Đề tài Tìm hiểu về các loài sao biển ở Việt Nam: đặc điểm, phân loại, phân bố, ứng dụng và công nghệ sản xuất các sản phẩm từ sao biển

............................................................................. 21 2.1.2.4. Ngâm rƣợu .................................................................................... 21 Đồ án tốt nghiệp GVHD SVTH VI 2.1.2.5. Làm khô 2 ( Bảo quản) ................................................................ 22 2.2. Tìm hiểu quy trình chiết tách và sàng lọc hoạt tính sinh học các hợp chất sinh học từ sao biển ..................................................................................... 23 2.2.1. Trình tự thực hiện ............................................................................... 23 2.2.2. Thao tác thực hiện .............................................................................. 23 2.2.2.1. Sơ đồ thực hiện thao tác xử lý mẫu và tạo dịch chiết ............... 23 2.2.2.2. Xử lý mẫu ...................................................................................... 24 2.2.2.3. Tạo dịch chiết ............................................................................... 24 2.2.2.4. Sàng lọc hoạt tính sinh học .......................................................... 26 Chƣơng 3. KẾT LUẬN & ĐỀ NGHỊ .................................................................... 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 34 Đồ án tốt nghiệp GVHD SVTH 1 Chƣơng 1. TÌM HIỂU CÁC LOÀI SAO BIỂN Ở VIỆT NAM Đồ án tốt nghiệp GVHD SVTH 2 1.1. Giới thiệu chung về sao biển  Việt Nam có bờ biển tiếp liền với Biển Đông. Đường bờ biển dài 3260 km chạy dài từ bắc tới nam. Với một vùng thềm lục địa rộng lớn khoảng hơn một triệu km 2 , thuộc vùng biển nhiệt đới nên nguồn nguyên liệu rất đa dạng và có cả bốn mùa. Trữ lượng cá của vùng biển Việt Nam rất phong phú (theo dự tính sơ bộ có khoảng 2000 loài, trong đó hơn 40 loài cá có giá trị kinh tế lớn) cùng với vô số các loài hải sản khác như tôm, cua, trai, tảo, Bên cạnh những loài hải sản đã được khai thác, đánh bắt lâu nay, nguồn hải sản sao biển cũng là một trong những loài đang được quan tâm đến, với sự đa dạng về chủng loại. Nên đây được xem là một hướng phát triển mới đầy tiềm năng cần được khai thác của ngành thủy sản.  Sao biển là loài động vật không xương sống, thuộc ngành Da gai (Echinodermata), lớp Asteroidea.  Đặc điểm phân bố: Phân bố rộng nhưng tập trung nhiều nhất ở khu vực Bắc Thái Bình Dương. Chúng sống ở đáy biển, thích nghi với đáy cát, bùn cát, đá nhỏ, san hô. Chúng ít di động, nhạy cảm với ánh sáng và độ mặn của nước biển.  Đặc điểm cấu tạo: Là nhóm động vật có cấu tạo điển hình của động vật da gai. Hình dạng của động vật sao biển là hình sao, cơ thể dẹp theo chiều lưng bụng và có đối xứng tỏa tròn bậc năm, gồm một đĩa trung tâm ở giữa và 5 hay nhiều cánh (có thể tới 45 cánh) xếp xung quanh, cánh sao biển dài từ 1 – 1,5 cm, có khi lên tới 80 cm. Lỗ miệng có màu sặc sỡ, khi bò trên giá thể thì lỗ miệng hướng về phía dưới, còn hậu môn ở về phía đối diện. Bên trong quanh miệng là ống nước vòng, từ đó phát ra năm ống nước phóng xạ tỏa ra tới tận đỉnh của năm cánh, mỗi ống nước phóng xạ có hai dãy chân ống. Sao biển không có đầu và việc di chuyển được thực hiện nhờ hoạt động của hai hàng chân ống nằm phía dưới của mỗi cánh tay. Tốc độ di chuyển của sao biển rất chậm từ 5 đến 10 cm trong 1 phút. Hình 1.1. Hình dạng ngoài của sao biển A.Mặt lưng B.Mặt bụng Đồ án tốt nghiệp GVHD SVTH 3  Phân loại: Lớp Sao biển (Asteroidea) được chia thành 7 bộ (order): Brisingida, Forcipulatida, Notomyotida, Paxillosida, Spinulosida, Valvatida và Velatida. Đến nay đã thống kê được khoảng 1.700 loài sao biển phân bố ở tất cả các đại dương trên thế giới. Những nơi có nhiều sao biển phải kể đến các vùng biển Australia, Đông Thái Bình Dương và Bắc Mỹ. Đặc biệt, vùng biển nhiệt đới Ấn Độ Dương  Thái Bình Dương là nơi tập trung đại đa số các loài sao biển.  Bộ Brisingida: Là các lớp sao biển sống dưới đáy biển sâu, chiều dài cơ thể khoảng 6  16 cm, các cánh tay mỏng dùng để kiếm thức ăn. Bộ Brisingida có khoảng 100 loài với 17 chi và 6 họ.  Bộ Forrcipulatida: Các loài sao biển thuộc bộ này được nhận biết bởi các cánh tay dạng kìm nhỏ, đây là những đặc điểm dễ nhận ra trên cơ thể chúng. Bộ Forrcipulatida chứa khoảng 300 loài trong số 68 chi và 6 họ.  Bộ Notomyotida: Là các loài sao biển sống dưới biển sâu với các cánh tay rất linh hoạt và các sợi cơ dài dọc theo bề mặt hông bên trong cơ thể. Bộ Notomyotida gồm khoảng 75 loài trong số 12 chi và 1 họ.  Bộ Paxillosida: Đây là các loài sao biển được xem như là động vật sống dưới nước, chúng có thể vùi cơ thể dưới các lớp bùn cát. Chúng được nhận ra bởi một số nét đặc trưng như cánh tay nhọn. Bộ Paxillosida chứa khoảng 255 loài trong số 46 chi và 5 họ.  Bộ Spinulosida: Đây là các loài sao biển với bộ khung khá mỏng manh và chân dạng kìm nhỏ. Bộ Spinulosida chứa khoảng 120 loài trong số 9 chi và 1 họ.  Bộ Valvatida: Đây là các loài sao biển khá đa dạng nhưng thường được nhận ra bởi xương mép nhỏ. Việc xác định về đặc điểm của các loài thuộc bộ này có rất nhiều thay đổi và gây nhiều tranh cãi. Bộ Valvatida có khoảng 695 loài trong số 165 chi và 14 họ.  Bộ Velatida: Các loài sao biển thuộc bộ này thường có thân mỏng với vòng tròn trung tâm lớn và những chỗ lõm với đường kính lớn. Có một số mối quan hệ tương đồng giữa họ Velatid và họ Valvatid. Bộ Velatida có khoảng 200 loài trong số 25 chi và 5 họ. Đồ án tốt nghiệp GVHD SVTH 4 1.2. Các loài sao biển ở Việt Nam  Ở Việt Nam có khoảng 60 loài sao biển khác nhau, phân bố dọc bờ biển từ bắc đến nam, riêng vịnh Nha Trang đã phát hiện được 20 loài sao biển thuộc 16 chi, 11 họ và 4 bộ. Còn tại bãi Vạn Bội  Cát Bà – Hải Phòng có bãi sao biển với diện tích rộng trên 5ha, là nơi tập trung của các loài sao biển rãnh nông và sao biển rãnh sâu (Astropecten polyacanthus, A.monacanthus) với mật độ cao (khoảng 20 con/m 2 ). Đa phần sao biển ở nước ta thuộc các bộ sau:  Bộ Spinulosida có họ Echinasteridae.  Bộ Valvatida có các họ Oreasteridae, Ophidiasteridae, Archasteridae.  Bộ Paxillosida có họ Astropectinidae.  