Đề tài Thực phẩm chuyển gen có nguồn gốc thực vật

ả sinh vật biến đổi gen có thể ảnh hưởng bất lợi đối với bảo tồn v à sử dụng bền vững đa dạng sinh học, đồng thời quan tâm đến các rủi ro đối với sức khỏe con người. Nghị định thư không bao trùm: việc vận chuyển xuyên biên giới các sinh vật biến đổi gen là các dược phẩm sử dụng cho người đã được quản lý trong các hiệp định hoặc tổ chức quốc tế liên quan. Nghị định thư không giải quyết các vấn đề an toàn thực phẩm (vấn đề này được các chuyên gia đề cập đến trong các diễn đàn quốc tế khác). Nghị định thư không quy định dán nhãn sản phẩm tiêu dùng ba 3.1.2. Đánh giá rủi ro đối với thực phẩm chuyển gen 3.1.2.1. Nguyên tắc chung Nghị định thư Cartagena về an toàn sinh học, các nguyên tắc chính bao gồm: Đánh giá rủi ro phải minh bạch và được tiến hành trên cơ sở khoa học của các ky thuật đánh giá rủi ro đã được công nhận. Trong đó có quan tâm đến các hướng dẫn và tư vấn do các tổ chức quốc tế liên quan xây dựng. Thiếu kiến thức khoa học hoặc không có đủ dữ liệu khoa học thì không nên khẳng định cấp độ rủi ro là đặc biệt, không có rủi ro hoặc rủi ro có thể chấp nhận được. Các rủi ro liên quan với GMO hoặc sản phẩm của chúng cần được xem xét trên bối cảnh rủi ro gây ra bởi các sinh vật nhận không biến đổi gen hoặc các sinh vật cho gen trong trường hợp nhận tiềm tàn. Đánh giá rủi ro nên tiến hành theo từng trường hợp cụ thể . 3.1.2.2 Các thông số cần xem xét khi đánh giá rủi ro Sinh vật nhận: là điểm khởi đầu để đánh giá rủi ro GMO. Các kiến thức, thông tin thu thập được về sinh vật chưa biến đổi gen là cơ sở để giám sát GMO, nhất la trong quá trình đánh giá an toàn thực phẩm. Sinh vật cho: cần cung cấp thông về nguồn gốc tự nhiên của sinh vật cho, nhất là khi sinh vật cho (hoặc các thành viên cùng loài của chúng) là mầm bệnh hoặc gây ảnh hưởng tới môi trường cũng như sức khỏe của con người và vật nuôi. Phương pháp biến đổi gen: thông tin liên quan đến phương pháp biến đổi gen đã sử dụng sẽ cho biết số lượng bản sao, khả năng sắp xếp của gen chuyển trong GMO cũng như hiệu quả chuyển gen. Đối thực vật, hai phương pháp chuyển gen có giá trị thực tiễn và được sử dụng phổ biến là phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn đất A.tumefaciens và phương pháp chuyển gen trực tiếp bằng hóa chất, xung điện hay súng bắn gen. Chuyển gen qua A.tumefaciens có số lượng bản sao của gen chuyển ít, khả năng sắp xếp lại trong bộ gen và hiệu quả chuyển gen cao hơn các phương pháp trực tiếp. Chuyển gen trực tiếp thường chỉ được sử dụng khi mô tế bào không tiếp nhận DNA qua phương pháp dùng A.tumefaciens, do hiệu quả thấp và thường tạo ra tế bào kém bền vững cũng như gây nên sự sắp xếp lại của các trình tự DNA đưa vào. Các đặc tính phân tử: các tính của GMO ở mức độ phân tử là nguồn cung cấp thông tin về thành phần và sự tiếp hợp của các đoạn DNA đưa vào, số lượng bản sao DNA cũng như mức độ biểu hiện của protein mới ở những thời điểm và những mô khác nhau. Sự ổn định, bền vững của tính trạng mới tạo được: đối với mỗi tính trạng mới, cần xác định độ bền vững cũng như mức độ biểu hiện. Các phương pháp xác định huyết thanh học như ELISA, western blot … thường được sủ dụng để nghiên cứu đặc tính này. Nếu tính trạng mới không tạo ra do sự biểu hiện protein tái tổ hợp thì đặc tính liên quan cần được xác định thông qua kiểm tra trực tiếp phân tử DNA hoặc gián tiếp thông qua quá trình phiên mã RNA. Sản phẩm biểu hiện: để xác định được nguy cơ cần có những hiểu biết nhất định về gen chuyển vào thực vật, đặc tính, nồng độ sản phẩm của gen (protein) và vị trí biểu hiện của chúng. Khi sản phẩm biểu hiện là một protein mới, hoặc một chuỗi polypeptide, chúng cần được nhận diện, nghiên cứu chức năng và nếu có thể thì so sánh với sản phẩm truyền thống cùng loại. Nhìn chung, đối với các mô thực vật biến đổi gen, protein mới có thể được biểu hiện với nồng độ không cao, thường thấp hơn 0.1% so với trọng lượng khô. Để có những thử nghiệm độ độc chính xác cần một lương lớn protein tinh chế. Thay vì sử dụng protein tách từ mô thực vật, người ta đã chiết tách protein này từ tế bào vi khuẩn để tiến hành thử nghiệm. Trong trường hợp như vậy, cần phải cứng minh sự tương đương về mặt chức năng giữa protein tách từ thực vật và protein tách từ vi khuẩn … Thông tin dinh dưỡng: trong chọn tạo giống, giống mới dù được tạo ra nhờ công nghệ sinh học hiện đại hay truyền thống đều cần được nghiên cứu về dinh dưỡng học. Việc đưa các nguyên liệu di truyền vào giống gốc có thể gay ra sự thay đổi về nồng độ dinh dưỡng cũng như dẫn đến sự biểu hiện của một số chát chất sinh hóa không mong muốn. Khả năng thay đổi thành phần dinh dưỡng là một trong những vấn đề rất được quan tâm khi đánh giá an toàn thực phẩm. Độc tố: để đánh giá độc tố, người ta thường tập trung vào nghiên cứu sự biểu hiện của protein mớiở mức tế bào và phân tử. Ngoài ra, khả năng gây dị ứng cũng là một trong những tiêu chí quan trọng để đánh giá độ an toàn của GMO. Trong mọi trường hợp, cần giám sát và đưa ra các biện pháp giải quyết khi ngẫu nhiên xảy ra sự cố. Các đặc tính của môi trường nhận tiềm tàng: khu vực giải phóng GMO có gầnkhu dân cư hay gần môi trường sinh thái đặc biệt như vườn quốc gia hay không là những nội dung cần quan tâm. Một số đặc điểm địa lý cũng cần biết như: khu vực đó có gần thung lũng, sông, đồi … Tất cả những thông số này sẽ ảnh hưởng đến quá trình phát tán của gen . 