Đề tài Tìm hiểu và thực tập qui trình định đanh vi khuẩn staphylococcus aureus, heamophilus influnenae và klebsiall peneumoniae trên bệnh phẩm đàm tại bệnh viện nhân dân Gia Định

l Red trong môi trường thửnghiệm làm môi trường chuyển sang màu đỏ. • Phenylalanine deaminase (PAD) Một số vi khuẩn thuộc bộ lạc Proteeae như Proteus, Morganella, Providencia có khả năng sản xuất men deaminase khử amin của amino acid phenylalanine thành một keto acid, chất này kết hợp với ion sắt trong thuốc thử Ferric chloride 10% để cho ra màu xanh lá cây. • Thử nghiệm bile esculine Thử nghiệm này giúp phân biệt vi sinh vật dựa trên khả năng thủy phân liên kết glucoside trong esculine thành esculetin và glucose tự do khi có sự hiện diện của muối mật. Esculetin tạo ra sẽ phản ứng với muối sắt trong môi trường thử nghiệm tạo thành hợp chất màu đen hay nâu đen. • Thử nghiệm khả năng sinh indol Trang 18 Thử nghiệm này phát hiên vi sinh vật sản xuất men tryptophanase khi nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường canh trypton. Phản ứng thủy phân trytophan tạo thành Indole, chất này kết hợp với Para-dimethylamino benzaldehyde trong thuốc thử Kovác cho ra một hợp chất muối dimethyl ammonium màu đỏ. • Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer) Thử nghiệm VP nhằm mục đích phát hiện acetoin, một sản phẩm trung tính trong quá trình trao đổi glucose trong tế bào vi sinh vật. Chất này bị oxid hóa trong môi trường kiềm biến đổi thành diacetyl, dưới sự xúc tác của alpha-naphthol để cho một phức chất màu hồng đỏ. • Thử nghiệm khả năng biến dưỡng malonate Thử nghiệm nhằm xác định khả năng của vi sinh vật sử dụng malonate như là nguồn carbon duy nhất trong môi trường. Các vi sinh vật biến dưỡng malonate sẽ sửdụng chu trình glyoxylic acid để biến dưỡng năng lượng. Nếu không sử dụng được malonate, chất này có tác dụng như một chất diệt khuẩn. Các vi sinh vật có khả năng biến dưỡng malonate đồng thời có khả năng sử dụng ammonium là nguồn đạm duy nhất. Do vậy khả năng biến dưỡng malonate được ghi nhận nhờ sự phóng thích NH3 làm kiềm hóa môi trường và chuyển màu của chỉ thị pH. • Thử nghiệm KIA Thử nghiệm này nhằm phát hiện khả năng sử dụng các nguồn carbonhydrate, khả năng sinh H2S và sinh khí trong môi trường KIA chứa hai loại đường lactose 1% và glucose 0.1%. Sau khi nuôi cấy chủng này 18-24 giờ, có ba trường hợp có thể xảy ra: + Nếu vi sinh vật chỉ lên men glucose, phần trên bề mặt của ống thạch nghiêng trở nên có pH kiềm và phần sâu trong ống có pH acid. Điều này có thể giải thích do visinh vật sau khi sử dụng hoàn toàn lượng glucose ít ỏi trên bề mặt mội trường, chúng tiếp tục dị hóa pepton trong môi trường giải phóng NH3 làm phần bề mặt của môi trường có pH kiềm. Ở phần sâu trong môi trường với điều kiện thiếu ôxi, glucose được lên men kỵ khí sinh ra các acid hữu cơ làm giảm pH của môi trường.Nếu trong môi trường có chất chỉ thị phenol red thì trên mặt thạch nghiêng sẽ có màu đỏ và phần sâu sẽ có màu vàng. Trang 19 + Nếu vi sinh vật có thể sử dụng cả glucose và lactose, toàn bộ môi trường trở nên có pH acid, vi sinh vật không cần phải sử dụng đến pepton để tạo năng lượng. + Nếu vi sinh vật không sử dụng được cả hai nguồn carbon này, thì pepton được sử dụng để biến dưỡng thu năng lượng và vật chất cần cho sự tăng trưởng của vi sinh vật. Tuy nhiên, do pepton chỉ được biến dưỡng trong điều kiện hiếu khí nên hiện tượng kiềm hóa chỉ diễn ra trên phần của bề mặt môi trường và chỉ phần này mới trở nên có màu đỏ.Trong khi đó, phần môi trường sâu trong ống nghiệm sẽ không có hiện tượng đổi màu. Trong các trường hợp nêu trên, sự lên men đường tạo ra các sản phẩm khí được nhận biết nhờ các khí này đẩy ống thạch lên trên hay làm vỡ thạch. Thử nghiệm này cũng có thể phát hiện khả năng sinh H2S do thành phần môi trường có chứa sodium thiosulphate. Vi sinh vật khử sulfate có thể khử hợp chất này để giải phóng H2S. Khí H2S tạo ra sẽ được phát hiện dựa vào phản ứng tạo kết tủa màu đen FeS giữa H2S và ion Fe2+ của chỉ thịammonium citrate hiện diện trong môi trường. •Thử nghiệm tính di động Vi sinh vật di động thường là các vi sinh vật có tiêm mao phân bố tại các vi trí khác nhau trên tế bào vi sinh vật. Trong môi trường thử nghiệm tính di động thường bổ sung triphenyltetrazolium chloride để phát hiện dễ dàng vị trí hiện diện của tế bào vi sinh vật trong môi trường do hợp chất này khi vào bên trong tế bào sẽ bị khử thành formazan có màu đỏ. • Thử nghiệm decarboxylase Thử nghiệm này giúp xác định khả năng một vi sinh vật tạo enzyme carboxylase thủy phân được các axít amin đặc hiệu để xúc tác phản ứng loại bỏ nhóm carboxyl. Các enzyme carboxylase chỉ được cảm ứng tổng hợp khi môi trường có tính acid và chứa chất cảm ứng đặc hiệu.Phản ứng tạo CO2 trong điều kiện kỵ khí, CO2 sinh ra làm giảm pH của môi trường và được ghi nhận qua sự đổi màu của chỉ thị pH. Trang 20 Thử nghiệm MR Thử nghiệm nhằm phân biệt vi sinh vật dựa vào sự khác biệt trong qusa trình taaoj và duy trì các sản phẩm có tính acid từ sự lên men glucose. Vi sinh vật lên men glucose tạp và duy trì sản phẩm acid, làm đổi màu thuốc thử. Nếu sản phẩm acid tiếp tục biến thành các sản phẩm trung tính, không làm đổi màu thuốc thử -chất chỉ thị màu Ph môi trường là methyl red đỏ -môi trường thử nghiệm: môi trương VP-MR -Sau thử nghiệm: môi trường chuyển sang đỏ :+ Môi trường không đổi màu: - Thử nghiệm catalase Dùng để phân biệt vi khuẩn hiếu khí và vi khuẩn kỵ khí. Vi sinh vật hiếu khí có enzyme catalase, có khả năng phân giải H2O2 thành H2O và O2 Hóa chất : H2O2 30% được giữ lạnh Nhỏ một giọt sinh khối lên H2O2: Nếu sủi bọt : + Nếu không sủi bọt :- (BỔ SUNG THỬ NGHIỆM VÀ HÌNH ẢNH) Cách tiến hành Bộ hóa chất bao gồm: • Đĩa giấy oxidase (OXI): thực hiện thử nghiệm oxidase - Nhỏ một giọt nước muối sinh lý vô trùng lên lame. Trang 21 - Dùng kẹp giấy lấy một đĩa giấy oxidase nhúng vào giọt nước muối sinh lý cho vừa đủ ướt và đặt lên lame. - Dùng vòng cấy vô trùng lấy khúm khuẩn quệt lên đĩa giấy oxidase. - Đọc kết quả sau 10 giây: phản ứng dương tính khi đĩa giấy oxidase xuất hiệnmàu tím đen; âm tính khi đĩa giấy oxidase không có