Bộ Forcipulatida có họ Asteridae. 1.2.1. Bộ Forcipulatida 1.2.1.1. Asterias forbesi Hình 1.2. Sao biển Asterias forbesi Asterias forbesi thường được gọi là sao biển Forbes, là một loài sao biển trong họ Asteriidae. a) Phân bố: Chúng thường được tìm thấy trong vùng nước nông ở phía tây bắc Đại Tây Dương và vùng biển Caribê. Ở Việt Nam, Asterias forbesi được khai thác từ các vùng biển Hải Phòng, Nha Trang (Khánh Hòa), Phan Thiết (Bình Thuận), Kiên Giang,... b) Đặc điểm: Asterias forbesi thường có 5 cánh nhưng đôi khi có thế là 4 hoặc 6 cánh. Giống như nhiều loài sao biển khác, bề mặt lưng được bao phủ bởi các nốt gò mềm. Các cánh tay đầy đặn, rộng từ phần đĩa trung tâm và nhỏ dần đến đầu cánh tay. Sao biển Asterias forbesi phát triển có đường kính lên đến khoảng 15 cm (5,9 in) và có chiều dài cánh tay khoảng 6 cm (2,4 in). Có hàng chân ống ở mặt bụng, hai bên của rãnh rãnh của mỗi cánh tay. Màu sắc mặt lưng của Asterias forbesi khác nhau, từ màu nâu đến màu đỏ tía và mặt bụng thường có màu nâu nhạt. Tại chóp của mỗi cánh tay có đốm mắt nhỏ. Đồ án tốt nghiệp GVHD SVTH 5 Hình 1.3. Sao biển nướng c) Bắt mồi  Sao biển Asterias forbesi ăn động vật thân mềm hai mảnh vỏ. Nó có thể mở vỏ bằng cách nắm chặt hai nửa với chân ống của nó và kéo 2 vỏ ra xa nhau. Sau đó, sao biển sẽ đưa dạ dày ra ngoài và bao lấy phần thịt, phần thịt sẽ được tiêu hóa bởi các enzym tiết ra, tiêu hóa cơ thể của động vật thân mềm tại chỗ.  Sao biển có thể xác định vị trí con mồi bằng cách nhận biết mùi. Trong một thử nghiệm, sáu mươi sao biển Asterias forbesi không được cho ăn trong một tuần được sử dụng. Mồi là một miếng thịt hến trong một thùng nước tuần hoàn. Sao biển thử nghiệm đã được đặt ở trong thùng nước có mồi sâu khoảng một mét (3 ft 3 in) tại vị trí mà nguồn thức ăn và sự chuyển động của mỗi con sao biển sẽ được ghi vào băng video. Một thử nghiệm khác tương tự được thực hiện nhưng trong thùng nước không có mùi của mồi dùng để đối chứng. 12 sao biển thử nghiệm (20%) chuyển hướng tới mục tiêu và được ghi nhận trong vòng 15 cm (6 inch) trong khoảng thời gian 15 phút. Hướng di chuyển trở nên chính hơn vì thế khoảng cách đến mồi giảm xuống. Tỷ lệ di chuyển của sao biển thấp hơn trong thử nghiệm đối chứng, điều đó có nghĩa là tốc độ di chuyển có thể cải thiện bởi khả năng xác định mùi của con mồi trong nước. Sao biển sẽ di chuyển về phía mồi nếu trước đó chúng đã bị bỏ đói trong một thời gian dài hơn. Thử nghiệm tương tự khác liên quan đến việc bỏ đói sao biển trong hai tháng trước khi thử nghiệm và điều này tăng khả năng tìm kiếm con mồi. d) Ứng dụng  Các loài sao biển thuộc họ Asteridae thường được dùng làm đồ mỹ nghệ dùng trong trang trí và du lịch. Ngoài ra, các loài này cũng được sử dụng làm nguyên liệu trong ẩm thực để chế biến các món ăn, một trong những cách chế biến loại nguyên liệu này là món sao biển nướng với cách làm cũng khá đơn giản. Cách làm món sao biển nướng:  Chuẩn bị: dầu thực vật, muối biển, tiêu sọ trắng, bột ớt cayenne và sao biển.  Thực hiện: Sao biển đem đi rửa sạch dưới vòi nước để làm sạch cát và tạp chất; để ráo. Rắc đều muối, tiêu và ớt lên cả hai mặt của sao biển. Đặt sao biển lên vỉ nướng nóng đã được phết dầu. Nướng mỗi mặt khoảng 5 phút là có thể dùng được. Đồ án tốt nghiệp GVHD SVTH 6 1.2.1.3. Asterias rubens Hình 1.4. Sao biển Asterias rubens a) Phân bố: Sao biển Asterias rubens là sao biển phổ biến nhất và quen thuộc ở phía đông Đại Tây Dương. Chúng thường được tìm thấy trên nền đá và sỏi, nơi nó ăn động vật thân mềm và động vật không xương sống ở đáy khác. Ở Việt Nam được khai thác từ các vùng biển Hải Phòng, Nha Trang (Khánh Hòa), Phan Thiết (Bình Thuận), Kiên Giang, ... b) Đặc điểm  Sao biển Asterias rubens thường có năm cánh, mỗi cánh rộng từ phần nối với đĩa trung tâm và dần dần thuôn nhọn ở chóp cánh, có đường kính từ 10  30 cm (4 12 in). Mặc dù một số con sao biển lớn hơn có đường kính lên đến 52 cm (20 in). Có một dòng gai trắng chạy từ đầu cánh đến chóp cánh ở mặt lưng của cánh tay, còn có các nốt gò mềm thấp ở hai bên dòng gai trắng. Mặt bụng của cánh tay có hai hàng chân ống nhỏ dọc theo hai bên ống phóng xạ, được sử dụng trong di chuyển. Những con sao biển này thường có màu cam hoặc đỏ gạch ở mặt lưng và nhạt màu ở mặt bụng nhưng cũng có thể là màu tím hoặc màu nâu nhạt. Các cá thể ở nước sâu thường nhạt màu hơn. c) Bắt mồi  Loài sao biển này thường ăn nhiều loại sinh vật đáy. Con mồi của chúng gồm các động vật thân mềm hai mảnh vỏ, hàu, động vật chân đầu, động vật da gai khác. Khi ăn một động vật thân mềm như một con trai, nó gắn chân ống của nó để mỗi van có thể dùng lực hút bám vào và dùng sức để tách phần vỏ ra một chút. Ngay cả một khoảng cách chỉ 1 mm (0,039 in) là đủ cho con sao biển đưa một phần của dạ dày vào, tiết ra các enzym và bắt đầu tiêu hóa cơ thể động vật thân mềm. Những con sao biển thường có khứu giác phát triển tốt và nhạy bén về mùi, nhờ vậy có thể phát hiện mùi của con mồi như hến và xác định được hướng di chuyển về phía con mồi. Nó cũng có thể phát hiện mùi của các loài sao biển săn mồi có thể ăn các con sao biển khác để có hành động lẩn tránh.  Sao biển Asterias rubens thường tiết ra một chất saponin có tác dụng đẩy lùi kẻ thù, gây ra một phản ứng đối với các loài ốc biển lớn – một loài thường săn Đồ án tốt nghiệp GVHD SVTH 7 mồi. Chất saponin ở nồng độ thấp thì khiến các loài ốc biển lớn có hành động lẩn tránh còn ở nồng độ cao nó gây ra một loạt các cơn co giật. 1.2.1.4. Pisaster ochraceus (Sao biển tía) Hình 1.5. Sao biển Pisaster ochraceus Loài Pisaster ochraceus, thường được biết đến là sao biển tím, sao biển vàng nâu hoặc sao biển đất son, là một loại sao biển thường được tìm thấy trong các vùng biển có nước ấm của Thái Bình Dương. Đây là một loài chủ chốt, Pisaster được coi là một chỉ báo quan trọng về tình trạng của khu vực bãi triều.  Đặc điểm  Sao biển Pisaster ochraceus có năm cánh lớn với chiều dài từ 10 – 25 cm (4 – 10 in). Các cánh được sắp xếp xung quanh đĩa trung tâm. Trong khi hầu hết các cá thể là màu tím, cũng có cá thể có màu cam, màu vàng nâu hay màu đất son. Bề mặt lưng chứa nhiều gai nhỏ (xương nhỏ) được sắp xếp theo mô hình ngũ giác trên đĩa trung tâm. Các xương nhỏ không cao hơn 2 mm. Trong Pisaster chân ống có mút ở hai đầu cho phép chúng bám vào bề mặt đá và sống ở những khu vực có sóng lớn.  