Đề tài Tối ưu hóa phản ứng Dansyl-Amino acid dùng để phân tích Amino acid của trùn quế ( Perionyx excavatus ) bằng phương pháp HPLC

mạng lưới mao mạch dưới da tạo điều kiện trao đổi khí qua da. Hệ hô hấp: không có cơ quan hô hấp riêng, trùn hô hấp qua da. O2 trong môi trường được hòa tan vào chất nhầy trên bề mặt cơ thể trùn, sau đó thấm vào hệ thống mạch máu phân nhánh li ti bên trong rồi được vận chuyển đến các cơ quan; việc thải CO2 cũng thông qua một tiến trình tương tự. Hệ bài tiết: trùn bài tiết chất thải chứa đạm dưới dạng ammoniac và urê qua các cặp thận ở các đốt. Hệ thần kinh: gồm hạch não, chuỗi hạch thần kinh bụng và dây thần kinh cùng với cơ quan cảm giác và cung phản xạ, trong hệ thần kinh còn có một số tế bào tiết ra các kích thích tố ảnh hưởng rất lớn đối với sinh sản và tái sinh sản. LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -11- Đáng chú ý là trùn Quế không có mắt nhưng vẫn có cảm giác với ánh sáng nhờ tế bào cảm nhận ánh sáng nằm phân tán dưới da. Hệ sinh dục: trùn Quế là loài động vật lưỡng tính, do đó chúng thụ tinh chéo để sinh sản, tuyến sinh dục tập trung ở một số đốt và có hệ thống dẫn tinh riêng. Cơ quan sinh dục cái gồm: buồng trứng, ống dẫn trứng, túi nhận tinh. Cơ quan sinh dục đực gồm có: tinh hoàn, túi chứa tinh, ống dẫn tinh và tiến liệt tuyến. Cơ quan sinh dục nằm ở phần trước của cơ thể. 1.1.1.3 Đặc tính sinh lý trùn Quế Trùn Quế thường sống trên mặt đất, thích sống nơi môi trường ẩm ướt, tối, có nhiều chất hữu cơ đang phân hủy và độ pH ổn định. Tế bào da của trùn Quế rất mỏng, thường xuyên tiết ra chất nhờn để bảo vệ cơ thể và thích ứng với điều kiện chui rúc trong môi trường tối và ẩm thấp do đó trùn Quế rất nhạy cảm, phản ứng mạnh với ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm. • pH: trùn Quế chịu được phổ pH khá rộng từ 4-9 thích hợp nhất là 6,8-7,5. Nếu pH quá thấp chúng sẽ bỏ đi. • Nhiệt độ: bình thường trùn Quế sống trong phạm vi nhiệt độ từ 5-30°C, nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng và sinh sản của trùn là 25-30°C, trong điều kiện khí hậu nhiệt đới tương đối ổn định và có độ ẩm cao như điều kiện của khu vực phía Nam, chúng sinh trưởng và sinh sản rất nhanh. • Độ ẩm: nước là thành phần quan trọng chiếm 75-90% khối lượng cơ thể trùn Quế, độ ẩm thích hợp nhất cho trùn Quế sinh trưởng và sinh sản là 60-70%. • Không khí: trùn Quế hô hấp qua da, chúng có khả năng hấp thu ôxy và thải CO2, do đó môi trường sống của chúng đòi hỏi phải thoáng khí, lưu ý các chất khí có hại cho trùn như: Clor (Cl2), amoniac (NH3), H2S, SO2, SO3, CH4, . . . LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -12- 1.1.3 SỰ SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN VÀ SINH SẢN 1.1.3.1 Sự sinh trưởng, phát triển của trùn Quế Trùn Quế sinh trưởng bằng phương thức tăng số lượng đốt thân hoặc tăng tiết diện đốt thân. Phương thức sinh sản của trùn Quế gồm sinh sản hữu tính và vô