3.1.3. Quy định về ghi nhãn cho thực phẩm chuyển gen: Những tranh cãi về thực phẩm có nguồn gốc từ cây chuyển gen thường động chạm tới chủ đề ghi nhãn. Nhiều người tiêu dùng tranh cãi và khăng khăng đòi quyền được biết họ đang ăn gì và họ có quyền chọn lựa loại thực phẩm mà họ ăn. Do đó, nhiều chính phủ đã bắt đầu để ý tới những đề xuất này và hoặc đã triển khai các quy định về ghi nhãn hoặc đang nghiên cứu triển khai những quy định này. 3.1.3.1. Các yêu cầu để triển khai các chính sách về ghi nhãn: Trước khi triển khai bất cứ quy định ghi nhãn nào, các chính phủ cần phải thiết lập các tiêu chuẩn và dịch vụ để tiến hành kiểm tra xem có các thành phần chuyển gen không; cấp giấy chứng nhận và đảm bảo rằng các tiêu chuẩn chất lượng là rõ ràng và có thể đạt được. Trong khi dễ dàng phát hiện thấy các thành phần chuyển gen trong các sản phẩm mà thành phần chuyển gen là thành phần chính (như ở đậu phụ hay ở bắp rang bơ), thì lại không dễ phát hiện ra các thành phần chuyển gen trong các sản phẩm chế biến như dầu, đường và thức ăn làm từ tinh bột, những loại thực phẩm này không còn chứa bất cứ DNA mới hoặc protein mới nữa. Một lưu ý khác đó là phần lớn thực phẩm được mua và tiêu thụ ở các nước đang phát triển không được bao gói và do vậy thường không được ghi nhãn. Ví dụ sữa đậu nành được bán rong trên đường hoặc rau quả tươi được bán tại các chợ. Một vấn đề khác mà các nhà quản lý phải cân nhắc đó là vấn đề từ ngữ: một nhãn hàng lý tưởng thì không được để cho người tiêu dùng phản đối sản phẩm. Cũng có một vấn đề là liệu nhãn ghi có hữu ích, hay được dùng để giáo dục không. Đối với một người nội trợ ở nhà ít khi được nghe về những cuộc tranh luận đối với thực phẩm chuyển gen thì một nhãn hàng như "được làm từ đậu tương chuyển gen" hoặc "được trồng từ hạt giống thu được từ công nghệ sinh học thực vật hiện đại" có thể tạo ra nhiều lúng túng. Sau đây là một vài ví dụ về các biện pháp ghi nhãn trên thế giới: Canada: Tại Canađa, tất cả các loại thực phẩm xác định thấy có những mối quan tâm về an toàn như là tính gây dị ứng và có sự thay đổi về thành phần hay dinh dưỡng thì cần phải được ghi nhãn đặc biệt. Việc ghi nhãn phải chỉ ra bản chất của sự thay đổi và phải dễ hiểu, đúng sự thực và không được gây nhầm lẫn cho người tiêu dùng. Các nhà sản xuất có thể chọn việc ghi nhãn các sản phẩm để cung cấp thông tin có liên quan tới việc có hay không có các thành phần chuyển gen do đó các thông tin phải thực tế và không được gây nhầm lẫn hay lừa bịp. Mỹ: Tại Mỹ, tất cả các loại thực phẩm phải ghi nhãn khi có những mối lo ngại đốivới sức khoẻ, có sự khác biệt trong việc sử dụng hay về giá trị dinh dưỡng hoặc tên gọi chung không còn thích hợp để mô tả là thực phẩm có nguồn gốc từ cây chuyển gen. Vào tháng giêng năm 2001, Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa kỳ đã công bố một hướng dẫn dự thảo cho ngành thực phẩm đó là việc ghi nhãn trên cơ sở tự nguyện. Tài liệu này hướng dẫn các nhà sản xuất trong việc ghi nhãn thực phẩm một cách thích hợp, trung thực và không gây nhầm lẫn và cũng đưa ra các ví dụ về ngôn ngữ ghi nhãn có thể được chấp nhận và không được chấp nhận. Liên minh Châu Âu: Các thành phần thực phẩm mà có chứa tối thiểu 1% thành phần chuyển gen được phát triển thông qua các kỹ thuật biến đổi di truyền (dựa trên các biện pháp tính toán DNA/protein) thì phải ghi nhãn. Các thành phần thu được từ cây chuyển gen nhưng không chứa các DNA hay protein mới thì không cần phải dán nhãn. Do vậy, các sản phẩm tinh chế cao như dầu, đường và tinh bột làm từ ngô, đậu tương và cải dầu (canola) chuyển gen được miễn không phải ghi nhãn. Khi mới được đưa ra giới thiệu vào năm 1997, các quy định về ghi nhãn của Liên minh Châu Âu không bao gồm các thành phần nhỏ như: các chất phụ gia thực phẩm, các chất tạo hương liệu và chất hỗ trợ quá trình chế biến. Gần đây các quy định về ghi nhãn được đưa vào năm 2000 yêu cầu ghi nhãn cả các chất phụ gia và chất tạo hương liệu trong trường hợp những chất này không tương tự với các sản phẩm thông thường (ví dụ như có chứa các protein hay DNA mới do kết quả của việc biến đổi di truyền). Các loại thực phẩm được miễn ghi nhãn: Thực phẩm thu được từ cây chuyển gen nhưng không chứa thành phần DNA hay protein mới (dầu, đường, tinh bột...làm từ đậu tương, ngô và cải dầu chuyển gen). Ngẫu nhiên có thành phần chuyển gen ở mức dưới 1% với điều kiện là đã thực thi các bước để tránh đưa vào thành phần chuyển gen. Các thực phẩm làm từ cây trồng được biến đổi di truyền thông qua các công nghệ sinh học ngoại trừ công nghệ DNA tái tổ hợp (ví dụ liên kết tế bào giữa các loài cùng giới). Australia: Yêu cầu ghi nhãn bắt buộc có hiệu lực từ tháng 12/2001. Hiện yêu cầu ghi nhãn là bắt buộc trong những trường hợp mà các đặc tính của thực phẩm bị thay thế như là thay đổi giá trị dinh dưỡng hoặc thực phẩm có chứa DNA mới hay protein mới do kết quả của việc thay đổi gen. Hàm lượng các thành phần biến đổi gen được phép có trong thực phẩm là tới 1%. Các trường hợp không phải ghi nhãn: Thực phẩm được làm từ cây chuyển gen nhưng không có chứa DNA hay protein mới (như dầu, đường, tinh bột ... làm từ đậu tương chuyển gen, ngô và cải dầu). Các phụ gia thực phẩm và các chất hỗ trợ quá trình chế biến (nếu như DNA hoặc protein mới không có trong sản phẩm thực phẩm cuối cùng). Hương liệu (với hàm lượng dưới mức 0,1% trong hàng thành phẩm). Thực phẩm được chế biến để bán (tại các nhà hàng). Thực phẩm làm từ các cây trồng được biến đổi di truyền thông qua các công nghệ khác ngoại trừ công nghệ tái tổ hợp DNA. Nhật bản: Bộ nông, ngư nghiệp Nhật bản (MAFF) là cơ quan chịu trách nhiệm về việc chuẩn y sự an toàn đối với môi trường, chuẩn y về sự an toàn của thức ăn gia súc và việc ghi nhãn công nghệ sinh học đối với thực phẩm. Ngày 1/4/2001, MAFF đã lên một chương trình ghi nhãn trong đó yêu cầu ghi nhãn đối với các sản phẩm thực phẩm công nghệ sinh học, nếu phát hiện thấy DNA hay protein công nghệ sinh học trong thực phẩm thành phẩm. Quy định của MAFF yêu cầu dán nhãn DNA tái tổ hợp chỉ khi hàm lượng thành phần này chiếm từ 5% trong tổng trọng lượng sản phẩm trở lên. Hàn quốc: Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hàn quốc (KFDA) yêu cầu ghi nhãn thực phẩm chế biến sử dụng ngô, đậu tương hay mầm đậu tương chuyển gen hoặc khi ba loại nguyên liệu này có trong năm thành phần chính của một sản phẩm thực phẩm chế biến. Các thành phần có hàm lượng không đáng kể thì không cần phải ghi nhãn. Mức cho phép ngẫu nhiên có mặt các thành phần chuyển gen đối với ba loại nguyên liệu này là tới 3% Bộ nông lâm nghiệp Hàn quốc cũng yêu cầu ghi nhãn đối với các chuyến hàng chở ba loại hàng hoá nói trên, nếu như đó là hàng chuyển tới để tiêu dùng trực tiếp và nếu có chứa các thành phần được cải tiến nhờ công nghệ sinh học với hàm lượng từ 3% trở lên. Để không phải ghi nhãn thì phải có giấy chứng nhận vẫn bảo toàn tính chất trong quá trình vận chuyển. 