Hai loài có thể bị nhầm lẫn với Pisaster ochraceus là Pisaster giganteus, trên bề mặt lưng các gai nhỏ có màu xanh xung quanh màu trắng hoặc gai màu tím, và Pisaster brevispinus, có các gai nhỏ trắng hồng. Hai loài có gai ở mặt lưng khác nhau và màu sắc cho phép phân biệt giữa các loài. Evasterias troscheli có thể bị nhầm lẫn với Pisaster ochraceus nhiều hơn. Nó có thể được phân biệt theo kích thước đĩa trung tâm nhỏ hơn, có các cánh thon và dài hơn Pisaster ochraceus. Đồ án tốt nghiệp GVHD SVTH 8 Hình 1.6. Sao biển Pisaster giganteus, Sao biển Pisaster brevispinus, Sao biển Evasterias troscheli (từ trái qua)  Nhiều loài sao biển có thể sống ít nhất là 4 năm. Nhưng đối với loài Pisaster ochraceus có thể sống lâu đến 20 năm. Loài sao biển này thường được coi là một loài chủ chốt ở nhiều bãi triều. Pisaster ochraceus là một loài ăn trai California và làm giảm số lượng loài trai California. Trong một thử nghiệm loại bỏ Pisaster ochraceus, người ta thấy rằng số lượng loài trai California gần như hoàn toàn thống trị ở khu vực bãi triều. Khi sự hiện diện của Pisaster ochraceus được ngăn chặn thì có sự đa dạng quần thể ở khu vực bãi triều. 1.2.2. Bộ Valvatida 1.2.2.1. Archaster typicus Hình 1.7. Sao biển Archaster typicus a) Phân loại, phân bố: Sao biển Archaster typicus là một loài sao biển trong họ Archasteridae. Nó thường được gọi là ngôi sao cát. Loài Archaster typicus được tìm thấy ở các vùng nước nông 60 mét (200 ft) ở miền tây Ấn Độ Dương và khu vực Ấn Độ – Thái Bình Dương. Phạm vi bao gồm quần đảo Maldive, vịnh Bengal, Singapore, miền bắc Australia, New Caledonia, Philippines, Trung Quốc, phía nam Nhật Bản và Hawaii. Chúng thường sống ở khu vực đáy biển với trầm tích mềm bao gồm cát, bùn và bãi cỏ. Ở Việt Nam được khai thác từ các vùng biển Hải Phòng, Nam Định, Đồ án tốt nghiệp GVHD SVTH 9 b) Đặc điểm Archaster typicus có 5 cánh hơi dài, hơi thon với chóp nhọn. Một số cá thể có 3; 4 hay 6 cánh. Con trưởng thành đường kính có thể lên đến 12 – 15 cm (4,7 – 5,9 in), con đực thường là nhỏ hơn so với cái. Loài sao biển này thích nghi với cuộc sống dưới đáy biển đầy cát trắng, nơi nó có thể vùi trong lớp trầm tích khi triều cao và di chuyển trên bề mặt trầm tích khi triều thấp. Chúng thường có màu xám hoặc nâu nhạt ở mặt lưng còn mặt bụng thì nhạt màu hơn. Có các gai ngắn sắp xếp theo một rìa biên, bằng phẳng và thẳng hơn so với Archaster polyacanthus và hệ chân ống có mút. c) Ứng dụng: Loài Archaster typicus thường dùng làm đồ mỹ nghệ cũng như ngâm rượu thuốc. Ngoài ra, còn được dùng làm nguyên liệu để chiết tách các hợp chất để phục vụ cho y học. Hình 1.8. Sao biển được làm khô dùng trong ngâm rượu Hình 1.9. Sao biển Archaster typicus ngâm rượu Đồ án tốt nghiệp GVHD SVTH 10 1.2.2.2. Linckia laevigata (Sao biển xanh) Hình 1.10. Sao biển Linckia laevigata màu xanh Hình 1.11. Sao biển Linckia laevigata màu xanh nhạt và cam Sao biển Linckia laevigata còn được gọi là sao biển xanh hay Linckia xanh. Loài sao biển này thuộc họ Ophidiasteridae. a) Phân bố: Chúng sống trong vùng nước nông của vùng nhiệt đới Ấn Độ Dương  Thái Bình Dương, thường được tìm thấy ở các vỉa san hô ngầm và cỏ biển, loài này khá phổ biến và thường có mật độ phân bố thưa thớt. Ở Việt Nam, chúng được tìm thấy ở vùng biển Quảng Trị, vùng biển Nha Trang (Khánh Hòa), b) Đặc điểm:  Sao biển Linckia laevigata là loài sao biển có 5 cánh nhưng một vài trường hợp có thể có 6 cánh. Các cánh tay thon dài và có phần chóp tròn, một số cá thể có thể có các đốm tròn trên mặt lưng có màu xanh đậm hơn hoặc nhạt hơn tùy vào màu của mặt lưng. Mặt bụng, ở giữa mỗi cánh tay có một đường chân ống màu vàng bắt đầu từ đĩa trung tâm đến chóp cánh tay. Sao biển trưởng thành đường kính có thể lên đến 30 cm (11,8 in). Các cá thể có thể màu xanh da trời nhạt, đậm hoặc sáng. Mặc dù, theo quan sát cũng có những dạng biến thể có màu trắng xanh, tím hoặc cam ở khắp đại dương.  Sao biển xanh cũng là loài thích ăn các mầm san hô sống. Cá nóc, ốc kèn, tôm Harlequin, thậm chí một số hải quỳ và một vài loài sao biển cũng là con mồi của loài sao biển này. Đồ án tốt nghiệp GVHD SVTH 11 c) Ứng dụng  Từ lâu Sao biển Linckia laevigata được xem như sản phẩm chính của ngành thủ công mỹ nghệ với các sản phẩm sao biển xanh được sấy khô dùng trong trang trí và du lịch. Chính vì vậy, ở một số khu vực là môi trường sống của chúng số lượng loài đã giảm đáng kể do việc khai thác liên tục bởi sự ưa chuộng các sản phẩm về loài này ngày càng tăng cao.  Ngoài ra, sao biển xanh còn được đánh bắt để nuôi trong các hồ cá cảnh. Mặc dù, loài nay rất nhạy cảm với sự thay đổi của pH, nhiệt độ và độ mặn trong môi trường sống. Bởi vì điều này, chúng sẽ dễ bị nhiễm vi sinh vật nên cần được chăm sóc kiểm tra thường xuyên. Linckia xanh cần một khoảng thời gian rất dài để thích nghi với môi trường sống của hồ được dùng để nuôi chúng. 1.2.2.3. Acanthaster planci (Sao biển gai) Hình 1.12. Sao biển Acanthaster planci a) Phân loại: Sao biển Acanthaster planci hay còn gọi là sao biển gai, thuộc họ Acanthasteridae, loài Acanthaster. Là loài sao biển lớn thứ nhì trên thế giới chỉ sau sao biển Pycnopodia helianthoides (Sao biển hoa hướng dương). Chúng thường ăn các loài san hô. Cái tên sao biển gai được đặt theo vẻ bề ngoài được phủ đầy gai nhọn có độc khắp bề mặt lưng của chúng, giống như vương miện bằng gai trong Kinh Thánh. Đồ án tốt nghiệp GVHD SVTH 12 b) Đặc điểm  Sao biển gai có khoảng 13 đến 16 cánh mở rộng tỏa tròn từ trung tâm của cơ thể, với đường kính có thể đạt tới 0,5 m. Cơ thể chúng được bao phủ bởi các gai nhọn cứng và rất sắc có chiều dài xấp xỉ 5 cm nhằm bảo vệ, chống lại các đe dọa từ kẻ địch bao gồm cả con người. Chúng có sự khác biệt về màu sắc cơ thể, màu sắc đa dạng khác nhau giữa các phần trên cơ thể.  