tính. Trong quá trình sinh trưởng, thể trọng và thể tích của trùn Quế tăng lên. Khi xuất hiện đai sinh dục là lúc trùn đã thành thục sinh dục. Sau đó, cùng với thời gian, đai sinh dục thoái hóa chứng tỏ trùn đã già. Trước khi trùn chết, khối lượng cơ thể giảm sút. Trong tự nhiên, vào mùa thu và mùa xuân trùn tăng trưởng nhanh, trong mùa đông và mùa hè trùn tăng trưởng chậm hơn. Trùn Quế có khả năng tái sinh một bộ phận nào đó bị tổn thương hoặc bị cắt đứt. 1.1.3.2 Sự sinh sản Trùn Quế là loài sinh vật lưỡng tính có đai và các lỗ sinh dục nằm ở phía đầu cơ thể, chúng giao phối chéo với nhau để hình thành kén ở mỗi con. Việc thụ tinh diễn ra ở đai sinh dục và đai hình thành kén có dạng quả lê, kén di chuyển dần về phía đầu, nhận tinh dịch qua túi nhận tinh rồi rơi ra đất và thắt lại. Kén trùn Quế thon dài, một đầu tròn và đầu kia nhọn hơn, nhìn giống như hạt bông cỏ, kích thước khoảng 1mm, ban đầu có màu trắng đục, sau chuyển sang xanh nhạt, vàng ngọc trai, sau đó chuyển thành màu xanh lục nhạt hoặc nâu nhạt rồi nâu sẫm khi kén sắp nở. Trọng lượng kén trùn Quế nặng từ 2,2-2,6mg. Thời gian nở hoàn toàn khác nhau tùy thuộc vào điều kiện môi trường, nhiệt độ, độ ẩm. Trong điều kiện bình thường thời gian nở ra ấu trùng của trùn Quế (Perionyx excavatus) là 2-3 tuần, mỗi kén trùn chứa từ 1-20 trùn con. Khi nhiệt độ tăng thì thời gian trung bình kén nở giảm và tỉ lệ kén nở tăng. Số kén, tỉ lệ kén nở và tỉ lệ sinh sản mỗi tuần của trùn Quế trên chất hữu cơ động vật và thực vật đều cao hơn so với một số loài trùn khác. LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -13- Bảng 1.1. Tỉ lệ sinh sản của trùn Quế trên chất hữu cơ động vật và thực vật Loài % số kén % kén nở % kén không nở Tỉ lệ sinh sản mỗi tuần Eisenia fetida 3,8 83,2 3,3 10,4 Eudrilus eugeniae 3,6 81,0 2,3 6,7 Excavatus perionyx 19,5 90,7 1,1 19,4 Dendrobaena veneta 1,6 81,2 1,1 1,4 Nguồn: Vermicomposting of Organic Wastes, Thomas E, Herlihy, Joyce Engineering, 2301 W, Meadowview Rd, Suite 203 Greensboro, NC 27407) Ngoài ra, thời gian kén nở, thời gian trùn trưởng thành và tổng thời gian tính từ giai đoạn trứng đến giai đoạn trưởng thành của trùn Quế ngắn hơn so với các loài trùn khác. Bảng 1.2. Thời gian kén nở, thời gian trùn trưởng thành và tổng thời gian từ giai đoạn trứng đến giai đoạn trưởng thành của trùn Quế Loài Thời gian kén nở (ngày) Thời gian trùn trưởng thành (ngày) Tổng thời gian từ giai đoạn trứng đến khi trưởng thành (ngày) Eisenia fetida 32 – 73 53 – 76 85 – 149 Eudrilus eugeniae 13 – 27 32 – 95 43 – 122 Perionyx excavatus 16 – 21 28 – 56 44 – 71 Dendrobaena veneta 40 – 126 57 – 86 97 – 214 Nguồn: Vermicomposting of Organic Wastes, Thomas E, Herlihy, Joyce Engineering, 2301 W, Meadowview Rd, Suite 203 Greensboro, NC(7407) Trùn Quế trưởng thành nặng từ 0,08-0,12g, trùn nhỏ nặng dưới 0,05g. Trùn con khi mới nở nhỏ như đầu kim, màu trắng, khoảng 2-3mm, sau 5-7 ngày cơ thể