi sinh của môi trường trước khi đem đi lên men.  Biến đổi: chủ yếu là biến đổi sinh học: ức chế, tiêu diệt các vi sinh vật nhiễm.  Thiết bị: sử dụng thiết bị thanh trùng bản mỏng. Bộ phận chính của thiết bị là những tấm bảng hình chữ nhật rất mỏng, làm bằng thép không rỉ. Mỗi tấm bảng có 4 lỗ tại 4 góc và hệ thống các đường rãnh trên khắp bề mặt để tạo sự chảy rối và tăng diện tích truyền nhiệt. Khi ghép các tấm bảng mỏng lại với nhau trên bộ khung của thiết bị sẽ hình thành nên những hệ thống đường vào và ra cho chất lỏng cần thanh trùng và chất tải nhiệt. Xanthan Gum 15 Hình 6: Bản mỏng Hình 7: Thiết bị thanh trùng bản mỏng  Thông số công nghệ: Nhiệt độ thanh trùng 70 – 750C Thời gian: 20 phút, sau đó đưa về 25 – 300C là nhiệt độ tối thích cho quá trình lên men xanthan. 4. Lên men  Mục đích: khai thác, vì quá trình lên men nhằm thu nhận sản phẩm trao đổi chất bậc 1 – là polysaccharide ngoại bào của vi khuẩn Xanthomonas campestris.  Những biến đổi: - Sinh học: có sự trao đổi chất của vi khuẩn với môi trường trong quá trình sinh trưởng phát triển, số lượng tế bào vi khuẩn tăng. - Vật lý: quá trình lên men tỏa nhiệt làm tăng nhiệt độ trong bình lên men, do trong quá trình trao đổi chất của vi khuẩn có thải một phần năng lượng ra bên ngoài dưới dạng nhiệt. - Hóa lý: Độ nhớt tăng lên do polysaccharide tạo ra ngày càng nhiều. - Hóa sinh: vi khuẩn Xanthomonas campestris sử dụng cơ chất để sinh tổng hợp ra xanthan gum, là một loại polysaccharide ngoại bào. Quá trình sinh tổng hợp xanthan gum diễn ra như sau: Tương tự như thực vật bậc cao, vi sinh vật cũng có khả năng tổng hợp ra các oligosaccharide và polysaccharide. Lượng oligosaccharide và polysaccharide nội bào chiếm đến 60% khối lượng khô của tế bào, còn polysaccharide ngoại bào thì vượt nhiều lần khối lượng của tế bào Tất cả các oligosaccharide và polysaccharide đều được tổng hợp bằng cách kéo dài chuỗi saccharide có trước nhờ việc thêm đơn vị monosaccharide. Đơn vị này sẽ tham gia phản ứng ở dạng nucleotide - monosaccharide đã được hoạt hoá, thường là dẫn xuất của uridin - diphosphate nhưng đôi khi cùng với nucleotide purin và pirimidin khác Bước đầu tiên của quá trình sinh tổng hợp xanthan là sự hấp thụ carbonhydrate. Tiếp theo sau đó là quá trình phosphoryl cơ chất bằng enzyme hexokinase để có thể sử dụng adenosine 5’- triphosphat. Sự sinh tổng hợp có liên quan đến sự chuyển đổi của cơ chất được phosphoryl hoá thành các loại nucleotide đường khác nhau mà đòi hỏi cần phải có sự tham gia của enzyme UDP- Glc pyrophosphorylase để kéo dài chuỗi polysaccharide. Trong X. campestris, chu trình Entner– Doudoroff cùng với chu trình tricarboxylic acid là 2 cơ chế chủ yếu cho sự dị hóa đường glucose. Ngoài ra, một lượng nhỏ đường glucose đi theo con đường pentose phosphate. Cuối cùng, hai hệ thống riêng biêt trên lại gặp nhau, chuẩn bị cho sự hấp thu glucose. Sự sinh tổng hợp xanthan, Xanthan Gum 16 giống như hầu hết các loại vi khuẩn sản sinh ra polysaccharide, sử dụng nhiều nguồn carbonhydrate hoạt hóa khác nhau để tổng hợp nên polymer. Hình 8: Con đường Entner–Doudoroff Hình 9: Chu trình tricarboxylic Xanthan Gum 17 Xanthan được tổng hơp bằng cách thêm lần lượt monossacharide vào chuỗi oligosacharide từ đường nucleotide diphosphate cho đến khi tạo thành phân tử chất cho isoprenoid lipid. Mạch chính của xanthan được hình thành từ sự thêm vào của D – glucose – 1 - phosphate và D - glucose từ 2 phân tử UDP – D -glucose. Sau đó, D - mannose và D - glucoronic acid được thêm vào từ GDP - mannose và UDP - glucoronic acid. Lần lượt, nhóm O-Acetyl được vận chuyển từ acetyl - CoA đến phần mannose còn lại. Những mô hình về các phản ứng này được nghiên cứu bởi Ielpi và đồng nghiệp của ông. Hơn nữa, trong mỗi bước của chu trình đã được mô tả đòi hỏi phải có những chất nền đặc biệt cũng như enzyme đặc hiệu cho quá trình đó, nếu như thiếu mất một chất nền hay một enzyme cần thiết, giai đoạn đó sẽ không thực hiện được. Hình 10: Sự sinh tổng hợp xanthan Chú thích: Ac: acetyl Glc:glucose Man: manose P: phosphate PEP: phosphoenolpyruvate Pyr: pyruvate Như đã đề cập trước đây, sự hình thành nên polysacharide ngoại bào là một quá trình trùng hợp. Ngay sau khi pentasaccharide lặp lại những đơn vị, oligomer được hình thành bằng sự vận chuyển đến những chất béo khác ngay lập tức, dần dần, chuỗi carbohydrate tăng dần kích thước. Sự hình thành nên oligomer thông thường yêu cầu phải có sự thêm vào của chuỗi Xanthan Gum 18 oligosaccharide dài hơn cùng với đơn vị lặp lại cuối cùng được gắn trên isoprenoid lipid diphosphate. Mặc dù cấu trúc lặp lại của các đơn vị được xác định bởi sự vận chuyển liên tục của những monosaccharide khác nhau và những nhóm acyl từ những chất cho tương ứng dưới xúc tác của các enzyme đường đặc biệt, enzyme polymerase tham gia phản ứng trùng hợp pentasaccharide thành chất đại phân tử có khối lượng phân tử là M > 106. Giai đoạn cuối cùng của sự tiết ra polysacharide ngoại bào từ màng tế bào chất, băng qua chất bao, những lớp màng ở bên ngoài khác và cuối cùng là thoát ra môi trường bên ngoài, thì ít lí thuyết hơn so với những quá trình sinh tổng hợp trước đó. Cơ chế kết thúc trong tất cả những vi khuẩn sản sinh ra polysacharide bằng việc giải phóng polymer từ isoprenoid lipid trước khi vận chuyển đến trạm cuối cùng. Rõ ràng, quá trình trên đòi hỏi phải có một nguồn năng lượng và ta có thể coi nó tương tự như quá trình giải phóng lipopolysaccharide ra khỏi những lớp màng bên ngoài, ở đây, chất cung cấp năng lượng sẽ là ATP. Có một điểm cần chú ý ở đây là có rất nhiều gene ảnh hưởng đến sự tổng hợp xanthan. Ở vi khuẩn Xanthanmonas campestris thì sự tổng hợp xanthan được điều khiển bởi nhóm 12 gen từ gen B đến gen M. Trong một nghiên cứu về X. campestris, khi sử dụng transposon mutagenesis, Harding đã phát hiện ra rằng có một nhóm gene liên kết với nhau và chúng đóng vai trò là enzyme mã hóa cho quá trình lắp ráp của pentasaccharide. Nhóm gene này được phân lập và phân tích bởi Thorne, Vanderslice và đồng sự, được sắp xếp theo trình tự ADN và bao gồm 12 gene, trong đó có 7 gene cần cho sự vận chuyển monosaccharide và những đơn vị lặp lại nhóm acyl. Những gene cần thiết cho quá trình acyl hóa xanthan còn được kiểm nghiệm kĩ hơn bởi Marzocca và đồng sự. Một chất quan trọng khác trong việc hình thành nên tính di truyền học của Xanthomonas là sự có mặt của gene xanA và xanB. Những gene này được cho là có liên quan đến sự sinh tổng hợp UDP - glucose và GDP - mannose . Gần đây, chúng còn được cho là những gen mã hóa UDP - glucose pyrophosphorylase (cần thiết cho sự sinh tổng hợp xanthan). Trên thực tế, qua sự phân tích về gene và sự sắp xếp ADN, có khoảng trên 20 gene thích hợp.  Thiết bị lên men: Xanthan là sản phẩm thương mại, được thực hiện bằng quá trình lên men tĩnh truyền thống trong những bình lên men có động cơ cánh khuấy (STR – stirred tank rate). Bình lên men có cánh khuấy nhằm mục đích cung cấp oxy cho canh trường, nhiệt độ giống cấy phải được điều khiển. Dung dịch đệm phosphate hoặc dung dịch đệm khác phù hợp được bổ sung vào môi trường dinh dưỡng để duy trì pH ổn định của canh trường trong khoảng 7. Hình 11: Thiết bị lên men có cánh khuấy (STR) Xanthan Gum 19 Bình lên men được trang bị hệ thống điều khiển vô trùng, khuấy, điều kiện hiếu khí, điều chỉnh nhiệt độ, pH, bọt, mức độ hòa tan oxy. Môi trường lên men trước khi cho vào thiết bị phải được thanh trùng. Sau đó giống vi khuẩn được cấy vào khoảng 5% - 10% thể tích môi trường. Môi trường dinh dưỡng yêu cầu phải có muối khoáng (P, K, S, Mg, Ca...), nguyên tố vết, glucose hoặc carbohydrate, nguồn nitơ như NH4Cl hoặc NH4NO3, nếu cần thiết phải bổ sung thêm các yếu tố sinh trưởng, gồm vitamin và các acid amin cần thiết. Nguồn nitơ có thể dùng dịch chiết nấm men, dịch men tiêu hóa...  Thông số của thiết bị lên men tĩnh:  Tốc độ khuấy cho phép: 1000 – 2000 v/ph, tốc độ tối ưu: 500 – 1000 v/ph.  Tốc độ sục khí: 0,2 – 2 vvm, tối ưu: 0,5 – 1 vvm  Nhiệt độ lên men: 20 – 350C, tối ưu: 25 – 300C  Thời gian lên men: 96 h.  pH: 5,5 – 8, tối ưu: 6,4 – 7,4  Oxy hòa tan: bão hòa 10% - 90%, tối ưu: bão hòa 20% - 60%  Một số vấn đề  Độ nhớt: Trong quy trình lên men, khi giảm độ nhớt của canh trường từ 4000 cP xuống còn 2000 cP, giá thành của sản phẩm sẽ giảm đi 10%. Hàm lượng pyruvate trong polysasaccharide dị thể ảnh hưởng đến độ nhớt của nó. Hơn nữa, khi hàm lượng pyruvate nhỏ hơn 2% và nồng độ xanthan lớn hơn 0,25% thì độ nhớt ở mức độ trung bình, còn nồng độ xanthan nhỏ hơn 0,25% thì độ nhớt sẽ giảm. Nồng độ SO4 2- trong canh trường cũng ảnh hưởng đến việc giảm độ nhớt của xanthan. Nồng độ sulfate phù hợp là khoảng 0,2 – 0,5 % về khối lượng, tối ưu là từ 0,35 – 0,38% khối lượng. Cation của muối sulfate phải tan trong nước và không gây độc cho canh trường với nồng độ sử dụng. Thường dùng nhất là Na2SO4 và (NH4)2SO4. Sự biến đổi sinh khối, hệ số nhớt, hệ số chảy, tốc độ sục khí oxy và áp suất oxy theo thời gian được thể hiện qua hình 12. Xanthan Gum 20 Hình 12: sự biến đổi của sinh khối (CDM: cell dried mass); xanthan, glucose, hệ số nhớt k (consistency factor), hệ số dòng chảy n, tốc độ sục khí oxy (OTR – oxygen transfer rate) và áp suất của oxy (pO2) theo thời gian. Bình phản ứng có thể tích 72L, 300L và 1500L với cùng năng lượng đầu vào (3,3 kW/m3) và tốc độ khí 7,2 mm/s Trong quá trình lên men, vi sinh vật phát triển theo hàm mũ là kết quả của sự tiêu thụ nhanh chóng nguồn nitơ. Nếu nguồn nitơ bị hạn chế thì vi sinh vật nằm ở pha ổn định. Xanthan được tổng hợp ở cả 2 pha: pha sinh trưởng và pha ổn định, đạt đến nồng độ cuối cùng khoảng 20 g/l. Quá trình tổng hợp xanthan sẽ dừng lại khi glucose được sử dụng hết. Hệ số độ nhớt k đặc trưng cho tính chất lưu biến của xanthan, tăng từ khoảng 15 mPasn đến 30000 mPasn. pO2 giảm từ đầu quá trình lên men cho tới giá trị nhỏ nhất khi OTR đạt giá trị cực đại ở pha sinh trưởng. Sau đó cả OTR và pO2 tiếp tục giảm cho đến khi kết thúc quá trình lên men, phản ánh ảnh hưởng của sự tăng độ nhớt của canh trường lên men vào tốc độ sục oxy.  Vấn đề sục khí oxy trong quá trình lên men: Oxy và các thành phần dinh dưỡng sử dụng cho các hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn được cung cấp nhờ quá trình sục khí và khuấy đảo. Vì Xanthomonas campestris là vi sinh vật hiếu khí bắt buộc nên việc cung cấp oxy cho canh trường lên men là cực kì quan trọng. Nếu lượng oxy hòa tan trong canh trường bị thiếu hụt thì năng suất riêng tạo ra xanthan cũng sẽ giảm tuyến tính theo tốc độ sục oxy (hình 13). Xanthan Gum 21 Hình 13: sự phụ thuộc của năng suất riêng của xanthan vào tốc độ sục khí oxy. Ghi chú: Kí hiệu hình tròn tương ứng với thiết bị STR ở 15L và 1500L, kí hiệu tam giác tương ứng với thiết bị bubble-column, những kí hiệu đen là không giới hạn oxy. Còn ở hình 14 ta thấy những sản phẩm có phân tử lượng thấp sẽ được tạo ra ở dưới mức oxy giới hạn. Hình 14: Ảnh hưởng của tốc độ sục oxy lên phân tử lượng của sản phẩm xanthan Duy trì hệ số truyền khối akL không đổi là điều kiện đảm bảo cung cấp đủ nhu cầu oxy cho vi khuẩn sinh trưởng. Để đạt nồng độ sản phẩm cao trong quy trình xuôi dòng và có hiệu quả về mặt kinh tế, ở cuối quá trình lên men, lượng oxy được sục vào sẽ được giới hạn, từ đó giảm chi phí năng lượng đầu vào. Bất kì sai sót nào trong giai đoạn thiết kế khi tính toán lượng oxy cần Xanthan Gum 22 sục vào sẽ dẫn đến hậu quả là những sai sót trong tỉ lệ xanthan tối đa thu được. Do đó hệ số truyền khối akL cần được tính toán chính xác. Có nhiều cách để tính toán hệ số truyền khối akL của thiết bị STR với chất lỏng giả dẻo có độ nhớt cao được đề nghị. Thường thì dòng chảy được mô tả theo Ostwald-de Wasle: nk  (1) Trong đó:  là ứng suất trượt, Pa k là chỉ số nhớt, mPa ns  là tốc độ trượt, s-1 Vì  biến đổi theo từng vị trí trong thiết bị STR nên người ta tính tốc độ trượt hiệu dụng eff gây ra bởi cánh khuấy. eff có thể tính theo Metzner & Otto như sau: eff =A.N (2) Trong đó: A là hằng số, đặc trưng cho cánh khuấy N là tốc độ khuấy Có nhiều biểu thức khác nhau để tính eff trong thiết bị STR, sử dụng để tính toán độ nhớt hiệu dụng eff . Xanthan Gum 23 Bảng 4: Các công thức tính độ nhớt hiệu dụng Phương pháp Công thức Wichterle Bán thực nghiệm )1/(122/1 )/()3.51( nL nn kdNnN   (3) Obernosterer and Henzler Bán thực nghiệm (4) Calderbank and Moo-Young Bán thực nghiệm )1/(1 13 4 . n n n NA         (5) Henzler and Kauling Phân tích thứ nguyên 5.0 /          eff eff VP   (6) Trong đó: b: chiều dài cánh khuấy, m d: đường kính cánh khuấy, m D: đường kính thiết bị lên men, m P: tổng năng lượng đầu vào V: thể tích phân tán, m3 Trong bảng 4, công thức (3) cho phép dự đoán tốc độ trượt tại cánh quạt của turbine, công thức (4) sử dụng cho khu vực khuấy, công thức (5) là biến thể của công thức (2), là hàm của chỉ số dòng chảy n và khác nhau ở vùng biên ban đầu. Herbst và cộng sự cho rằng eff được tính theo công thức (5) sẽ nhỏ hơn eff tính theo công thức (6). Rõ ràng là công thức tính toán hệ số truyền khối akL phụ thuộc vào việc lựa chọn công thức tính eff . Hệ số truyền khối akL được tính toán lý thuyết, một số công thức được liệt kê ở bảng 5. )2/(1 3 1 038.0 n L b d d D kV P                 Xanthan Gum 24 Bảng 5: lựa chọn công thức tính akL trong thiết bị lên men có cánh khuấy với canh trường nhớt (lưu chất phi Newton) Loại cánh khuấy Dòng chảy Tốc độ trượt Công thức Rushton turbine d/D = 0,4 k  13,2 n  0,42 CT(5) 32.019,0 2 6,05.05,1 2 2 06,0                                      G Geff LL eff eff L L L u Nd g dnu D Nd D adk       ( (7) Rushton turbine d/D=0,27- 0,47 k  0,005 n=1 10 4 s -1 39,15,08,1 2 4 2 105,2                     w eff LL eff eff L L L D Nd D adk       ( (8) Bán lý thuyết CT(8)      25,05,0 2/)1( 10/495/3 5,0 5/3 )/( / 675,0                 w eff b G n L nn LL L L u u k P D ak      ( (9) 6-Blade paddle d/D=0,5 k  33,2 n  0,68 CT (5) 69,013,0 32 41,0 2 0786,0                    G L eff LL u NddNNd N