Mặc dù sao biển gai thuộc lớp sao biển nhưng chúng khác với các loài khác về tập tính ăn với khẩu phần ưa thích nhất là các mầm (polyp) san hô sống. Nhìn chung, con mồi ưa thích nhất là các mô mềm của các loài san hô tạo rạn nhưng chúng cũng ăn các nhóm san hô khác. c) Phân bố: Sao biển Acanthaster planci phân bố rộng khắp Ấn Độ Dương  Thái Bình Dương. Chúng sống ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới từ Biển Đỏ và phía đông bờ biển châu Phi qua Ấn Độ Dương và qua Thái Bình Dương tới bờ biển phía tây của Trung Mỹ. Sao biển gai thường được tìm thấy ở các vỉa san hô ngầm hay các cộng đồng san hô cứng trong khu vực ở độ sâu từ 5 đến 20 m. Ở Việt Nam được phát hiện ở vùng biển Quảng Trị, Quảng Nam, khu vực vinh Nha Trang, Bà Rịa Vũng Tàu, Kiên Giang, d) Độc tố  Sao biển Acanthaster planci đặc trưng bởi có saponin gọi là asterosaponins trong mô của chúng. Chúng chứa một hỗn hợp của các saponin. Có ít nhất 15 nghiên cứu hóa học đã được tiến hành để nghiên cứu về saponin. Các saponin có tính chất:  Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước, có tác dụng nhũ hoá và tẩy sạch;  Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng;  Độc với cá vì saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô hấp nên làm mất các chất điện giải cần thiết, ngoài ra có tác dụng diệt các loài thân mềm như giun, sán, ốc sên.  Sao biển gai không có cơ chế để tiêm chất độc, nhưng khi gai đâm thủng mô của kẻ thù hoặc người không thận trọng, saponin sẽ đi vào mô ở vùng bị thương. Ở con người, sau khi bị gai đâm vào, ngay lập tức gây đau nhức có thể kéo dài trong vài giờ, chảy máu dai dẳng do hiệu ứng phá huyết của saponin, buồn nôn và sưng mô mà có thể kéo dài một tuần hoặc nhiều hơn. Các gai giòn có thể vỡ ra và nằm ở trong các mô, nguời bị thương phải được phẫu thuật lấy ra. Saponin tồn tại trong suốt vòng đời của sao biển gai. Đồ án tốt nghiệp GVHD SVTH 13 1.2.2.4. Culcita novaeguineae (Sao biển gối) Hình 1.13. Sao biển Culcita novaeguineae a) Phân loại  Phân bố: Sao biển Culcita novaeguineae tên thường gọi là sao biển gối, là một loài thuộc bộ Valvatida trong họ Oreasteridae. Nó có thể thay đổi màu sắc và có thể được tìm thấy trong vùng nước ấm nhiệt đới ở Ấn Độ  Thái Bình Dương. Ở Việt Nam được tìm thấy tại vùng biển Quảng Ninh, Nha Trang, Bà Rịa Vũng Tàu, Phú Quốc (Kiên Giang), b) Đặc điểm  Sao biển Culcita novaeguineae có 5 cánh. Những con trưởng thành có các cánh tay ngắn và sao biển có hình dạng như một chiếc gối ngũ giác căng tròn mặt lưng. Chúng có thể phát triển với đường kính lên đến 30 cm (12 in). Các màu sắc rất đa dạng và trên mặt lưng có những vết lốm đốm với màu tối hơn và nhẹ hơn (màu nâu vàng, nâu, cam, vàng và xanh lá cây) màu tổng thể của bề mặt lưng. Những con sao biển gối nhỏ có hình dạng rất khác so với con sao biển gối khi trưởng thành. Những con nhỏ cũng có 5 cánh tay, các cánh tay ngắn, rộng, mặt lưng không nhô cao như những con trưởng thành.  Con mồi của chúng thường là các loài sống trên san hô và các loài sống trên cơ thể các loài khác cũng như các vật chất hữu cơ. c) Ứng dụng: Sao biển gối thường không dùng trong thực phẩm. Chúng thường được bắt về để sấy khô làm các sản phẩm thủ công mỹ nghệ và du lịch. Đồ án tốt nghiệp GVHD SVTH 14 1.2.2.5. Protoreaster nodosus (Sao biển chocolate chip) Hình 1.14. Sao biển Protoreaster nodosus a) Phân loại  Phân bố Sao biển Protoreaster nodosus thường được gọi là sao biển sừng hoặc sao biển socola chip, thuộc họ Oreasteridae. Là một loài sao biển được tìm thấy trong vùng nước nông và ấm của khu vực Ấn Độ Dương Thái Bình Dương. Loài này được tìm thấy nhiều ở vùng biển quanh đảo Phú Quốc, vùng biển Nha Trang, b) Đặc điểm:  Sao biển Protoreaster nodosus có hàng gai hay "sừng", hình dạng của các gai có hình nón đỉnh nhọn và màu đen sắp xếp theo một hàng duy nhất chạy từ đĩa trung tâm đến đỉnh cánh, còn tại phần đĩa trung tâm thì các gai xếp thành hình tròn bao quanh phần đĩa. Các gai này có thể bị mòn và có đỉnh tròn. Những chỗ lồi lõm tối màu có thể được sử dụng để xua đuổi kẻ săn mồi, bằng cách trông có vẻ đáng sợ và nguy hiểm. Hầu hết các sao biển socola chip được tìm thấy là đều có năm cánh tay, nhưng một số cá thể có thể có bốn hoặc sáu cánh. Đường kính có thể lên đến 30 cm (12 in) ở những con trưởng thành.  Ở mặt bụng, hệ chân ống có màu tím ( nhạt, trong suốt, màu hồng) được sắp xếp thành hai hàng dọc theo ống phóng xạ trên mỗi cánh tay. Tại các vùng tối Đồ án tốt nghiệp GVHD SVTH 15 của ngôi sao biển thường có màu đỏ hoặc nâu, còn những vùng sáng có màu trắng, vàng, nâu nhạt, cam. Với màu sắc này, kết hợp với những chiếc sừng nhỏ trên mặt lưng giúp cho những con sao biển này có hình dạng tương tự như những chiếc bánh cookie có các hạt socola ở trên. c) Ứng dụng: Sao biển Protoreaster nodosus thường được dùng làm các mặt hàng thủ công mỹ nghệ hoặc nuôi trong các bể cá cảnh. Hình 1.15. Sao biển chocolate chip khô Đồ án tốt nghiệp GVHD SVTH 16 1.2.3. Bộ Paxillosida 1.2.3.1. Astropecten polyacanthus Hình 1.16. Sao biển Astropecten polyacanthus a) Phân loại: Sao biển Astropecten polyacanthus, sao biển cát chọn lọc hay sao biển lược, là một loài sao biển thuộc họ Astropectinidae. Nó là loài phổ biến nhất trong các chi astropecten, được tìm thấy ở khắp các khu vực Ấn Độ – Thái Bình Dương. Đường kính lên đến 20 cm (8 in). Các tên gọi khác của loài sao biển này xuất phát từ tiếng Latin "polyacanthus" có nghĩa là "nhiều gai". b) Đặc điểm  Bề mặt lưng của sao biển lược có màu tím sẫm, trong khi mặt bụng có màu cam. Trên mặt lưng có các xương gai nhỏ, trong tiếng Latin được hiểu là các cọc nhỏ. Những gai nhỏ với đỉnh nhọn và thường có màu kem, xám hoặc nâu. Dọc theo cạnh của năm cánh tay ở mặt bụng có một hàng gai ở phần mép cánh tay thường dài hơn và nhọn hơn gai ở mặt bụng, thường có màu nâu hay màu nhạt. Các cánh tay là khá rộng và có độ dài tối đa là 9 cm (3,5 in). Các chân ống được chỉ thay vì phải mút, một sự sắp xếp đó là phù hợp hơn cho đào. Astropecten polyacanthus có thể bị nhầm lẫn với Archaster typicus. Trông chúng tương tự nhau bởi vì cả hai đã phát triển đặc điểm cho phép chúng đào cát. c) Phân bố  Sao biển Astropecten polyacanthus được tìm thấy ở các vùng biển nhiệt đới và cận nhiệt đới khắp khu