chuyển dần sang màu đỏ và bắt đầu xuất hiện một lằn đỏ thẳm trên lưng, dài 1-2cm. LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -14- Trùn Quế sinh trưởng bằng cách tăng số lượng đốt thân hoặc tăng tiết diện đốt, Khoảng 15-30 ngày sau, chúng trưởng thành, bắt đầu xuất hiện đai sinh dục, đã bắt đầu có thể bắt cặp và sinh sản (Arellano, 1997). Sau 60 ngày, trùn Quế đạt 8-10cm (thu hoạch trùn thịt lúc này là tốt nhất). Từ 70-90 ngày trùn Quế bắt đầu đẻ nhưng tỉ lệ trứng nở thấp. Từ 90 ngày tuổi trở đi, trùn Quế trở thành bố mẹ hoàn chỉnh, đẻ rất khỏe (1 tuần đẻ 1 lần) và tỉ lệ trứng nở cao nếu được chăm sóc, nuôi dưỡng tốt. 1.1.3.3 Tập tính ăn Trùn Quế thích nghi với phổ thức ăn khá rộng, chúng có thể ăn bất kỳ chất thải hữu cơ nào có thể phân hủy trong tự nhiên như phân gia súc, gia cầm, rác mục... Tuy nhiên, thức ăn có hàm lượng dinh dưỡng cao sẽ hấp dẫn chúng và giúp chúng sinh trưởng và sinh sản tốt hơn. Trùn Quế không đào hang sâu mà thường sống ở phía trên lớp mặt đất, những nơi ẩm thấp, gần cống rãnh, nơi có nhiều chất hữu cơ dễ phân hủy và thối rữa như trong đống phân động vật, rác hoai mục… 1.1.4 KỸ THUẬT NUÔI TRÙN QUẾ 1.1.4.1 Chuẩn bị môi trường nuôi Nuôi trùn Quế trong khay, chậu, hộp nhựa Sử dụng các dụng cụ đơn giản, rẻ tiền như thùng gỗ, thau chậu, thùng xô, hộp nhựa .... Các thùng gỗ chỉ nên có kích thước vừa phải (ví dụ thùng có kích thước 0,2-0,4m2, cao 0,3m loại thùng này có thể chứa được 10.000 con trùn), chúng được đặt trên các khung nhiều tầng để dễ chăm sóc và tận dụng không gian, đáy hộp có khoan nhiều lỗ thoát nước, bốn góc hộp có chân cao 5cm để khi chồng lên nhau vẫn có kẻ hỡ để thông khí, bên dưới hộp có lót khay để hứng nước từ các hộp chảy xuống. Hộp nhựa có những lỗ thoáng khí xung quanh, lỗ thoát nước phía dưới, sử dụng chất nền ẩm xốp trải đều trên đáy hộp với độ dày khoảng 2,5-5cm, rồi cho đất hoặc phân trộn vào, thêm thức ăn vào và trộn các thành phần lại với nhau, sau đó cho trùn vào hộp, che phủ để tạo bóng tối cho trùn phát triển, thường xuyên giữ ẩm LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -15- và kiểm tra lỗ thoáng khí, lỗ thoát nước, giữ nhiệt độ từ 15-25°C. Sau 4-8 tuần thì thu hoạch. Nuôi trùn Quế trong chum vại, chậu hoa Dùng chum vại bằng đất, sành sứ để nuôi trùn, kích cỡ chum vại hay đổi theo điều kiện cụ thể. Khi nuôi lưu ý tưới nước để đảm bảo độ ẩm, nhưng nếu tưới nhiều lại không thể thoát nước kịp ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của trùn. Sau 1-2 tháng khi trùn phát triển nhiều thì sang trùn ra chậu khác để tiếp tục nuôi. Nuôi trùn Quế ở đồng ruộng có mái che Dụng cụ: luống nuôi trong đất hoặc làm bằng các vật liệu nhẹ như gỗ, bạt không thấm nước . . . bề ngang 1-2m, sâu (hoặc cao) khoảng 30-40cm, chiều dài 2m. Luống có nền cứng, phẳng, đáy lát lớp hồ non, hơi nghiêng một chút để thoát nước. Sát đáy về phía thấp làm những lỗ hoặc khe ở thành luống để chống đọng