3.1.3.2. Tác động của việc ghi nhãn thực pham: Chi phí của việc ghi nhãn không đơn thuần là chi phí về giấy, mực. Việc kiểm tra phải được thực hiện từ ngay khi bắt đầu tiến trình sản xuất thực phẩm: đầu tiên với các công ty hạt giống và sau đó tới người trồng, các công ty ngũ cốc, các nhà chế biến thực phẩm, các nhà phân phối, những người bán hàng. Khoản chi phí khổng lồ không chỉ gắn với việc dán nhãn chuyển gen mà còn cả với việc không phải dán nhãn. Các nhà sản xuất các loại thực phẩm không chuyển gen cũng phải chứng minh từng bước của quá trình, không chỉ quay trở lại đối với người trồng mà còn cả những người cung cấp hạt giống. Một nghiên cứu ở Canađa cho thấy rằng chi phí ghi nhãn phải bằng ít nhất 9-10% giá bán lẻ hàng thực phẩm chế biến và từ 35-41% chi phí của nhà sản xuất. Nghiên cứu cũng kết luận rằng thực phẩm công nghệ sinh học và không phải công nghệ sinh học (được ghi nhãn là "không phải là sản phẩm công nghệ sinh học") sẽ chịu tác động như nhau do mức tăng giá này, mức giá chiếm từ 700-950 triệu đôla một năm tại Canađa. Do vậy, bất cứ hình thức ghi nhãn nào, cho dù là sản phẩm chuyển gen hay không chuyển gen sẽ đi kèm với chi phí tăng thêm, giá thành sản phẩm sẽ tăng và người tiểu dùng phải chấp nhận. Tóm lại, vấn đề ghi nhãn thực phẩm chuyển gen là một vấn đề phức tạp mà hiện vẫn chưa được giải quyết. Tuy nhiên, có một điều rõ ràng đó là phần lớn các nước sẽ áp dụng một số loại chính sách ghi nhãn. Ngay lúc này, quyết định ghi nhãn sản phẩm chuyển gen không chỉ liên quan mật thiết tới sự an toàn thực tế của sản phẩm mà còn liên quan tới "mối lo ngại" gắn với những sản phẩm này. Sự có mặt của một nhãn chuyển gen sẽ không có nghĩa là sản phẩm kém an toàn hơn hoặc có sự khác biệt đáng kể vì tất cả các thực phẩm chuyển gen đã đáp ứng các tiêu chuẩn về an toàn trước khi được cho phép bán. Cách duy nhất để phát triển và duy trì một hệ thống ghi nhãn trung thực, không gây nhầm lẫn và có thể xác minh được, đó là đảm bảo rằng hệ thống phải dựa trên tiêu chí khách quan như là thành phần thực tế của thực phẩm chứ không phải dựa trên biện pháp sản xuất. 3.2 Các nhà khoa học, thực phẩm chuyển gen và người tiêu dùng Công nghệ sinh học có vai trò quan trọng đối với sự phát triển trong tương lai của thế giới nhưng thách thức đặt ra là làm thế nào để có nhiều nước đang phát triển tiếp cận được với công nghệ hiện đại. Năm 1994, thực phẩm chuyển gen đầu tiên, cây cà chua mang tính trạng chín chậm, đã được trồng và tiêu thụ ở một số nước phát triển. Từ đó, ngày càng nhiều loại thực phẩm có nguồn gốc từ cây trồng chuyển gen được thương mại hóa và sử dụng trên toàn thế giới. Việc đưa các thực phẩm mới này vào bữa ăn hàng ngày đang làm tăng lên những băn khoăn chính đáng về độ an toàn của chúng. Các giống cây trồng chuyển gen ngày càng được phát triển nhờ vào các công cụ của công nghệ sinh học hiện đại. Cũng chính vì vậy mà rất nhiều người tiêu dùng thắc mắc rằng liệu các thực phẩm này có an toàn bằng các loại thực phẩm có được nhờ sử dụng các biện pháp nông nghiệp truyền thống hay không, những thực phẩm chuyển gen có thực sự có được những đặc tính tốt có lợi cho người sử dụng không, ngoài những tính chất mới như đã được giới thiệu liệu có tìm ẩn những nguy cơ gây hại đến sức khỏe của con người hay không … Mối lo ngại lớn nhất đối với thực phẩm chuyển gen là những protein mới có thể gây độc hoặc gây dị ứng. Ngoài ra còn có những nguy cơ khác như giảm nồng độ một số chất dinh dưỡng này trong khi lại tăng nồng độ một số chất khác. Khá nhiều tổ chức an tòa toàn thực phẩm đã tiến hành thống kê thực phẩm gây dị ứng và xây dựng các nguyên tắc, quy chế để đánh giá rủi ro. Hàng loại thử nghiệm và câu hỏi phải được xem xét kỹ để quyết định liệu thực phẩm này có làm tăng tính dị ứng hay không. Với cây trồng chuyển gen, các tiêu chí liên quan đến khả năng gây dị ứng cần xem xét bao gồm: Nguồn nguyên liệu di truyền đã được biết có nguy cơ gây dị ứng. Tìm hiểu trình tự amino acid của các kháng nguyên gây dị ứng. Đánh giá các phản ứng miễn dịch. Ảnh hưởng của độ pH hoặc quá trình tiêu hóa đến sự bền vững của các chất mới Ảnh hưởng của nhiệt độ hoặc của quy trình chế biến đến sự bền vững của các chất mới Nếu các sản phẩm biến đổi gen chứa gen phân lập từ những nguồn nguyên liệu đã được biết không gây dị ứng thì chúng cần được tiến hành các nghiên cứu về sự tương đồng giữa trình tự amino acid của protein mới do gen mã hóa với các kháng nguyên gây dị ứng đã biết cũng như về quá trình tiêu hóa và chế biến sản phẩm. Như vậy, bước đầu tiên của quá trình đánh giá khả năng gây dị ứng là xác định đặc tính chất bất kỳ protein nào là sản phẩm của gen đưa vào. Nguồn protein, lịch sử sử dụng an toàn, chức năng của protein, sự hấp thụ, tính bền nhiệt và các quá trình khác đều được đem so sánh với các protein đã biết khác. Cho tới nay, khoa học hoàn toàn có thể xác định chắc chắn một protein có khả năng gây dị ứng hay không. Như vậy, việc chọn lọc và kiểm tra phản ứng gây dị ứng của GMO gồm một số bước chính như sau: không sử dụng gen gây dị ứng để biến nạp; nhận biết gen từ các nguồn gây dị ứng; đánh giá khả năng gây dị ứng của các protein mới. Quá trình kiểm tra này cho hiệu quả tương đối cao. Ví dụ: protein dự trữ 2S ở hạt dẻ Brazil được đưa vào đậu tương để làm tăng hàm lượng amino acid chứa lưu huỳnh nhằm tăng giá trị dinh dưỡng. Một số người dị ứng với hạt dẻ Brazil được kiểm tra mẫu máu của họ xem có bị tác động của protein mới này hay không. Mẫu thử của 8/9 người cho thấy có sự ảnh hưởng vì thế dòng đậu tương mang protein dự trữ 2S không được tiếp tuc gieo trồng. Bên cạnh đó, còn có mối lo ngại rằng ăn thực phẩm chuyển gen sẽ gây lờn thuốc. Các nhà khoa học thường sử dụng gen kháng kháng sinh làm tác nhân chọn lọc để nhận biết những tế bào tái tổ hợp. Việc sử dụng gen kháng kháng sinh chọn lọc tạo mối lo ngại về khả năng xảy ra sự kháng kháng sinh trong quần thể vi khuẩn gây bệnh ở người. Đến nay rất nhiều nghiên cứu và thử nghiệm khoa học về vấn đề này đã cho rằng: Khả năng các gen kháng kháng sinh có thể được chuyển sang một sinh vật khác là vô cùng nhỏ. Thậm chí khi một gen kháng kháng sinh được chuyển sang sinh vật khác thì ảnh hưởng của việc này là không đáng kể do các kháng sinh được sử dụng trong GMO ít được ứng dụng trong thú y và y học. Hơn nữa, mức độ an toàn của các gen kháng kháng sinh chọn lọc đã được nhiều tổ chức quốc tế xem xét sau một quá trình đánh giá toàn diện trong nhiều năm. Tuy nhiên, để làm dịu những lo lắng của xã hội, các nhà khoa học ở nhiều quốc gia đang nghiên cứu để thiết kế những gen chỉ thị mới nhằm loại những gen kháng kháng sinh chọn lọc khỏi những sản