vực Indo  Thái Bình Dương từ biển Đỏ và Zanzibar tới Hawaii, và từ Nhật Bản đến Australia và New Zealand. Ở Úc phạm vi kéo dài từ phía tây Cape Naturaliste, vòng quanh bờ biển phía bắc Sydney ở phía đông. Nó thường được tìm thấy trên đáy cát bùn ở các bến cảng và cửa sông có ở độ sâu khoảng 185 m (607 ft). Ở Việt Nam thường tìm thấy ở vùng biển phía Bắc như Hải Phòng, Nam Định và vùng biển miền Trung, d) Sinh học  Các sao biển cát Astropecten polyacanthus dành nhiều thời gian vào việc vùi dưới đáy biển bùn. Chúng ăn các mảnh vụn và động vật hai mảnh vỏ và động vật thân mềm. Đôi khi, chúng cũng ăn sỏi và động vật không xương sống nhỏ bám Đồ án tốt nghiệp GVHD SVTH 17 vào bề mặt. Loài sao biển Astropecten polyacanthus có chứa các chất độc thần kinh mạnh  Tetrodotoxin còn được gọi là TTX. Trong một nghiên cứu, hầu hết trong 54 sao biển được thử nghiệm có chứa TTX. 1.2.4. Bộ Spinulosida 1.2.4.1. Echinaster luzonicus Hình 1.17. Sao biển Echinaster luzonicus a) Phân loại: Sao biển Echinaster luzonicus hay còn gọi là sao biển nốt sần nhỏ, là một loài sao biển thuộc họ Echinasteridae . Con mồi của loài sao biển này khá đa dạng từ động vật không xương sống như bọt biển, giun, động vật thân mềm, đến các chất hữu cơ hay xác thối. Thế nhưng nó cũng chính là con mồi ưa thích của loài tôm Hymenocera picta. b) Đặc điểm:  Loài sao biển này có đĩa trung tâm tương đối nhỏ, các cánh tay đối xứng tỏa tròn xung quanh đĩa trung tâm, thường có 5  8 cánh tay, nhưng đôi khi ít hơn (do bị ăn thịt) và đôi khi nhiều hơn (vì sự tái sinh khi ngẫu nhiên). Các cánh tay dài, thuôn tròn, phần chóp có màu tối và thường cong lên. Chiều dài các cánh có thể lên tới 22 cm khi trưởng thành.  Ở mặt lưng, màu sắc của nó là màu nâu vàng, thường màu đỏ tươi nhưng lên màu từ cam đến nâu tím. Ngoài ra, còn có sắc thái khác nhau của màu hồng Đồ án tốt nghiệp GVHD SVTH 18 hoặc màu be, trên mặt lưng luôn được phủ kín bởi những chấm nhỏ có màu tối (trong đó có lỗ sần hô hấp). Khi chạm vào ta vào Echinaster luzonicus sẽ cảm thấy thô vì có nhiều xương gai dưới lớp biểu bì. Ở mặt bụng, dưới mỗi cánh tay có một ống phóng xạ, hai bên ống là hai hàng chân ống sử dụng để di chuyển và lưu thông thực phẩm.  Loài sao biển này có thể bị nhầm lẫn với loài Echinaster Varicolor, Echinaster purpureus và một số loài thuộc họ Ophidiasteridae như Linckia (biểu bì trơn). c) Phân bố: Sao biển Luzonicus Echinaster được tìm thấy ở vùng biển nhiệt đới Ấn Độ  Thái Bình Dương, chủ yếu ở các khu vực của Indonesia và Philippines và từ vịnh Bengal đến New Caledonia và Polynesia. Ở Việt Nam tìm thấy ở Quãng Trị, Bà Rịa Vũng Tàu, Kiên Giang (Phú Quốc), ở độ sâu khoảng 20 m, đôi khi lên đến 73 m. Đôi khi được tìm thấy ở các rạn san hô. Đồ án tốt nghiệp GVHD SVTH 19 Chƣơng 2. TÌM HIỂU CÁC QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CÁC SẢN PHẨM TỪ SAO BIỂN Đồ án tốt nghiệp GVHD SVTH 20 2.1. Tìm hiểu quy trình sản xuất sao biển khô 2.1.1. Sơ đồ quy trình sản xuất Nguyên liệu Rửa Làm khô 1 Ngâm rƣợu Làm khô 2 Thành phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD SVTH 21 2.1.2. Thuyết minh quy trình sản xuất 2.1.2.1. Nguyên liệu  Nguyên liệu có thể là sao biển sống hoặc là sao biển đã chết, nhưng tốt nhất bạn nên chọn những con đã chết vì dù là sao biển còn sống hay đã chết sản phẩm làm ra là như nhau.  Để phân biệt được giữa sao biển chết và sao biển sống cần quan tâm đến một vài dấu hiệu nhận biết sau:  Sao biển là một loài di chuyển chậm. Vì thế khi bắt gặp một con sao biển trên bãi biển, bạn cần bỏ ra vài phút để quan sát xem con sao biển đó có di chuyển hay không và có các bọt các xung quanh không. Nếu không thì ta có thể đoán được phần nào là nó đã chết.  Nếu muốn chắc chắn hơn. Hãy chạm vào con sao biển xem cơ thể nó có giòn, cứng hay không, nếu có thì con sao biển đó đã chết. 2.1.2.2. Rửa  Chuẩn bị: Thau, thuốc tẩy, nước sạch.  Thực hiện:  Trước khi thực hiện công đoạn ngâm trong rượu và làm khô, ta cần làm sạch con sao biển. Pha thuốc tẩy: nước với tỉ lệ 1:3, sao cho dung dịch rửa khi cho sao biển vào ngâm sẽ ngập con sao biển và ngâm rửa trong khoảng một phút.  Trong quá trình ngâm rửa có thể dùng tay nhẹ dàng làm sạch cát đất, các tạp chất trên thân sao biển. Không được thực hiện các thao tác mạnh tay lên con sao biển vì như vậy sẽ làm trầy hoặc rách da của sao biển (do da của sao biển khá mỏng). 2.1.2.3. Làm khô 1  Sau khi ngâm rửa, ta cần làm khô con sao biển bằng cách phơi dưới ánh nắng mặt trời. Sao biển phải được làm khô hoàn toàn. Trong quá trình phơi khô, các cánh tay của sao biển có xu hướng cong lên tương tự như việc phơi khô các loại hải sản khác. Nên dùng một số vật có trọng lượng đủ để giữ các cánh tay không bị cong. 2.1.2.4. Ngâm rƣợu  Chuẩn bị: + 1 thau (hoặc chậu, khay, ) có diện tích lớn hơn đường kính của con sao biển. Vì như vậy, không cần phải ấn các cánh tay của sao biển xuống cho bằng phẳng.  Rượu có nồng độ là 70.  Thực hiện:  Đầu tiên, ta đổ một ít rượu tràn đều phần đáy thau để chắc chắn mặt bụng của sao biển tiếp xúc hết với rượu. Sau đó, đặt con sao biển vào, điều chỉnh các cánh tay theo kiểu dáng mình mong muốn rồi đổ từ từ rượu vào cho đến khi ngập hết mặt lưng con sao biển. Ở mỗi cánh tay nên dùng một hòn đá nặng đặt lên để Đồ án tốt nghiệp GVHD SVTH 22 tránh trong quá trình ngâm rượu các cánh tay bị cong lên. Sau khi thực hiện xong, ta mang thau sao biển ra ngoài trời phơi từ 30 – 48 giờ.  Một số trường hợp, người ta sử dụng formaldehyde thay cho rượu. Formaldehyde sẽ được pha với nước có tỉ lệ 1:5. Với cách làm này có một nhược điểm là sao biển sau khi ngâm xong sẽ còn mùi của formaldehyde khá nồng cần phải mất một khoảng thời gian để mùi nhẹ dần. 2.1.2.5. Làm khô 2 ( Bảo quản) Cách 1: Phơi nắng  Sao biển sau khi ngâm rượu, ta lấy sao biển ra đem phơi khô dưới nắng để bảo quản. Phải đảm bảo sau khi phơi sao biển phải khô hoàn toàn từ trong ra ngoài. Nếu bên trong sao biển vẫn chưa khô thì trong quá trình sử dụng sao biển sẽ có mùi hôi và không sử dụng được lâu dài do bị thối. Kiểm tra sao biển thường xuyên để đảm bảo rằng trong quá trình phơi khô hình dạng sao biển đúng với yêu cầu của bạn. Cách 2: Ướp muối  Ngoài cách làm khô bằng cách phơi dưới ánh nắng. Một phương pháp khác cũng khá đơn giản, đó là làm khô bằng muối.  