nước trong luống. Mái che nên làm ở dạng cơ động dễ di chuyển, thay đổi trong những thời tiết khác nhau. Đồng ruộng không có mái che Dụng cụ: luống nuôi có thể nổi hoặc chìm, bề ngang 1-2m, chiều dài thường không giới hạn mà tùy theo diện tích nuôi. Ưu điểm: Không phải làm lán trại, có thể sử dụng các trang thiết bị cơ giới để chăm sóc và thu hoạch. Khuyết điểm: bị tác động mạnh bởi yếu tố thời tiết, có thể gây tổn hại đến trùn, cần diện tích tương đối lớn. Nuôi trong nhà với quy mô công nghiệp và bán công nghiệp Là dạng cải tiến và mở rộng của luống nuôi có mái che trên đồng ruộng và nuôi trong thau chậu. Hiện nay quy mô nuôi công nghiệp với những trang thiết bị hiện đại được áp dụng khá phổ biến ở các nước phát triển như Mỹ, Úc, Canada. Dụng cụ: Khung (bồn) nuôi có thể được xây dựng kiên cố trên mặt đất có kích thước rộng hơn hoặc được sắp thành nhiều tầng. LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -16- Ưu điểm: Việc chăm sóc có thể thực hiện bằng tay hoặc hệ thống tự động tuỳ theo quy mô, chủ động được điều kiện nuôi, chăm sóc tốt, nuôi theo quy mô lớn. Khuyết điểm: chi phí xây dựng cao. a/ Chất nền và cách ủ chất nền Chất nền Là yếu tố quan trọng cho trùn trong thời gian đầu sinh sống, là nơi ở tạm thời và lâu dài của trùn Quế nhằm tránh những điều kiện bất lợi của ngoại cảnh như ánh sáng, nóng, lạnh, đồng thời chất nền là nguồn cung cấp thức ăn ban đầu khi mới thả trùn vào ô nuôi. Do đó chất nền phải sạch, giàu dinh dưỡng, tơi xốp nhưng đảm bảo độ ẩm, không mặn, không độc hại và có pH thích hợp cho trùn sinh trưởng và phát triển. Vật liệu thường dùng làm chất nền như: giấy báo, giấy carton vụn, lá cây, các cây thực vật ủ hoai kỹ có độ ẩm 70%, rơm rạ mục, cỏ mục, đất mùn, tảo biển băm nhỏ, mùn cưa, than bùn, bã xơ dừa hay vỏ đậu phộng, phân của chính trùn Quế. . . . Chất nền tốt nhất là phân động vật qua thời kì ủ nóng. Một số công thức ủ chất nền: 70% phân bò + 30% phụ phẩm thực vật 70% phân heo + 30% phụ phẩm thực vật 60% phân gà + 40% phụ phẩm thực vật. Cách ủ chất nền Cách ủ: dùng phương pháp chất đống, xếp một lớp thực vật (rơm, rạ, lá cây,… băm nhỏ) dày 20cm, sau đó xếp một lớp phân gia súc dày 10cm lên trên, không nên nén nguyên liệu quá chặt. Phun nước vào đống ủ để đạt độ ẩm 50-60%, có thể phun đều chế phẩm EM 1% để giúp phân mau hoai và diệt mầm bệnh. Khi hố đầy dùng nylon phủ kín xung quanh để bảo đảm nhiệt độ và độ ẩm thích hợp, dùng cọc tre nhọn xuyên một lỗ thủng từ đỉnh xuống đáy để làm chỗ tưới nước mỗi ngày cho đống ủ. Khi ủ vừa tưới vừa lắc thanh tre nhằm làm cho nước ngầm đều hố ủ. Cần LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -17- đảo đống ủ khoảng 15 ngày một lần và tưới thêm nước để thúc đẩy vi sinh vật phát triển làm đống ủ mau hoai mục. Việc ủ hoàn thành khi đống ủ không còn nóng. Phân ủ có màu nâu và không còn mùi hôi của phân. Thông thường, thời gian ủ là từ 20-30 ngày. b/ Phương pháp cho trùn