màu tím đen. • Thử nghiệm trên ống nghiệm đã có chứa các môi tường thử nghiệm tương ứng - Dùng tăm bông vô trùng lấy khúm khuẩn cho vào nước muối sinh lý vô trùng đểlàm thành huyền dịch có độ đục McFarland 2,0. - Dung que cấy vòng lấy dịch từ ống pha nước muối sinh lý có chứa vi sinh vật cấy vào các ống chưa các thử nghiệm tượng ứng. - Ủ 35-37oC/12-24 giờ. -Đọc kết quả theo bảng 2.1 Tương tự cho thử nghiệm sinh hóa đối với bộ API trên 10 giếng thử nghiệm -cách dùng: dùng Micropipetcho vào mỗi giếng 200 µl huyền dịch, đậy nắp. - Ủ 35-37oC/12-24 giờ. -Đọc kết quả theo bảng 2.1 Bộ thử nghiệm API Trang 22 Bảng 2.1 Hướng dẫn đọc kết quả phản ứng sinh hóa Giếng số Ký hiệu Thử nghiệm sinh hóa Thuốc thử thêm vào Kết quả thử nghiệm (+) (-) 1 GLU Lên men glucose Vàng tím 2 NIT Khử nitrat thành nitite Tìm nitite Đỏ/hồn/xuất hiện vòng 3 phút Càng nhạt 3 ONPG Thủy giải ONPG Vàng nhạt 4 URE Sinh urease Đỏ cánh sen Càng/đỏ nhạt 5 PAD Phenyl alanine deaminase FeCl3 Xánh lá (xuất hienj khi bỏ thuốc thử) Vàng nhạt 6 CIT Sử dụng citrate Xanh biển (có ánh xnah biển) Xanh lá/ vàng 7 ESC Thủy giải Esculine Đen( có màu từ đen nhạt qua đen đậm) Không đen 8 H2S Sinh H2S Đen (xuát hienj dưới đáy Không Trang 23 giếng, mất màu khi nhỏ kovac) đen IND Sinh indol Kovac Đỏ bề mặt (đọc sau 1 phút) vàng bề mặt 9 VP Voges- prokauer KOH+napthto l Đỏ(xuất hiện 5 phút) Vàng nhạt 10 MLO Sử dụng malonate Xanh biển Xanh lá/vàng Đọc kết quả định danh hệ thống định danh phân chia các thử nghiệm sinh hóa theo nhóm như trong hình 2.1 3.Phương pháp cấy mẫu đàm (PHẦN NÀY CHƯA NẮM RÕ CẦN TÌM HIỂU KỸ) Trước hết làm tan đàm trong dung dịch nước muối sinh lý vô trùng vừa pha thêm NALC (SPUTAPREP-QT kit của Nam Khoa) và sau đó pha loãng đàm. Tiến hành như sau: - Trong một tube 15 ml vô trùng (loại Falcon) đã chứa 10 ml nước muối sinh lý vô trùng (NS), cho thêm vào 50 mg NALC (N-Acetyl-L-Cystein), tức là toàn bộ bột NACL chứa trong một tube Eppendorf. Lắc nhẹ cho tan hoàn toàn. Dung dịch NS có NALC này chỉ dùng trong ngày và đủ cho 2 – 3 mẫu. Luôn luôn bảo quản tube dung dịch NALC đã pha trong tủ lạnh 4 o C . - Lấy một thể tích đàm cần nuôi cấy cho vào một tube vô trùng nắp vặn chặt. Thêm vào một thể tích như vậy dung dịch NS có NALC vừa mới pha. Lắc nhẹ cho đến khi đàm tan trong dung dịch này. Như vậy chúng ta đã có đàm pha loãng 1/2 . Sau khi đàm tan hoàn toàn, pha loãng tiếp mẫu đàm này thành 1/10 trong nước muối sinh lý vô trùng. Như vậy chúng ta đã có mẫu đàm pha loãng 1/20. - Tiến hành cấy định lượng mẫu đàm đã pha loãng 1/2 trên các hộp thạch máu cừu ( BA ), thạch nâu máu ngựa có Bacitracin (CAHI) và thạch MC bằng khuyên cấy định lượng 10 µl (0,01 ml) Trang 24 và 1 µl (0,001 ml) hay dùng micropipett để hút 10 µl và 1 µl cấy lên mặt thạch. Với mẫu đàm pha loãng 1/20, dùng khuên cấy 1 µl hay dùng micropipet để hút 1 µl cấy lên mặt thạch và cũng như trên 3 loại hộp thạch như trên. Phương pháp cấy định lượng trên mặt thạch được thực hiện như cấy định lượng nước tiểu. Sau khi cấy, các hộp thạch BA và CAHI được ủ trong khí trường CO2 còn các hộp thạch MC được ủ trong khí trường bình thường, nhiệt độ ủ là 35 – 37 o C, thời gian ủ qua đêm hay tối đa 24 giờ. Đọc kết quả và định lượng các vi khuẩn mọc trên các hộp thạch như trong bảng trình bày sau: Bảng 1 : Cách đọc kết quả định lượng các loại vi khuẩn trong mẫu đàm dựa trên số lượng các loại khóm vi khuẩn mọc trên các hộp thạch. Hộp thạch Mẫu đàm pha loãng Vòng cấy định lượng Thể tích đàm được cấy Số vi khuẩn được định lượng 1 1/2 10 µl 5 µl 2N x 10 2 / ml 2 1/2 1 µl 0,5 µl 2N x 10 3/ ml 3 1/20 1 µl 0,05 µl 2N x 10 4/ ml Trang 25 Sơ đồ cấy định lượng mẫu đàm trên các hộp thạch N là số khóm của một loại vi khuẩn đếm được trên các hộp thạch. Để có con số định lượng của một loại vi khuẩn thì chúng ta nên lấy số trung bình của các kết quả. Ví dụ: ứng với các khóm nghi ngờ K. pneumoniae, kết quả trên hộp thạch MC1 là 200 khóm, lượng vi khuẩn K. pneumoniae trong 1 ml đàm là 40000 CFU/ml (2 x200 x 102); trên hộp thạch MC2 là 15, lượng vi khuẩn / ml đàm là 30000 CFU/ml (2 x 15 x 103); và trên hộp thạch MC3 là 3, lượng vi khuẩn là 60000 CFU/ml (2 x 3 x104). Như vậy kết quả cuối cùng lượng vi khuẩn K. pneumoniae trong mẫu đàm sẽ được tính là (40000 + 30000 + 60000)/3 = 43333 CFU/ml. Nếu các hộp thạch 1 và 2 có vi khuẩn quá nhiều (> 200 khóm 2), chúng ta chỉ nên đếm số khóm trên hộp thạch 3. Bàn luận và kết quả - Các vi khuẩn có lượng ≥ 1000 CFU/ml thì phải định danh và làm kháng sinh đồ. Có nghĩa là tiến hành định danh và làm kháng sinh đồ bất cứ khóm vi khuẩn nào mọc được trên hộp thạch 2 và 3 hay có số lượng ≥ 5 trên hộp thạch 1. Trả lời lâm sàng cả kết quả định lượng là bao nhiêu vi khuẩn đã định danh và làm kháng sinh đồ để lâm sàng có thể tùy nghi sử dụng.(theo TS.Phạm Hùng Vân) -Tuy vậy, tùy từng Labo xét nghiệm chọn các vi khuẩn có lượng từ 103 – 107 CFU/ml để tiến hành làm kháng sinh đồ. 2.3.4. Phương pháp làm kháng sinh đồ với kỹ thuật KIRBY 2.3.5. Chuẩn bị môi trường. Môi trường được chuẩn bị theo hướng dẫn của từng hãng sản xuất: bằng cách cân chính xác lượng thạch Muller-Hinton khô và hòa tan vào trong nuớc cất trung tính, kiểm tra pH trước khi hấp tiệt khuẩn. Trong khi hấp, tránh để môi trường ở nhiệt độ cao và thời gian dài hơn sự cần thiết, vì điều đó sẽ làm giảm khả năng đệm và thay đổi pH của môi trường. Sau khi để nguội môi Trang 26 trường tới 50 – 600C (có pH khoảng 7,2 – 7,4) có thể thêm máu hoặc các sản phẩm của máu, lắc cho đều và đỗ vào đĩa petri đã vô khuẩn với độ dày 3,5 – 4,5 mm (có nghĩa 25 ml thạch cho một đĩa Petri đường kính 90 mm hoặc 40 ml thạch cho đĩa có đường kính 110mm v.v…). Các đĩa này phải đặt trên mặt phẳng nằm ngang để đảm bảo cho độ sâu của thạch ở mọi vị trí trong đĩa bằng nhau. Để đĩa môi trường nguội ở nhiệt độ phòng rồi bảo quản trong túi nilon ở tủ lạnh 4 – 80C. Các đĩa thạch này được dùng trong vòng 7 ngày kể từ ngày chuẩn bị. Các đĩa thạch có máu hoặc chế phẩm của máu phải được kiểm tra vô khuẩn trong tủ ấm qua đêm mới được sử dụng. Ria cấy vi khuẩn: Sau khi vi khuẩn thuần khiết được nuôi cấy qua đêm trên các môi trường