Đặt con sao biển lên khay rồi phủ kín bằng một lớp muối biển lên con sao biển. Sử dụng các vật nặng (hòn đá) đặt lên các cánh tay của sao biển để tránh bị cong lên trong quá trình làm khô. Muối có khả năng hút ẩm rất cao, sẽ giúp hút hết nước và hơi ẩm bên trong sao biển. Đây là cách bảo quản khá độc đáo và dễ thực hiện. Khi làm khô bằng muối, tốt nhất nên để khay sao biển ra ngoài trời nơi có ánh nắng để tránh mùi trong quá trình làm khô và giúp việc làm khô được thực hiện nhanh chóng hơn. Đồ án tốt nghiệp GVHD SVTH 23 2.2. Tìm hiểu quy trình chiết tách và sàng lọc hoạt tính sinh học các hợp chất sinh học từ sao biển 2.2.1. Trình tự thực hiện 2.2.2. Thao tác thực hiện 2.2.2.1. Sơ đồ thực hiện thao tác xử lý mẫu và tạo dịch chiết Mẫu nguyên liệu Xử lý mẫu Tạo dịch chiết Sàng lọc hoạt tính sinh học Thái nhỏ, chiết siêu âm trong MeOH, cất loại dung môi Bổ sung nước Sao biển Archaster typicus Dịch chiết MeOH Cặn CHCl3 Cặn BuOH Cặn pha nƣớc Chiết CHCl3/H2O 1:1 Bổ sung BuOH Chiết CHCl3/H2O 1:1 Đồ án tốt nghiệp GVHD SVTH 24 2.2.2.2. Xử lý mẫu Các mẫu sao biển sau khi thu về được tiến hành bảo quản theo quy trình thống nhất sau:  Rửa sạch nhiều lần bằng nước cất để loại muối và tạp bẩn.  Để ráo nước ở nhiệt độ phòng, ép nhẹ bằng giấy lọc bản để thấm hết nước.  Cho các mẫu vào túi nilon sạch, kèm theo kí hiệu mẫu được ghi bằng bút chì trên giấy nến để tránh bị mờ hoặc rách nát khi tiếp xúc với nước và ở điều kiện lạnh âm sâu  Các túi mẫu được lưu giữ trong tủ lạnh sâu ở -200C để đảm bảo mẫu không bị phân hủy bởi vi sinh vật. 2.2.2.3. Tạo dịch chiết Các mẫu sao biển được chiết theo quy trình sau: Bước 1: Lấy các mẫu ra khỏi tủ lạnh. Trong quá trình lấy mẫu phải cẩn thận vì trong tủ lạnh âm sâu do có sự tạo tuyết nên các túi mẫu sẽ bị dính vào nhau do đó rất dễ bị rách khi lấy mẫu ra. Nếu túi bị rách sẽ có thể làm mất kí hiệu mẫu gây ra các sự cố nhầm lẫn trong quá trình thực hiện và kết quả. Bước 2: Rã đông – Rửa mẫu. Mẫu lấy ra được để rã đông ở nhiệt độ phòng sau đó rửa lại bằng nước cất trước khi tiến hành cắt nhỏ và xay mẫu. Bước 3: Cắt nhỏ và xay mẫu. Mẫu sau khi rửa được cân kế đến cắt nhỏ và xay mẫu. Bước 4: Tách chiết bằng dung môi MeOH. Mẫu đã xay được tiến hành chiết 3 lần bằng MeOH (metanol) trên thiết bị siêu âm (Ultrasonic 2010, 950W) ở nhiệt độ 40 – 500C, thời gian chiết mỗi lần tối thiểu 60 phút. Bước 5: Lọc & Chưng cất. Dịch chiết của 3 lần chiết được lọc qua giấy lọc (Sử dụng giấy lọc Whatman đường kính 240 nm, N0 1) để loại sinh khối, gộp lại và tiến cất loại dung môi dưới áp suât giảm ở nhiệt độ dưới 500C thu được dịch cô MeOH. Bước 6: Loại muối ra khỏi dịch cô MeOH thô.  Dịch cô MeOH thô được tiến hành rửa loại muối qua cột đã được nhồi nhựa trao đổi ion Dianion HP-20 với kích thước cột: đường kính = 30 nm và chiều dài l= 0.5 m.  Dịch cô MeOH thô được đưa lên cột Dianion, tiến hành rửa loại muối bằng nước cất với thể tích khoảng 1 – 2 lit/mẫu.  Rửa toàn bộ chất trên cột Dianion HP-20 bằng MeOH cho đến khi dịch ra khỏi cột không còn chứa các chất hòa tan của cặn dịch chiết ban đầu (Khoảng 2 – 3 lit MeOH/mẫu). Đồ án tốt nghiệp GVHD SVTH 25 Bước 7: Loại dung môi ra khỏi dịch MeOH.  Dịch MeOH rửa cột Dianion được tiến hành cất loại dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ dưới 500C đến khối lượng không đổi.  Dịch chiết thô MeOH sau khi đã loại muối lấy từ dịch tổng. Dịch chiết này sau khi sấy khô cho vào bình chiết có dung tích phù hợp. Dịch này được hòa tan trong nước cất. Cho vào dịch chiết dung môi n-Hexane, bình chiết được đặt trong bể siêu âm (Ultrasonic 2010, 950W) và được siêu âm ở nhiệt độ 400C trong 10 phút. Chiết phân bố liên tục ba lần bằng n-Hexane theo tỉ lệ 1:1 về thể tích. Dịch chiết n- Hexane được cho vào bình cầu đáy tròn và bốc hơi dung môi trong chân không (11 mmHg) bằng máy cô quay ở nhiệt độ 400C. Cặn thu được cân và hòa tan. Cặn thu được cho vào lọ nhỏ được dán nhãn và đánh kí hiệu mẫu gửi đi thử hoạt tính.  Lớp nước thu được từ chiết phân bố tiếp tục được chiết phân bố ba lần bằng CHCl3 theo tỉ lệ 1:1 về thể tích. Lớp CHCl3 được cho vào bình cầu đáy tròn và bốc hơi dung môi trong chân không (11 mmHg) bằng máy cô quay ở nhiệt độ 400C. Cặn thu được cân và hòa tan. Cặn thu được cho vào lọ nhỏ được dán nhãn và đánh kí hiệu mẫu gửi đi thử hoạt tính.  Lớp nước thu được từ chiết phân bố tiếp tục được chiết phân bố ba lần bằng Butanol theo tỉ lệ 1:1 về thể tích. Lớp Butanol được cho vào bình cầu đáy tròn và bốc hơi dung môi trong chân không (11 mmHg) bằng máy cô quay ở nhiệt độ 400C. Cặn thu được cân và hòa tan. Cặn thu được cho vào lọ nhỏ được dán nhãn và đánh kí hiệu mẫu gửi đi thử hoạt tính.  Lớp nước còn lại được cho vào bình cầu đáy tròn và làm bốc hơi dung môi trong chân không (11 mmHg) bằng máy cô quay ở nhiệt độ 400C rồi lưu trữ.  Các mẫu chiết bằng dung môi MeOH được kí hiệu là: KC-001-M. Sau khi loại muối và tiến hành phân đoạn trên các dung môi n-Hexane (H), CHCl3 (C), Butano (B), Nước (N) sẽ được kí hiệu như sau: KC-001-H: Phân đoạn n-Hexane. KC-001-C: Phân đoạn CHCl3. KC-001-B: Phân đoạn Butanol. KC-001-N: Phân đoạn nước. Bước 8: Chuyển toàn bộ lượng cặn dịch chiết thu được vào lọ đựng cặn dịch chiết đã được cân và dán kí hiệu mẫu (Lọ phải đảm bảo sạch, chịu được dung môi và không bị ảnh hưởng bới điều kiện lạnh âm sâu). Ví dụ: Mẫu được dán nhãn theo quy ước đánh ký hiệu mẫu như trên KC 09.09/06-10 KC-001-B Ngàythángnăm Đồ án tốt nghiệp GVHD SVTH 26 Bước 9: Cân lọ chứa cặn dịch chiết và tính lượng cặn dịch chiết thu được bằng cách trừ đi khối lượng ban đầu. Bước 10: Bảo quản các lọ đựng cặn dịch chiết trong tủ lạnh âm sâu (-200C) để tránh bị vi sinh vật phân hủy. 2.2.2.4. Sàng lọc hoạt tính sinh học Trong sàng lọc hoạt tính sinh học chúng ta có thể tiến hành đánh giá hoạt tính sinh học thông qua các loại hoạt tính sau:  Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Antimicrobial Activity assay).  Hoạt tính gây độc tế bào (Cytotoxic activity assay).  