Quế ăn Một tuần sau khi thả giống không cần phải cho trùn ăn, nên để trùn ăn hết chất nền. Từ tuần thứ 2 trở đi cần kiểm tra 2-3 ngày 1 lần và cho ăn khi thấy trùn đã ăn hết thức ăn. Thường thì lượng thức ăn hàng ngày bằng với trọng lượng trùn. Cách cho ăn: Rải một lớp thức ăn dày khoảng 5-6cm trên bề mặt ô nuôi mà nên cho ăn thành từng cụm, thức ăn có thể khô hoặc sệt. Đậy ô nuôi lại sau khi cho ăn. Không nên cho ăn khi lượng thức ăn cũ còn nhiều. Nếu thức ăn cũ tồn đọng phía dưới, trùn chỉ tập trung ăn và sống phía dưới mà không sống trên bề mặt, và như vậy trùn sẽ giảm khả năng sinh sản. Thời gian cho ăn vào mùa hè từ 3-5 ngày cho ăn 1 lần, lượng cho ăn bón trên bề mặt luống 1 lớp dày 2-3cm. Sau khi cho ăn xong che phủ lại và tưới ẩm. Vào mùa đông lượng thức ăn cho trùn Quế ăn ít hơn, dày khoảng 5cm và bón phủ đầy luống trùn, thời gian cho ăn thưa hơn mùa hè. Thức ăn cho trùn: Thức ăn thông thường của trùn Quế rất đa dạng, gồm: phân bò, trâu, dê, heo, gà, vịt, rơm rạ mục, cỏ dại, cỏ khô, vỏ trái cây, bùn biogas, rau quả thối rữa, thức ăn thừa . . . Một số công thức thức ăn cho trùn Quế • Bùn biogas + đất trồng + lá cây • Phân bò sữa + phân cừu + phân ngựa trộn với tỉ lệ bằng nhau • Phân bò sữa + chất thải nông nghiệp với tỉ lệ 10 : 3 • Phân bò sữa + chất thải nông nghiệp với tỉ lệ 10 : 3 • Phân bò sữa + cám đậu xanh trộn với tỉ lệ 10 : 3 • Phân bò sữa + thức ăn thừa trộn với tỉ lệ 10 : 3 LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -18- • Phân bò sữa + nước vo gạo trộn với tỉ lệ 10 : 3 • Phân bò sữa + lá cây đang phân huỷ trộn với tỉ lệ 10 : 3 • Phân bò sữa + bùn có nguồn gốc từ cống trộn với tỉ lệ 10 : 3 • Phân bò sữa + rau quả đang phân huỷ trộn với tỉ lệ 10 : 3 • Phân bò sữa + cám mì trộn với tỉ lệ 10 : 3 • Phân bò sữa đã ủ ít nhất 7 ngày • Chất tải nông nghiệp + bùn có nguồn gốc từ cống + thức ăn thừa + lá cây phân huỷ • Cỏ dại + lá cây + Phân bò sữa trộn với tỉ lệ 70 : 15 : 15 • Tốt nhất là: Phân bò sữa + cám mì + cám đậu xanh + rau quả hư trộn với tỉ lệ 10 : 1 : 1 : 1 + bột vỏ trứng. Nguồn: Growth and reproduction of Perionyx excavatus in organic waste management, C. A. Edward 7 J. Dominguez 7 E. F. Neuhauser (16 July 1997). c/ Các yếu tố môi trường sống Nhiệt độ: duy trì ở nhiệt độ 25-280C để trùn sinh trưởng và sinh sản. Độ ẩm: nước là thành phần quan trọng chiếm 75-90% khối lượng cơ thể trùn. Trùn Quế cần độ ẩm là 60-70%. Nhiệt độ và độ ẩm có quan hệ lẫn nhau trên sự sinh trưởng và sinh sản của trùn, trong đó độ ẩm là một trong những nguyên nhân làm tăng hay giảm sản lượng của trùn quế. Độ chiếu sáng: che phủ luống nuôi trùn để tránh tia tử ngoại của ánh sáng mặt trời rất có hại cho trùn và có khả năng giết chết trùn. Không khí: ảnh hưởng đến sinh trường và sinh sản của trùn chủ yếu là hàm lượng O2 và CO2 có trong không khí, lưu ý các chất khí có hại cho trùn như: Clor(Cl2), amoniac(NH3), H2S, SO2, SO3, CH4. Đây cũng là nguyên nhân trùn không thích ăn thức ăn có mùi (nhất là NH3). Độ pH: trùn quế thích hợp nhất và sống tốt ở pH = 7. LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -19- 1.1.5 Bệnh của trùn Quế Trùn Quế có thể mắc một số bệnh như: 9 Bệnh no hơi: do trùn ăn nhằm những loại thức ăn quá giàu đạm như phân bò sữa, phân heo. 9 Bệnh trúng khí độc: do đáy chất nền đã bị thối rữa, trong thời gian dài chất nền thiếu O2. 