ak     ( (10) Các công thức trong bảng 5 được phân chia theo các trường hợp phản ánh tác động trực tiếp của tốc độ khuấy (công thức 7, 8, 10) và tính toán năng lượng đầu vào (công thức 9). Khả năng dự đoán của những công thức trên khác nhau đáng kể (hình 15). Xanthan Gum 25 Hình 15: So sánh hệ số truyền khối thực nghiệm và tính toán theo các công thức 10, 11, 12, 13 ở bảng 4 Dựa vào các kết quả ở hình 15, có thể kết luận rằng mối tương quan về thứ nguyên của Kawase và Moo-Young (công thức 9) đưa ra những số liệu thực nghiệm tốt nhất. Herbst và cộng sự khi làm việc với thiết bị có thể tích từ 0,015 đến 1,5 m3 đã chứng tỏ năng lượng đầu vào cần thiết để đạt được hệ số truyền khối như mong muốn được tính theo công thức (9). Hình 16 thể hiện các dữ liệu thực nghiệm từ công thức của Kawase & Moo-Young (công thức 9) Xanthan Gum 26 Hình 16: Biểu đồ mối quan hệ tương đối giữa công thức của Kawase & Moo-Young (12) với số liệu thực nghiệm của Herbst và cộng sự Tốc độ sục khí oxy không đổi được thực nghiệm xác nhận là có hiệu quả trong quá trình sản xuất xanthan sinh học. Để giữ tốc độ sục khí không đổi thì năng lượng đầu vào khoảng 3,3 kW/m 3, vận tốc khí bên ngoài là 7,2 mm/s và thùng phản ứng có thể tích 0,072 – 1,5m3. Với những điều kiện như vậy, quá trình lên men với những thông số đặc trưng có tính lặp lại rất tốt mà không phụ thuộc vào quy mô sản xuất. Có thể thấy rõ điều này ở hình 12, khi mà nồng độ, tính chất lưu biến (k, n), tốc độ sục oxy, nồng độ oxy hòa tan đều được lặp lại tốt. Hơn nữa chất lượng của sản phẩm được đánh giá thông qua khối lượng phân tử, chỉ số phân tán cao phân tử, hàm lượng pyruvate là không đổi, không phụ thuộc vào quy mô của quá trình lên men. Kết quả độ nhớt cao của xanthan tại tốc độ trượt thấp, đặc biệt quan trọng trong và sau quá trình sản xuất nhiều sản phẩm công nghiệp. Do xanthan giả dẻo cao được yêu cầu. Nghĩa là theo tính chất lưu biến để quyết định tốc độ trượt  , hệ số lưu biến k và n mong muốn đạt giá trị cao để có độ nhớt hiệu dụng eff là lớn nhất. Tuy nhiên, thực tế là không có cách nào để biến đổi k và n độc lập với nhau vì cả hai thông số này xuất hiện phụ thuộc lẫn nhau . Hệ số dòng chảy n tỉ lệ nghịch với khối lượng phân tử của xan than (M) và cả hệ số nhớt k. Ở hình 12 ta thấy k tăng theo thể tích của bình lên men, còn n thì giảm. Tuy nhiên mức độ tăng của k mạnh hơn mức độ giảm của n. Do đó hệ số độ nhớt k là hệ số nổi trội, dễ nhận biết để xác định tính chất lưu biến của xanthan. Công thức thực nghiệm của Peter và các cộng sự: M = 4,9.10 6 + 3,8.10 6 .OTR/ * 2O Q + 2,6.10 7  (11) Công thức 11 với ngụ ý điều kiện không giới hạn O2 và tốc độ sinh trưởng nhanh là bắt buộc phải chắc chắn khi xanthan có độ nhớt cao được sử dụng. Ngoài ra, thành phần môi trường cũng có ảnh hưởng gián tiếp đến phân tử lượng trung bình của xanthan. Khi sử dụng môi trường phức tạp, giới hạn O2 được thông báo tại giai đoạn đầu của quá trình lên men, do đó phân tử lượng trung bình của xanthan giảm. Xanthan Gum 27 Khi nguồn nitơ quá nhiều trong môi trường tổng hợp sẽ chống lại sự sinh trưởng của vi khuẩn, dẫn đến kết quả tất yếu là phân tử lượng của xanthan tổng hợp được là thấp. Mức độ cung cấp nitơ cũng ảnh hưởng đến hàm lượng pyruvate trong xanthan. Các nhà khoa học đã chứng minh được tính chất lưu biến của xanthan tăng theo số bậc tăng của pyruvate (hình 17) Hình 17: Đường cong so sánh của 0,5 g/l xanthan trong 0,12M KCl với những bậc khác nhau của pyruvate. Ký hiệu • là xanthan với nồng độ 6% khối lượng của pyruvate và Mw = 7.10 6 g/mol. Ký hiệu о là xanthan với khoảng 1,5% pyruvate và Mw = 6.5.10 6 g/mol  Ảnh hưởng của methionine Khi thêm methionine vào canh trường với nồng độ thấp, khoảng 1,3 mM, sẽ làm giảm 40% chiều dài mạch xanthan. Do cấu trúc tương tự của acid amin này sẽ gây hiệu ứng cản trở trong công thức cấu tạo của mạch polysaccharide. Công thức của xanthan cũng bị ảnh hưởng bởi các tế bào gốc: các tế bào gốc trước canh trường lên men có methionine sẽ tổng hợp xanthan ít hơn các tế bào không có methionine. Cấu trúc tế bào thay đổi theo sự thay đổi của dòng nạp liệu glucose. Tế bào có methionine tiết ra các phần carbohydrate có phân tử lượng nhỏ hơn xanthan. Động học của quá trình phát triển và sản xuất xanthan trong lên men tĩnh được nghiên cứu ở quy trình lên men trong phòng thí nghiệm, không điều khiển pH. Quá trình lên men được thực hiện ở tốc độ khuấy trộn 100 – 600 v/ph. Khi tăng tốc độ khuấy thì tỷ lệ sản phẩm và sinh khối tạo ra cũng tăng. Công thức hóa học của xanthan chịu ảnh hưởng của sự khuấy trộn, vì hàm lượng pyruvate tăng khi tăng tốc độ khuấy. Tuy nhiên sự ảnh hưởng đến phân tử lượng của xanthan là không đáng kể khi tốc độ khuấy thay đổi trong khoảng 100-600 v/ph.  Ảnh hưởng của lactose Mặc dù Xanthomonas campestris có khả năng chuyển hóa glucose và galactose trong sản phẩm thủy phâ n dịch whey (huyết thanh sữa) thành xanthan gum, nhưng để tận dụng nguồn lactose trong dịch whey, thì trước hết phải thủy phân nó bằng enzyme lactase hoặc β - galactosidase. Tuy nhiên, β - galactosidase trong Xanthomonas campestris liên kết yếu với lastose, do đó cần phải tính toán việc tận dụng nguồn lactose chưa thủy phân. Vì vậy cố gắng tạo Xanthan Gum 28 ra chủng vi khuẩn có khả năng tận dụng nguồn lactose hiệu quả hơn, bằng các phương pháp chuyển đổi gene, gây đột biến.  Vấn đề lựa chọn quy trình lên men tĩnh hay lên men liên tục trong công nghiệp Quy trình lên men liên tục được thực hiện ở phòng thí nghiệm. Ưu điểm của lên men liên tục là: - Hiệu suất cao hơn rất nhiều so với lên men tĩnh. - Về lý thuyết là không giới hạn về chiều dài của quy trình, do không có sự thoái hóa giống vi sinh vật nhờ sử dụng môi trường tổng hợp cùng với việc giảm lượng sulfur. - Tránh được những khoảng thời gian chết như giai đoạn chuẩn bị trong lên men tĩnh. - Có thể đạt đến lượng sản phẩm cực đại với chất lượng ổn định, nhờ những điều kiện ổn định của môi trường lên men. Một trong những ứng dụng thú vị nhất của quy trình lên men liên tục này là nó được ứng dụng trong ngành công nghiệp dầu khí, nơi mà các nhà máy sản xuất có thể cung cấp xanthan ở nhiều cấp độ công nghiệp khác nhau, có thể sẵn sàng pha loãng thành dung dịch có nồng độ theo yêu cầu. Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất của lên men liên tục là tích lũy sản phẩm rất ít, chỉ dao động trong khoảng 5 – 7 g/l tại hiệu suất tối đa và chất lượng sản phẩm mong muốn (tốc độ pha loãng ở đây là khoảng 0,075 h-1). Chính sự ràng buộc này và những hạn chế trong vấn đề vô khuẩn, chống nhiễm bẩn là những lý do quan trọng giải thích tại sao trong công nghiệp người ta không dùng phương pháp lên men liên tục. Không may mắn là phương pháp lên men tĩnh có bổ sung cơ chất glucose cũng không cải thiện được đáng kể, thậm chí trong một số trường hợp còn cho kết quả tệ hơn lên men tĩnh. Một đặc điểm chung của lên men tĩnh có bổ sung cơ chất là một lượng lớn cơ chất (glucose) cung cấp cho canh trường (60%) vẫn còn sót lại trong canh trường không được tận thu. Chính những hạn chế này mà phương pháp lên men tĩnh có bổ sung cơ chất không đem lại hiệu quả kinh tế. Gần đây, một phương pháp mới lên men tĩnh có bổ sung cơ chất được đề nghị dựa vào việc theo dõi nguồn nitơ kìm hãm sự phát triển của Xanthomonas campestris. Điểm mới trong quy trình này là sử dụng amoni bổ sung vào để điều khiển sự phát triển của vi sinh vật. Điều này giúp cho sản phẩm chính được tích lũy nhiều hơn ở pha sinh trưởng. Những lợi ích được trông đợi ở phương pháp này là: - Sản lượng xanthan thu được nhiều hơn - Năng suất của thiết bị cao hơn - Nâng cao chất lượng sản phẩm và sự đồng đều - Giảm chi phí đầu tư cũng như giá thành sản phẩm - Tăng năng suất sản xuất của nhà máy so với phương pháp lên men tĩnh (xem bảng 6) Xanthan Gum 29 Bảng 6: so sánh giữa lên men tĩnh và lên men tĩnh có bổ sung cơ chất theo phương pháp mới Thông số Lên men tĩnh Lên men tĩnh có bổ sung cơ chất XO (g /L) 0.2 0.5 Xf (g /L) 4 5.2 Nồng độ sản phẩm (g/L) 25.38 30.8 Thời gian lên men 84 49 Năng suất (g/L.h) 0.3 0.63 Hiệu suất 0.507 0.65 Tổng chi phí đầu tư ($x10 3 ) 5,493 2,930 Chi phí cho một kg sản phẩm ($) 7.28 5.38 Thực tế để đạt hiệu quả mong muốn, thường dùng kết hợp các loại thiết bị khác nhau, gồm cánh khuấy Interming trong thiết bị STR với các thiết bị bổ sung cơ chất hoặc sử dụng thiết bị bubble-column. 5. Thanh trùng  Mục đích: chuẩn bị. Sau giai đoạn lên men, xanthan được thu nhận qua các quá trình xuôi dòng. Canh trường sau lên men phải được thanh trùng nhằm mục đích tiêu diệt hết các tế bào vi khuẩn Xanthomonas (Hình 5), chuẩn bị cho quá trình tách vi sinh vật và kết tủa xanthan.  Biến đổi: - Sinh học: vi khuẩn Xanthomonas còn lại trong canh trường sẽ bị tiêu diệt hết. - Hóa lý: độ nhớt giảm do nhiệt độ tăng.  Thiết bị: Dùng thiết bị thanh trùng hình trụ có cánh khuấy. Hình 18: Thiết bị thanh trùng hình trụ có cánh khuấy Xanthan Gum 30 Thiết bị gồm 2 ống hình trụ đồng trục đường kính khác nhau. Trên trục có các cánh khuấy và thanh chắn thẳng đứng tháo lắp được, trục nối với motor truyền động. Canh trường được bơm vào ống bên trong từ phía đáy và tháo ra ở phía đỉnh. Ngược lại chất tải nhiệt nạp từ trên đỉnh vào khoảng không gian giữa hai ống trụ và ra ở đáy. Cánh khuấy và thanh chắn quay, giúp truyền nhiệt nhanh và tốt hơn.  Thông số công nghệ Nhiệt độ: 700C Thời gian: 30 phút. Xanthomonas rất nhạy cảm với nhiệt độ và không có khả năng sinh bào tử nên chỉ cần thanh trùng là đủ. Tuy nhiên cần chú ý tới điểm nhiệt độ chuyển tiếp Tm có thể phá hủy chuỗi polymer. Ở đây Tm vào khoảng 100 0C, tuy nhiên nó có thể thay đổi theo chiều dài của chuỗi polymer cũng như tỉ lệ hàm lượng của các gốc pyruvate và acetate. 6. Tách vi sinh vật  Mục đích: chuẩn bị Sau khi thanh trùng canh trường lên men phải lọc bỏ hết các tế bào vi khuẩn Xanthomonas, chuẩn bị cho quá trình kết tủa xanthan.  Biến đổi: - Hóa lý: dung dịch trong hơn, vì tách được một phần cặn  Phương pháp: Người ta thường dùng phương pháp ly tâm để tách và để cho quá trình tách dễ dàng hơn thì thường tiến hành pha loãng canh trường lên men để giảm độ nhớt. Ngoài ra cũng có thể tách bằng cách khác, đó là sử dụng hóa chất hoặc các enzyme tiêu hóa. Tuy nhiên cách này thì sản phẩm xanthan thu được có thể bị lẫn các mảnh vụn của vi khuẩn và làm giảm khả năng hòa tan. Sản phẩm thu được bằng cách này chỉ dùng trong ngành dầu khí.  Thiết bị: máy ly tâm  Nguyên lý hoạt động: dựa vào sự chênh lệch khối lượng riêng giữa xác vi sinh vật và dịch lên men.  Cấu tạo - Thiết bị thân hình trụ, đáy hình chóp, có nắp đậy. - Giữa thiết bị có ống phân phối để dẫn dịch lên men vào vào, trên thành ống có lỗ để thoát dịch. - Trên ống có lắp các đĩa hình chóp với góc nghiêng 300.  Hoạt động: - Đưa dịch lên men (dạng huyền phù) vào ống phân phối, do các đĩa quay với tốc độ nhanh, dịch thoát ra các lỗ ở thành ống, chảy theo bề mặt nghiêng của các đĩa chóp, sau đó dâng lên phía trên rồi thoát ra ngoài. - Xác vi sinh vật chảy xuống theo ống xuống đáy chóp. Xanthan Gum 31 Hình 19: Thiết bị ly tâm 7. Kết tủa  Mục đích: chuẩn bị cho quá trình tách nước.  Biến đổi: - Hóa lý: có sự chuyển pha từ pha lỏng vào pha rắn.  Phương pháp Sau khi lọc bỏ hết vi khuẩn của canh trường sau lên men, xanthan được thu nhận bằng cách làm chậm quá trình hòa tan và cho kết tủa bằng cách thêm vào các hợp chất hữu cơ tan trong nước, có thể là acetone, alcohol, dioxane, tetrahydrofuran, muối hoặc acid, tùy trường hợp cụ thể. Thường dùng nhất là thêm ethanol hoặc isopropanol. Alcohol sau đó sẽ được thu hồi bằng hệ thống chưng cất để tái sử dụng. Việc thêm muối cũng làm tăng khả năng kết tủa nhờ các cation của muối liên kết với các gốc tích điện âm có trong canh trường. Kết tủa được tách ra bằng thiết bị lọc khung bản. Thu nhận xanthan gum là một quy trình phức tạp và tốn kém vì độ nhớt cao của nó kể cả ở nồng độ thấp, làm cho quá trình vận chuyển, xử lý gặp nhiều khó khăn. Do đó, các chất hóa học hỗ trợ được thêm vào để tăng hiệu quả. Một số cách giải quyết cho vấn đề làm sao giảm lượng các chất cần thiết thêm vào trong quá trình kết tủa xanthan gum nhằm nâng cao hiệu suất của quá trình sản xuất: - Tăng nồng độ của xanthan gum trong dung dịch, bao gồm các polysaccharide tan. - Thêm vào các cation nhiều hóa trị, chất điều chỉnh pH. Nhược điểm khi tăng nồng độ xanthan gum là làm cho độ nhớt của dung dịch tăng lên rất nhanh (chỉ cần nồng độ <5%), gây khó khăn lớn. Còn việc thêm vào các cation (thêm muối) và chất điều chỉnh pH có thể ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm sau cùng (giảm khả năng hòa tan). Sợi polymer thu nhận được dưới dạng rắn ẩm và phải qua quá trình tinh sạch cuối cùng để có được sản phẩm đạt chất lượng. Xanthan thu được sau quá trình trên được hòa tan và rửa lại bằng nước/dung dịch KCl để loại bỏ hết những thành phần gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm như các mảnh vụn tế bào, microgel, vụn hữu cơ, các chất màu… rồi để lắng và tách nước. Cuối cùng đem đi sấy khô. 8. Tách nước  Mục đích: - Chuẩn bị cho quá trình sấy Xanthan Gum 32 - Hoàn thiện  Biến đổi: nói chung không có biến đổi  Thiết bị: Xanthan gum sau khi tách nước phải đạt được ít nhất là khoảng 80% về khối lượng. Tuy nhiên, để sấy thật khô thì rất khó khăn vì những ảnh hưởng không mong muốn của dung dịch xanthan gum trong dung dịch muối. Do đó, tách nước đến khoảng 50% hoặc ít hơn là phù hợp. Sử dụng thiết bị V-type disk press để tách nước. Cấu tạo của thiết bị: gồm 2 đĩa tròn xoay được, khoảng cách giữa 2 đĩa không đều và giảm dần khi quay, có lưới bọc xung quanh. Khi cho xanthan qua thiết bị này, nước sẽ được tách ra nhờ lực ép, còn xanthan gum được ép thành khối bánh và quay cùng với đĩa cho tới khi thoát ra khỏi thiết bị và được thu hồi lại. Việc tách nước sẽ được thực hiện 2 lần, chẳng hạn với 30kg xanthan sau tách nước lần đầu, cho thêm một lượng tương đương dung dịch isopropanol (15% khối lượng nước)