Hoạt tính chống oxy hóa của các mẫu sinh vật biển thông qua phản ứng bao vây gốc tự do DPPH (Antioxidant activity assay – DPPH free radical scavenging).  Hoạt tính chống loãng xương thông qua các cơ chế kích thích sự khác biệt hóa của nguyên bào xương MC3T3-E1.  Hoạt tính kháng NF-B. Nhưng trong bài đồ án này do thời gian thực hiện có giới hạn nên chỉ nói đến hai quy trình: Quy trình đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Antimicrobial Activity assay) và Quy trình đánh giá hoạt tính gây độc tế bào (Cytotoxic activity assay). Quy trình đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật (Antimicrobial Activity assay)  Nguyên liệu: Mẫu sao biển được chuẩn bị theo một quy trình thống nhất đã được xây dựng trong khuôn khổ đề tài KC09.15 và các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm:  Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli (ATCC 25922) Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923)  Vi khuẩn Gr(+): Bacilus subtillis (ATCC 27212) Staphylococcus aureus.  Nấm sợi: Aspergillus niger, Fusarium oxysporum.  Nấm men: Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae.  Kháng sinh kiểm định:  Ampicilin đối với vi khuẩn Gr (+).  Tetracylin đối với vi khuẩn Gr (-).  Nystatin đối với nấm sợi và nấm men.  Cách pha kháng sinh: Kháng sinh pha trong dung môi DMSO 100% với nồng độ: Ampicilin: 50 mM; Tetracylin: 10 mM; Nystatin: 0.04 mM.  Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: Đồ án tốt nghiệp GVHD SVTH 27  Môi trường duy trì và bảo tồn giống: Saboraud Dextrose Broth (SDB) cho nấm men và nấm mốc. Thành phần môi trường gồm có: Polypeptone hoặc Neopeptone: 10g; Dextrone: 40g; nước cất: 1000ml, pH= 5.8.  Môi trường Trypcase Soya Broth (TSB) được sử dụng để phục hồi các chủng vi sinh. Thành phần môi trường như sau: Casein thuỷ phân 17,0 g/l, Đậu nành thuỷ phân 3,0 g/l, Sodium chloride 5 g/l, Dipotassium phosphate 2,5 g/l, Dextrose 2,5 g/l, pH 7,3.  Môi trường thí nghiệm: Eugon Broth cho vi khuẩn và Myco phil cho nấm.  Phương pháp tiến hành và đọc kết quả: Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định để đánh giá hoạt tính kháng sinh của các mẫu chiết được tiến hành trên các phiến vi lượng 96 giếng (96-well microtiter plate) theo phương pháp hiện đại của Vander Bergher và Vlietlinck (1991), hiện đang được áp dụng tại trường đại học Dược, đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ. Bước 1: Sàng lọc sơ bộ tìm mẫu (chất) có hoạt tính.  Chuẩn bị vi sinh vật: Nấm được duy trì trong môi trường dinh dưỡng đã nêu ở phần nguyên liệu và phương pháp. Các chủng kiểm định được hoạt hóa trước khi tiến hành thử nghiệm trong môi trường dinh dưỡng dịch thể đặc biệt (24 giờ đối với vi khuẩn, 48 giờ đối với nấm). Sau đó được pha loãng tới nồng độ 0,5 đơn vị Mc Fland để tiến hành thí nghiệm.  Chuẩn bị mẫu thử:  Hòa tan các chiết phẩm trong dung dịch DMSO 100% bằng máy Vortex với nồng độ 4 – 10 mg/ml.  Từ dung dịch gốc nhỏ sang phiến vi lượng 96 giếng, mỗi giếng 10 l mẫu.  Nhỏ vào mỗi giếng đã có mẫu sẵn 190 l vi sinh vật đã hoạt hóa.  Đối chứng dương: Dãy 1: Môi trường. Dãy 2: Kháng sinh + vi sinh vật kiểm định.  Đối chứng âm: chỉ có vi sinh vật kiểm định.  Để trong tủ ẩm 370C/ 24 giờ đối với vi khuẩn và 300C/ 48 giờ đối với nấm.  Đọc kết quả: Mẫu dương tính khi nhìn bằng mắt thường thấy trong suốt, không có vi sinh vật phát triển, giống như hình ảnh ở giếng chứng âm tính. Mẫu dương tính ở bước 1 sẽ được tiếp tục thử bước 2 để tính giá trị MIC (Minimmum Inhibitory Concentration). Đồ án tốt nghiệp GVHD SVTH 28 Bước 2: Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC-Minimmum Inhibitory Concentration) của mẫu (chất) có hoạt tính:  Các bước tiến hành như bước 1: Riêng các mẫu có biểu hiện dương tính ở bước 1 được pha loãng theo các thang nồng độ thấp dần, từ (5 – 10) thang nồng độ để tính giá trị ức chế tối thiểu mà ở đó vi sinh vật bị ức chế phát triển gần như hoàn toàn.  Đọc kết quả:  Nồng độ dương tính là ở đó không có vi sinh phát triển. Khi nuôi cấy lại nồng độ này trên môi trường thạch đĩa để kiểm tra, có giá trị CFU (Colony Forming Unit) < 5.  Mẫu thô có MIC ≤ 200 g/ml, mẫu tinh có MIC ≤ 50 g/ml là có hoạt tính. Quy trình đánh giá hoạt tính gây độc tế bào (Cytotoxic activity assay)  Nguyên liệu:  Dòng tế bào  Dòng KB (Human epidemoid carcinoma – Ung thư biểu mô) từ phòng thí nghiệm Bioassay trường Đại học Dược Illinois – USA.  Dòng FL (Fibril sarcoma of Uteus – Ung thư màng tử cung).  Dòng Hep-G2 (Hepatocellular carcinoma – Ung thư gan) từ Viện VSDT Trung ương.  Môi trường nuôi cấy tế bào:  D’MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) là môi trường do Dullbecco cải tiến từ môi trường E’MEM (Eagle’s Minimal Essential Medium) hiện được sử dụng chủ yếu trong việc nuôi cấy tế bào, đặc biệt là tế bào gốc. Nó có nồng độ amino acid cao gấp đôi và nồng độ vitamin cao gấp bốn môi trường E’MEM, tối ưu cho việc nuôi cấy tế bào có mật độ cao. Chính vì vậy mà D’MEM là môi trường thương phẩm thích hợp cho nuôi cấy nhiều loại tế bào động vật. Hoặc có thể thay môi trường D’MEM bằng môi trường MEME (Minimum Essential Medium with Eagle’s salt). Có bổ sung L-glutamine, Sodium piruvat, NaHCO3, PSF (Penixillin- Streptomycin sulfate-Fungizone); NAA (Non-Essential Amino Acids); 10% BCS (Bovine Calf Serum).  Tripsin  EDTA 0,05%; DMSO (Dimethyl Sulfoside); TCA (Trichloro Acetic Acid); Tris Base; PBS (Phosphate Buffered Saline); SRB (Sulfo Rhodamine B); Acid Acetic.  Các dụng cụ dùng 1 lần: Bình nuôi cấy tế bào, phiến vi lượng 96 giếng, pipet pasteur, các đầu tip cho micropipet, Đồ án tốt nghiệp GVHD SVTH 29  Chất chuẩn chứng dương tính: Dùng chất chuẩn có khả năng diệt tế bào: Elipticine hoặc Colchicine pha trong DMSO với nồng độ 0,01 mM.  Mẫu sinh vật biển: Mẫu sao biển được chuẩn bị theo một quy trình thống nhất đã xây dựng theo khuôn khổ đề tài KC09.15 và KC09.09/06-10.  Tủ ấm CO2, tủ lạnh sâu -84 0 C, tủ lạnh thường, máy li tâm, máy đọc Eliasa; Box Laminar PII, bình Nitơ lỏng, cân phân tích, máy đo pH, buồng đếm tế bào, kính hiển vi soi ngược.  