không có chất ức chế, dùng que cấy lấy 5 – 10 khuẩn lạc (hoặc 3 vị trí khác nhau, nếu vi khuẩn ở trong ống) để tránh phải các vi khuẩn đột biến, nghiền vào một ống PBS (hoặc nước muối sinh lý) vô trùng, lắc đều bằng máy lắc Votex, so sánh với ống độ đục chuẩn Mc Farland 0,5 (nếu đục quá thì cho thêm PBS hoặc nước muối sinh lý; ngược lại nếu không đủ đục thì cho thêm vi khuẩn), ta được hỗn dịch vi khuẩn ≈ 108 CFU/ml. Dùng que tăm bông vô trùng nhún vào hỗn dịch vi khuẩn trên ép vào thành ống cho bớt nước, rồi ria đều khắp với những đường bắt chéo nhau 1200 lên mặt thạch đã được để trong tủ ấm cho khô (nhưng không quá 30 phút). Chuẩn bị khoanh giấy kháng sinh: Lấy ống khoanh giấy kháng sinh từ tủ lạnh để ở nhiệt độ phòng 30 phút cho thăng bằng nhiệt độ giữa trong và ngoài ống. Đặt các khoanh giấy đã chọn lựa với từng vi khuẩn được thử sao cho mặt của khoanh giấy áp sát vào mặt môi trường, mép ngoài của khoanh giấy cách thành trong của đĩa 15 mm và khoanh nọ cách khoanh kia 20mm. Để đĩa thạch ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút cho kháng sinh khuếch tán, rồi để môi trường trong tủ ấm 350C qua đêm. Các đĩa thử với các chủng H.influenzae, S. pneumoniae và phải để trong tủ ấm có 5 -10% CO2. Đọc kết quả: Trang 27 Dùng thước đo đường kính vùng ức chế, dựa vào tiêu chuẩn của từng hãng sản xuất khoanh giấy kháng sinh, ta có mức độ nhạy cảm, trung gian và kháng của từng loại vi khuẩn. ( BIỆN LUẬN TÍNH KHÁNG *ĐƯỜNG KÍNH VÔ KHUẨN*) 2.4. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Mẫu bệnh phẩm đàm Đàm tươi thu nhận được từ các bệnh nhân có bệnh lý liên quan đến đường hô hấp như suy hô hấp, viêm phổi do vi trùng, thoe dõi tràn khí màn phổi, cường giáp,… Trong mẫu đàm có chứa nhiều tác nhân đích gây bệnh như chủng Staphylococcus aureus, Haemophilus influenza, Klebsiella pneumoniae … 2.4.1. Haemophilus influenzae a. lịch sử và tên gọi H. influenzae được phân lập lần đầu bởi Richard Pfeiffer từ đờm của một bệnh nhân bị viêm phổi - cúm trong đại dịch cúm năm 1890. Lúc đó, vi khuẩn này được hiểu lầm là nguyên nhân gây ra bệnh cúm nên được gọi là trực khuẩn cúm (Influenzae bacteria). Mãi cho đến khi đại dịch cúm xảy ra trong những năm 1918-1919, người ta mới biết H. influenzae chỉ là thành viên của hệ vi khuẩn ký sinh ở đường hô hấp trên và không phải lúc nào cũng gây bệnh. Đến năm 1933, khi phát hiện ra virus cúm là căn nguyên của bệnh cúm, vai trò của H. influenzae mới được làm sáng tỏ: virus cúm gây ra bệnh cúm, còn Haemophilus influenzae chỉ là vi khuẩn “ăn theo” (second invader) sau khi các tế bào đường hô hấp đã bị tổn thương nặng nề bởi virus cúm. Vì vậy, vi khuẩn này có tên là H. influenzae được xuất phát từ nhu cầu đòi hỏi môi trường giàu chất dinh dưỡng, đó là các yếu tố phát triển có ở máu (Haemophilus: ưa máu), đặc biệt là yếu tố X (hemin) và yếu tố V (NAD hoặc NADP). Thêm vào đó, vi khuẩn này lại có mối liên quan lịch sử với bệnh cúm (Influenzae: bệnh cúm). Cho nên, vi khuẩn được gọi tên là như vậy . Đặc điểm sinh học đặc trưng của Haemophilus influenzae typ b Trang 28 b. Hình thái và cấu trúc H. influenzae là một trong những loài vi khuẩn nhỏ nhất, còn được gọi là cầu trực khuẩn vì vi khuẩn này có dạng trực khuẩn ngắn (1,0–1,5m) nhưng uốn cong ở hai đầu trông như hình cầu. Tuy nhiên, khi vi khuẩn này ở dịch não tuỷ hình thể có thể kéo dài ra gấp vài lần so với chiều dài thông thường (Hình 1.1). H. influenzae có đặc tính bắt màu Gram âm, không di động và không hình thành nha bào. Thành tế bào vi khuẩn này có cấu trúc bề mặt lipopolysaccharide– protein tương tự như thành của các vi khuẩn Gram âm khác. Ngoài ra, H. influenzae được phân loại thành 2 nhóm: loại không vỏ polysaccharide (non-typeable không xác định được typ huyết thanh) và loại có vỏ (typeable xác định được typ huyết thanh). Loài H. influenzae (Hi) có vỏ bọc được phân loại tiếp tục theo các typ huyết thanh từ a đến f tuỳ thuộc vào đặc tính kháng nguyên của vỏ polysaccharide do gen qui định . Vỏ bọc typ b là một dạng trùng hợp của ribose, ribitol và phosphate, được gọi là polyribosyl - ribitol - phosphate (PRP). Polysaccharide bề mặt này liên quan mạnh mẽ đến tính gây độc của vi khuẩn, đặc biệt là H. influenzae typ b (Hib), là nguyên nhân của nhiều trường hợp nhiễm trùng hệ thống nghiêm trọng bao gồm cả viêm màng não mủ (trên 90% các ca nhiễm khuẩn lan tràn do Hib). Hình Hình thể của H. influenzae typ b trên tiêu bản nhuộm gram dịch não tuỷ dưới kính hiển vi quang học. Trang 29 Trên thực tế lâm sàng, nếu nhuộm gram bệnh phẩm dịch não tủy từ bệnh nhân mà trên vi trường cho thấy nhiều vi khuẩn gram (-) nhỏ, đa hình thái thì đây là dấu hiệu rất quan trọng gợi ý cho chẩn đoán sớm viêm màng não mủ do H. influenzae typ b . Sức đề kháng H. influenzae typ b là loại vi khuẩn chịu đựng rất kém với các yếu tố ngoại cảnh. Trong bệnh phẩm, chúng chết nhanh chóng nếu để ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp, để khô hoặc lạnh giá. Các chất sát khuẩn thông thường tiêu diệt vi khuẩn này một cách dễ dàng . Vì vậy, bệnh phẩm để chẩn đoán vi sinh nên được vận chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 2h, hoặc không quá 6h ở nhiệt độ phòng thí nghiệm (24 - 28oC). Nếu là tăm bông phải giữ trong môi trường vận chuyển (bảo quản), có thể giữ ở nhiệt độ 4 - 8oC tối đa 24h trong môi trường vận chuyển. c. Đặc điểm nuôi cấy .  Điều kiện nuôi cấy H. influenzae là loại vi khuẩn khó nuôi cấy. Chúng không mọc trên các trường nuôi cấy thông thường, chỉ mọc khi trong môi trường đã có sẵn cả hai yếu tố X và V. Yếu tố X có lẽ không phải là một chất thuần tuý mà là hỗn hợp của các chất màu có chứa sắt (như hemin và hematin), khi không có hai yếu tố này trong môi trường nuôi cấy thì chúng không phát triển được. H. influenzae dùng yếu tố X để tổng hợp một số enzym như catalase, peroxidase và các cytochrom của hệ thống vận chuyển điện tử. Máu và các sản phẩm của máu, kể cả hemin là nguồn nguyên liệu truyền thống được sử dụng để sản xuất yếu tố X. Thạch máu (5%) có khả năng cung cấp đủ lượng yếu tố X mà H. influenzae cần thiết phát triển. Khi dùng hematin tinh chế thì nồng độ cần thiết là 0,1 – 1,0 g/ml. Yếu tố V là NAD hoặc NADP mặc dù có mặt trong máu, nhưng một phần do chúng nằm bên trong tế bào. Mặt khác, trong máu của nhiều loài động vật có NADase, nên trong máu tươi không có NAD ở dạng tự do. Trong thạch chocolate, NAD được giải phóng ra khỏi tế bào và NADase bị phá huỷ. Khi dùng NAD tinh chế, nồng độ cần thiết là 0,2 - 1,0 g/ml. Trang 30 H. influenzae hiếu khí, đòi hỏi CO2 (2-5%) khi mới phân lập. Mọc tốt trên môi trường chocolate và Levinthal ở nhiệt độ khoảng 23-390C, tối ưu là 370C. Không mọc được trên thạch máu cừu; nếu mọc trên các loại thạch máu khác (ví dụ máu thỏ) thì không gây tan máu và khuẩn lạc nhỏ hơn nhiều so với trên chocolate trong cùng các điều kiện nuôi cấy khác. Cũng trên thạch máu, người ta thấy các khuẩn lạc H. influenzae mọc xung quanh các khuẩn lạc Staphylococcus aureus bội nhiễm thì rất to, trong khi đó ở những vùng xa thì hoặc là không mọc, hoặc là rất bé. Hiện tượng này gọi là hiện tượng “vệ tinh” (satellitism), do khả năng tiết ra yếu tố V của vi khuẩn bội nhiễm đó giúp H. influenzae phát triển được trên thạch máu thông thường. Các môi trường nuôi cấy và đặc điểm khuẩn lạc Để nuôi cấy H. influenzae, có 3 loại môi trường có thể được được sử dụng: + Thạch chocolate có hoặc không có 300g Bacitracin/ml môi trường (có tác dụng ức chế các vi khuẩn khác, đặc biệt là liên cầu) để tìm H. influenzae. Đây là loại môi trường thường được sử dụng nhất trong nuôi cấy và phân lập H. influenzae. + Thạch máu thỏ tươi 7%: Sau khi nuôi cấy vi khuẩn vào môi trường phân lập, ủ ấm trong khí trường 5% CO2 (nếu không có tủ ấm CO2, môi trường nuôi cấy được đặt trong một chuông thủy tinh và đốt 1 cây nến trong quả chuông này. Sau khi ngọn nến tắt, khí trường bên trong quả chuông có thể là 3 - 5% CO2) ở 37oC trong thời gian 18 - 24h. Hình. Hiện tượng khuẩn lạc "vệ tinh" của Haemophilus influenzae xung quanh các khuẩn lạc Staphylococcus aureus Trang 31 (1) (2) Hình: (1). Khuẩn lạc H. influenzae mọc trờn mụi trường chocolate ; (2). Khuẩn lạc H. influenzae mọc trờn mụi trường thạch máu thỏ tươi 7%. Sau 18 - 24h, quan sát các khuẩn lạc của H. influenzae mọc trên môi trường với đặc điểm: khuẩn lạc nhỏ kích thước khoảng 1-2 mm, tròn, vồng nhẹ và hơi trong, óng ánh khi chiếu sáng và khụng gây tan huyết. Sau 16 - 18h nuôi cấy, Haemophilus influenzae phát triển thành những khuẩn lạc bóng mờ, vồng nhẹ, đường kính từ 1- 2mm và khụng gõy tan huyết. Vi khuẩn Hib luôn có vỏ, khuẩn lạc thường sáng bóng, nhày ướt, óng ánh khi ánh sáng chiếu vào và có đường kính lớn hơn. Ngoài ra, môi trường nuôi cấy vi khuẩn thuần nhất thường có mùi hăng đặc biệt (hăng indole). Sau 24 - 48h, trạng thái mất vỏ xuất hiện, tính óng ánh biến mất, vi khuẩn tự ly giải và có thể tính chất bắt màu Gram thay đổi. Trên môi trường lỏng, Haemophilus influenzae thường phát triển làm đục môi trường. Tình trạng mất vỏ xảy ra sớm hơn trên môi trường thạch, vì vậy nếu muốn xác định vỏ cần chọn thời điểm nuôi cấy thích hợp (18h). d. Đặc điểm phân biệt các loài khác nhau của Haemophilus Trang 32 Những đặc điểm này cũng cần phân biệt với các loại Heamophilus khác ở những đặc điểm sau đây: Tính chất Loài Tan huyết Cần yếu tố X Cần yếu tố V Cần CO2 H. influenzae - + + + H. parainfluenzae - - + - H. hemolyticus + + + - H.parahemolyticus + - + ± H. aphrophilus - + - + H. paraphrophilus - - + + Bảng ???: Những đặc điểm sinh học sinh học để phân biệt H. influenzae với các Haemophilus khác. e. Tính chất sinh hóa đặc trưng của H. influenzae và phương pháp xác định Tính chất sinh hóa đặc trưng của H. influenzae là nhu cầu đòi hỏi bắt buộc 2 yếu tố phát triển là X và V trong môi trường nuôi cấy. Tính chất này có thể được xác định bằng một trong các thử nghiệm sau : - Thử nghiệm với yếu tố X và V: Sử dụng một đĩa môi trường thạch dinh dưỡng Trypticasein Soya, cấy vi khuẩn phân lập được nghi ngờ là H. influenzae lên một nửa đĩa thạch bằng cách ria dày theo 3 hướng. Sau đó, đặt các khoanh giấy X, V và XV lên vùng nuôi cấy, khoảng cách giữa các khoanh giấy là 1,5 - 2,0 cm. Ủ ở 37oC với khí trường 5% CO2 qua đêm rồi đọc kết quả: + Nếu vi khuẩn chỉ mọc xung quanh khoanh giấy XV hoặc giữa 2 khoanh giấy X và V thì đó chính là H. influenzae, nếu chỉ mọc xung quanh V thì đó là H. parainfluenzae. + Nếu vi khuẩn chỉ mọc xung quanh khoanh giấy X và XV thì đó là H. aphrophilus. + Nếu vi khuẩn mọc xung quanh khoanh giấy XV hoặc giữa 2 khoanh giấy X và V, có gây tan huyết thì đó là H. hemolyticus. Trang 33 Hình: Thử nghiệm với yếu tố X, V bằng 2 khoanh giấy X, V cho kết quả là vi khuẩn đòi hỏi bắt buộc phải có cả 2 yếu tố X, V cho sự phát triển. Hình Thử nghiệm với bằng 3 khoanh giấy X, V và XV, cho thấy vi khuẩn đòi hỏi bắt buộc phải có cả 2 yếu tố X và V cho sự phát triển. Trang 34 Hình: Vi khuẩn chỉ đòi hỏi bắt buộc phải có cả 1 yếu tố V cho sự phát triển (H. parainfluenzae) - Thử nghiệm "vệ tinh": Hình: Thử nghiệm "vệ tinh" dương tính Được thực hiện bằng cách cấy vi khuẩn phân lập được nghi ngờ là H. influenzae lên cả đĩa thạch hoặc một nửa đĩa thạch máu thỏ (5%) với các đường ria dày theo 01 hướng. Sau đó, bằng kỹ thuật vô trùng, dùng que cấy lấy khuẩn lạc S. aureus chuẩn quốc tế cấy một đường thẳng lên bề mặt đĩa thạch máu vuông góc với các đường đã nuôi cấy vi khuẩn nghi ngờ H. influenzae. Để đĩa thạch mỏu đã nuôi cấy vào tủ ấm ở 37oC, 5 - 10% CO2 khoảng 18 - 24 giờ thì đọc kết quả (hình 1.6). Trang 35 + Nếu trên đĩa thạch mỏu chỉ xuất hiện các khuẩn lạc của vi khuẩn thử nghiệm mọc xung quanh đường cấy của vi khuẩn S. aureus thì được chẩn đoán là thử nghiệm "vệ tinh" dương tính (vi khuẩn S. aureus có khả năng gây tan máu, do đó sẽ giải phóng ra yếu tố V từ trong tế bào hồng cầu. Kết quả môi trường thạch máu ban đầu chỉ có yếu tố X, nay có thêm yếu tố V) + Nếu trên đĩa thạch máu xuất hiện những khuẩn lạc mọc hầu hết trên môi trường hoặc không thấy vi khuẩn thử nghiệm mọc, được chẩn đoán là thử nghiệm "vệ tinh" âm tính. - Xác định nhu cầu đòi hỏi bắt buộc 2 yếu tố phát triển X và V bằng đĩa thạch Haemophilus Quad ID: Hình: Đĩa thạch Haemophilus Quad ID Đĩa thạch Haemophilus Quad ID được chia ra thành 4 phần (như hình 1.7): 1/4 đĩa thạch với môi trường có chứa haemin (yếu tố X), 1/4 đĩa thạch với môi trường có chứa NAD (yếu tố V); 1/4 khác của đĩa thạch với môi trường có chứa cả 2 yếu tố X và V; 1/4 đĩa thạch còn lại của với môi trường thạch máu ngựa 5% dùng để phân biệt giữa H. hemolyticus (cũng đòi hỏi bắt buộc phải có 2 yếu tố phát triển là X và V, nhưng lại có tính chất gây tan máu) với H. influenzae. Tiến hành thử nghiệm: + Pha chủng vi khuẩn nghi ngờ H. influenzae thuần vào canh thang Trypticase soy hoặc nước cất để có độ đục tương đương với 0,5 Mc Farland. + Sử dụng que cấy vô trùng lấy đầy một ăng huyền dịch vi khuẩn cần xác định cấy zích zắc lên từng 1/4 đĩa thạch Haemophilus Quad ID, bắt đầu từ 1/4 có chứa yếu tố V và kết thúc ở Trang 36 1/4 có chứa thạch máu (chú ý: cấy toàn bộ môi trường ở từng 1/4 đĩa thạch, bắt đầu từ phía thành đĩa tới trung tâm của đĩa thạch. Chọc que cấy vào phần 1/4 đĩa có chứa thạch máu để xác định tính chất gây tan máu yếu). + Ủ môi trường nuôi cấy ở 37oC với khí trường 5% CO2 qua đêm rồi đọc kết quả bằng cách quan sát vùng thạch máu để xác định tớnh chất gây tan máu và các vùng khác để xác định vi khuẩn có mọc hay không. Hình: Đĩa thạch Haemophilus Quad ID: cho thấy vi khuẩn thử nghiệm mọc trên cả 2 vùng: vùng 1/4 của đĩa thạch với môi trường có chứa cả 2 yếu tố X và V và 1/4 đĩa thạch lại của với môi trường thạch máu ngựa 5% và có kốm theo tan máu. Vì vậy, vi khuẩn thử nghiệm ở đây là: H. hemolyticus. Chỉ có yếu tố X Chỉ có yếu tố V Gồm có yếu tố X và V Môi trường thạch máu ngựa (có các khuẩn lạc gây tan máu) Trang 37 Nếu vi khuẩn thử nghiệm mọc trên cả 2 vựng: vựng 1/4 của đĩa thạch với môi trường có chứa cả 2 yếu tố X và V và 1/4 đĩa thạch với môi trường thạch máu ngựa 5% nhưng không cú kèm theo tan máu thì đây là H. influenzae. Nếu vi khuẩn thử nghiệm mọc trên cả 2 vựng: vựng 1/4 của đĩa thạch với môi trường có chứa cả 2 yếu tố X và V và 1/4 đĩa thạch chứa môi trường thạch máu ngựa 5% nhưng cú kèm theo tan máu, đây là H. hemolyticus (không phải H. influenzae). 2.4.2. Vi khuẩn Klebsiella pneumoniae a. Đặc điểm phân loại Năm 1884, nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram (1853-1938) đã phát triển kĩ thuật nhuộm Gram để phân biệt Klebsiella pneumoniae và Streptococcus pneumoniae. Klebsiella được đặt theo tên nhà vi khuẩn học người Đức thế kỉ 19, Edwin Klebs. Dựa vào độ tương đồng di truyền, chi Klebsiella được chia làm 8 loài: Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Klebsiella planticola, Klebsiellaterrigena, Klebsiella mobilis (Enterobacter aerogenes), Klebsiella ornithinolyticavà Klebsiella variicola. Klebsiella pneumoniae lại được chia làm 3 loài phụ làKlebsiella pneumoniae, Klebsiella ozaenae và Klebsiella rhinoscleromatis. Sự phânchia này dựa theo sự khác nhau trong quá trình phát sinh bệnh chứ không phải dựavào khoảng cách di truyền. Trong chi Klebsiella, Klebsiella pneumoniae làthành viên quan trọng nhất về bệnh học và đã trở thành một trong những tác nhângây nhiễm khuẩn bệnh viện nghiêm trọng trong những năm gần đây Đặc điểm phân loại của Klebsiella pneumoniae: Giới: Bacteria Ngành : Proteobacteria Lớp: Gammaproteobacteria Bộ: Enterobacteriales Trang 38 Họ: Enterobacteriaceae Chi: Klebsiella Loài: Klebsiella pneumoniae b. Đặc điểm hình thái, sinh hóa và phân bố Klebsiella pneumoniae là trực khuẩn Gram âm, không di động, có vỏ polysacharide đặc trưng. Lớp áo này giúp vi khuẩn tránh được hàng rào phòng vệcủa tế bào chủ. Hình 1.1 Hình kính hiển vi quét của khuẩn lạc K. pneumoniae K. pneumoniae sống kị khí tùy ý, có khả năng lên men lactose. K. pneumoniae có phản ứng indole âm và có khả năng tăng trưởng với cảmelezitose và 3-hydroxybutyrate . Vi khuẩn này có mặt khắp nơi trong tự nhiên như ở đất, nước, nước thải, các sản phẩm thực vật, những thức ăn có hàm lượng đường và acid cao.Nó có thể gây ra những thay đổi phá hoại đến phổi của con người. K. pneumoniae có thể gây ra bệnh viêm phổi Klebsiella . Chúng gây ra các thay đổi phá hoại phổi người và xuất huyết với tế bào chết ( hoại tử ) mà đôi khi sản xuất, dày, đờm, máu chất nhầy (currant thạch đờm) Trang 39 Klebsiella pneumoniaephân lập được từ các bệnh phẩm trên người như viêm phổi, apxe phổi, viêm phổi, viêm màng não, nhiễm trùng tiểu, nhiễm trùng huyết. c. Các nhân tố gây bệnh Klebsiella pneumoniae biểu hiện 2 loại kháng nguyên bềmặt: kháng nguyên O có bản chất lipopolysaccharide và kháng nguyên vỏ K có bản chất polysaccharide. Có khoảng hơn 80 kháng nguyên K và 9 kháng nguyên O. Cảhai kháng nguyên này là cơ sở cho sự phân nhóm huyết thanh và đều góp phần vào quá trình phát sinh bệnh. Dựa vào tính biến động trong cấu trúc của những kháng nguyên này, người ta lại phân loại thành nhiều kiểu huyết thanh khác nhau. Độc tính của tất cả các loại huyết thanh dường như là như nhau. Klebsiella pneumoniaecó khả năng đông tụ hồng cầu nhờ những lông lipi. Để vượt qua hàng rào phòng vệ của tế bào chủ, ngoài việc thoát khỏi sự thực bào do hoạt động của các bạch cầu đa nhân, vi khuẩn phải còn phải tìm cách thoát khỏi ảnh hưởng của các chất diệt khuẩn trong huyết thanh. Hoạt tính diệt khuẩn chủyếu qua trung gian các protein bổ thể. Bổ thể được hoạt hóa khi có hay không có kháng thể đặc hiệu nhưng đều dẫn tới hoạt hóa protein C3, hình thành opsonin C3b và sản phẩm cuối cùng là protein C5b-C9. Protein này tạo ra các kênh xuyên màng ở màng ngoài tế bào vi khuẩn làm cho Na+ được bơm vào trong, thay đổi ấp suất thẩm thấu bên trong tế bào vi khuẩn. Cho tới nay, cơ chế giúp vi khuẩn kháng huyết thanh vẫn chưa rõ., giả thuyết được đưa ra là do lớp vỏpolysaccharide bao bọc và che lớp lipopolysaccharide nằm ở dưới hoặc do chuỗi bên của kháng nguyên O xuyên qua lớp vỏ tạo thành cấu trúc bề mặt không hoạt hóa bổ thể . Để tăng trưởng được trong mô tế bào chủ, vi khuẩn phải được cung cấp đủsắt. Đây là nhân tố thiết yếu cho sự tăng trưởng của vi khuẩn, có chức năng xúc táccác phản ứng oxi hóa khử trong quá trình truyền điện tử. d. Đặc điểm gây bệnh và tình hình đề kháng kháng sinh Klebsiella pneumoniae là tác nhân đứng thứ 2 sau E.coli gây nhiễm khuẩn bệnh viện và cộng đồng. Chúng có thể gây bệnh viêm phổi, apxe phổi, viêm màng phổi và những nhiễm trùng ngoài Trang 40 phổi như viêm ruột, viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết, nhiễm khuẩn đường tiết niệu. Yếu tố nguy cơ để nhiễm các chủng này ở bệnh viện là do bệnh nhân thời gian nằm viện kéo dài, hệ miễn dịch suy yếu, nằm chung giường với người nhiễm bệnh hay thực hiện những thủ thuật xâm lấn như đặt ống thông tiểu, đặt nội khí quản,…Tuy nhiên, nhiễm khuẩn bệnh viện do Klebsiella tăng cao chủyếu do việc sử dụng kháng sinh làm gia tăng những chủng kháng thuốc.Tính đề kháng kháng sinh của chúng là rất cao. 2.4.3. STAPHYLOCOCCUS AUREUS  Đặc điểm sinh học. Nguồn gốc_vị trí phân loại:  Nguồn gốc: Staphylococcus có nguồn gốc từ tiếng Latinh Staphylo (chùm nho) Coccus (hạt). Năm 1871 Recklinghausen thu nhận cầu khẩu trong thận chết do nhiễm khuẩn huyết. Staphylococcus aureus do Robert Koch phát hiện vào năm 1878 phân lập từ mủ u nhọt và Loius Pasteur (1880) đều nghiên cứu về tụ cầu từ lịch sử đầu của ngành vi sinh vật học. Ngày 9 tháng 4 năm 1881, bác sĩ Alexander Ogston đã trình bày tại hội nghị lần thứ 9 Hội Phẩu Thuật Đức một báo cáo khoa học trong đó ông sử dụng khái niệm tụ cầu khuẩn (Staphylococcus), trình bày tương đối đầy đủ vai trò của vi khuẩn này trong các bệnh lý sinh mủ lâm sàng Năm 1882 Rosenbach nghiên cứu và đặt tên cho cầu khuẩn tạo khuẩn lạc màu vàng là Staphylococcus pyrogen aureus.(tl:luanvan.co/luan-van/tong-quan-ve-staphylococcus-aureus- 2021/) Năm 1926 Julius von Daraniy là người đầu tiên phát hiện mối tương quan giữa sự hiện diện hoạt động men coagula huyết tương của vi khuẩn với khả năng gây bệnh của nó. Tuy nhiên mãi đến nay 1948, phát hiện này mới được chấp nhận rộng rãi  Vị trí phân loại: + Giới: Prokaryote Trang 41 + Ngành : Firmicutes + Lớp: Firmibacteria + Họ: Microccoceas + Giống: Staphylococcus + Loài : aureus 1.2. Hình thể Staphylococcus aureus hay còn gọi là tụ cầu vàng, là một loại tụ cầu khuẩn cực kì nguy hiểm. www.vinphaco.vn Staphylococcus aureus là cầu khuẩn Gram dương, hình cầu đường kính 0,5 – 1,5µm, có thể đứng riêng lẻ, thường đứng thành từng đôi, hoặc từng chùm không đồng đều như chùm nho (tiếng Hy lạp Staphyle nghĩa là chùm nho). Staphylococcus aureus Không di động, không sinh nha bào, thường cư trú trên da và màng nhày động vật có máu nóng. 1.3 tính chất: Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi, có cả sự trao đổi chất, hô hấp và lên men. Chúng cho phản ứng catalase dương tính và có thể sử dụng nhiều loại carbonhydrat khác nhau tạo acid lactic nhưng không sinh hơi. Khuẩn lạc trên môi trường tryptic soy agar thường có màu kem hoặc màu cam. Thành tế bào chứa peptidoglican hình thành một hang rào vững chắc xung quanh tế bào và acid teichoic giúp duy trì môi trường ion thích hợp cho màng cytoplasma, đồng thời góp phần bảo vệ bề mặt tế bào tụ cầu. S.aureus có thể mọc ở nhiều điều kiện, môi trường khác nhau, nhưng tốt nhất là 30-370C và pH gần trung tính chúng kháng được Trang 42 với chất diệt trùng, độ khô nóng và có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15% NaCl (Scott E Martin và Jonh J Iandola, 2000). 1.4. Phân loại 1.4.1 Dựa vào kháng nguyên. -Vách của vi khuẩn có 1 số loại kháng nguyên: + Acid teichoic: Là kháng nguyên ngưng kết, làm tăng tác dụng hoạt hoá bổ thể, giúp vi khuẩn bám vào niêm mạc mũi. + Protein A: Có hầu hết ở các chủng của s. aureus, ức chế hoạt động của bạch cầu, ngăn quá trình opsonin hoá và thực bào, làm vi khuẩn bám dính tế bào để gây bệnh. Protein A gắn với mảnh Fc của IgG, ứng dụng điều này làm phản ứng đồng ngưng kết để xác định nhiều loại kháng nguyên vi sinh vật. -Vỏ polysaccarid: Có ở một số chủng, mang tính đặc hiệu kháng nguyên và có tác dụng chống thực bào. Các kháng nguyên này cho phản ứng ngưng kết với kháng thể đặc hiệu, dựa vào đó chia tụ cầu thành các typ huyết thanh (18 typ), ít sử dụng trong phòng xét nghiệm vi sinh lâm sàng. 1.4.2. dựa vào phage Sự kí sinh của phage trên vi khuẩn có tính đặc hiệu cao đặc biệt là S.aureus, vì đây là vi khuẩn gây nhiểm trùng cao nhất ở người Các S. aureus có thể bị ly giải bởi phage đặc hiệu, có nhiều phage, xếp vào 4 nhóm I,II, III, IV. Nhóm I: 29, 52, 52A, 79, 80. Nhóm II:3A, 3B, 3C, 55, 71. Nhóm III: 6, 7, 42E,47, 53, 54, 75, 77, 83A, 84, 85. Nhóm IV: 42D Định typ bằng phage đáp ứng yêu cầu về dịch tễ học hơn xác định typ huyết thanh vì tụ cầu có tính di truyền luôn thay đổi nên tính kháng nguyên thay đổi. Định typ bằng phage giúp xác định nguồn gốc của vụ dịch. 1.6. Các yếu tố độc lực Trang 43 1.6.1. Các Protein bề mặt: Các protein này thúc đẩy việc bám dính vào tế bào chủ. Tạo protein gắn kết fibrinogen và fibronetin làm kích thích sự kết dính các khối máu và mô bị chấn thương. 1.6.2. Các dung huyết tố: Tác động lên màng hồng cầu nhiều động vật khác nhau. -Dung huyết tố α: Chỉ có ở tụ cầu nguồn gốc từ người, làm tan máu thỏ, gây nhiễm độc tế bào lympho, đại thực bào, gây hoại tử da, gây độc tế bào thần kinh. Dung huyết tố α là ngoại độc tố nên dưới tác dụng của tác nhân lý hoá biến thành giải độc tố làm vacxin. -Dung huyết tố β: Chỉ có ở tụ cầu nguồn gốc từ động vật làm tan máu cừu, gây độc cho tế bào tuyến sữa, gây chết chuột và thỏ, chưa xác định vai trò của nó ở người. -Dung huyết tố γ: Làm tan máu thỏ, cừu, người, gây chết chuột lang. -Dung huyết tố δ: Làm tan máu thỏ, người, cừu, khỉ. -Dung huyết tố ε: Chỉ có ở tụ cầu da, làm tan máu khi phối hợp với dung huyết tố β. 1.6.3. Các độc tố. -Độc tố diệt bạch cầu (leucocidin): Tác động trực tiếp trên thành tế bào bạch cầu đa nhân, đại thực bào làm phá huỷ tế bào. -Độc tố ruột (enterotoxin): Phát hiện được các độc tố ruột: А, B, C1, C2, D, E độc lực mạnh gây ngộ độc thức ăn, viêm đại tràng (xảy ra ở người điều trị kháng sinh kéo dài). Độc tố ruột có 2 đặc tính: Vững bền với nhiệt độ và vững bền với các enzym tiêu hoá. -Độc tố gây sốt: Có 3 typ độc tố gây sốt A, B, C, gây sốt, ảnh hưởng tới phân bào và tham gia vào shock. -Độc tố gây bong da: Thường tác động trên trẻ mới sinh gây bong da do chúng làm tách các lớp của biểu bì. -Độc tố gây shock: Độc tố TSST (toxic shock syndrome toxin) 1.6.3. Các enzym -Coagulase: Bản chất là protein, hoạt động như prothrombin làm fibrinogen thành fibrin, làm đông huyết tương người, thỏ. Các tế bào vi khuẩn khoác fibrin đề kháng với sự opsonin hoá và thực bào. Coagulase thường có ở S. aureus, tạo huyết cục trong tĩnh mạch và gây nhiễm khuẩn huyết. -Fibrinolysin (Staphylokinase) làm phân huỷ fibrin nên chủng có enzym này phát triển trong cục máu sẽ làm vỡ và tạo những mảnh nhỏ theo mạch máu gây tắc mạch và nhiễm khuẩn lan rộng. Phát hiện enzym này bằng cách tìm khả năng gây phân huỷ fibrin bị kết tủa bởi sức nóng. Trang 44 -Enzym chuyển hoá đường manit. S. aureus có khả năng chuyển hoá đường manit, phát hiện trên môi trường schapman (môi trường gồm có đường manit, natriclorua nồng độ 6,5%, chỉ thị màu đỏ phenol), vi khuẩn lên men đường làm chuyển màu môi trường từ đỏ da cam sang màu vàng). -Catalase phân huỷ hydrogen peroxide tạo bởi qúa trình thực bào (H202 -> H20 + 02), tính chất này giúp phân biệt tụ cầu với các cầu khuẩn Gram dương khác. -Hyaluronidase phá huỷ tổ chức liên kết do phân huỷ acid hyaluronic giúp vi khuẩn lan rộng. -Desoxyribonuclease (DNase) làm phân huỷ acid desoxyribonucleic dẫn đến tổn thương tổ chức. -Penicillinase làm phá huỷ cấu trúc, làm mất tác dụng của penicillin.  Khả năng gây bệnh trên bệnh phẩm đàm Tụ cầu cư trú trên người lành (20-40%), gây bệnh khi có điều kiện thuận lợi. bệnh do tụ cầu có thể lan truyền trực tiếp và gián tiếp như qua không khí, đồ dùng, dụng cụ, thức ăn… Trong đàm Staphylococcus aureus thường gây ra các bệnh như viêm mũi họng, amydal, viêm xoang… đặc biệt và nguy hiểm nhất là bệnh về hô hấp: viêm khí quản, viêm phổi hoại tử, áp xe phổi biến chứng tràn khí màng phổi, tràn khí trung thất, tràng khí dưới da, tràn mũ màng phổi.  Các phương pháp phát hiện Staphylococcus aureus 3.1. Phương pháp nuôi cấy Trước khi nuôi cấy phải tiến hành nhuộm gram để đánh giá mẩu đàm. Các loại môi trường nuôi cấy: Môi trường thạch máu _ Blood Agar (BA): Khuẩn lạc có màu kem trắng, tiêu huyết. www.benhphoi.com Trang 45 Trên môi trường thạch thường: Có khả năng sinh sắc tố, khuẩn lạc có màu vàng chanh S.aureus không mọc trên môi trường Mac Conkey Agar (BA) 3.2. Nhuộm gram Trêm lame S.aureus có hình cầu, bắt màu tím (gram dương) Trang 46 4.3 Phương pháp thử nghiệm sinh hóa Sơ đồ định danh Staphylococcus aureus Cầu khuẩn Gram (+) Streptococci Staphylococci Micrococci Micrococci Staphylococci S.aureus S.intermedius S.saprophyticus S.aureus S.intermediuss (-) (+) Oxidase (+) (-) Coagulase (-) Polymycin B 300UI (R) Trang 47  Thử nghiệm Catalase: thử nghiệm dung để phân biệt tụ cầu và Micorococci (catalase dương) với các cầu khuẩn gram dương khác.Phản ứng catalase âm không có hiện tượng sủi bọt khí. + faculty.mc3.edu  Thử nghiệm Oxidase: phân biệt Staphylococi (âm tính) với Micrococci (dương tính). Phản ứng Oxidase dương tính có hiện tượng đổi màu xanh, âm tính không đổi màu (thiếu hình)  Thử nghiệm Coagulase: dung để phân biệt tụ cầu vàng với các tụ cầu khác. Tụ cầu vàng do có coagulase nên gây đông huyết .Những vi khuần khác không có coagulase không gây đông huyết tương. Ghi chú: MSA (Manitol Salt Agar); URE ( Urease); ODC (Ornithindecarboxylase) Pb (Polymycin B 300UI, R<10mm) Trang 48 old.infectionnet.org Thử nghiệm lên men mannitol: Nuôi cấy tụ cầu vào môi trường chapman, sau 24-48 giờ tụ cầu gây bệnh sẽ làm cho màu của môi trường chuyển từ màu đỏ sang màu vàng do tụ cầu vàng có khả năng lên men mannitol, sinh acid sẽ làm đổi màu chất chỉ thị đỏ phenol từ đỏ sang vàng). Trang 49  Đặt polimycin trên môi trường Mueller Hinton Agar (MH ): do vòng ức chế R<=10 là Staphylococcus aureus. ( thiếu hình) 4. Kỹ thuật kháng sinh đồ đối với Staphylococcus aureus : Mueller-Hinton Agar Bảng kháng sinh cần đặt: Vị trí Tên kháng sinh 1 E 2 CD 3 GM 4 OX 5 VA 6 PG 7 CIP 8 LEV 9 DXT 3. NỘI DUNG THỰC TẬP 3.1. DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ 3.1.1. Dụng cụ - Kính hiển vi điện tử Trang 50 - Tủ cấy vi sinh (Sanyo, Nhật) - Tủ hút ẩm - Máy ly tâm (Hitachi, Nhật) - Máy vortex - Micropipet, đầu tuyp, eppendorf, que cấy vòng, que cấy thẳng, que cấy vô trùng, tăm bông vô trùng, khay nhựa 12 giếng Hóa chất - Bộ thuốc nhuộm Gram: Crystol Violet, Lugol, ethanol 95%, dung dịch safranin 0.5%, nước cất. -Đĩa thạch MC, MHA ,(Nam Khoa, Việt Nam). - Đĩa đặt môi trường BA,MC,URI 3.2. PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU BỆNH PHẨM Đàm, dịch hút đàm qua mũi, dịch hút rửa phế quản qua nội soi và cấy đàm, bệnh phẩm chứa đàm. 3.2.1. Chỉ định - Các trường hợp viêm nhiễm đường hô hấp dưới như viêm phổi, viêm phế quản cấp, cơn cấp của viêm phế quản mạn. - Nên cho chỉ định lấy mẫu trong các trường hợp bệnh nhân có một trong các triệu chứng sau: ho có máu hay ho nhiều, đau ngực, khó thở, có dấu hiệu đặc phổi như có ran ẩm và rít; giảm tiếng rì rào phế nang; gõ đục khi kháng phổi; phim phổi có thâm nhiễm; có nang; có mủ. Trang 51 3.2.2. Thời điểm lấy mẫu - Càng sớm ở giai đoạn sớm của bệnh càng tốt. Nghĩa là tiến hành lấy mẫu ngay sau khi có chẩn đoán lâm sàng. - Nên lấy mẫu trước khi bệnh nhân dùng kháng sinh hệ thống. 3.2.3. Cách lấy mẫu đàm Đàm - Trước hết cho bệnh nhân súc miệng sạch, không súc miệng bằng nước súc miệng có chất sát trùng. - Hướng dẫn bệnh nhân hít thật sâu rồi hãy cố khạc đờm ra. Có thể giúp bệnh nhân khạc đờm bằng cách vỗ nhẹ vào lưng.Bệnh nhân khạc đờm vào lọ vô trùng, rộng miệng, nắp chặt (dùng lọ vô trùng lấy mẫu).Tránh lẫn nước bọt.  Dịch hút đàm trên khí quản qua đường mũi (Naso – Tracheal – Aspirate) - Trường hợp bệnh nhân không thể khạc được đờm, như ở trẻ em. - Dùng dụng cụ đặc biệt gọi là bộ hút khí quản (tracheal suction set), là một ống nghiệm gắn với một nắp vặn trên đó có 2 vòi, một nối với một ống thông mềm, một nối với máy bơm chân không đang hoạt động và trên vòi này có một van hông đang mở. Trước hết người mẹ hay thân nhân bệnh nhi ẵm ngửa bé vào lòng, giữ đầu hơi ngửa ra sau. Đưa ống thông qua mũi bệnh nhi cho đến khi đầu ống chạm vào phần trên khí quản, lúc đó bệnh nhi sẽ có phản xạ ho. Ngay lúc bệnh nhi ho, dùng tay bịt chặt van hông lại, nhờ vậy đờm được hút vào ống thông. Sau đó rút ống thông khỏi mũi bệnh nhi, rồi cho đầu ống thông vào một lọ chứa 5 ml nước muối sinh lý vô trùng. Nước muối sinh lý sẽ rửa đàm dính ở thành ống thông vào ống nghiệm.Tắt máy bơm, tháo nắp có vòi khỏi ống nghiệm rồi đậy chặt ống nghiệm bằng một nắp vặn khác có trong bộ dụng cụ.Gửi mẫu đến ngay phòng thí nghiệm. Trang 52 - Nếu không có dụng cụ này, có thể dùng ống chích 60ml, nối một đầu với ống thông mềm để lấy đờm theo cách như trên, nhưng thay vì dùng bơm chân không, hút đờm bằng tay với ống chích trên.  Dịch hút phế quản qua nội soi (BW = Broncho – Washing) - Do bác sĩ chuyên khoa lấy khi đang nội soi, cho vào tube vô trùng nắp chặt rồi gửi ngay đến phòng thí nghiệm.  Các bệnh phẩm khác - Như dịch hút xuyên khí quản, chọc hút phổi, do các bác sĩ chuyên khoa lấy và gửi ngay đến phòng thí nghiệm để khảo sát. 3.3. ĐÁNH GIÁ MẪU BỆNH PHẨM ĐÀM Vì đàm cũng như dịch hút đàm trên khí quản qua đường mũi (NTA) hay dịch rửa phế quản qua nôi soi (BW) có thể bị ngoại nhiễm bởi các vi khuẩn thường trú vùng họng, do đó cần phải đánh giá trước khi tiến hành nuôi cấy. - Tốt nhất các mẫu sau khi nhận phải được tiến hành khảo sát ngay, không chậm trễ. Nếu vì một lý do gì đó chưa thể khảo sát ngay được, có thể giữ mẫu trong tủ lạnh, nhưng không quá 2 giờ. 3.3.1. Khảo sát đại thể mẫu đàm Ghi nhận tính chất đại thể của mẫu đờm, các tính chất sau: - Có nhiều nước bọt không? - Có mủ (purulent) không, thường màu xanh hay vàng đục? - Có mủ nhầy (muco –purelent) không? - Có nhầy (mucoid) không? Trang 53 Mẫu có lẫn nhiều nước bọt là mẫu không thích hợp để cấy. 3.3.2. Khảo sát vi thể - Dùng một que tre, gỗ, vòng cấy hay pipet Pastuer lấy một ít đờm từ vùng nhày mủ, trải đều thành một phết 2 x 3cm trên một tấm lam. Để khô tự nhiên, sau đó gắn nhẹ trên lửa. -Thực hiện phết nhuộm gram. - Tiến hành đánh giá chất lượng bệnh phẩm trên 10 vi trường với vật kính 10X. Đếm số lượng bạch cầu đa nhân và tế bào biểu mô trong 1 vi trường theo thang điểm Muray & Washington. Bảng...: Thang điểm Muray & Washington. Xếp loại Số tế bào / 1 vi trường Chất lượng bệnh phẩm Quyết định Tế bào biểu mô Tế bào bạch cầu 1 >25 <10 Nhiễm Mẫu không đạt, lấy mẫu lại 2 >25 10 - 25 Nhiễm 3 >25 >25 Nhiễm 4 10 - 25 >25 Chấp nhận Mẫu đạt, tiến hành cấy 5 25 Tốt 3.4. TIẾN HÀNH ĐỊNH DANH CÁC VI KHUẨN 3.4.1. Quy trình định danh H. influenzae. Trang 54 Sơ đồ 1: Quy trình định danh Haemophilus influenzae 3.4.2. giải thích quy trình  Mẫu đàm. Thu nhận mẫu bệnh phẩm đàm: Nếu là người lớn, đàm được lấy vào buổi sáng sớm, ho và khạc sâu, đàm được giữ ở hộp vô khuẩn rồi chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 2 -6 giờ (nhiệt độ phòng thí nghiệm). Dịch tỵ hầu (mũi-họng): nếu bệnh nhân không khạc được hoặc là trẻ nhỏ dùng tăm bông cán mảnh mềm lấy chất dịch ở ngã ba mũi - họng theo đường mũi (dịch tỵ hầu): đưa tăm bông vào sâu bằng một nửa khoảng cách tính từ cánh mũi đến dái tai cùng phía, vê nhẹ rồi rút ra. Chú ý, nếu chưa vào đủ độ sâu đã có vật cản không cố lấy mà phải làm lại ở mũi bên kia. Tăm bông Hình 1: dụng cụ lấy mẫu đàm Trang 55 phải đảm bảo không dễ bị tụt đầu bông vào khí quản và cán làm bằng kim loại mảnh, mềm không gỉ không dễ gẫy khi thực hiện thao tác. Chất dịch hô hấp lấy bằng máy hút chân không nhẹ: cách này thay thế cho cách ngoáy tỵ hầu ở trên. Dùng ống thông plastic nhỏ mềm đưa sâu qua lỗ mũi một khoảng cách bằng 1/2 khoảng cách từ đỉnh mũi đến ống tai ngoài của bệnh nhân để hút dịch. Ngoáy họng: đè lưỡi, dùng tăm bông vô khuẩn đã được làm ẩm bằng nước muối sinh lý (vô khuẩn) chà sát nhẹ 2 hốc amidan, thành sau họng (sau lưỡi gà). Tránh không được chạm vào lưỡi, răng, mặt trong má và lưỡi gà. Sau đó phải cắm tăm bông vào môi trường vận chuyển.  Đánh giá mẫu đàm. Tất cả các mẫu bệnh phẩm đàm thu nhận được đều được đánh giá cả về đại thể và vi thể trước khi đem nuôi cấy vào môi trường. Các bước thực hiện đánh giá mẫu đàm như đã trình bày ở mục 3.3. (ĐÁNH GIÁ MẪU BỆNH PHẨM ĐÀM). Sau khi đánh giá mẫu đàm ở vật kính x10 ta chuyển qua vật kính x100 có giọt dầu soi kính, quan sát vùng nhầy nhớt và quanh tế bào bạch cầu để ghi nhận sự hiện diện của vi khuẩn. Qua việc quan sát ta có thể nghi ngờ loại vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm theo bảng ….  Cấy vào môi trường. Hình 2: mẫu bệnh phẩm đàm được đánh giá trước khi nuôi cấy Trang 56 Các mẫu đàm đạt tiêu chuẩn được tiến hành cấy vào môi trường thạch nâu máu ngựa bổ sung Bacitracin (CAHI ), ủ ở 37 , CO2 5% trong 24-48h và tiến hành định danh.  Định danh Trên môi trường thạch CAHI, H. influenzae mọc thành khúm đục nhẹ, hơi dẹt đường kính khoảng 1mm rất dễ nhận diện. kết hợp với quan sát hình dạng, kích thước, sự bắt màu thuốc nhuộm khi nhuộm Gram, ta có thể định danh cách dễ dàng vi khuẩn H. influenzae  Kháng sinh đồ Thực hiện đặt các đĩa kháng sinh đồ theo bảng sau: STT Tên kháng sinh đồ Ký hiệu 1 SAM 2 CXM 3 CRO 4 AUG 5 cefaclor CFC 6 ciprofloxacin CIP 7 tetracycline TET 8 Ampicillin AP 9 TS 3.4.3. Phương pháp định danh Klebsiella pneumoniae Lấy mẫu đàm tươi Quy trình phân lập +Tiến hành nhuộm gram Trang 57 Quan sát dưới kính hiển vi và đánh giá số lượng tế bào đếm được +nếu mẫu đặc tiến hành làm loãng bang NALC sau đó pha vào dung dịch nước muối NaCl 0,9% Sau đó tiến hành phân lập vi khuẩn Klebsiella pneumoniaetrên môi trường MC, BA (CẦN TÌM MÔI TRƯƠNG PHÂN LẬP VÀ THỜI GIAN Ủ) Đặc điểm nhận dạng của khóm khuẩn Klebsiella pneumoniaetrên môi trường dĩa thạch Thử nghiệm định danh Klebsiella pneumoniaeTa tiến hành thực hiện các thử nghiệm theo bảng định danh vi khuẩn này (SƠ ĐỒ ĐỊNH DANH) Bảng.Một số thử nghiệm sinh hóa của các loài chi Klebsiella Loài OXI NO2 KIA/TSI PAD ỦE IND MOB CIT VP MR LDC MLO ONPG GLU LAC GÁ H2S K. pneumoniae - + + + + - - + - - + + - + + + K .oxytoca - + + + + - - + + - + + - + + + K .ornithinolytica - + + + + - - + + - + +/- + + + + K. planticola - + + + + - - + - - + + + + + + K. ozanae - + + +/- +/- - - - - - +/- - + +/- - + K. rhinoscleromatis - + + - - - - - - - - - + - + - K. terrigena - + + + + - - - - - +/- + +/- + + +