phẩm hiện nay để giảm thiểu nguy cơ. Hệ Cre/ lox cho phép loại bỏ các chỉ thị chọn lọc sau khi biến nạp vào tế bào thực vật đã được nghiên cứu ứng dụng. Hãng Syngenta (Thụy Sỹ) công bố một hệ thống chọn lọc mới hòan toàn không sủ dụng các gen kháng kháng sinh cho phép phát hiện và chọn lọc dễ dàng, hiệu quả các tế bào tái tổ hợp mà không gây ảnh hưởng hoặc tiêu diệt các tế bào bình thường. Như vậy, ta thấy rất rõ thực phẩm chuyển gen phải trải qua rất nhiều thử nghiệm nghiêm ngặt. Trước khi được đưa ra thị trường, chúng phải được đánh giá sao cho phù hợp với các quy định do nững tổ chức khoa học quốc tế đưa ra như Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế của Liên hợp quốc (OECD), Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Ủy ban An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc tế của Tổ chức Nông Lương Liên hiệp (Codex Alimentarius). Những quy định này đều mang các nội dung chính: Các sản phẩm biến đổi gen cần được đánh giá giống như các loại thực phẩm khác do các nguy cơ gây ra bởi thực phẩm chuyển gen cũng có bản chất giống như các loại thực phẩm thông thường. Các sản phẩm này sẽ dược xem xét trên độ an toàn, khả năng gây dị ứng, độc tinh và dinh dưỡng của chúng hơn là dựa vào phương pháp và kỹ thuật sản xuất. Tương tự như việc cấp phép trước khi thương mại hóa cho các loại chất phụ gia mới (như chất bảo quản hay màu thực phẩm), bất kỳ một chất mới nào được tạo ra nhờ công nghệ sinh học được bổ sung vào thực phẩm đều phải được phê chuẩn trước khi đưa ra thị trường. Thực phẩm chuyển gen dự kiến đưa ra thị trường cần được đánh giá toàn diện dưới sự giám sát độc lập của các nhà khoa học và các nhà đánh giá về mặt dinh dưỡng, độc tính, khả năng gây dị ứng và các khía cạnh khoa học thực phẩm khác. Những đánh giá về an toàn thực phẩm này dựa trên những quy định hướng dẫn sản phẩm, thông tin chi tiết về mục đích sử dụng sản phẩm, các thông tin về phân tử, hóa sinh, độc tính, dinh dưỡng và khả năng gây dị ứng. Các vấn đề chính được xem xét bao gồm: Thực phẩm chuyển gen có an toàn hay không? Nồng độ các độc tố hay các chất gây dị ứng trong thực phẩm có thay đổi không Hàm lượng các chất dinh dưỡng chính có thay đổi hay không? Các chất mới trong thực phẩm chuyển gen có bảo đảm tính an toàn hay không Khả năng tiêu hóa có bị thay đổi không Các quy trình tạo ra thực phẩm có được chấp nhận không Như vậy, thực phẩm chuyển gen nếu tuân thủ đầy đủ theo các quy định trên và được kiểm tra đánh giá nghiêm ngặt thì sẽ an toàn cho người sử dụng (xác suất rủi ro rất thấp). Vì vậy, việc lựa chọn có sử dụng thực phẩm chuyển gen hay không và sử dụng loại nào tùy thuộc vào nhận thức và quan điểm của người tiêu dùng. Tuy nhiên, điều đáng lo ngại là nhiều thực phẩm chuyển gen được bày bán trên thị trường nhưng không được đánh dấu đó là thực phẩm chuyển gen; hay những thực phẩm trở thành thực phẩm chuyển gen ngoài mong muốn. Đó là việc cây trồng chuyển gen được canh tác gần khu vực của cây trồng truyền thống và xảy ra việc chuyển giao gen qua hạt phấn ngoài ý muốn. Bên cạnh đó, còn có những hạt giống của cây trồng chuyển gieo được nhập khẩu trái phép qua đường khách du lịch và được đưa cho người dân trồng thử, sau đó sản phẩm của nó được bày bán bình thường như các sản phẩm truyền thống khác… Vấn đề này thiết nghĩ phải được các ngành chức năng quản lý, kiểm tra chặt chẽ để người tiêu dùng có thể an tâm trong việc lựa chọn thực phẩm của mình. Bảng 3.1. Ví dụ về sản phẩm công nghệ sinh học thực phẩm hiện nay Sản phẩm Đặc điểm Cải dầu Chống chịu chất diệt cỏ Cải dầu Có hàm lượng axít béo chuyển đổi Ngô Chống chịu chất diệt cỏ Ngô Kháng sâu bệnh và chống chịu thuốc diệt cỏ Ngô Có hàm lượng axit amino chuyển đổi Dưa Có đặc tính chín chậm Đu đủ Kháng virút Khoai tây Kháng sâu bệnh Khoai tây Kháng virút và sâu bệnh Lúa gạo Chống chịu thuốc diệt cỏ Đậu tương Chống chịu thuốc diệt cỏ Đậu tương Có hàm lượng axít béo chuyển đổi Bí đỏ Kháng virút Củ cải đường Chống chịu thuốc diệt cỏ Cà chua Có đặc tính chín chậm Cà chua Kháng sâu bệnh Lúa mỳ Chống chịu thuốc diệt cỏ Lúa mỳ Chống chịu thuốc diệt cỏ CHƯƠNG 4: MỘT SỐ THÀNH TỰU VỀ THỰC VẬT CHUYỂN GEN 4.1 Golden rice (gạo vàng) – Thực phẩm chuyển gen của tương lai Thiếu vitamin A sẽ bị quáng gà có thể dẫn đến bị mù, hơn nữa có thể bị các bệnh về cơ và đường hô hấp [A. Sommer, 1988; J. P. Grant, 1991]. Các bệnh này thường gặp ở trẻ em ở các nước nghèo, nước đang phát triển như châu Á, châu Phi, châu Mỹ La Tinh. Ở các nước này, gạo là nguồn lương thực chính của người dân, vì thế các nhà khoa học tìm cách chuyển gen có thể sinh tổng hợp provitamin A vào cây lúa tạo ra loại gạo mới có chứa provitamin A để bổ sung lượng vitamin A cần thiết cho cơ thể, giảm các bệnh do thiếu vitamin A gây ra. Loại gạo đó chính là gạo vàng (golden rice). Gọi là gạo vàng vì hạt gạo sau khi tách vỏ, nội nhũ có màu vàng – màu của β – carotene (provitamin A). 4.1.1 Vitamin A ( Retinol, Axerotol, Xeroptol, Xerophtalmie) 4.1.1.1 Giới thiệu Vitamin A là vitamin hòa tan tốt trong chất béo, không tan trong nước. Vitamin A có nhiều trong lòng đỏ trứng, sữa, mỡ bò, gan các thu, gan cá mập (37%), mỡ cá, gan gà … Provitamin A (caroten) có nhiều ở gấc, bí đỏ, carrot, cà chua, bắp vàng … khi vào cơ thể nó có thể chuyển thành vitamin A. Vitamin A dễ bị oxi hóa, nhưng trong điều kiện yếm khí thì bền với nhiệt độ cao (kể cả khi 100oC). Vitamin A bị phân hủy khi có oxi không khí, tuy nhiên khá bền với acid, kiềm ở nhiệt độ không quá cao. Trong gan, vitamin A tồn tại ở dạng ester với acid acetic và acid palmitic, ở dạng này bền hơn dạng tự do. Hình 4.1. Cấu trúc của retinol, dạng phổ biến nhất của vitamin A trong thực phẩm Vitamin A có hai dạng A1 (Retinol), A2 (dehydro-retinol). 4.1.1.2. Provitamin A: Có các dạng α, β, γ, δ – carotene. Trong đó, β – carotene là có hoạt tính vitamin A cao nhất. Khi thủy phân β – carotene bằng enzyme carotenase, ta có 2 phân tử vitamin A. Carotene có công thức chung là C40H56. Đặc tính của cấu tạo của carotene: Ở giữa có 9 nối đôi nằm xen kẻ nhau. 2 vòng thơm ở hai đầu là vòng β – ionon (hay α – ionon). α – carotene có 1 vòng β – ionon và 1 vòng α – ionon. β – carotene có 2 vòng β – ionon. γ – carotene có có 1 vòng β – ionon ở 1 đầu còn đầu kia mạch hở. Do đó, khi phân cắt carotene bằng enzyme, từ β – carotene tạo ra 2 phân tử vitamin A, còn từ α – carotene và γ – carotene ta chỉ thu được 1 phân tử vitamin A [5]. α – carotene β – carotene γ – carotene Hình 4.2 Các dạng cấu tạo phân tử caroten 4.1.1.3 Tác dụng Giúp tăng dinh dưỡng biểu mô và thượng bì, nuôi dưỡng da. Thiếu vitamin A da dày lên, khô và có lớp sừng, vảy … Tham gia vào quá trình trao đổi protide, lipid, glucide, muối khoáng, quá trình oxi hóa phosphosyl hóa. Chống bệnh viêm loét, khô giác mạc mắt, tăng độ nhạy của mắt, chống bệnh quang gà. Vitamin A có vai trò đặc biệt trong quá trình cảm quang của mắt (độ nhậy với ánh sáng) (tác dụng chủ yếu). Sự nhạy cảm của mắt với ánh sáng phụ thuộc vào chất rodopsin (sắc tố thị giác). Rodopsin là phức của dạng aldehyte của vitamin A (Retinal dạng cis) với protein Opsin. Dưới tác dụng của ánh sáng chiếu vào võng mạc mắt, rodopsin bị phân giải thành opsin và retinal dạng trans. Trong bóng tối sẽ xảy ra quá trình ngược lại, tổng hợp rodopsin làm tăng độ nhạy của mắt với ánh sáng. Trong điều kiện bình thường sự phân giải và tổng hợp rodopsin được duy trì ở trạng thái cân bằng (vận tốc tổng hợp = vận tốc phân giải) . Tác hại khi thiếu vitamin A: Tốc độ tạo rodopsin chậm lại, thời gian thích ứng của mắt bình thường là 8 phút, với người thiếu vitamin A thời gian thích ứng là 30 – 45 phút, sinh ra quáng gà, kém nhạy với ánh sáng. Giảm tích lũy protein ở gan, giảm lượng glycogen, tăng tích lũy acid pyruvic ở não, cơ và gan do ảnh hưởng làm giảm vitamin B1, giảm lượng coenzyme A, ngừng tổng hợp albumin, huyết thanh …. 4.1.1.4. Nhu cầu Người lớn: 1 – 2.5 mg/ngày (3000 – 5300 UI). Trẻ em: 0 – 1 tuổi: 1500 UI/ ngày. 1 – 10 tuổi: 2000 – 4000 UI/ngày. Trên 10 tuổi: 4000 – 5000 UI/ngày 1 UI = 0.6 γ β – carotene 1γ = 0.001 mg = 10-6 g 4.1.2 Gạo vàng 1 Gạo Vàng 1 (đầu tiên) là một thành quả lớn trong chương trình nghiên cứu của một đội ngũ khoa học gia Thụy Sĩ và Đức quốc, dưới sự tài trợ 100 triệu đô la bởi cơ quan Rockerfeller Foundation của Mỹ. Đội ngũ này được hướng dẫn bởi Giáo sư Ingo Potrykus, Viện Kỹ thuật Liên bang ở Thụy Sĩ, và Tiến sĩ Peter Beyer, Đại học Freiburg ở Đức đã chuyển gen có khả năng tạo β – carotene vào giống lúa TP 309, với phương pháp chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Trong nội nhũ chưa trưởng thành của gạo có thể tổng hợp sản phẩm trung gian – geranylgeranyl diphosphate – được dùng để tạo ra carotene không màu bởi enzyme phytoene synthase được đưa vào trong nội nhũ gạo [P. Burkhardt và cộng sự, 1997]. Sự tổng hợp β – carotene cần có sự kết hợp của ba enzyme: phytoene desaturase, ζ – carotene desaturase và lycopene β – cyclase (các enzyme này có sẵn ở các loại thực vật có mầu đỏ, cam vàng như đu đủ, carrot …) Các nhà khoa học dùng Agrobacterium để chuyển gen tạo β – carotene vào nội nhũ gạo với 3 vectơ [C. Yanish-Perron, 1985 và M. Bevan, 1984] pB19hpc, pZPsC và pZLcyH. Hình 4.3. Ba vectơ dùng trong chuyển gen tạo β – carotene vào nội nhũ gạo Thínghiệm1:Ủphôigạochưatrưởngthành với Agrobacterium LBA4404/pb19HPC. Vectơ pB19Hpc chứa đoạn plant phytoene synthase (psy) có nguồn gốc từ cây thủy hoa vàng (Narcissus pseudonarcissus; mã số GenBank X78814) [M. Schledz và cộng sự, 1996] và đoạn gen phytoene desaturase (CrtI) có nguồn gốc từ vi khuẩn Erwinia uredovora (mã số GenBank D90087) dưới sự điều khiển của glutenin đặc trưng nội nhũ (endosperm specific glutelin – Gt1) và promoter CaMV 35S của virus khảm bông cải [M. Bonk và cộng sự, 1997]. Plasmid điều khiển sự tạo thành lycopen trong nội nhũ. Thí nghiệm 2: Ủ phôi gạo chưa trưởng thành với Agrobacterium LBA4404/pZPsC và LBA4404/pZLcyH (dùng kết hợp hai vectơ để cho kết hoàn chỉnh). Vectơ pZPsC mang gen psy và ctrI như plasmid pB19hpc, nhưng thiếu maker chọn lọc aphIV. Vectơ pZLcyH mang gen mã hóa lycopene β – cyclase (nguồn gốc từ Narcissus pseudonarcissus) mã số Gen-Bank X98796 [S. Al-Babili, 1996], được điều khiển bởi glutenin promoter CaMV 35S như một maker [M. Bonk và cộng sự, 1997]. Kết quả phân tích cho thấy việc sử dụng kết hợp hai vectơ ở thí nghiệm 2 cho kết quả tốt hơn, lượng cartene tạo ra nhiều hơn ở thí nghiệm 1 [P. Beyer, 2000], do ở thí nghiệm 1 gạo vàng ngoài tạo ra β – carotene còn có zeaxanthin, lutein, trong khi đó ở thí nghiệm 2 gạo vàng tạo chủ yếu β – carotene (vectơ chuyển vào có gen tổng hợp enzyme lycopene β – cyclase). Hình 4.4. Quá trình tổng hợp β – carotene trong gạo vàng Phytoene desaturase, ζ – carotene desaturase và lycopene β – cyclase: 3 enzyme cần thiết có trong thực vật để tổng hợp β – carotene; CtrI: có vai trò thay thế cho 3 enzyme trên trong gạo vàng. Kết quả: gạo vàng 1 có chứa 1.6 µg carotenoid tổng/g khối lượng khô hạt [P. Beyer, 2002]. Các nhà khoa học cho rằng đây là lượng quá thấp không đủ cung cấp nhu cầu cho cơ thể người hằng ngày vì thế đã ra đời gạo vàng 2. 4.1.3 Gạo vàng 2 Dr. Rachel Drake và đồng nghiệp của công ty Hạt Giống Syngenta đã nghiên cứu rất kỹ về Gạo Vàng 1 để tìm hiểu nguyên nhân tại sao loại Gạo Vàng này chứa quá ít β- carotene. Họ đặc biệt chú ý đến 2 gen của Gạo Vàng 1. Gen thứ nhất gọi là phytoene synthase được trích từ doffodils. Gen thứ hai gọi là carotene synthetase được lấy từ vi khuẩn đất, Erwinia uredovora. Bà Drake đã khám phá ra chính enzym tạo bởi gen phytoene synthase là nguyên nhân chủ yếu làm cản trở Gạo Vàng 1 sản xuất chất β – carotene. Do đó, họ cố gắng tìm kiếm gen này từ loại thảo mộc khác hơn doffodils có thể hoạt động tốt hơn trong cây lúa. Cuối cùng họ tìm thấy gen phytoene synthase trong cây bắp có thể làm cho Gạo Vàng 2 chứa đến 37 µg carotenoid tổng/g khối lượng khô hạt, trong đó có 31 µg là β – carotene (nguồn provitamine có thể sinh ra vitamine A nhiều nhất). Cơ thể con người sẽ chuyển đổi β – carotene thành vitamine A. Kết quả nghiên cứu này đã được đăng tải trên tạp chí Nature Biotechnology ngày 27/3/2005. Đoạn gen được chuyển vào ở gạo vàng 2 giống với ở gạo vàng 1, chỉ khác là gen phytoene synthase (CtrI) có nguồn gốc từ cây bắp (ở gạo vàng 1 gen phytoene synthase có nguồn gốc từ doffodils) có tác dụng tổng hợp β – carotene tốt hơn. Hình 4.5 Cấu trúc DNA dùng trong gạo vàng 2 [Paine, 2005] Glu: promoter glutenin gạo Glut01 (1568-2406 nucleotide); SSUctrI: kết hợp chức năng của đậu Hà Lan RUBISCO peptide có cấu trúc siêu phân tử dạng hạt với ctrI Erwinia uredovora. Hình 4.6 A: gạo thường; B: gạo vàng 1; C: gạo vàng 2 Chuyển gen Anti – ACO giữ hoa lâu tàn và gen CryIA(c) kháng sâu vào cây hoa cúc [2] Cơ sở khoa học và thực tiễn của việc chuyển gen vào cây hoa cúc Nhờ vào thành tựu của ngành công nghệ sinh học nói chung và công nghệ gen nói riêng nên trong hơn 1 thập kỉ qua nhiều gen quý đã được chuyển vào một số loại cây trồng nhằm tạo ra cây trồng mang các gen có những đặc tính mong muốn. Chỉ trong vòng 15 năm phát triển các nhà khoa học trên thế giới đã tạo ra hơn 60 loài cây trồng mang những gen ngoại lai đặc trưng có các đặc tính quan trọng như: kháng sâu bệnh, kháng thuốc diệt cỏ, kháng thuốc trừ sâu Bt, chịu lạnh. Ở Việt Nam, một số Viện nghiên cứu như: Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Sinh học nhiệt đới, Viện lúa Đồng bằng Sông Cửu Long… đã có những thành tựu về công nghệ gen đáng ghi nhận, tạo ra các cây trồng chuyển gen như: lúa mang gen kháng bệnh bạc lá (Phan Tố Phượng và CS), các cây họ cải mang gen kháng sâu và kháng chất diệt cỏ (Đặng Trọng Lương và CS)… Bên cạnh một số cây lương thực và cây rau được biến đổi gen, việc nghiên cứu chuyển gen vào đối tượng cây hoa nhằm kéo dài tuổi thọ của hoa cắt cũng được quan tâm. Để giải quyết vấn đề này, hiện nay, một số hướng nghiên cứu là tạo ra các giống cây ăn quả mang gen chín chậm nhờ phương pháp chuyển gen đang được tiến hành ở nhiều nơi trên thế giới. Trên thực tế, người ta chủ yếu sử dụng gen ACC oxidase(ACO) để ức chế quá trình chín quả, đặc biệt đối với các loại quả có thời gian bảo quản ngắn, khó vận chuyển như:cà chua, dưa đỏ, dâu tây, nho, đu đủ,… Ngoài ra, gen ACO cũng được ứng dụng để kéo dài thời gian tồn tại của hoa, lá, quả trên cây, ngăn cản sự già hóa… Tất cả những cơ thể chuyển gen mang gen antisense ACC oxidase hoặc ACC synthase đều được xác định là có sự giảm đáng kể quá trình chín quả: ở dưa đỏ hàm lượng ethylen nội sinh giảm đi 1% so với đối chứng không chuyển gen antisense ACO; ở cây đào , antisense ACO được chuyển gen có sự giảm mức độ ethylene và chậm lại sự hóa già của tràng hoa so với cây không được chuyển gen…; ở cà chua chuyển gin chín chậm, nhờ antisense quá trình mềm quả, thay đổi màu sắc … đều chậm hơn đối chứng rất nhiều. Do vậy, nội dung nghiên cứu của đề tài này nhằm giải quyết : Chuyển gen anti – ACO vào giống hoa cúc vàng nhằm kéo dài tuổi thọ hoa cắt của cây hoa này. Chuyển gen Bt (cryIA(c)) vào giống hòa cúc vàng nhằm tăng tính kháng sâu của cây hoa này. 4.2.2 Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 4.2.2.1 Đối tượng và vật liệu Giống hoa cúc HCT1 và HCV1 Hình 4.7 Giống hoa cúc nghiên cứu chuyển gen Plasmit pAnti – ACO 2300 Plasmit pART 27 mang gen Bt (cry IAc) Hình 4.8 Cấu trúc plasmit pART27 mang gen Bt ( cryIA (c)) 4.2.2.2 Chuẩn bị mẫu và tiền nuôi cấy trước khi biến nạp Lá non in vitro được cắt nhỏ thành kích thước 0.8 x 0.8 cm. Mẫu lá được đặt trên môi trường ( B3, MS đặc bổ sung 2,0mg/l BAP và 1,0 mg/l NAA cho giống HCV1) không có kháng sinh. Nuôi 2-3 ngày trong điều kiện nhiệt độ 250C, chiếu sáng 16h/ngày, dùng làm nguyên liệu cho biến nạp. 4.2.2.3 Phương pháp biến nạp Nuôi cấy vi khuẩn. Vi khuẩn Agrobacterium được nuôi cấy theo phương pháp của Nancy L.Mathis và Maud A. Whinchee (Mỹ). Ly tâm dịch nuôi để thu lấy tế bào vi khuẩn. Lây nhiễm và đồng nuôi cấy. Thời gian lây nhiễm: 30’; thời gian đồng nuôi cấy: 2 ngày trong tối ở 280C. Chọn lọc và tái sinh: Sử dụng kháng sinh chọn lọc thích hợp. 4.2.2.4 Kiểm tra sự có mặt của các gen ngoại lai có trong cây trồng Chọn lọc: Chủng vi khuẩn Agrobacterium LBA 4404 AA3 có mang vectơ là plasmit pART 27 có chứa gen nptII (Neomycin phosphotransferase II) và gen Cry IA (c) (kháng sâu) thay thế một phần của T-AND. Còn chủng vi khuẩn Agrobacterium LBA 4404 AA3 có mang vectơ là plasmit Anti – ACO 2300 có chứa gen nptII (Neomycin phosphotransferase II) và gen Anti-ACO (giữ hoa lâu tàn) thay thế một phần của T-AND. Vì vậy, chúng có thể được chuyển vào tế bào lá hoa cúc trong quá trình biến nạp. Gen nptII và gen CryIAC, Anti-ACO cùng được điều khiển bởi promotor CAMV 35S. Promotor này hoạt động tốt trong bộ gen thực vật. Do vậy, ở những cây được biến nạp nếu biểu hiện kiểu hình , những gen này sẽ cho các tính trạng: một là kháng Kanamycin trong môi trường chọn lọc, hai là gen CryIA(c) tạo ra protein Bt có khả năng kháng lại một số sâu hại và gen anti – ACO giữ cho hoa tươi lâu hơn. Kháng sinh Kanamycin với nồng độ 50mg/l được sử dụng làm yếu tố chọn lọc. Quá trình chọn lọc được tiến hành đối với những cụm chồi 18 ngày tuổi. Kháng sinh Kanamycin ức chế quá trình sinh tổng hợp protein ở thực vật cho nên sau 14 ngày đã xuất hiện nhiều chồi có biểu hiện bạch tạng. Sau 35 ngày, các cây sẽ biểu hiện dạng bạch tạng 100%. Mặt khác, chồi biến nạp phát triển bình thường: thân lá xanh tốt. Tính kháng này có được là do tế bào có thể đã mang gen ngoại lai ntpII được điều khiên bởi promotor CAMV35S. Khi promotor hoạt động, gen nptII sẽ mã hóa cho neomycin phosphotransferase (APH[3’]-II) làm mất hoạt tính của kháng sinh nên cây vẫn phát triển được. 4.2.2.5 Kiểm tra sự có mặt của promotor 35S trong cây cúc được biến nạp Đoạn CAMV 35S là promotor điều khiển sự hoạt động của gen cryIA(c), anti-ACO và4 gen nptII. Để xác định sự có mặt của đoạn promotor này, chúng tôi tiến hành làm phản ứng PCR với cặp mồi 35S1/35S2 để nhạn một trình tự đặc trưng của nó. Nếu mẫu AND của cây nào cho phản ứng dương tính thì chứng tỏ đoạn promotor 35S đã được chuyển thành công vào cây hoa cúc. Sau khi thực hiện phản ứng PCR, điện di sản phẩm trên gel Agarose và so sánh với marker 1kb. 4.3 Chuyển gen cryIA(b,c) kháng sâu vào cây lúa thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens[2] 4.3.1 Cơ sở khoa học và thực tiễn của việc chuyển gen kháng sâu đục thân vào cây lúa Lúa (Oryza sativar L.) là một loại cây trồng quan trọng. Hơn một nửa dân số trên thế giới sử dụng lúa như nguồn cung cấp lương thực chính. Ở Việt Nam, lúa được trồng rộng rãi và là nguồn lương thực quan trọng nhất. Tuy nhiên, năng suất lúa phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện ngoại cảnh như khí hậu, thời tiết, đặc điểm thổ nhưỡng và sâu bệnh. Hiện nay, sự phát triển của công nghệ sinh học, đặc biệt là kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, kỹ thuật di truyền và kỹ thuật phân tử cho phép các nhà tạo giống nâng cao tính chống chịu của cây trồng một cách nhanh chóng. Chuyển gen thông qua A. tumefaciens ngày càng được ứng dụng rộng rãi để chuyển một hay nhiều gen vào cây trồng. Tính ưu việt của hệ thống chuyển gen này là hiệu quả tạo cây chuyển gen bền vững cao, có thể chuyển một đoạn AND có kích thước tương đối lơn, không cần đến thiết bị cũng như hệ thống nuôi cấy phức tạp. Ngoài ra, lượng bản sao gen chuyển ít tạo thuận lợi trong việc phân tích cũng như biển hiện gen mới trong cây chuyển gen. Những năm gần đay bắt đầu có những kết quả nghiên cứu về khả năng chuyển gen thông qua A. tumefaciens ở cây lúa trong đó đã chuyển gen thành công cả ở lúa japonica và lúa indica, lúa indica có khả năng tái sinh và chuyển gen thấp hơn so với lúa japonica. Mục đích nghiên cứu của chúng tôi là dùng phương pháp chuyển gen thông qua A. tumefaciens để tạo cây lúa mang các gen kháng sâu bện đặc biệt gen kháng sâu đục thân. Vì đối với loại sâu hại này, biện pháp phòng trừ bằng dùng giống kháng không đem lại kết quả. Hơn 30 năm qua Viện Nghiên cứu Lúa quốc tế đã chọn lọc tính kháng sâu đục thân cho hơn 30.000 giống lúa nhưng chưa tìm ra giống kháng (IRRI, 1995). Do vậy, chuyển gen kháng sâu đục thân vào cây lúa bằng công nghệ gen là phuong pháp nhiều hứa hẹn, việc tạo ra các giống lúa biến đổi gen kháng sâu đục thân sẽ giúp giảm lượng thuốc trừ sâu, tiết kiệm chi phí và giảm ô nhiễm môi trường. Một số tác giả thông báo đã tạo được các dòng lúa japonica và indica chuyển gen Bt kháng được sâu đục thân màu hồng, sâu đục thân sọc, sâu đục thân màu vàng và sâu cuốn lá (Fujimote và CS, 1993; Duan và CS, 1996; Nayak và CS, 1997; Datta và CS, 1998). Wu và CS, 2002 báo cáo giống lúa japonica chuyển gen cryIA(b) tạo được tính kháng sâu đục thân ổn định ở thế hệ R6 và trong điều kiện thí nghiệm ngoài đồng. Tuy nhiên, chưa thấy có báo cáo về việc tạo dòng lúa biến đổi gen Bt trên nền giống có đặc tính nông học tốt. Hơn nữa, trong chuyển gen ở cây trồng, hệ thống chọn lọc cây biến đổi gen thông dụng nhất là sử dụng thuốc kháng sinh hoặc thuốc trừ cỏ. Các tế bào đã biến đổi gen có khả năng phát triển bình thường trong môi trường nuôi cấy có chứa chất kháng sinh (thường dùng nhất là hygromycin) hoặc chất trừ cỏ (thường dùng nhất là PPT). Việc sử dụng các hệ thống chọn lọc này gây nhiều lo ngại về tính an toàn của cây trồng biến đổi gen đối với môi trường và sức khỏe con người. Nhằm khắc phục nhược điểm này, gần đây một phương pháp chon lọc mới đã được ứng dụng, đó là hệ thống chọn lọc bằng mannose. Hệ thống chọn lọc này dựa trên việc sử dụng gen pmi- được phân lập từ Escherichia coli- làm gen chỉ thị để điều khiển tạo ra enzyme phosphomannose isomerase (Miles và Guest, 1984). Trong môi trường nuôi cấy có thêm mannose, tế bào đối chứng không mang gen pmi, enzyme hexokinase trong các tế bào làm biến đổi mannose thành mannose-6-phosphate là nguồn carbon mà tế bào cây không sử dụng nên không phát triển được. Ngược lại, các tế bào có mang gen pmi, enzyme phosphomannose isomerase được tạo ra làm chuyển hóa mannose-6-phosphate là nguồn carbon mà tế bào cây có thể sử dụng cho sự sinh trưởng phát triển. Vì vậy, chỉ có cây trồng có mang gen pmi mới có khả năng phát triển bình thường trong môi trường nuôi cây có chứa mannose, trong khi các cây không có gen pmi không phát triển được. Hệ thống chọn lọc bằng mannose đã được áp dụng trong tạo cây biến đổi gen ở cây củ cải đường (Joersbo và CS, 1998), bắp, lúa mì (Wright và CS,2001) và lúa indica (Hoa và Bong, 2003). Trong nghiên cứu này, chúng tôi tạo cây biến nạp gen cryIA(b) và cryIA(c) kháng sâu bằng Agrobacterium và xử dụng hai hệ thống chọn lọc bằng mannose và chọn lọc bằng kháng sinh trên các giống lúa có đặc tính nông học và phẩm chất tốt. Mục đích so sánh hai hệ thống chọn lọc nhằm tìm ra phương pháp tối ưu cho công nghệ chuyển gen ở cây lúa và giải pháp khắc phục các mối lo ngại về tính an toàn của cây biến đổi gen hiện nay. 4.3.2 Tạo dòng lúa biến đổi gen kháng sâu đục thân qua trung gian A. tumefaciens và chọn lọc bằng mannose 4.3.2.1 Vật liệu và phương pháp Thiết kế vector chứa gen kháng sâu cryIA(b) và cryIA(c) với gen chọn lọc là pmi Để tạo ra các dòng lúa biến đổi gen kháng sâu bằng hệ thống chọn lọc mannose, người ta đã thiết kế hai vectơ Vecto pUBB-Man : được thiết kế bằng cách dùng vector pCaCar (Hoa và ctv., 2003) nhưng gen crtI và psy trên vecto nạt được lấy ra bằng enzyme giới han Hind III + BamHIvà thay vào đó là ubiquitin promoter-cry1A(b). Để thực hiện mục tiêu này, ubiquitin-cry1A(b) từ vector pUBB (do Dr. Altosaar cung cấp) được tách ra bằng enzyme gưới hạn HindIII+ SpeI và đoạn AND gần 2,2kb có mang ubiquitin promoter được chọn. Vector pUBB cũng được cắt với SpeI+ BamHI để chọn đoạn DNA khoảng 1,9kb có mang gen cry1A(b) . Hai đoạn DNA 2,2kb và 1,9kb được gắn đồng thời vào vị trí tương ứng Hind III và BamHI trên vector pCaCar. Vector pUBB-Man chuyển vào tế bào có khả năng tiếp nhận DNA ngoại nhập (competent cell) của A. tumefaciens chủng LBA 4404 (Hoekema và CS, 1984). Hình 4.9 Sơ đồ vecto pUBB - Man Vector pUBC-Man : được thiết kế băng cách dùng vecto pCaCar (Hoa và CS, 2003) nhưng gen crtI và psy trên vecto này được lấy ra bằng enzyme gưới hạn Hind III+BamHI và thay vào đó là ubiquitin-cry1A(c) được cắt từ vector pUBC (do Dr. Altosaar cung cấp). Các công đoạn cắt, ghép được thực hiện như trên để tạo ra vector pUBC-Man và được chuyển vào A. tumefaciens chủng LBA 4404 (Hoekema và CS, 1984). Hình 4.10 Sơ đồ vecto pUBC - Man Giống lúa và phương pháp chuyển gen Phôi non của giống lúa IR64 và phôi già từ hạt gạo KDML105, Một Bụi được tách và nuôi cấy trên môi trường tạo mô sẹo. Chọn các mô sẹo có khả năng sinh phôi để chủng với vi khuẩn A. tumefaciens chủng LBA 4404. Phương pháp chuyển gen được thực hiện theo Hoa và Bong (2003). Chọn lọc được tiến hành cách nhau mỗi hai tuần trên môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) có chứa 30g/l sucrose và 25g/l mannose (D(+)-mannose 99+%, Heros Organics, Geel, Belgium) ở vòng chọn lọc thứ nhất, 15 g/l sucrose và 25 g/l mannose ở vòng chọn lọc thứ ba. Các cây kháng mannose được kiểm tra lại bằng xét nghiệm chlorophenol red (CR) (Hoa và Bong, 2003) trước khi chuyển trồng ra đất. Tách DNA và phân tích Southern blot DNA được trích từ lá theo phương pháp của McCouch và CS (1998). 10 micrograms DNA được cắt đoạn với EcoRI và BamHI (hai điểm cắt) để xác định sự hiện diện của gen Cry1A(b) đối với dòng lúa chuyển gen bằng vecto pUBB-Man và cắt đoạn với KpnI (một điểm cắt) để xác định số copy. Tương tự DNA của các dòng lúa chuyển gen bằng vector pUB-Man được cắt đoạn với EcoRI và BamHI hoặc XhoI (hai điểm cắt) để xác định sự hiện diện của gen cry1A(c) và cắt với KpnI (1 điểm cắt) để xác định số copy. DNA cắt đoạn được chạy điện đi qua 0,8% agarose gel trước khi chuyển bằng mao dẫn và cố định trên màng nylong (Hybond- N+, Amersham). Gen cry1A(c) và cry1A(b) được đánh dấu bằng DIG (Boeheringer, Rotkreuz, Switzer1) được dùng làm mẫu dò lai (probe). Lai, rửa, phát hiện và xác định gen được thực hiện theo phương pháp của Wiinn và ctv. (1996). Kết quả chuyển gen kháng sâu đục thân vào lúa Kết quả nghiên cứu cho thấy chọn lọc bằng mannose cho hiệu quả chuyển gen tương đối cao. Các cây phát triển trên môi trường mannose được kiểm định có mang gen pmi qua xét nghiệm PCR và phân tích bằng phương pháp Southern blot.Các dòng lúa kháng sâu được tạo ra bằng ứng dụng hệ thống chọn lọc mannose sinh trưởng phát triển bình thường. Nghiên cứu cũng cho thấy lợi điểm của phương pháp biến đổi gen bằng Agrobacterium. Gen chuyển được gắn vào bộ gen lúa theo phương thức đơn giản ở một locus, không có sự tái sắp xếp, điều này liên qua đến tính ổn định trong biểu hiện của gen chuyển ở các dòng biến đổi gen. Kết quả các cây được chuyển nạp gen sống và phát triển trên môi trường chọn lọc có chứa mannose được kiểm định bằng phân tích Southern khẳng định có sự hiện diên của gen cryIA( c) hoặc cryIA(b) Gen kháng sâu cryIA(c ) hoạt động hữu hiệu ở lúa tạo tính kháng sâu đục thân cao, các dòng biến đổi gen kháng sâu đạt tỉ lệ cao và tính kháng sâu hơn hẳn giống chuẩn. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN Người ta đã tạo thành công loại gạo vàng chứa provitamin A bằng phương pháp chuyển gen góp phần bổ sung Vitamin A trong khẩu phần ăn hàng ngày. Tuy nhiên, gạo vàng không phải là biện pháp duy nhất để làm giảm bớt bệnh thiếu vitamin A cho nhiều trẻ em và phụ nữ trên thế giới. Gạo vàng giàu vitamin A dự kiến sẽ được cấp phép vào năm 2012 [3] Đối với cây hoa cúc, người ta đã hoàn thiện được qui trình tái sinh cây từ mẫu lá và bước đầu chuyển gen anti – ACO và gen Bt cryIA(c) vào hai giống hoa cúc HCV1 và HCT1. Đồng thời cũng xác định có mặt gen ngoại lai anti – ACO và gen Bt trong các cây hoa cúc chuyển gen bằng PCR và lai phân tử AND Southern blot. Đã thu được cây hoa cúc mang gen anti – ACO và cây hoa cúc mang gen Bt. Đối với cây lúa chuyển gen kháng sâu, kết quả các cây được chuyển nạp gen sống và phát triển trên môi trường chọn lọc có chứa mannose được kiểm định bằng phân tích Southern khẳng định có sự hiện diên của gen cryIA( c) hoặc cryIA(b) Chuyển gen thông qua Agrobacterium và chọn lọc bằng mannose đảm bảo tạo ra cây chuyển gen ”sạch”, không chứa gen kháng kháng sinh. Kết quả tạo ra những dòng lúa kháng sâu đục thân. Trong tương lai, Việt Nam có thể sẽ đưa cây trồng công nghệ sinh học vào canh tác trong 1 hoặc 2 năm tới. Đây là điều đáng mừng cho nền nông nghiệp nước ta. Hiện nay, .sản phẩm từ sinh vật chuyển gen nói chung và từ thực vật chuyển gen nói riêng vô cùng phong phú và đa dạng, điều đó chứng tỏ khả năng tuyệt vời của ngành công nghệ sinh học có thể giúp nhân loại giải quyết các vấn đề khó khăn lớn cho sức khỏe con người cũng như trong lĩnh vực nông nghiệp. Tuy nhiên, cần phải theo dõi các rủi ro tiềm tàng trong các công tác thử nghiệm và sản xuất các sản phẩm biến đổi di truyền liên hệ đến sức khỏe con người và môi trường. Tài liệu tham khảo Tài liệu trong nước 1.Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2005. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản Giáo Dục. 2. Lê Trần Bình, 2005, Nghiên cứu áp dụng công nghệ gen để tạo cây chuyển gen nâng cao sức chống chịu đối với sâu bệnh và ngoại cảnh bất lợi 3. Trần Hồng Hà., 2004, An toàn sinh học: đánh giá và quản lý rủi ro các sinh vật biến đổi gen, Nhà xuất bản Bộ tài nguyên và môi trường. 4. Nguyển Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Lê Thị Thủy Tiên, Huỳnh Ngọc Oanh, Cao Cường., 2002, Công nghệ gen, Nhà xuất bản đại học Quốc gia TP.HCM. 5. Nguyễn Đức Lượng, 2006, Công nghệ vi sinh tập 2, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP.HCM. 6. Đồng Thị Thanh Thu, 2004. Giáo trình sinh hóa cơ bản, Tủ sách trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên. 7. Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp. 2005, Công nghệ sinh học tập 2, Nhà xuất bản Giáo dục. Tài liệu nước ngoài 8. Al-Babili S., E. Hobeika, P. Beyer, 1996. Plant Physiol, vol 112,1398. 9. Bernard R.Glick, Jack J.Pasternak, 2003. Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA. 3rd Edition. ASM Press, USA. 10. Bevan M., 1984. Nucleic Acids Res., vol 12, 8711. 11. Beyer P., Ye, X., Al-Babili, S., Klöti, A., Zhang, J., Lucca, P. & Potrykus, I.2000. Engineering the provitamin A (ß-carotene) biosynthetic pathway into (carotenoid- free) rice endosperm. Science, vol 287, 303-305. 12. Beyer P., Salim Al-Babili, Xudong Ye, , Paola Lucca, Patrick Schaub, Ralf Welsch và Ingo Potrykus, 2002. Golden Rice: Introducing the ß-Carotene Biosynthesis Pathway into Rice Endosperm by Genetic Engineering to Defeat Vitamin A Deficiency. J. Nutr. Vol 132, 506-510. 13. Burkhardt P. et al., 1997. Plant J., vol11, 1071. 14. Bonk M. et al., 1997. Eur. J. Biochem, vol 247, 942. 15. Cartagena Protocol on Biosafety to the Convention on Biological Diversity,2000, Adopted at the Convention on Biological Diversity, 29/1/2000, Montreal, Canada. 16. Clive Jame, 2007. Brief 37: Global Status of Commercialized Biotech/GM CropsSambrook, J. va, ISAAA. 17. Grant J. P., 1991. The State of the World’s Children. Oxford Univ. Press, Oxford. 18. Makrides SC, 2003. Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. Elsevier Science B. V. USA. 19. Sambrook, J. và Russel, D., 2002. Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3rd. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 20. Schledz M. et al., 1996. Plant J, vol 10, 781. 21. Sommer A,. 1988. J. Nutr, vol 119, 96. 22. Yanish-Perron C., J. Vieira, J. C. Messing, 1985. Gene, vol33, 103 Tài liệu web 23. 24. 25. 26. 27. 28.