Phương pháp tiến hành và đọc kết quả:  Theo phương pháp của Skehan & cộng sự (1990) và Likhiwitayawuid và cộng sự (1993) hiện đang được áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư Quốc gia của Mỹ (NCI) và trường Đại học Dược, Đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ.  Dòng tế bào được giữ trong Nitơ lỏng, đánh thức và duy trì trong các môi trường có bổ sung huyết thanh bê tươi 7 – 10%. Hòa mẫu thí nghiệm vào dung dịch DMSO 100% ( 4 – 10 mg/ml) cho bước sàng lọc sơ bộ.  Pha 10 thang nồng độ cho bước 2 để tính giá trị IC50.  Tế bào nuôi cấy cho phát triển tới mức 60 – 70%, thay môi trường sạch để hoạt hóa tế bào từ 18 – 24 giờ, lúc đó tế bào đã sẵn sàng để thực hiện thí nghiệm.  Tế bào được xử lý Tripsin 0,1% cho tách khỏi đáy bình. Hòa dung dịch huyền phù tế bào bằng môi trường sạch, rửa và đếm số lượng, pha tế bào nồng độ 3x10 4 tế bào/ml đối với dòng KB, 4x104 tế bào/ml đối với dòng FL.  Thêm vào các giếng đã có chất chuẩn bị sẵn ở trên 190 l dung dịch huyền phù tế bào.  Phiến được ủ trong tủ CO2 thêm 3 ngày.  Kết thúc thí nghiệm: Tế bào khi ủ 3 ngày được cố định bằng dung dịch TCA lạnh (30 – 50%). Rửa, để khô, nhuộm SRB 0,4% trong acid acetic 1% và rửa lại bằng acid acetic để lại mẫu thừa; để khô, hòa lại bằng dung dịch đệm Tris base 10 mM.  Đọc trên máy ELISA ở bước sóng 495 – 515 nm. Đồ án tốt nghiệp GVHD SVTH 30  Tính kết quả:  Giá trị CS: Là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của chất thử tính theo % so với đối chứng. Dựa trên kết quả đo được của chúng OD (ngày 0), DMSO 10% và so sánh với giá trị mật độ quang OD (Optical Density) khi trộn để tìm giá trị CS (%) theo công thức: ( ) ( ) ( ) ( )  Giá trị CS% sau khi tính theo công thức trên, được đưa vào tính toán Excel để tìm ra % trung bình  độ lệch chuẩn của phép thử được lặp lại 3 lần theo công thức của Ducan như sau: Độ lệch chuẩn  √ ∑( ̅)  Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS < 50%) sẽ được chọn ra để thử nghiệm tiếp để tìm giá trị IC50.  Giá trị IC50: Dùng giá trị CS của 10 thang nồng độ, dựa vào chương trình Table Curve theo thang giá trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử để tính giá trị IC50. Giá trị IC50 ≤ 20 g/ml đối với mẫu thô và ≤ 4 g/ml đối với mẫu chất sạch được coi là mẫu có hoạt tính. Công thức: Trong đó: Y: Nồng độ chất thử; X: Giá trị CS (%) Đồ án tốt nghiệp GVHD SVTH 31 Chƣơng 3. KẾT LUẬN & ĐỀ NGHỊ Đồ án tốt nghiệp GVHD SVTH 32 KẾT LUẬN Qua thời gian thực hiện đề tà tốt nghiệp, những nội dung mà đồ án đã thực hiện được gồm: Tìm hiểu được đặc điểm, phân loại, phân bố, ứng dụng của một số loài sao biển thuộc bốn bộ phổ biến ở Việt Nam là: 1. Bộ Forcipulatida có  Họ Asteridae có 2 loài sao biển: Asterias forbesi, Asterias rubens.  Họ Pisasteridae có loài sao biển Pisaster ochraceus (Sao biển tía). 2. Bộ Valvatida có các họ Oreasteridae, Ophidiasteridae, Archasteridae và Acanthasteridae.  Họ Archasteridae có loài sao biển Archaster typicus.  Họ Ophidiasteridae có loài sao biển Linckia laevigata (Sao biển xanh).  Họ Acanthasteridae có loài sao biển Acanthaster planci (Sao biển gai).  Họ Oreasteridae có 2 loài sao biển: Culcita novaeguineae (Sao biển gối), Protoreaster nodosus (Sao biển chocolate chip). 3. Bộ Paxillosida có họ Astropectinidae.  Loài sao biển Astropecten polyacanthus. 4. Bộ Spinulosida có họ Echinasteridae.  Loài sao biển Echinaster luzonicus. Tìm hiểu quy trình công nghệ sản xuất các sản phẩm từ sao biển.  Qua đó tìm hiểu được quy trình sản xuất sao biển khô. Nguyên liệu  Rửa  Làm khô 1  Ngâm rượu  Làm khô 2  Thành phẩm. Sản phẩm làm ra thường dùng để làm quà lưu niệm hay trong trang trí nội thất,  Cũng như, tìm hiểu quy trình chiết tách và sàng lọc hoạt tính sinh học các hợp chất sinh học từ sao biển. Nắm được các bước cơ bản để xử lấy mẫu và chiết tách các hợp chất từ mẫu sao biển nói riêng và các mẫu sinh vật biển nói chung. Ngoài ra, còn biết được các loại hoạt tính sinh học thường dùng để sàng lọc hoạt tính sinh học là:  Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Antimicrobial Activity assay).  Hoạt tính gây độc tế bào (Cytotoxic activity assay).  Hoạt tính chống oxy hóa của các mẫu sinh vật biển thông qua phản ứng bao vây gốc tự do DPPH (Antioxidant activity assay – DPPH free radical scavenging).  Hoạt tính chống loãng xương thông qua các cơ chế kích thích sự khác biệt hóa của nguyên bào xương MC3T3-E1.  Hoạt tính kháng NF-B. Đồ án tốt nghiệp GVHD SVTH 33 Do thời gian thực hiện, tìm hiểu có giới hạn nên trong bài đồ án chỉ trình bày quy trình đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Antimicrobial Activity assay) và quy tình đánh giá hoạt tính gây độc tế bào (Cytotoxic activity assay). ĐỀ NGHỊ Qua quá trình thực hiện đề tài, em nhận thấy sự quan tâm trong nước đến loài sao biển còn khá ít. Việc thống kê số lượng về các bộ, họ, loài còn rất ít cũng như tìm hiểu về đặc điểm, phân loại, phân bố của từng loài. Chỉ mới có một vài nghiên cứu tập trung khai thác các hợp chất từ sao biển để ứng dụng trong y học (sản xuất thực phẩm chức năng). Nguồn hải sản sao biển cũng là một trong những nguồn lợi mà thiên nhiên ban tặng cho nước ra với số lượng loài cũng khá đa dạng (khoảng 60 loài). Việc tìm hiểu sâu hơn về từng loài sao biển ở nước ta sẽ giúp biết được loài nào tốt để tìm hướng khai thác còn loài nào có ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe con người và môi trường sinh thái thì cần phải cảnh báo để người dân biết phòng tránh. Bên cạnh đó, ngoài việc sử dụng sao biển dùng làm các mặt hàng mỹ nghệ cũng như sử dụng sao biển theo các cách dân gian như ngâm rượu thì sao biển còn có thể sử dụng như một dạng thực phẩm vừa lạ, vừa tốt cho sức khỏe. Đồ án tốt nghiệp GVHD SVTH 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Đào Tấn Hổ, 1994. Danh mục động vật da gai Việt Nam, Tập I, NXB Khoa học và kỹ thuật. [2] GS.TS. Châu Văn Minh (2009), Nghiên cứu sàng lọc các chất có hoạt tính sinh học theo định hướng kháng sinh, gây độc tế bào và chống ôxy hóa từ sinh vật biển nhằm tạo các sản phẩm có giá trị dược dụng, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên và Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội.