Đề tài Thiết kế Ti-Plasmid tái tổ hợp pBI121 mang gen mã hóa kháng nguyên glycoprotein của virus dại phục vụ chuyển gen

tÝnh tr¹ng ph¸t sinh khèi u ®­îc gäi lµ Ti-plasmid (Tumor inducing). Cho ®Õn nay tr×nh tù nuclªotit cña Ti-plasmid ®· ®­îc x¸c ®Þnh. Ti plasmid lµ mét ph©n tö ADN vßng t­¬ng ®èi lín gåm 150.000 - 200.000 cÆp nuclªotit. Tuy nhiªn, chØ cã mét ®o¹n gåm 2000 - 3000 cÆp nuclªotit cã kh¶ n¨ng g¾n vµo hÑ gen cña tÕ bµo chñ ®­îc gäi lµ T-ADN. Nh÷ng enzym cã tr¸ch nhiÖm chuyÓn n¹p ®o¹n T-ADN tõ plasmid vµo hÖ gen cña tÕ bµo chñ ®­îc mµ ho¸ bëi c¸c ®o¹n gen vir [17]. Bªn c¹nh nh÷ng gen chøc n¨ng võa kÓ trªn Ti-plasmid cã mang gen tæng hîp indolyl acetic axit, mét lo¹i auxin tù nhiªn, v× thÕ mµ khi nu«i cÊy in vitro nh÷ng tÕ bµo thùc vËt c¶m biÕn cã thÓ sèng trong m«i tr­êng thiÕu auxin vµ cytokinin. Ngoµi ra, Ti-plasmid cßn mang gen tæng hîp nh÷ng axit amin hiÕm, vÝ dô: mét lo¹i u t¹o octopin vµ lo¹i kh¸c t¹o nopalin v× vËy ng­êi ta ph©n biÖt 2 lo¹i plasmid lµ lo¹i nopalin vµ octopin cã trong c¸c chñng a. tumefaciens kh¸c nhau. VÒ tr×nh tù nuclªotit chóng chØ kh¸c nhau ë ®o¹n gen m· ho¸ cho c¸c enzym tham gia vµo qu¸ tr×nh sinh tæng hîp nopalin vµ octopin [1]. HiÖn nay, ng­êi ta ®· thµnh c«ng trong viÖc c¶i biÕn Ti-plasmid b»ng c¸ch c¾t bá hÇu hÕt c¸c ®o¹n gen g©y ph¸t triÓn khèi u chØ ®Ó l¹i ®o¹n gen vir vµ phÇn T-ADN tèi thiÓu mang ®iÓm ghÐp gen. Lo¹i vect¬ nµy ®­îc sö dông rÊt cã hiÖu qu¶ cho viÖc ®­a ADN l¹ vµo tÕ bµo thùc vËt kh«ng nh÷ng ®èi víi lo¹i c©y hai lµ mÇm mµ c¶ ë lóa lµ ®¹i diÖn cña lo¹i c©y mét l¸ mÇm. 1.4. Giíi thiÖu chung vÒ vect¬ sö dông trong chuyÓn gen §Ó cã thÓ chuyÓn gen vµo thùc vËt th«ng qua a. tumefaciens ng­êi ta ph¶i sö dông mét hÖ thèng vect¬ chuyÓn gen. Cã hai lo¹i vect¬ chuyÓn gen ®ã lµ vect¬ liªn hîp vµ vect¬ nhÞ thÓ. 1.4.1. Vect¬ nhÞ thÓ (binary vector) Vect¬ nhÞ thÓ ra ®êi ®· kh¾c phôc ®­îc t×nh tr¹ng khã nh©n b¶n trong a. tumefaciens cña vect¬ liªn hîp. Mét vect¬ nhÞ thÓ bao gåm nh÷ng thµnh phÇn sau: 1) VÞ trÝ ghÐp nèi ®a ®iÓm; 2) §o¹n khëi ®Çu t¸i b¶n ho¹t ®éng c¶ trong E. coli vµ a. tumefaciens, vÝ dô RK2; 3) gen chän läc ho¹t ®éng c¶ ë vi khuÈn vµ thùc vËt nh­ gen kh¸ng kh¸ng sinh, gen b- glucuronidase…; 4) cã kh¶ n¨ng vËn chuyÓn nh­ oriV, oriT, trfA, chØ cÇn khi chuyÓn th«ng qua a. tumefaciens, kh«ng cÇn khi chuyÓn gen trùc tiÕp; 5) §o¹n T-ADN ngo¹i biªn (border), ®Æc biÖt lµ ®o¹n ngo¹i biªn b¾t buéc ph¶i cã. Ngoµi ra cßn cã mét sè thµnh phÇn phô trî kh¸c nh­ gen kÝch thÝch vËn chuyÓn T-ADN (T-DNA transfer stimulator sequence = TSS). HÖ vect¬ nhÞ thÓ ®­îc thiÕt kÕ bao gåm hai plasmid tù t¸i b¶n. Lo¹i vect¬ vËn t¶i mang GOI gi÷a ®o¹n biªn cña T-ADN vµ mét plasmid bæ trî cã gen vir ®¶m nhËn chøc n¨ng vËn chuyÓn gen ngo¹i lai vµo tÕ bµo thùc vËt. Plasmid bæ trî ®­îc c¶i biÕn tõ Ti-plasmid tù nhiªn b»ng c¸ch lo¹i bá gen kÝch thÝch tÕ bµo thùc vËt ph¸t triÓn thµnh khèi u, nh­ng vÉn duy tr× kh¶ n¨ng th©m nhËp vµo tÕ bµo thùc vËt [1]. HÖ thèng vect¬ nhÞ thÓ lu«n ®­îc c¶i tiÕn ®Ó cã thÓ n©ng cao hiÖu suÊt chuyÓn gen th«ng qua A. tumefaciens. Mét trong nh÷ng h­íng c¶i biÕn lµ ®­a vµo vect¬ mét chuçi COS ®Ó ph©n lËp c¸c ®o¹n g¾n lín hoÆc th­ viªn gen thùc vËt, trong ®ã ®iÓn h×nh lµ vect¬ pBI121. 1.4.2. Vect¬ pBI121 C¸c vect¬ chØ thùc hiÖn ®­îc chøc n¨ng cña m×nh khi chóng cã mét sè ®Æc tÝnh nh­: cã kh¶ n¨ng tù sao chÐp ®éc lËp vµ tÝch cùc trong tÕ bµo vËt chñ; cã kÝch th­íc nhá, dÔ nhËn gen quan t©m, dÔ x©m nhËp vµ ®­îc sao chÐp; mang mét sè dÊu hiÖu chän läc gióp ph©n biÖt c¸c tÕ bµo mang plasmid t¸i tæ hîp víi c¸c tÕ bµo kh«ng cã plasmid t¸i tæ hîp; tån t¹i bÒn v÷ng trong tÕ bµo vËt chñ. C¸c ®Æc tÝnh nµy lµ c¬ së quyÕt ®Þnh c¸c thµnh phÇn chÝnh cña plasmid víi: Gen quan t©m ®­îc g¾n thªm ®o¹n khëi ®éng vµ ®o¹n kÕt thóc; gen chØ thÞ chän läc; c¸c thµnh phÇn kh¸c nh­ vïng khëi ®Çu sao chÐp vµ vïng tr×nh tù nh©n dßng ®a ®iÓm c¾t (MCS) [5]. Vect¬ pBI121 cã kÝch th­íc kho¶ng 13Kb víi c¸c thµnh phÇn chÝnh nh­ sau: * §o¹n khëi ®éng gen (promoter) C¸c gen ngo¹i lai cã thÓ ®­îc biÓu hiÖn thµnh protein cÇn ph¶i cã mÆt c¸c tÝn hiÖu ®iÒu khiÓn thÝch hîp ë nh÷ng vÞ trÝ thÝch hîp. Nh÷ng tÝn hiÖu kh«ng thÓ thiÕu trong qu¸ tr×nh ®iÒu khiÓn biÓu hiÖn gen bao gåm ®o¹n khëi ®éng gen vµ ®o¹n kÕt thóc gen. §o¹n khëi ®éng bao gåm tr×nh tù nuclªotit phÝa ®Çu 5’ cña c¸c gen cÊu tróc. Nã ®ãng vai trß ®iÒu khiÓn qu¸ tr×nh phiªn m· nhê kh¶ n¨ng ®¶m b¶o c¸c vÞ trÝ nhËn biÕt cho enzym ARN polymeraza, cho c¸c yÕu tè ho¹t ho¸ vµ khëi ®éng. Cho ®Õn nay mét sè promoter ®­îc sö dông trong chuyÓn gen nh­: Chuçi khëi ®éng x©y dùng, chuçi khëi ®éng c¶m øng, chuçi khëi ®éng trong c¸c m« ®Æc thï. Promoter 35S lµ mét d¹ng chuçi khëi ®éng x©y dùng ®­îc t¸ch tõ virus kh¶m sóp l¬ (Cauliflower Mosaic virus 35S promoter CaMV35S-P), lo¹i promoter nos [7]. Trong c¸c nghiªn cøu chuyÓn gen thùc vËt, CaMV35S-P ®­îc sö dông réng r·i nhê kh¶ n¨ng ho¹t ®éng m¹nh ë nhiÒu lo¹i m« cña c©y hai l¸ mÇm, tuy nhiªn nã l¹i Ýt ho¹t ®éng ë c©y mét lµ mÇm. §Ó kh¾c phôc nh­îc ®iÓm nµy, CaMV35S-P ®­îc sö dông kÕt hîp víi c¸c thµnh phÇn khëi ®éng kh¸c, ch¼ng h¹n vect¬ pEmu chøa nhiÒu b¶n sao cña c¸c tiÓu phÇn ph¶n øng kÞ khÝ cña gen Adh1 tõ ng« vµ c¸c tiÓu phÇn cña gen tæng hîp octopin tõ A. tumefaciens ®· lµm gia t¨ng sù biÓu hiÖn cña gen trong c©y mét lµ mÇm lªn hµng chôc lÇn [12]. Promoter 35S dµi 350bp, gåm 3 thµnh phÇn: - Hép TATA ( ë vÞ trÝ tõ- 46 ®Õn + 8). - Vïng t¨ng c­êng A (enhancer) tõ vÞ trÝ - 90 ®Õn - 46, lµm t¨ng biÓu hiÖn gen ngo¹i lai ë rÔ. -Vïng t¨ng c­êng B (enhancer) tõ vÞ trÝ -343 ®Õn -90, lµm t¨ng biÓu hiÖn gen chuyÓn ë l¸. Trong vïng B gåm 5 phÇn nhá tõ B1 - B5 ph©n chia theo møc ®é ph¶n øng cña mçi vïng ®èi víi c¸c yÕu tè dÞch m· kh¸c nhau [17]. NÕu x¶y ra sù thay ®æi trong vïng t¨ng c­êng tõ vÞ trÝ -207 ®Õn -56 cã thÓ dÉn ®Õn mÊt kh¶ n¨ng g©y nhiÔm cña virus. Lîi dông tÝnh chÊt nµy, cã thÓ g¾n gen ngo¹i l¹i vµo vïng enhancer sÏ lµm mÊt kh¶ n¨ng g©y nhiÔm cña virus kh¶m sóp l¬ [17]. *§o¹n kÕt thóc. C¸c ®o¹n kÕt thóc th­êng chøa ®u«i polyA nh­ AATTAA, hoÆc AACCAA gióp b¶o vÖ c¸c ph©n tö ARN th«ng tin ®­îc bÒn v÷ng h¬n vµ tr¸nh ®­îc sù ph©n huû. Hai ®o¹n kÕt thóc ®­îc sö dông nhiÒu trong c«ng nghÖ gen thùc vËt lµ ®o¹n kÕt thóc cña CaMV35S (cã mÆt trong 7 s¶n phÈm chuyÓn gen hiÖn nay) vµ ®o¹n kÕt thóc NOS cã mÆt trong Ýt nhÊt 16 - 28 s¶n phÈm) [7]. *Gen chØ thÞ C¸c chØ thÞ chän läc di truyÒn sö dông trong biÕn n¹p thùc vËt th­êng cã nguån gèc tõ vi khuÈn hoÆc thùc vËt, gåm 2 lo¹i chÝnh: - ChØ thÞ chän läc (selectable marker): kÕt cÊu gen mang ®o¹n khëi ®éng NOS (nopaline synthase promoter-terminater) ®iÒu khiÓn sù biÓu hiÖn gen kh¸ng npt2 (neomycin phospho transferase gene), chØ cã nh÷ng thÓ biÕn n¹p sèng ®­îc trªn m«i tr­êng cã kh¸ng sinh kanamycin. ViÖc sö dông gen chØ thÞ cÇn ®¹t mét sè yªu cÇu sau: chÊt chän läc øc chÕ sinh tr­ëng c¸c tÕ bµo kh«ng ®­îc biÕn n¹p, sù thÓ hiÖn cña gen chän läc kh«ng lµm ¶nh h­ëng tíi trao ®æi chÊt cña c¸c tÕ bµo chuyÓn n¹p, sù biÓu hiÖn cña gen chän läc b¶o vÖ tÕ bµo khái t¸c dông cña chÊt chän läc, kh«ng ¶nh h­ëng tíi c©y chuyÓn gen [4]. - ChØ thÞ sµng läc (screenable marker) kh«ng chØ gióp nhËn biÕt c¸c thÓ biÕn n¹p mµ cßn dù ®o¸n ®­îc møc ®é biÓu hiÖn gen quan t©m trong m« thùc vËt ®­îc chuyÓn gen. Ch¼ng h¹n, chØ thÞ b-glucuronidaza (GUS) cho phÐp sµng läc ho¹t tÝnh cña enzym dÔ dµng trªn c¬ së kÜ thuËt nhuém ho¸ tÕ bµo. Gen chØ thÞ sµng läc cÇn cã mét sè ®Æc ®iÓm sau: s¶n phÈm cña nã lµ ®éc nhÊt vµ kh«ng ®éc ®èi víi tÕ bµo thùc vËt, c¸c enzym chØ thÞ ph¶i cã kh¶ n¨ng dÞch m· æn ®Þnh cao, ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch thuËn tiÖn, rÎ tiÒn, ®é nh¹y cao vµ cã kh¶ n¨ng ph¶n øng víi c¸c polypeptit ngoµi mµ kh«ng ¶nh h­ëng ho¹t tÝnh enzym [7] . * Vïng khëi ®éng sao chÐp vµ MCS - Vïng pUC ori: vïng khëi ®éng sao chÐp trong E. coli, cã nguån gèc tõ vect¬ pUC9. - RK 2 ori V: vïng khëi ®éng sao chÐp trong A. tumefaciens, cã nguån gèc tõ plasmid RK2. - Vïng MCS cã chøa tr×nh tù ®iÓm c¾t cña rÊt nhiÒu lo¹i enzym nh­ HindIII, SphI, PstI, EcoRV…Trong ®ã chóng ta quan t©m ®Õn hai lo¹i enzym lµ BamHI vµ SacI, tr×nh tù ®iÓm c¾t cña chóng ë hai ®Çu cña gen GUS. V× vËy khi c¾t pBI121 b»ng hai lo¹i enzym trªn sau ®ã ®iÖn di chóng ta sÏ thu ®­îc hai b¨ng t­¬ng øng víi kÝch th­íc kho¶ng 11,2Kb (vect¬) vµ 1,8Kb (gen gus). NÕu g¾n vµo ®o¹n gen ngo¹i lai mµ ta mong muèn th× gen GUS kh«ng ®­îc biÓu hiÖn. §iÒu nµy rÊt cã ý nghÜa trong viÖc chän läc thÓ biÕn n¹p [5]. Trong t­¬ng lai, viÖc tèi ­u ho¸ hÖ thèng chñ/vect¬ vµ c¶i tiÕn c¸c vect¬ trªn c¬ së nghiªn cøu tØ mØ c¸c yÕu tè tham gia vµo qu¸ tr×nh chuyÓn n¹p æn ®Þnh, c¸c yÕu tè ®­a gen chuyÓn n¹p vµo vÞ trÝ nhÊt ®Þnh trong genome thùc vËt vµ c¸c ®iÒu kiÖn nu«i cÊy t¸i sinh c©y chuyÓn gen vÉn lµ nh÷ng vÊn ®Ò cÇn thiÕt trong nghiªn cøu chuyÓn gen ë thùc vËt. H×nh 4. S¬ ®å cÊu tróc vect¬ pBI121 1.4.3. T×nh h×nh nghiªn cøu vaccine thùc vËt trªn thÕ giíi Cho dï hiÖn nay phÇn lín thuèc ch÷a bÖnh ®­îc tæng hîp b»ng ph­¬ng ph¸p ho¸ häc, tuy nhiªn 1/3 tæng sè thuèc trªn thÞ tr­êng ®Òu cã nguån gèc tõ thùc vËt. Cïng víi sù ph¸t triÓn cña c«ng nghÖ gen, thùc vËt l¹i ®­îc biÕt ®Õn víi mét vai trß lµ mét nguån nguyªn liÖu míi trong viÖc s¶n xuÊt thuèc phßng bÖnh. Thùc vËt chuyÓn gen s¶n xuÊt kh¸ng nguyªn phßng bÖnh dÞch t¶, bÖnh viªm gan B vµ bÖnh d¹i ®ang ®­îc ph¸t triÓn ë rÊt nhiÒu phßng thÝ nghiÖm trªn toµn thÕ giíi (Boyce Thompson Plant Research institute, Thomas Jeferson institute, North Carolina State University…) [27]. Vaccine ¨n ®­îc (edible vaccine) s¶n xuÊt ë trong thùc vËt ( Dr. Charles Arntzen, Boyce Thompson institute for Plant Research, USA) ®· xo¸ bá nh÷ng rµo c¶n trong viÖc s¶n xuÊt vaccine b»ng ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy tÕ bµo. §Æc biÖt ®èi víi c¸c n­íc ®ang ph¸t triÓn, nh÷ng rµo c¶n nµy trë nªn khã kh¨n h¬n rÊt nhiÒu, chóng bao gåm: nh÷ng yÕu tè cÇn thiÕt cho c«ng nghÖ lªn men, quy tr×nh tinh s¹ch nghiªm ngÆt, ®ßi hái b¶o qu¶n ë nhiÖt ®é thÊp trong suèt qu¶ tr×nh vËn chuyÓn, gi¸ thµnh cao… ViÖc s¶n xuÊt vaccine b»ng thùc vËt c¶i biÕn di truyÒn cã thÓ cung cÊp s¶n phÈm víi gi¸ rÎ hiÖn ®ang ®­îc thùc hiÖn víi c¸c bÖnh d¹i, bÖnh dÞch t¶, bÖnh viªm gan B, bÖnh sèt rÐt, bÖnh AIDS… vµ chØ ®¬n thuÇn, khi ¨n c¸c lo¹i thùc vËt nµy, c¬ thÓ cña chóng ta sÏ sinh kh¸ng thÓ chèng l¹i bÖnh tËt [27]. Dr. arntzen cïng c¸c céng sù ®· thµnh c«ng trong viÖc t¹o ra c©y thuèc l¸ s¶n xuÊt vaccine phßng bÖnh viªm gan B vµ chøng minh ®­îc r»ng vaccine ®­îc s¶n xuÊt trong thùc vËt cã cÊu tróc vµ chøc n¨ng t­¬ng tù nh­ nh÷ng vaccine ®­îc s¶n xuÊt tõ huyÕt thanh ng­êi hoÆc tõ tÕ bµo nÊm men. Chóng còng g©y ®¸p øng miÔn dÞch rÊt m¹nh khi ®­îc tiªm vµo chuét. Khandelwal vµ céng sù còng c«ng bè ®· thµnh c«ng trong viÖc chuyÓn gen m· ho¸ cho protein ng­ng kÕt tè hång cÇu cña virus dÞch h¹ch ë bß vµo c©y l¹c, c©y thuèc l¸ [23, 24]. Mét lo¹i vaccine kh¸c còng ®­îc t¹o thµnh theo c¸ch nµy, ®ã lµ vaccine phßng bÖnh tiªu ch¶y. Dr. arntzen cïng c¸c céng sù còng ®· t¹o ra ®­îc c©y thuèc l¸ vµ c©y khoai t©y chuyÓn gen cã chøa mét l­îng lín c¸c chÊt kh¸ng nguyªn ho¹t ®éng lµ c¸c ®éc tè trong ruét kh«ng bÒn víi nhiÖt cña E. coli (E. coli heat labile enterotoxin = LT-B). §éc tè nµy cã cÊu tróc t­¬ng tù nh­ ®éc tè cña virus t¶. Nh÷ng con chuét ®­îc ¨n c¸c lo¹i thùc vËt nµy ®· béc lé ph¶n øng miÔn dÞch rÊt m¹nh. C¸c cuéc thö nghiÖm biÓu hiÖn l©m sµng trªn nh÷ng ng­êi t×nh nguyÖn b»ng viÖc sö dông khoai t©y t­¬i chøa vaccine phßng bÖnh tiªu ch¶y sÏ sím kiÓm chøng hiÖu qu¶ cña vaccine cã nguån gèc tõ thùc vËt [27]. Nh÷ng nhµ nghiªn cøu ë tr­êng ®¹i häc Thomas Jefferson bang Philadelphia, USA ®· t¹o ra c©y cµ chua cã biÓu hiÖn kh¸ng nguyªn cña virus d¹i. Dr. Karaser vµ c¸c céng sù t¹i phßng thÝ nghiÖm Biotechnology Foundation cña Thomas Jefferson University còng ®· biÓu hiÖn ®­îc vaccine d¹i trong c©y rau bina (spinach). Dr. Karaser th«ng b¸o r»ng, ®Ò tµi nghiªn cøu nµy ®· ®­îc kiÓm chøng b»ng mét cuéc thö nghiÖm gåm 16 ng­êi chia thµnh hai nhãm: mét nhãm ®èi chøng vµ mét nhãm thÝ nghiÖm. Nhãm thÝ nghiÖm ®­îc ¨n kho¶ng 150g l¸ rau bina. KÕt qu¶ khi kiÓm tra th× nh÷ng ng­êi nµy cã sè l­îng kh¸ng thÓ t¨ng h¬n so víi nhãm cßn l¹i. Vaccine d¹i tõ thùc vËt sÏ ®­îc ph¸t triÓn mét c¸ch ®Çy ®ñ trong vßng tõ 2 - 4 n¨m tiÕp theo [13]. XuÊt ph¸t tõ nhu cÇu vÒ vaccine ë n­íc ta hiÖn nay, ®ång thêi ®Ó nhanh chãng n¾m b¾t vµ tiÕp cËn víi c«ng nghÖ míi trong viÖc s¶n xuÊt vaccine vµ c¸c d­îc chÊt ch÷a bÖnh cho ng­êi, ®éng vËt trªn ®èi t­îng c©y trång. Phßng c«ng nghÖ tÕ bµo thùc vËt thuéc ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc ®ang thùc hiÖn mét sè ®Ò ¸n chuyÓn gen m· ho¸ cho kh¸ng nguyªn cña mét sè virus nh­ virus d¹i vµ virus viªm n·o NhËt B¶n vµo c©y trång. Ch­¬ng 2. VËt liÖu v µ ph­¬ng ph¸p 2.1.VËt liÖu nghiªn cøu 2.1.1. C¸c chñng vi sinh vËt vµ cÆp måi sö dông trong nghiªn cøu - Vi khuÈn A. tumefaciens chñng Cv58C1, pGV2206 vµ pGV3101 vµ vi khuÈn E.coli chñng DH5a cña h·ng Gibco BRL, life Technologies, Mü. - Chñng E. Coli Top 10 mang vect¬ pBI121. - CÆp måi ®Æc hiÖu RabG-start-BamHI, RabG-stop-SacI h·ng invitrogen tæng hîp. - Plasmid (vect¬ pCRâ2.1+ gen GlyP) mang toµn bé gen m· hãa cho ph©n tö glycoprotein cña virus d¹i chñng Vnucovo-32. C¸c vËt liÖu trªn ®­îc ViÖn C«ng nghÖ sinh häc cung cÊp. 2.1.2. Ho¸ chÊt, thiÕt bÞ * Hãa chÊt Ho¸ chÊt dïng trong nghiªn cøu lµ cña h·ng: Invitrogen, Amersham Parmacia Biotech, New England Biolabs… Bao gåm mét sè ho¸ chÊt sau: - Bé hãa chÊt sö dông cho ph¶n øng PCR cña h·ng Applied Biosystem (Mü) - Bé kÝt th«i gel cña h·ng QIAGEN ( QIAquick Gel Extraction Kit) - Bé kit tinh s¹ch ADN cña h·ng QIAGEN (QIAquick DNA Purification Kit) - Thang ADN 1Kb cña h·ng MBI Fermantas, hai enzym BamHIvµ SacI, dung dÞch ®Öm, BSA - Dung dÞch ®Öm 10X, rATP, T4 ligase - Pepton 10g/l, trypton 10g/l, Yeast extract - NaCl, MgSO4.7H2O, 1mM HEPES - Agarose, sucrose, 50mM glucose - Glycerol , 0,1 M CaCl2, 5M acetat potassium, acetic acid, NaOH, SDS 1% - C¸c lo¹i kh¸ng sinh kanamycin, ampecilin vµ rifamycin - Cån 70%, dung dÞch chloroform : isopropanol (24 : 1), n­íc khö ion, RNase - 25mM Tris HCl pH 8, 10mM EDTA pH 8 (Ethylene Diamine tetraacetic) * ThiÕt bÞ - M¸y PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mü), m¸y ®iÖn di Powerpac300 (Bio-Rad, Mü), m¸y soi ADN (Mini-transllumminatior, Bio-Rad, Mü), m¸y chôp ¶nh (Amersham Pharmacia Biotech, Thuþ §iÓn), m¸y Vortex (Mimishaker, IKA, §øc), m¸y hót ch©n kh«ng Speed-Vac 110A (Savant, Mü), m¸y ly t©m, m¸y xung ®iÖn Gene Plulser, cïng víi c¸c trang thiÕt bÞ kh¸c cña Phßng C«ng nghÖ tÕ bµo thùc vËt, ViÖn C«ng nghÖ sinh häc. S¶n phÈm PCR-GlyP gus NOST GlyP Sac BamH I I Bam HI & Sac I BamHI SacI T4 - ligase 35S gus NOST 35S GlyP NOST BamHI SacI 35S pBI121 ... … pBI121 pBI121 ... … pBI121 pBI121 ... … pBI121 2.2. Ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu H×nh 5. S¬ ®å thiÕt kÕ Ti-plasmid t¸i tæ hîp pBI121 mang gen GlyP 2.2.1. PCR nh©n gen ®Æc hiÖu PCR viÕt t¾t tõ ch÷ Polymerase Chain Reaction lµ ph­¬ng ph¸p nh©n nhanh mét ®o¹n ADN mong muèn trong èng nghiÖm. Theo lý thuyÕt sÏ cã 3 ®o¹n ADN ®ã lµ: ®o¹n ADN khu«n cÇn nh©n b¶n, måi xu«i vµ måi ng­îc. Thªm vµo ®ã lµ c¸c thµnh phÇn: Taq polymerase, dNTPs (ATP, TTP, CTP vµ GTP) vµ mét dung dÞch muèi MgCl2. Mét ph¶n øng PCR ®­îc thùc hiÖn nh­ sau: Bæ sung lÇn l­ît nh÷ng chÊt sau ®©y vµo èng PCR 0,5 ml B¶ng 1. Thµnh phÇn cña ph¶n øng PCR Thµnh phÇn ThÓ tÝch N­íc cÊt 14,7ml Dung dÞch ®Öm PCR 10X 2,5ml MgCl225mM 2,5ml dNTPs 2,0ml Måi RabG-start-BamHI 1,0ml Måi RabG-stop-SacI 1,0ml ADN khu«n 1,0ml Taq polymerase 0,2ml Tæng thÓ tÝch 25ml Thùc hiÖn ph¶n øng PCR theo chu kú nhiÖt nh­ sau: - B­íc 1 biÕn tÝnh: 940C, 2 phót - B­íc 2 biÕn tÝnh: 930C, 30 gi©y - B­íc 3 g¾n måi: 600C, 30 gi©y - B­íc 4 kÐo dµi chuçi: 720C, 1phót 30 gi©y - B­íc 5 hoµn thiÖn viÖc kÐo dµi: 720C, 10 phót - B­íc 6: 40C, l­u gi÷ Tõ b­íc 2 ®Õn b­íc 4 lÆp l¹i 32 chu kú. 2.2.2. Ph­¬ng ph¸p ®iÖn di §iÖn di trªn gel agarose 0,8% dïng ®Ó ph©n t¸ch axÝt nucleic cã kÝch th­íc lín (tõ 0,2 - 70Kb). Khi n»m trong ®iÖn tr­êng ADN sÏ ®i tõ cùc ©m sang cùc d­¬ng, träng l­îng ph©n tö ADN nµo nhÑ nhÊt sÏ ®i xuèng tr­íc, nÆng di chuyÓn chËm sÏ ®i xuèng sau t¹o thµnh mét d·y ADN cã kÝch th­íc kh¸c nhau. Trong nghiªn cøu nµy chóng t«i sö dông gel agarose 0,8% ®Ó t¸ch nh÷ng axÝt nucleic cã khèi l­îng tõ 0,4 - 20Kb. 1. ChuÈn bÞ gel agarose 0,8% C©n 0,8g agarose cho vµo 100ml dung dÞch ®Öm TAE 1X (Tris-base, glacial acetic acid, EDTA), ®un cho agarose tan hoµn toµn, ®Ó nguéi xuèng kho¶ng 50 - 60oC, ®æ dung dÞch agarose vµo khay ®iÖn di cã cµi s½n r¨ng l­îc. Sau 30 - 60 phót, khi gel ®· ®«ng cøng, ®Æt vµo bÓ ®iÖn di, ®æ ®Öm TAE 1X ngËp c¸ch mÆt gel 1 - 2mm, gì l­îc ra. 2. ChuÈn bÞ mÉu MÉu ADN ®­îc trén víi 3ml ®Öm tra mÉu (loading buffer - 0,1ml bromophenol blue 10%; 0,3ml glycerol 100% vµ dÉn b»ng n­íc ®Õn 1ml) vµ ®­îc tra vµo c¸c giÕng nhá trªn gel, giÕng ®Çu tiªn th­êng dïng ®Ó tra thang ADN chuÈn, ch¹y ®iÖn di víi hiÖu ®iÖn thÕ 100V trong thêi gian 30 phót. 3. Nhuém mÉu vµ soi gel §Ó quan s¸t ®­îc ADN d­íi ¸nh s¸ng tö ngo¹i ng­êi ta ph¶i tiÕn hµnh nhuém mÉu trong dung dÞch ethidium bromide nång ®é 0,5mg/ml trong 30 - 40 phót, l¾c nhÑ, sau ®ã röa b»ng n­íc cÊt vµ ®em soi d­íi tia tö ngo¹i 234nm trªn m¸y soi ADN vµ chôp ¶nh. 2.2.3. Th«i gel vµ tinh s¹ch s¶n phÈm PCR 2.2.3.1. Ph­¬ng ph¸p th«i gel Sau khi nh©n b¶n b»ng kü thuËt PCR hoÆc c¾t enzym giíi h¹n muèn cã ®­îc ®­îc ®o¹n gen cã kÝch th­íc mong muèn, tinh s¹ch th× ph¶i tiÕn hµnh th«i gel theo quy tr×nh sau: - §iÖn di s¶n phÈm PCR hoÆc s¶n phÈm c¾t enzym, mçi mét mÉu th× ®iÖn di thµnh hai giÕng, mét giÕng ®èi chøng ®iÖn di víi 5ml mÉu, sau khi ®iÖn di xong chØ c¾t, nhuém vµ soi gel ë giÕng ®èi chøng, sau ®ã ®¸nh dÊu vµo kÝch th­íc cÇn t×m, ghÐp hai mÉu gel l¹i vµ c¾t lÊy ®o¹n gel mang gen cÇn quan t©m ë giÕng cßn l¹i. - C©n gel theo quy ­íc 1mg gel t­¬ng ®­¬ng 1ml - Bæ sung dung dÞch QG theo tØ lÖ: V mÉu : VQG = 1 : 3 (ml) - ñ ë 50oC trong 15 phót, 3 phót trén nhÑ mét lÇn, sau khi gel tan hÕt ñ thªm 5 phót cho gel tan hoµn toµn - ChuyÓn hçn hîp dung dÞch lªn cét th«i gel, ly t©m cùc ®¹i trong 1 phót - Lo¹i bá dÞch ch¶y qua cét - Bæ sung 500ml QG, ly t©m 1 phót - Thªm 750ml ®Öm PE vµo cét, ®Ó ë nhiÖt ®é phßng trong 5 phót - Ly t©m cùc ®¹i 13000 vßng/phót, ®æ dÞch ch¶y qua cét, ly t©m bæ sung 1 phót ®Ó lo¹i bá hÕt ®Öm PE - ChuyÓn sang èng eppendorf 1,5ml míi - Hoµ tan ADN trong 30 - 50ml n­íc cÊt khö trïng hoÆc dung dÞch EB, ®· ®­îc lµm Êm ®Õn 500C, ®Ó ë nhiÖt ®é phßng trong vßng 1 phót, sau ®ã ly t©m cùc ®¹i 13000 vßng/phót trong 1 phót. 2.2.3.2. Tinh s¹ch s¶n phÈm PCR Tinh s¹ch s¶n phÈm PCR nh»m lo¹i bá c¸c thµnh phÇn trong ph¶n øng cßn d­ thõa (Taq polymerase, c¸c ion…). *C¸c b­íc tiÕn hµnh - Bæ sung dung dÞch PB theo tû lÖ: VmÉu : VPB= 1 : 5, trén nhÑ - Cho hçn hîp dung dÞch vµo cét tinh s¹ch, ly t©m 13000 vßng/phót, trong 1 phót - Bæ sung 0,75ml dung dÞch NW vµo cét tinh s¹ch, ly t©m 13000 vßng/phót, trong 1 phót. - Lo¹i bá dÞch næi ch¶y qua cét, ly t©m bæ sung 1 phót, ®Ó lo¹i s¹ch NW. - Cho cét tinh s¹ch vµo èng eppendorf 1,5ml. - Bæ sung thÓ tÝch EB t­¬ng ®­¬ng thÓ tÝch mÉu, ®Ó ë nhiÖt ®é phßng 1 - 2 phót. Ly t©m 13000 vßng/phót, trong 1 phót. 2.2.4. C¾t b»ng enzym giíi h¹n V× trong måi RabG-start-BamHI cã chøa tr×nh tù ®iÓm c¾t cña enzym BamHI vµ RabG-stop-SacI cã chøa tr×nh tù ®iÓm c¾t cña SacI. V× vËy, chóng t«i dïng hai enzym nµy ®Ó c¾t s¶n phÈm PCR vµ vect¬ pBI121. B¶ng 2. Thµnh phÇn ph¶n øng c¾t b»ng enzym Thµnh phÇn ThÓ tÝch S¶n phÈm PCR hoÆc vect¬ pBI121 25ml Dung dÞch ®Öm 3ml Enzym BamHI 1ml Enzym SacI 1ml BSA 1ml Tæng thÓ tÝch V= 30ml Bæ sung lÇn l­ît theo thµnh phÇn trªn vµo èng eppendorf 1,5ml, ñ ë 37oC 5 giê. 2.2.5. Ph¶n øng ghÐp nèi S¶n phÈm PCR vµ vect¬ pBI121 sau khi ®­îc xö lý b»ng enzym giíi h¹n sÏ t¹o ra nh÷ng ®Çu dÝnh ë hai ®Çu ph©n tö ADN. Khi ta trén lÉn chóng víi nhau d­íi sù xóc t¸c cña enzym T4 ligase, c¸c ®Çu dÝnh nµy sÏ ghÐp cÆp bæ sung víi nhau. V× vËy, s¶n phÈm PCR ®· qua xö lý enzym sÏ ®­îc g¾n vµo vect¬ pBI121. B¶ng 3. Thµnh phÇn ph¶n øng ghÐp nèi Thµnh phÇn ThÓ tÝch ADN tõ s¶n phÈm PCR ®· xö lý enzym 2,0ml Dung dÞch ®Öm 10X 1,5ml pBI121 ®· xö lý enzym 10ml rATP 0,5ml T4 ligase 1,0ml Tæng thÓ tÝch V = 15ml Hçn hîp ph¶n øng ®­îc ñ ë 4oC qua ®ªm. 2.2.6. Ph­¬ng ph¸p t¹o tÕ bµo E. coli kh¶ biÕn B¶ng 4. Thµnh phÇn m«i tr­êng LB Thµnh phÇn Hµm l­îng (g/l) bacto peptone 10g/l yeast extract 5g/l NaCl 10g/l C¸ch pha: C©n lÇn l­ît c¸c thµnh phÇn trªn, sau ®ã bæ sung n­íc cÊt ®Õn thÓ tÝch ®Þnh møc, dïng m¸y khuÊy tõ khuÊy ®Òu, chØnh pH 7,0. NÕu lµ LB ®Æc th× bæ sung 16g/l bacto agar. Sau ®ã ®em ®i khö trïng ë 117oC trong 25 phót. * Ph­¬ng ph¸p tiÕn hµnh 1. §æ ®Üa th¹ch, mçi mét ®Üa kho¶ng 25ml LB ®Æc 2. Chñng vi khuÈn E. coli DH5a ®­îc cÊy tr¶i trªn m«i tr­êng LB ®Æc vµ nu«i qua ®ªm ë 370C. 3. CÊy mét khuÈn l¹c vµo trong 2ml m«i tr­êng LB láng, l¾c qua ®ªm ë 370C, 200 vßng/phót 4. ChuyÓn 0,5ml dÞch nu«i trªn sang 50ml m«i tr­êng LB láng, l¾c trong 3 giê, ®o OD600nm ®¹t 0,6 - 0,8 th× chuyÓn dÞch nu«i cÊy sang èng ly t©m 50ml ®Ó ë trong ®¸. 5. Ly t©m thu khuÈn ë tèc ®é 4000 vßng/phót, 00C, trong 10 phót, thu cÆn tÕ bµo 6. Hoµ tan tÕ bµo nhÑ nhµng trong 20 - 30ml 0,1M CaCl2, gi÷ trong ®¸ 45 phót, ly t©m 4000 vßng/phót, 00C, trong 10 phót, thu cÆn vµ hoµ tan trong 1,5ml 0,1M CaCl2 vµ 0,5ml glycerol. 7. Chia 50ml dÞch khuÈn vµo mçi èng eppendorf 1,5ml, lµm ®«ng l¹nh nhanh b»ng nit¬ láng vµ gi÷ chñng ë -85oC. 8. CÊy tr¶i trªn m«i tr­êng cã vµ kh«ng cã kh¸ng sinh ®Ó kiÓm tra. 2.2.7. BiÕn n¹p vect¬ pBI121 ®· g¾n gen GlyP vµo tÕ bµo kh¶ biÕn E. coli DH5a theo ph­¬ng ph¸p sèc nhiÖt * Ph­¬ng ph¸p tiÕn hµnh - Bæ sung 5ml vect¬ (s¶n phÈm ghÐp nèi) vµo 50ml tÕ bµo kh¶ biÕn vµ trén nhÑ. Hçn hîp ®­îc ®Æt trong ®¸ 30 phót. Sau ®ã ñ ë 420C chÝnh x¸c 1,5 phót vµ ®Æt ngay vµo ®¸ 5 phót. Bæ sung 450ml m«i tr­êng LB láng, hçn hîp ®­îc ñ ë 37oC, l¾c 200 vßng/ phót trong 1 giê - Sö dông que cÊy tr¶i, tr¶i tö 50 - 100ml dÞch vi khuÈn lªn ®Üa m«i tr­êng LB ®Æc cã chøa 50mg/l kanamycin - ñ ®Üa ë 370C trong 16 giê. 2.2.8. T¸ch plasmid b»ng ph­¬ng ph¸p Sambrook B¶ng 5. Thµnh phÇn Sol STT Thµnh phÇn Sol I 50mM glucose, 25mM tris HCl pH 8, 10mM EDTA pH8 Sol II 0,2 NaOH, SDS 1% Sol III 60ml acetat potassium 5M, 11,5ml acid acetic, 28,5ml H2O Chó ý: Sol I ph¶i khö trïng ë 1170C vµ gi÷ ë – 40C SDS ( Sodium dodecyl sulfate) pha míi tr­íc khi dïng * C¸c b­íc tiÕn hµnh - LÊy 2ml dung dÞch vi khuÈn nu«i trong LB láng 12 giê. - Ly t©m 13000 vßng/phót thu tÕ bµo - Bæ sung 150ml Sol I hoµ tan tÕ bµo hoµn toµn - Bæ sung 150ml Sol II trén nhÑ trong 30 gi©y - Bæ sung tiÕp 150ml Sol III trén nhÑ trong 30 gi©y - Bæ sung 450ml chloroform : isopropanol (24 : 1) trén ®Òu trong 3 phót - Ly t©m 13.000 vßng/ phót, hót nhÑ nhµng kh«ng cÆn 400ml pha trªn sang èng eppendorf míi - Cho 800ml cån tuyÖt ®èi ®Ó ë nhiÖt ®é phßng 5 - 10 phót, ly t©m 10.000 vßng/ phót, lo¹i bá pha trªn. - Cho 500ml cån 80% vµo, ly t©m 2 phót, sau ®ã lo¹i bá cån vµ lµm ®«ng kh« trong 5 phót. - Hoµ tan s¶n phÈm trong 50ml n­íc khö ion - Bæ sung RNase - ñ ë 370C trong 10 phót - KiÓm tra ®é tinh s¹ch b»ng c¸ch lÊy 5ml ®iÖn di trªn gel agarose 0,8% 2.2.9. Ph­¬ng ph¸p t¹o tÕ bµo kh¶ biÕn A. tumefaciens B¶ng 6. Thµnh phÇn cña m«i tr­êng YEP Thµnh phÇn Hµm l­îng( g/l) peptone 10g/l sucrose 1g/l yeast extract 5g/l MgSO4.7 H2O 0,5g/l C¸ch pha: C©n lÇn l­ît c¸c thµnh phÇn trªn, sau ®ã bæ sung n­íc cÊt ®Õn thÓ tÝch ®Þnh møc, dïng m¸y khuÊy tõ khuÊy ®Òu cho tan hÕt, sau ®ã chØnh ®Õn pH 7,0. NÕu lµ m«i tr­êng ®Æc th× cã bæ sung thªm 16g/l bacto agar. Khö trïng m«i tr­êng ë 1170C trong 25 phót. * C¸c b­íc tiÕn hµnh - Lµm míi gièng trªn m«i tr­êng YEP ®Æc 3 chñng A. tumefaciens Cv58C1, pGV 2206 vµ pGV3101. - Nu«i cÊy l¾c vi khuÈn trong 2ml m«i tr­êng YEP láng ë 28oC trong 6 giê. - LÊy 100ml dung dÞch vi khuÈn nu«i cÊy tiÕp ë 280C qua ®ªm trong 100ml YEP láng ®Õn khi OD660nm= 1 - 1,5. - Lµm l¹nh mÉu trong ®¸ 15 phót, ly t©m 5.000 vßng/phót trong 20 phót ®Ó thu cÆn tÕ bµo. - Röa cÆn hai lÇn trong 10ml 1mM HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid) pH 7,0. - CÆn tÕ bµo hoµ tan trong 500-700ml 10% glycerol. - Chia 45ml dÞch tÕ bµo vµo mçi èng eppendorf, lµm l¹nh trong nit¬ láng vµ gi÷ chñng ë -85%. 2.2.10. BiÕn n¹p Ti-plasmid vµo A. tumefaciens b»ng ph­¬ng ph¸p xung ®iÖn (Electroporation method) BiÕn n¹p vµo 3 chñng tÕ bµo kh¶ biÕn A. tumefaciens lµ Cv58C1, pGV2206 vµ pGV3101. B¶ng 7. Thµnh phÇn cña m«i tr­êng SOC Thµnh phÇn Hµm l­îng (1lÝt) yeast extract 5g/l trypton 20g/l NaCl 10mM KCl 2,5mM MgSO4 10mM MgCl2 10mM glucose 20mM C¸ch lµm: C©n lÇn l­ît c¸c thµnh phÇn trªn, thªm n­íc cÊt ®Õn thÓ tÝch ®Þnh møc, dïng m¸y khuÊy tõ khuÊy tan hÕt c¸c chÊt vµ khö trïng ë 1170C. * C¸c b­íc tiÕn hµnh - Lµm tan tÕ bµo kh¶ biÕn A. tumefaciens trong ®¸ 30 phót. - Thªm 5ml ADN plasmid t¸i tæ hîp vµo mçi èng eppendorf chøa tÕ bµo kh¶ biÕn, trén ®Òu vµ ®Æt trong ®¸ 15 phót. - Dïng pipet chuyÓn dung dÞch sang cuvet dïng trong xung ®iÖn ®· ®­îc lµm l¹nh tõ tr­íc. - B¾n xung ®iÖn ë 25mF, 400W, 2,5kV. - Bæ sung ngay 1ml m«i tr­êng SOC vµo cuvet vµ chuyÓn sang èng eppendorf l¾c ë 28oC tõ 1 - 1,5 giê. - CÊy tr¶i 50ml trªn m«i tr­êng chän läc YEP ®Æc cã bæ sung thªm rifamycin 100mg/l, ampicilin 50mg/l, kanamycin 50mg/l. - Chän mét sè khuÈn l¹c mäc trªn m«i tr­êng nµy ®Ó tiÕn hµnh kiÓm tra khuÈn l¹c d­¬ng tÝnh cã chøa gen GlyP b»ng c¸c c¸ch: + Colony-PCR: Ph­¬ng ph¸p nµy còng t­¬ng tù nh­ ph¶n øng PCR nh­ng thay c¸c mÉu ADN hoÆc plasmid b»ng c¸c tÕ bµo vi khuÈn ®­îc lÊy trùc tiÕp tõ khuÈn l¹c. + T¸ch plasmid vµ PCR kiÓm tra víi hai cÆp måi pUC18-F1/R1 vµ RabG-start-BamHI/RabG-stop-SacI + C¾t b»ng enzym h¹n chÕ BamHI vµ SacI Ch­¬ng 3. KÕt qu¶ vµ th¶o luËn 3.1. ChuÈn bÞ vect¬ pBI121 vµ gen glyP 3.1.1. T¸ch vect¬ pBI121 tõ chñng E. Coli Top 10 HÖ thèng chuyÓn gen vµo thùc vËt th«ng qua Agrobacterium tumefaciens ®ßi hái ph¶i cã mét vect¬ chuyÓn gen thÝch hîp. Vect¬ chuyÓn gen ®­îc sö dông trong thÝ nghiÖm nµy lµ mét lo¹i vect¬ nhÞ thÓ cã nguån gèc tõ Ti-plasmid cña vi khuÈn Agrobacterium §Ó g¾n ®­îc g¾n gen quan t©m vµo hÖ gen cña thùc vËt th× gen ®ã ph¶i n»m trong vïng T-AND ®­îc h¹n chÕ bëi c¸c ®o¹n tr×nh tù lÆp l¹i ®­îc gäi lµ ®o¹n ®Çu biªn ( left border and right border) trªn plssmid. H¬n n÷a, muèn biÓu hiÖn ®­îc trong tÕ bµo thùc vËt th× ®o¹n gen ph¶i n»m trong kÕt cÊu hoµn chØnh víi ®o¹n khëi ®éng vµ ®o¹n kÕt thóc. Vect¬ pBI121 ®­îc thiÕt kÕ víi promoter 35S ho¹t ®éng rÊt m¹nh ë c©y hai l¸ nÇm vµ ®o¹n kÕt thóc NOS. Gen GUS n»m trªn vect¬ pBI121 ®­îc kÕt nèi víi vïng khëi ®éng b»ng enzym h¹n chÕ BamHI vµ víi vïng kÕt thóc b»ng enzym SacI, tr×nh tù nhËn biÕt cña hai enzym nµy còng cã ë hai ®Çu ®o¹n gen GlyP ®­îc nh©n b¶n b»ng PCR, nh­ vËy vÒ mÆt lý thuyÕt gen GUS cã thÓ bÞ lo¹i bá vµ ®­îc thay thÕ b»ng gen GlyP. §ång thêi vect¬ nµy ®­îc thiÕt kÕ dùa trªn vect¬ pBIN19 cã kÝch th­íc t­¬ng ®èi nhá kho¶ng 13kb phï hîp víi yªu cÇu cña mét vect¬ chuyÓn gen. Víi tÊt c¶ nh÷ng ­u ®iÓm trªn vect¬ pBI121 ®· vµ ®ang ®­îc sö dông lµm nguyªn liÖu cho rÊt nhiÒu nghiªn cøu chuyÓn gen. §Ó thu ®­îc vect¬ pBI121 tinh s¹ch, chóng t«i tiÕn hµnh t¸ch plasmid tõ chñng E. coli Top 10 theo ph­¬ng ph¸p cña Sambrook theo môc 2.2.8. KÕt qu¶ ®iÖn di cho thÊy plasmid t¸ch ®­îc cã hµm l­îng cao vµ t­¬ng ®èi s¹ch protein. B­íc tiÕp theo c¾t vect¬ b»ng enzym h¹n chÕ, th«i gel vµ tinh s¹ch ®Ó thu ®­îc vect¬ më vßng cã 2 ®Çu dÝnh ®óng nh­ mong muèn nh»m phôc vô cho c¸c thÝ nghiÖm tiÕp theo. 3.1.2. KhuyÕch ®¹i gen GlyP b»ng kü thuËt PCR Kü thuËt PCR (polymerase chain Reaction) ®­îc sö dông rÊt hiÖu qu¶ trong viÖc x¸c ®Þnh sù cã mÆt vµ nh©n b¶n gen GlyP víi ADN khu«n lµ ADN plasmid (vector pCR®2.1 + GlyP) mang toµn bé gen GlyP ®· dïng ®Ó x¸c ®Þnh tr×nh tù (Chu Hoµng Hµ vµ cs). Ngoµi nh÷ng yÕu tè cÇn thiÕt kh¸c nh­ Taq polymerase, MgCl2 , buffer… th× cÆp måi ®Æc hiÖu lµ thµnh phÇn kh«ng thÓ thiÕu ®Ó ph¶n øng PCR thùc hiÖn ®­îc. Dùa vµo tr×nh tù ®· ®­îc c«ng bè trªn ng©n hµng gen thÕ giíi vµ tr×nh tù gen GlyP chñng Vnucovo-32 do viªn C«ng nghÖ Sinh häc x¸c ®Þnh ®­îc, chóng t«i thiÕt kÕ cÆp måi ®Æc hiÖu RabG-start-BamHI, RabG-stop-SacI sö dông cho viÖc nh©n b¶n mét ®o¹n gen GlyP cã kÝch th­íc 1,5Kb b»ng kü thuËt PCR. B¶ng 8 . C¸c th«ng sè cÇn thiÕt cña cÆp måi nµy nh­ sau: Tªn måi Tr×nh tù måi Tm %GC RabG-start-BamHI 5’-GAGGATCCCTTATGGTTCCTCAGGCTCTCCT-3’ BamHI 96 54,84 RabG-stop-SacI 5’-GCGAGCTCTCACAGTCTGGTCTCAC-3’ SacI 80 60,00 PUC18-F1 5’-CAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3’ 62 55,00 PUC18-R1 5’-GCGGATAACAATTTCACACA-3’ 56 40,00 §Æc biÖt, ®Ó phôc vô cho viÖc thiÕt kÕ vect¬ chuyÓn gen sau nµy, chóng t«i ®· thiÕt kÕ thªm trªn cÆp måi tr×nh tù ®iÓm c¾t cña hai enzym h¹n chÕ lµ BamHI vµ SacI. Tr×nh tù nhËn biÕt cña hai enzym nµy bao gåm 6 nuclªotit, trong ®ã tr×nh tù cña BamHI lµ 5’-G GATCC-3’ vµ cña SacI lµ 5’-GAGCT C-3’. Ph¶n øng PCR ®­îc tiÕn hµnh t­¬ng tù nh­ môc 2.1. MÆc dï nhiÖt ®é b¾t mèi theo tÝnh to¸n lý thuyÕt cña måi RabG-start-BamHI lµ 960C vµ cña RabG-stop-SacI lµ 800C, nh­ng khi trong qu¸ tr×nh thÝ nghiÖm, chóng t«i thÊy hiÖu qu¶ cao nhÊt thu ®­îc khi thùc hiÖn ph¶n ph¶n øng víi nhiÖt ®é g¾n måi lµ 600C, trong kho¶ng 32 chu k×. S¶n phÈm PCR ®o¹n gen GlyP ®­îc gi÷ ë 40C vµ lÊy 5ml s¶n phÈm ®Ó diÖn di kiÓm tra trªn gel agarose 0,8%. Sau khi tiÕn hµnh nhuém vµ soi gel chóng t«i thu ®­îc mét b¨ng rÊt ®Æc hiÖu cã kÝch th­íc 1,5Kb (h×nh 6), ®iÒu nµy phï hîp víi yªu cÇu vÒ kÝch th­íc cña ®o¹n gen mµ chóng t«i cÇn nh©n b¶n, ®o¹n gen kh«ng bÞ lÉn víi ADN t¹p nhiÔm kh¸c. VËy cã thÓ kÕt luËn ®­îc r»ng chóng t«i ®· khuÕch ®¹i thµnh c«ng ®o¹n gen GlyP cña virus d¹i. 1,5Kb H×nh 6. ¶nh ®iÖn di s¶n phÈm PCR nh©n ®o¹n gen GlyP Ghi chó: M. Thang ADN chuÈn 1Kb; 1 vµ 2 lµ s¶n phÈm PCR 1 2 M Trong s¶n phÈm PCR gen GlyP thu ®­îc sÏ cã chøa nh÷ng ®o¹n gen ®· ®­îc nh©n b¶n, ®o¹n måi, sîi khu«n vµ nh÷ng ®o¹n gen ch­a hoµn thiÖn. V× vËy, c«ng viÖc tiÕp theo chóng t«i lµ tiÕn hµnh th«i gel vµ tinh s¹ch s¶n phÈm PCR ®Ó thu ®­îc ®o¹n gen GlyP cã ®é tinh s¹ch cÇn thiÕt cho ph¶n øng c¾t enzym h¹n chÕ. Quy tr×nh nµy ®­îc thùc hiÖn t­¬ng tù nh­ môc 2.2.3. S¶n phÈm ADN thu ®­îc ®­îc b¶o qu¶n ë -20oC ®Ó sö dông cho b­íc thÝ nghiÖm tiÕp theo. 3.2. ThiÕt kÕ ti-plasmid t¸i tæ hîp pBI121 Mang gen GlyP d­íi sù ®iÒu khiÓn cña ®o¹n khëi ®éng 35S vµ ®o¹n kÕt thóc NOS 3.2.1. C¾t enzym h¹n chÕ t¹o ®Çu dÝnh vµ ghÐp nèi t¹o vect¬ t¸i tæ hîp Trªn vïng MCS (multi cloning site) cña vect¬ pBI121 cã chøa hai vÞ trÝ c¾t cña enzym h¹n chÕ BamHI vµ SacI. Do ®ã vect¬ pBI121®­îc xö lý b»ng hai enzym h¹n chÕ trªn ®Ó t¹o hai ®Çu dÝnh kh¸c nhau, tr¸nh viÖc ®ãng vßng trë l¹i. ViÖc xö lý c¾t b»ng hai enzym kh¸c nhau còng gi÷ vai trß gióp gen GlyP g¾n vµo vect¬ ®óng chiÒu (môc 2.2.4). Theo dù ®o¸n vÒ mÆt lý thuyÕt, s¶n phÈm c¾t cña pBI121 sÏ cã hai b¨ng t­¬ng øng víi kÝch th­íc cña vect¬ kho¶ng 11,2Kb vµ kÝch th­íc cña gen gus 1,8Kb. Dùa vµo ¶nh ®iÖn di kiÓm tra (H×nh 7) cho thÊy, kÕt qu¶ viÖc më vßng vect¬ b»ng enzym h¹n chÕ hoµn toµn phï hîp víi ph©n tÝch lý thuyÕt. Sau khi ®iÖn di chóng t«i tiÕn hµnh th«i gel vµ tinh s¹ch ®Ó thu ®­îc ®o¹n vect¬ cã kÝch th­íc lµ 11,2Kb. 1 M 11,2Kb 1,8Kb H×nh 7. ¶nh ®iÖn di s¶n phÈm c¾t vect¬ pBI121 b»ng enzym BamHI vµ SacI Ghi chó. 1: Vect¬ pBI121 sau khi c¾t b»ng enzym h¹n chÕ; 2: Thang ADN chuÈn 1Kb M 1 1,5Kb Nh»m t¹o ®­îc nh÷ng ®Çu dÝnh ë hai ®Çu ®o¹n gen GlyP cã kh¶ n¨ng liªn kÕt bæ sung víi hai ®Çu dÝnh trªn vect¬ ®· c¾t, chóng t«i tiÕp tôc xö lý c¾t s¶n phÈm PCR ®o¹n gen GlyP b»ng hai enzym BamHI vµ SacI. Ngoµi nh÷ng thµnh phÇn cÇn thiÕt cho ph¶n øng c¾t b»ng enzym h¹n chÕ, chóng t«i cã bæ sung thªm 1ml BSA ®Ó n©ng cao hiÖu suÊt cña ph¶n øng. S¶n phÈm c¾t cã ®Çu dÝnh ë hai ®Çu ®o¹n gen vµ mét sè nucleotid riªng lÎ nªn tr­íc khi thùc hiÖn ph¶n øng ghÐp nèi (ligation), chóng t«i tiÕn hµnh tinh s¹ch theo bé kÝt tinh s¹ch cña h·ng QIAGEN (môc 2.2.3.2), h×nh 8 d­íi ®©y lµ ¶nh ®iÖn di kÕt qu¶ sau khi tinh s¹ch. Sau ®ã thùc hiÖn ph¶n øng ghÐp nèi b»ng enzym T4 ligase (môc 2.2.5). H×nh 8: ¶nh ®iÖn di s¶n phÈm c¾t ADN b»ng enzym giíi h¹n sau tinh s¹ch Ghi chó: M. Thanh ADN chuÈn 1kb ; 1. s¶n phÈm PCR sau khi ®· c¾t b»ng enzym giíi h¹n Enzym ghÐp nèi (ligase) lµ enzym xóc t¸c cho viÖc liªn kÕt nèi hai ®o¹n ADN cã vai trß hÕt søc quan träng trong c«ng nghÖ ADN t¸i tæ hîp. Trong nghiªn cøu nµy chóng t«i sö dông enzym T4-ligase cã nguån gèc tõ phage T4 x©m nhiÔm E. coli . Ngoµi kh¶ n¨ng liªn kÕt c¸c ®o¹n ADN cã ®Çu dÝnh gièng nh­ Ligase ®­îc t¸ch tõ E.coli, enzym nµy cßn cã kh¶ n¨ng liªn kÕt c¸c ®o¹n ADN ®Çu b»ng. Do gi÷a ADN vect¬ vµ ®o¹n ADN gen GlyP cã c¸c ®Çu dÝnh phï hîp, bæ sung víi nhau nªn trong m«i tr­êng cã T4-ligase th× ADN vect¬ vµ ADN ®o¹n gen GlyP (®o¹n xen) sÏ kÕt nèi víi nhau t¹o thµnh mét vect¬ t¸i tæ hîp. §Ó gia t¨ng hiÖu qu¶ xóc t¸c, rATP ®­îc bæ sung thªm víi môc ®Ých trî gióp ho¹t ®éng cho enzym T4-ligase. Ph¶n øng nµy, ®­îc thùc hiÖn ë 4oC trong kho¶ng thêi gian tõ 12 - 16h. T4- Ligase GAGCT G Gen GlyP GATCC C NOS TCGAG C CCTAG 35S G pBI121 pBI121 GAGCT G Gen GlyP GATCC C NOS TCGAG C CCTAG 35S G pBI121 pBI121 H×nh 9. S¬ ®å ghÐp nèi vect¬ pBI121 vµ gen GlyP 3.2.2. BiÕn n¹p vect¬ t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo E. coli DH5α S¶n phÈm PCR nh©n ®o¹n gen GlyP sau khi ®· xö lý b»ng BamHI vµ SacI, tinh s¹ch, ®­îc g¾n trùc tiÕp vµo vect¬ chuyÓn gen pBI121 ®· ®­îc më vßng s½n vµ sÏ ®­îc biÕn n¹p vµo tÕ bµo E. coli DH5a ®Ó chän läc, nh©n nhanh plasmid víi sè l­îng lín. * ChuÈn bÞ tÕ bµo kh¶ biÕn E. coli DH5a E. coli lµ mét vi khuÈn Gram ©m khi nu«i trong m«i tr­êng cã chøa CaCl2, mµng tÕ bµo sÏ bÞ lµm cho máng ®i vµ cã nh÷ng lç nhá t¹o ®iÒu kiÖn thuËn lîi cho c¸c ph©n tö ADN ®i vµo. Cã nhiÒu ph­¬ng ph¸p t¹o tÕ bµo kh¶ biÕn nh­ ph­¬ng ph¸p ho¸ häc, ph­¬ng ph¸p vËt lý, ph­¬ng ph¸p sö dông sãng siªu ©m… nh­ng th«ng th­êng ng­êi ta hay sö dông ph­¬ng ph¸p ho¸ häc h¬n v× ph­¬ng ph¸p nµy rÊt ®¬n gi¶n vµ tiÕt kiÖm chi phÝ. TÕ bµo E. coli kh¶ biÕn ®­îc t¹o ra theo quy tr×nh ë môc 2.2.6. * BiÕn n¹p vect¬ Ti-plasmid t¸i tæ hîp mang cÊu tróc 35S/GlyP/NOS vµo tÕ bµo kh¶ biÕn E. coli DH5a. Vect¬ t¸i tæ hîp ®­îc ®­a vµo tÕ bµo E. coli kh¶ biÕn b»ng ph­¬ng ph¸p sèc nhiÖt ( môc2.2.7). Khi biÕn n¹p cã c¸c tr­êng hîp sau x¶y ra: - C¸c tÕ bµo kh«ng chøa vect¬ t¸i tæ hîp, chóng sÏ kh«ng mäc ®­îc trªn m«i tr­êng cã chøa kh¸ng sinh kanamycin v× kh«ng cã gen npt2 m· ho¸ cho enzym ph©n gi¶i kh¸ng sinh. - C¸c tÕ bµo mang plasmid b×nh th­êng kh«ng cã gen GlyP g¾n vµo, chóng vÉn mäc trªn m«i tr­êng chän läc. - c¸c tÕ bµo cã chøa vect¬ mang gen GlyP nh­ng gen nµy kh«ng cßn nguyªn vÑn do bÞ ®øt g·y trong qu¸ tr×nh thÝ nghiÖm, nh÷ng tÕ bµo nµy vÉn mäc ®­îc trªn m«i tr­êng chän läc. - C¸c tÕ bµo mang vect¬ cã chøa gen ®Ých nguyªn vÑn vµ cã thÓ ®­îc biÓu hiÖn trong m«i tr­êng tÕ bµo. TÊt nhiªn, nh÷ng tÕ bµo nµy còng mäc ®­îc trªn m«i tr­êng chän läc kh¸ng sinh. KÕt qu¶ thu ®­îc trªn ®Üa th¹ch cã rÊt nhiÒu khuÈn l¹c mäc. §iÒu nµy cho thÊy hiÖu qu¶ biÕn n¹p b»ng ph­¬ng ph¸p sèc nhiÖt cao. Chóng t«i cã thÓ kÕt luËn s¬ bé r»ng ®· biÕn n¹p ®­îc vect¬ Ti-plasmid t¸i tæ hîp mang gen GlyP vµo chñng tÕ bµo E.coli DH5a. VÊn ®Ò ®Æt ra lµ liÖu trong nh÷ng khuÈn l¹c thu ®­îc, khuÈn l¹c nµo mang vect¬ cã chøa ®o¹n gen GlyP cßn nguyªn vÑn, chóng t«i tiÕn hµnh kiÓm tra sù cã mÆt cña ®o¹n gen GlyP trong c¸c dßng khuÈn l¹c b»ng ph­¬ng ph¸p colony-PCR (PCR trùc tiÕp tõ khuÈn l¹c). 3.2.3. KiÓm tra sù cã mÆt cña ®o¹n gen GlyP trong c¸c dßng khuÈn l¹c b»ng kü thuËt colony-PCR Ti-plasmid t¸i tæ hîp khi ®­îc biÕn n¹p vµo tÕ bµo E. coli nhê bé m¸y sao chÐp cña tÕ bµo sÏ ®­îc nh©n lªn, kÕt qu¶ t¹o ra rÊt nhiÒu b¶o sao. §ång thêi gen npt2 m· ho¸ cho enzym ph©n huû kh¸ng sinh kanamycin ho¹t ®éng nªn tÕ bµo cã thÓ sèng ®­îc trªn m«i tr­êng chän läc LB + 50mg/l kanamycin. Khi cã khuÈn l¹c mäc trªn m«i tr­êng chän läc cã thÓ nãi b­íc ®Çu cña qu¸ tr×nh biÕn n¹p ®· thµnh c«ng. §Ó ch¾c ch¾n r»ng gen GlyP cã mÆt trong c¸c dßng khuÈn l¹c thu ®­îc chóng t«i tiÕn hµnh ph¶n øng colony-PCR. Ph­¬ng ph¸p nµy gióp chóng ta ph¸t hiÖn nhanh nh÷ng dßng khuÈn l¹c nµo mang gen ®Ých, gi¶m chi phÝ trong nghiªn cøu vµ ®ì mÊt thêi gian, c¸c b­íc ph¶n øng còng t­¬ng tù nh­ ph¶n øng PCR th«ng th­êng nh­ng ADN ®­îc thay b»ng c¸c tÕ bµo vi khuÈn. TiÕn hµnh ph¶n øng víi 12 dßng khuÈn l¹c kh¸c nhau sö dông cÆp måi trªn vect¬ (pUC18F1,R1). Së dÜ trong thÝ nghiÖm nµy chóng t«i kh«ng dïng cÆp måi RabG-start-BamHI, RabG-stop-SacI lµ do khi thùc hiÖn ph¶n øng nèi kÕt gen GlyP ®­îc sö dông víi mét l­îng lín. Ngoµi nh÷ng gen ®· ®­îc g¾n vµo vect¬ cßn cã rÊt nhiÒu gen cßn d­ thõa, chóng sÏ tån t¹i bªn trong hoÆc xung quanh nh÷ng khuÈn l¹c mäc trªn ®Üa th¹ch khi biÕn n¹p. V× vËy nÕu thùc hiÖn ph¶n øng colony- PCR víi cÆp måi RabG-start-BamHI, RabG-stop-SacI, chóng ta vÉn thu ®­îc b¨ng ®Æc hiÖu 1,5Kb nh­ng trªn thùc tÕ gen GlyP vÉn ch­a ®­îc g¾n vµo vect¬. §ã chÝnh lµ lý do mµ chóng t«i sö dông cÆp måi trªn vect¬ (pUC18F1,R1) cho ph¶n øng nµy. Dù ®o¸n khi ®iÖn di sÏ thu ®­îc b¨ng ADN cã kÝch th­íc kho¶ng 2,75Kb. KÕt qu¶ chóng t«i thu ®­îc nh­ sau: M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2,75Kb H×nh 10. ¶nh ®iÖn di s¶n phÈm colony-PCR trùc tiÕp tõ c¸c khuÈn l¹c Ghi chó: M: Thang ADN chuÈn 1Kb; 1-12 s¶n phÈm colony-PCR tõ khuÈn l¹c t­¬ng øng víi c¸c dßng khuÈn l¹c 1-12. Tõ ¶nh chôp ®iÖn di, cho thÊy cã 10 dßng khuÈn l¹c d­¬ng tÝnh xuÊt hiÖn b¨ng ADN cã kÝch th­íc kho¶ng 2,75Kb ®óng víi kÝch th­íc cña ®o¹n gen GlyP 1,5Kb céng víi mét ®o¹n 1,25Kb cña vect¬. Tõ kÕt qu¶ thu ®­îc, chóng t«i tiÕn hµnh nu«i khuÈn trªn m«i tr­êng LB láng vµ t¸ch plasmid (môc 2.2.8 ) 3 dßng khuÈn l¹c d­¬ng tÝnh vµ 1 dßng ©m tÝnh lµm ®èi chøng theo ph­¬ng ph¸p Sambrook, ®©y lµ ph­¬ng ph¸p t­¬ng ®èi ®¬n gi¶n nh­ng thu ®­îc plasmid cã ®é tinh s¹ch cao. Sau khi t¸ch, kÕt qu¶ ®iÖn di trªn h×nh 11 xuÊt hiÖn hai b¨ng, mét b¨ng lµ d¹ng siªu xo¾n vµ mét b¨ng lµ d¹ng duçi th¼ng. Ta thÊy dßng sè 1 cã b¨ng thÊp h¬n c¸c b¨ng cña 3 dßng cßn l¹i, lµ do plasmid kh«ng cã ®o¹n gen GlyP ®­îc g¾n vµo. B¨ng ®iÖn di plasmid cho thÊy cã ®ñ hµm l­îng vµ chÊt l­îng cho c¸c thÝ nghiÖm tiÕp theo. 1 2 3 4 H×nh 11. ¶nh ®iÖn di plasmid t¸i tæ hîp t¸ch tõ tÕ bµo E.coli DH5µ Ghi chó: 1. S¶n phÈm t¸ch plasmid t¸i tæ hîp dßng khuÈn l¹c ©m tÝnh 2,3,4. Plasmid cña c¸c dßng khuÈn l¹c d­¬ng tÝnh. 3.3.3. KiÓm tra sù cã mÆt cña gen GlyP trong Ti-plasmid t¸i tæ hîp b»ng enzym h¹n chÕ 1 M 11,2 Kb 1,5 Kb LÊy plasmid võa t¸ch ®­îc c¾t b»ng 2 enzym h¹n chÕ (BamHI + SacI), kÕt qu¶ thu ®­îc nh­ trªn h×nh 12. H×nh 12. ¶nh ®iÖn di s¶n phÈm c¾t plasmid t¸i tæ hîp b»ng 2 enzym BamHI + SacI Ghi chó: 1: S¶n phÈm c¾t plasmid t¸i tæ hîp; M: Thang ADN chuÈn 1Kb KÕt qu¶ ®iÖn di cho thÊy s¶n phÈm c¾t ph©n thµnh hai b¨ng t­¬ng øng víi phÇn vect¬ pBI121 kho¶ng 11,2Kb vµ ®o¹n gen GlyP kho¶ng 1,5Kb. Nh­ vËy cã thÓ kÕt luËn chóng t«i ®· thiÕt kÕ vµ biÕn n¹p thµnh c«ng Ti-plasmid t¸i tæ hîp pBI121 mang gen GlyP vµo trong tÕ bµo E. coli DH5a. TÕ bµo vi khuÈn ®­îc gi÷ chñng trong glycerol ë -85oC. 3.4. KÕt qu¶ biÕn n¹p Ti-plasmid t¸i tæ hîp pbi121 mang gen glyP vµo tÕ bµo A. tumefaciens. 3.3.1. BiÕn n¹p Ti-plasmid t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo A. tumefaciens. Cã nhiÒu ph­¬ng ph¸p chuyÓn gen vµo thùc vËt nh­ chuyÓn gen th«ng qua A. tumefaciens, chuyÓn gen trùc tiÕp vµo c¸c tÕ bµo trÇn vµ thÓ transient, chuyÓn gen trùc tiÕp qua tÕ bµo trÇn vµ chuyÓn n¹p gen b»ng thiÕt bÞ b¾n gen…Ph­¬ng ph¸p chuyÓn gen th«ng qua vi khuÈn A. tumefaciens võa cho hiÖu qu¶ cao, ®¬n gi¶n l¹i Ýt tèn kÐm rÊt phï hîp víi n­íc ta nªn ®­îc lùa chän ®Ó chuyÓn c¸c kÕt cÊu gen thiÕt kÕ ®­îc vµo mét sè c©y trång. Chóng ta ®· biÕt, Ti-plasmid t¸i tæ hîp cã thÓ ®­îc chuyÓn vµo A. tumefaciens b»ng ph­¬ng ph¸p trùc tiÕp nhê sèc nhiÖt sö dông CaCl2, tuy nhiªn hiÖu qu¶ biÕn n¹p vµo tÕ bµo A. tumefaciens theo c¸ch nµy t­¬ng ®èi thÊp so víi tÕ bµo E. coli. v× vËy, trong nghiªn cøu nµy chóng t«i thùc hiÖn biÕn n¹p plasmid t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo A. tumefaciens b»ng ph­¬ng ph¸p xung ®iÖn. Ti-plasmid t¸i tæ hîp sau khi thiÕt kÕ thµnh c«ng chóng t«i tiÕn hµnh chuyÓn vµo A. tumefaciens b»ng ph­¬ng ph¸p xung ®iÖn, ®©y lµ ph­¬ng ph¸p biÕn n¹p rÊt cã hiÖu qu¶, cã thêi gian thÝ nghiÖm ng¾n. Ba chñng tÕ bµo A. tumefaciens Cv58C1, pGV2206, pGV3101 ®­îc sö dông cã mang gen m· ho¸ cho enzym kh¸ng hai lo¹i kh¸ng sinh ampecilin vµ rifamycin. Tr­íc tiªn, ®Ó ph©n tö ADN ®i vµo tÕ bµo ®­îc rÔ rµng chóng t«i tiÕn hµnh t¹o tÕ bµo kh¶ biÕn A. tumefaciens (môc 2.2.2.10). TÕ bµo kh¶ biÕn A. tumefaciens ®­îc bæ sung thªm plasmid t¸i tæ hîp vµ ®­îc xö lý ë ®iÒu kiÖn 25mF, 400W, 2,5 kV tõ 8 - 10 gi©y. Sau khi xung ®iÖn, mÉu ®­îc bæ sung ngay 1ml m«i tr­êng SOC, l¾c ë 28oC trong hai giê vµ cÊy tr¶i trªn ®Üa petri chøa m«i tr­êng chän läc thÝch hîp YEP + ampecilin 50mg/l, kanamycin 50mg/l, rifamycin 100mg/l, nu«i ë 28oC qua ®ªm. T­¬ng tù mÉu ®èi chøng (kh«ng ®­îc bæ sung thªm vect¬ t¸i tæ hîp) còng ®­îc xö lý b»ng xung ®iÖn vµ còng ®­îc nu«i cÊy trªn m«i tr­êng chän läc nh­ trªn. KÕt qu¶ biÕn n¹p b»ng xung ®iÖn ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng d­íi ®©y: B¶ng 9. KÕt qu¶ thÝ nghiÖm biÕn n¹p b»ng xung ®iÖn chuyÓn Ti-plasmid t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo A. tumefaciens. M«i tr­êng Sè l­îng khuÈn l¹c trung b×nh/1 ®Üa petri §èi chøng Chñng Cv58c1 Chñng pGV 2206 Chñng pGV 3101 YEP+Amp+Rif +++ +++ +++ +++ YEP+Km+Amp+Rif - +++ +++ ++ Chó thÝch: (+++): xuÊt hiÖn rÊt nhiÒu khuÈn l¹c; (++): xuÊt hiÖn khuÈn l¹c; (-): kh«ng xuÊt hiÖn khuÈn l¹c Tõ b¶ng 9 cho thÊy, tÕ bµo A. tumefaciens trong mÉu ®èi chøng (chñng vi khuÈn kh«ng mang vect¬ t¸i tæ), mäc rÊt tèt trªn m«i tr­êng YEP chøa kh¸ng sinh chän läc A. tumefaciens, cßn trªn m«i tr­êng chøa thªm kh¸ng sinh kanamycin chän läc khuÈn mang vect¬ t¸i tæ hîp kh«ng mäc ®­îc. §èi víi c¸c mÉu thÝ nghiÖm, khuÈn mäc rÊt nhiÒu trªn m«i tr­êng chøa c¶ 3 lo¹i kh¸ng sinh chän läc. §iÒu nµy cho thÊy ®· biÕn n¹p thµnh c«ng vect¬ t¸i tæ hîp vµo 3 chñng vi khuÈn A. tumefaciens. Trong ®ã, ë nh÷ng ®Üa chøa hai chñng Cv58c1 vµ pGV 2206 sè l­îng khuÈn l¹c mäc nhiÒu h¬n so víi chñng pGV3101. H×nh 13. ¶nh chôp ®Üa th¹ch sau khi biÕn n¹p vect¬ Ti-plasmid vµo tÕ bµo A. tumefaciens chñng Cv58C1 3.3.2. KiÓm tra sù cã mÆt cña vect¬ Ti-plasmid t¸i tæ hîp trong c¸c dßng khuÈn l¹c b»ng colony-PCR vµ c¾t enzym h¹n chÕ C¸c dßng khuÈn l¹c A. tumefaciens ®­îc t¹o ra nhê xung ®iÖn chøa Ti-plasmid t¸i tæ hîp ®· ®­îc ph¸t hiÖn b»ng ph­¬ng ph¸p chän läc trªn m«i tr­êng ®Æc hiÖu. §Ó kiÓm tra sù cã mÆt cña gen GlyP trong c¸c dßng khuÈn l¹c chóng t«i lÊy ngÉu nhiªn mçi chñng kho¶ng 6 khuÈn l¹c tiÕn hµnh kiÓm tra b»ng ph­¬ng ph¸p colony-PCR (môc 2.2.11) víi cÆp måi (RabG-sart-BamHI+RabG-stop-SacI), ®©y lµ ph­¬ng ph¸p ®¬n gi¶n cho phÐp kh¼ng ®Þnh vµ x¸c ®Þnh chÝnh x¸c cÊu tróc cña plasmid t¸i tæ hîp ®­îc biÕn n¹p vµo tÕ bµo A. tumefaciens. KÕt qu¶ thu ®­îc tÊt c¶ c¸c dßng ®Òu xuÊt hiÖn b¨ng 1,5Kb, ®iÒu nµy chøng tá chóng t«i ®· ®­a ®­îc Ti-plasmid t¸i tæ hîp vµo trong 3 chñng vi khuÈn A. tumefaciens Cv58c1, pGV 2206 vµ pGV 3101. 11,2 kb 1,5 kb M 1 2 §Ó mét lÇn n÷a kh¼ng ®Þnh ch¾c ch¾n sù cã mÆt cña gen GlyP trong Ti-plasmid t¸i tæ hîp chóng t«i tiÕn hµnh t¸ch plasmid tõ tÕ bµo vi khuÈn A. tumefaciens. V× sè l­îng b¶n sao cña plasmid cã trong tÕ bµo A. tumefaciens rÊt thÊp (kho¶ng vµi chôc b¶n sao) nªn khi t¸ch plasmid th× ph¶i t¸ch víi khèi l­îng lín. Ph­¬ng ph¸p Sambrook ®­îc sö dông rÊt cã hiÖu qu¶ trong tr­êng hîp t¸ch plasmid tõ A. tumefaciens. Tr­íc tiªn ph¶i nu«i l¾c tÕ bµo vi khuÈn trong 100ml m«i tr­êng YEP láng ë 28oC qua ®ªm. Sau ®ã cho vµo èng li t©m 50ml li t©m ë 5000 vßng/phót trong 10 phót ®Ó thu c¨n tÕ bµo, tiÕn hµnh t¸ch plasmid (môc 2.2.8). Sau khi t¸ch ®­îc plasmid tiÕn hµnh c¾t b»ng 2 enzym h¹n chÕ BamHI vµ SacI. §iÖn di kiÓm tra chóng t«i thu ®­îc kÕt qu¶ sau: H×nh 14. KÕt qu¶ ®iÖn di s¶n phÈm PCR vµ s¶n phÈm c¾t Ti-plasmid t¸i tæ hîp mang gen GlyP sau khi t¸ch tõ tÕ bµo A. tumeffaciens. Ghi chó: GiÕng 1: Thang AND chuÈn 1Kb; giÕng 2: s¶n phÈm colony-PCR tõ tÕ bµo A. tumefaciens; giÕng 3:s¶n phÈm c¾t Ti-plasmid t¸i tæ. Tõ kÕt qu¶ trªn cho thÊy chóng t«i ®· thu ®­îc mét b¨ng ®Æc hiÖu 1,5Kb s¶n phÈm PCR vµ s¶n phÈm c¾t b»ng enzym h¹n chÕ thu ®­îc hai b¨ng bao gåm : b¨ng vect¬ lµ 11,2Kb, b¨ng ®o¹n gen GlyP 1,5Kb. §iÒu nµy hoµn toµn thèng nhÊt víi gi¶ thiÕt ®Æt ra vµ chøng tá chóng t«i ®· chuyÓn thµnh c«ng Ti-plasmid t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo vi khuÈn A. tumefaciens. Nh­ vËy, chóng t«i ®· hoµn thµnh nghiªn cøu t¹o chñng vi khuÈn A. Tumefaciens mang T-plasmid t¸i tæ hîp pBI121 chøa ®o¹n gen GlyP m· ho¸ cho ph©n tö glycoprotein cña virus d¹i. §©y lµ nguån nguyªn liÖu ®Çu tiªn phôc vô cho nghiªn cøu chuyÓn gen nh»m t¹o c©y trång chuyÓn gen cã thÓ s¶n xuÊt vaccine d¹i ¨n ®­îc. H×nh 15. Ti-plasmid t¸i tæ hîp pBI121 mang gen GlyP cña vir KÕt luËn vµ ®Ò nghÞ KÕt kuËn 1. chóng t«i ®· nh©n b¶n thµnh c«ng ®o¹n gen GlyP cã chiÒu dµi 1500 nuclªotit m· ho¸ cho ph©n tö glycoprotein vá cña chñng virus d¹i Vnucovo-32 b»ng kü thuËt PCR sö dông cÆp måi ®Æc hiÖu RabG-start-BamHI, RabG-stop-SacI. 2. §· thµnh c«ng trong viÖc thiÕt kÕ Ti-plasmid t¸i tæ hîp pBI121 mang gen GlyP d­íi sù ®iÒu khiÓn cña ®o¹n khëi ®éng 35S vµ ®o¹n kÕt thóc NOS. 3. §· t¹o ®­îc ba chñng a. tumeffaciens Cv58C1, pGV2206 vµ pGV3101 chøa Ti-plasmid t¸i tæ hîp mang gen GlyP phôc vô cho viÖc chuyÓn gen s¶n xuÊt vaccine d¹i ¨n ®­îc trªn ®èi t­îng thùc vËt. §Ò NGHÞ Nghiªn cøu chuyÓn Ti-plasmid t¸i tæ hîp mang gen GlyP vµo c©y l¹c b»ng hÖ thèng chuyÓn gen th«ng qua a. tumeffaciens. §ång thêi biÓu hiÖn gen GlyP trong vi khuÈn E. coli thu protein ®Ó s¶n xuÊt kh¸ng thÓ ®a dßng phôc vô nghiªn cøu c©y chuyÓn gen sau nµy. Tµi liÖu tham kh¶o Tµi liÖu TiÕng ViÖt 1. Lª TrÇn B×nh, Hå H÷u NhÞ, Lª ThÞ Muéi (1997), C«ng nghÖ sinh häc thùc vËt trong c¶i tiÕn gièng c©y trång, Nxb N«ng nghiÖp, Hµ Néi. 2. NguyÔn ThÞ ChÝnh, Ng« TiÕn HiÓn (2001), Virut häc, Nxb §¹i häc Quèc Gia Hµ Néi 3. NguyÔn L©n Dòng, NguyÔn §×nh QuyÒn, Ph¹m V¨n Ty (2002), Vi sinh vËt häc, Nxb Gi¸o Dôc. 4. Lª Thanh Hoµ, §¸i Duy Ban (2002), C«ng nghÖ sinh häc ®èi víi c©y trång vËt nu«i vµ b¶o vÖ m«i tr­êng, TËp II, Nxb N«ng nghiÖp, Hµ néi. 5. Lª Thanh Hoµ (2003), Sinh häc ph©n tö virus Gumboro, nghiªn cøu øng dông t¹i ViÖt Nam, Nxb N«ng nghiÖp, Hµ Néi. 6. Lª Hång Hinh (2003), Vi sinh y häc, Nxb Y häc Hµ Néi. 7. Lª ThÞ Thu HiÒn (2003), T¹o chñng vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens mang gen kh¸ng c«n trïng ®Ó chuyÓn vµo c©y trång, LuËn ¸n tiÕn sÜ, ViÖn C«ng nghÖ sinh häc, ViÖn khoa häc vµ c«ng nghÖ ViÖt Nam. 8. NguyÔn ThÞ Lang (2002), Ph­¬ng ph¸p c¬ b¶n trong nghiªn cøu c«ng nghÖ sinh häc, Nxb N«ng nghiÖp, Tp Hå ChÝ Minh. 9. §ç Ngäc Liªn (2004), MiÔn dÞch häc c¬ së, Nxb §¹i häc Quèc gia, Hµ Néi. 10. §oµn ThÞ Nguyªn, TrÇn Quang C¶nh (2004), Gi¸o tr×nh vi sinh vËt, Nxb Y häc Hµ Néi. 11. TrÇn V¨n TiÕn, §inh Kim XuyÕn (2003), Gi¸m s¸t vµ kiÓm so¸t bÖnh truyÒn nhiÔm ë ng­êi, Nxb Khoa häc vµ kü thuËt, Hµ Néi. 12. NguyÔn §øc Thµnh (2003), ChuyÓn gen ë thùc vËt, Nxb Khoa häc vµ kü thuËt, Hµ Néi. Tµi liÖu TiÕng Anh 13. American Medical Association (2002), “Plant-based vaccine show promise against infectious diseases”, 4 Oct, pp. 4197-5329. 14. Byrnes M. (2001), “Plant vaccine promises safe genetic modification” Daily News, 9 Jun, 15. Charlton K.M., Rupprecht C.E., Dietzschold B., Koprowski H. (1994), “in Lyssaviruses”, spingler-Verlag press, Berlin, pp. 95-119. 16. Centers for Disease Control and Prevention (2003), “ The virus”, National center for infevtious Diseases, 6 Feb, 17. Chilton M.D. (1993), “Agrbacterium gene transfer: Progress on a poor nam’s vector”, Vol., 90, pp. 3119-3210. 18. Coll J.M. (1995), “The glycoprotein G of rhabdoviruses” Archives of virology, 140(5), pp. 827-851. 19. Conzelmann K.K. (1998), “Nonsegmented Negative- Strand RNA virus: Genetics and Manipulation of viral genome”, Ann. Rev. Genet., 32, pp. 123-162. 20. Goldbeg K.B., Morell B., Hillman B.I., Heaton L.A., Chol T.J., Jackson A. O (1991), “Structure of the glycoprotein gene of sonchus yellow net virus, a pinal rhabdovirus”, Virology, 185, pp. 32-38. 21. Jond W., Krebs M.S., Charles E., James E. (2000), “Rabies surveillance in the United States during 1999”, Public veterinary medicine, 217 (12), pp. 1799-1811. 22. Khattak S., Darai G., Sle S., Rosen-Wolff A. (2002), “Characterization of expression of Puumala virus nucleocapsid protein in transgenic plant”, National library of Medicine, 45(4-6). 23. Khandelwal A., Sita G.l., Shaila M.S. (2003), “Expression of hemagglutini protein of virus in transgenic tobaco and immunogenicity of plant-derived protein a mouse model”, Viriology, 308(2), pp. 207-215. 24. Khandelwal A., Sita G.l., Shaila M.S. (2003), “ oral immunization of cattle with hemagglutinin protein of rinderpest virus expressed in transgenic peanut induces specific immune responses”, Vaccine, 21, pp. 3282-3289. 25. Langevin C., Jaaro H., Bressanalli S., Fainziber M. (2002) “Rabies virus glycoprotein (RVG) is a trimeric ligand for the N-terminal cystein-rish domain of the mammalian p75 neurotrophin receptor”, The Journal of biological chemistry, 4 Oct, p No. 40, pp. 37655-37662. 26. National library of medicine (1999), “A plethora of hitech vaccine-genetic, edible, sugar glass, an more”, Pubmed, 4 July, 21, pp. 3282-3289. 27. Prakash C.S. (1996), “Edible vaccines and antibody producing plants”, biotechnology and Developmant monitor, No.27, pp. 10-13. 28. Smith M.L., Mason H.S., Shuler M.L. ( 2002), “Hepatitis B surface antigen expression in plant cell culture: Kinetics of antigen accumulation in batch culture and its intracellular form”, Biotachnol Bioeng, 30 Dec, 80(7), pp. 812-222. 29. University of South carolina (2004), “Rabies”, Microbiology and Immunology On-line, 2 Nov. 30. Vaccineation Liberation-Imformation (2005) “Rabies, vaccine and health principles” Vaccination Liberation, 26 Der, 31. Wantto M., Ryan A., Cummins J. (2004), "Cauliflower mosaic viral promoter – arecipe for disaster?", 32. World Health Organization (2003), “Rabies vaccine”, Immunization, vaccines and biologicals, April 2003, 33. Wetz G.W., Davis N.L., Palton J. (1987) , “The role of proteins in vesicular stomatits virus RNA replication”, Plenum Press, New York, pp. 271-298. Môc lôc Trang Më ®Çu.....................................................................................................................................1