9 Ngộ độc muối. 9 Bệnh bại máu do vi khuẩn. 9 Bệnh do nấm. 9 Bệnh ký sinh trùng. 1.1.6 ỨNG DỤNG CỦA TRÙN QUẾ TRONG THỰC PHẨM VÀ TRỊ LIỆU Trùn Quế là loại thực phẩm có hàm lượng đạm cao, giàu nguyên tố khóang vi lượng, ít chất béo. Trong trùn Quế có nhiều loại amino acid cần thiết cho con người. Trong thịt trùn Quế có chứa hàm lượng vitamin B1, B2, A, C, E cao. Vì vậy ở nhiều nước trên thế giới đã sử dụng trùn Quế để chế biến thành thực phẩm cho con người. Ở Nhật có tới 200 loại thực phẩm chế biến từ Trùn quế. Ở Ý trùn Quế còn được chế biến thành patê. Ở Úc người ta ăn trùn Quế với món ốp lết. Ở Hàn Quốc có món cháo trùn. Hiện nay trên thị trường đã có bán bánh bích qui có hàm lượng trùn Quế. Nhiều nhà dinh dưỡng học trên thế giới dự đoán: trùn Quế là loại động vật dinh dưỡng cao, dễ nuôi trong tương lai sẽ là nguồn thực phẩm quan trọng, phổ biến và quý giá của loài người. Y học cổ truyền của nhiều nước, đã dùng trùn Quế để chữa các bệnh về tim mạch, huyết áp, thần kinh, kháng ung thư, hen suyễn và thấp khớp, thương hàn.... LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -20- Tại Trung Quốc, người ta đã sử dụng trùn Quế trong các bài thuốc chữa bệnh. Theo y học cổ truyền ở Việt Nam, trùn Quế được sử dụng trong một số bài thuốc chữa sốt rét, sốt nóng, suy nhược cơ thể, cao huyết áp, tai biến mạch máu não, viêm tắc mạch....Trùn Quế còn chứa enzim Proteaz có thể thuỷ phân đặc hiệu sỏi Fibrin với hoạt tính rất cao. Ở các nước phương Tây, nhờ khoa học kỹ thuật phát triển người ta đã biết sử dụng trùn Quế vào việc chế biến một số loại thuốc tây và mỹ phẩm. Nhật và Canada là hai quốc gia sử dụng trùn Quế nhiều nhất trên thế giới trong việc chế biến mỹ phẩm và dược phẩm. Thịt trùn Quế có khả năng giúp tăng tuần hoàn máu ngoại vi của bề mặt cơ thể, có tác dụng giải nhiệt, hạ sốt. Dịch ngâm nước của trùn quế có tác dụng giảm đau. Dịch ngâm cồn của trùn Quế có tác dụng làm thuốc trị bệnh xơ vữa động mạch và hàm lượng mỡ trong máu cao. Trùn Quế được sử dụng để bổ sung vào trong thực phẩm cho trẻ em giúp tăng sức đề kháng, chống suy dinh dưỡng, phát triển hệ cơ, giảm hội chứng thiểu năng trí tuệ. Việc bổ sung thịt trùn Quế vào trong thực phẩm cho các vận động viên thể thao giúp tăng cường sức khoẻ, bồi bổ sinh lực, tăng khả năng chịu đựng của cơ bắp. Giúp người bệnh mau phục hồi sức khoẻ. 1.2 VAI TRÒ CỦA CÁC AMINO ACID TRONG TRÙN QUẾ Trong trùn Quế có nhiều amino acid như: aspartic acid, threonin, serin, glutamic acid, glycin, valin, methionin, isoleucin, leucin, cystin....... Chúng tham dự vào nhiều quá trình chuyển hóa trong cơ thể như tổng hợp các chất dẫn truyền thần kinh, đổi mới các sợi cơ bắp. LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -21- 9 Isoleucin và Leucin giúp điều hoà nồng độ đường trong máu, phát triển và phục hồi các mô cơ, tránh sự phá vỡ protein ở những người bị stress hay bị chấn động tâm lý. 9 Lysin cần thiết cho sự phát triển xương của trẻ, hỗ trợ sự hấp thụ canxi, duy trì sự cân bằng nitơ trong cơ thể. Lysin giúp ăn ngon miệng, gia tăng chuyển hoá và hấp thu tối đa chất dinh dưỡng và phát triển chiều cao. 9 Methionin tăng cường tổng hợp gluthation và được sử dụng thay thế cho acetylcystein để điều trị ngộ độc paracetamol đề phòng tổn thương gan. Chính vì thế methionin là loại thuốc giải độc paracetamol. Và methionin còn dùng theo đường uống để làm giảm pH nước tiểu. 9 Phenylalanin tốt cho trí nhớ, trị được bệnh Parkinson (bệnh mãn tính về hệ thần kinh làm các cơ rung và yếu). 9 Threonin giúp duy trì sự cân bằng protein trong cơ thể, hỗ trợ sự hình thành collagen và eleastin trong da. Khi có sự kết hợp threonin với aspartic và methionin, chúng có chức năng hỗ trợ hệ thống miễn dịch bằng cách sản xuất chất kháng sinh. Các chất dinh dưỡng khác cũng được hấp thụ tốt hơn khi có sự hiện diện của threonin. 9 Valin có chức năng phục hồi và phát triển mô cơ, duy trì sự cân bằng nitrogen trong cơ thể. 9 Glutamic acid giữ vai trò quan trọng trong việc chuyển hóa ở tế bào thần kinh và não. Thường được dùng trong các trường hợp suy nhược chức năng thần kinh, trẻ em chậm phát triển cơ thể hoặc trí óc, rối loạn chức năng gan, hôn mê gan. 9 Arginin là acid amin tham gia vào chu trình tạo ra urê ở gan (chức năng giải độc amoniac của gan) nên có tác dụng điều hòa nồng độ amoniac ở máu, thúc đẩy quá trình tổng hợp protid ở cơ thể, điều trị các rối loạn chức năng gan. 9 Cystin giúp làm đẹp da, tóc, móng. Cystin giúp tăng cường sinh lực, giải độc gan nhờ chứa gốc giải độc lưu huỳnh (-SH) và có tác dụng chống viêm. Nhờ đó cystin có hiệu quả trong việc điều trị mụn nhọt, viêm da do tác dụng phụ của thuốc LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -22- hoặc do tác nhân của môi trường sống. Ngoài ra cystin cũng còn được dùng trong việc điều trị rụng tóc theo đường uống, góp phần tổng hợp kératin của lông, tóc, kích thích sự tăng trưởng của lông, tóc cũng như tế bào biểu bì. 9 Tyrosin có khả năng tăng tuần hoàn máu ngoại vi của bề mặt cơ thể, có tác dụng giải nhiệt, hạ sốt. -Kết hợp arginin, aspartic acid và ornithin giúp giải độc gan, trung hòa lượng amoniac thừa trong cơ thể và góp phần hỗ trợ điều trị viêm gan, xơ gan, giải độc gan, làm giảm cholesterol giúp ăn ngon, chống béo phì, không bị sạm da. -Kết hợp cystin, methionin, cholin và phenylalanin giúp giải độc gan, vừa giúp tạo lập acetylcholin là chất dẫn truyền thần kinh quan trọng, ngoài ra còn phụ trị tai biến mạch máu não. -Kết hợp lysin, glycin, histidin, alanin, arginin, acid aspartic, cystin và cystin giúp điều trị các bệnh về da và các bệnh lý về thần kinh. -Kết hợp alanin, glycin và glutamic acid giúp giảm bớt các triệu chứng của bệnh phì đại tuyến tiền liệt. -Kết hợp arginin và glutamic acid có tác dụng khử độc cho các bắp thịt. -Kết hợp tyrosin-cholin dùng để tổng hợp acétylcholine, là chất dẫn truyền thần kinh, dùng để chữa trị cho bệnh nhân bị suy nhược thần kinh . Như vậy các amino acid quan trọng có trong trùn Quế đóng vai trò quan trọng trong biến dưỡng, mang lại hiệu quả cao trong việc điều hòa các chức năng sinh lý của cơ thể, dùng để chữa trị trong các trường hợp suy dinh dưỡng, suy nhược, mệt mỏi, thời kỳ bệnh hay hồi phục, trong thai kỳ và cho con bú, suy gan, người già yếu cao tuổi, vận động viên thể thao. Cấu trúc các loại amino acid: LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -23- H2N CHC CH3 OH O H2N CHC CH2 OH O CH2 CH2 NH C NH2 NH H2N CHC CH2 OH O C NH2 O H2N CHC CH2 OH O C OH O H2N CHC CH2 OH O SH Alanine (Ala) Arginine (Arg) Asparagine (Asn) Aspartic acid (Asp) Cystein (Cys) H2N CHC CH2 OH O CH2 C OH O H2N CHC CH2 OH O CH2 C NH2 O H2N CHC H OH O H2N CHC CH2 OH O N NH H2N CHC CH OH O CH3 CH2 CH3 H2N CHC CH2 OH O CHCH3 CH3 Glutamic acid (Glu) Glutamine (Gln) Glycine (Gly) Histidine (His) Isoleusine (Ile) H2N CHC CH2 OH O CH2 CH2 CH2 NH2 H2N CHC CH2 OH O CH2 S CH3 H2N CHC CH2 OH O HN C OH O Leucine (Leu) Lysine (Lys) Methionine (Met) Phenylalanine (Phe) Proline (Pro) H2N CHC CH2 OH O OH H2N CHC CH OH O OH CH3 H2N CHC CH2 OH O HN H2N CHC CH2 OH O OH H2N CHC CH OH O CH3 CH3 Serine (Ser) Threonine (Thr) Tryptophan (Trp) Tyrosine (Tyr) Valine (Val) LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -24- 1.3 PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN AMINO ACID TRONG TRÙN QUẾ Để phân tích thành phần amino acid trong trùn Quế, người ta thường dùng các phương pháp sắc ký như sắc ký bản mỏng, sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu năng cao. 1.3.1 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ BẢN MỎNG Phương pháp sắc ký bản mỏng nhuộm màu với thuốc thử Ninhydrin có thể định tính, bán định lượng đồng thời nhiều amino acid từ dịch thủy phân protein. Phương pháp này thường được sử dụng trong kiểm nghiệm thực phẩm, nghiên cứu sinh hóa trước đây. Để tăng độ phân giải giữa các amino acid, người ta phải dùng sắc ký hai chiều với hai hệ dung môi khác nhau. Trong phương pháp sắc ký bản mỏng có ba hệ dung môi thường được sử dụng là phenol/nước, collidin, butanol/acid acetic/nước. Tuỳ theo hệ dung môi các amino acid có thứ tự và giá trị Rf khác nhau được trình bày ở bảng 1.3 LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -25- Bảng 1.3. Tương quan giữa giá trị Rf và hệ dung môi Phenol/nước Collidin Butanol/acetic/nước Asp 0,12 Lys 0,14 Lys 0,06 Glu 0,13 Arg 0,16 Asp 0,07 Ser 0,33 Asp 0,22 His 0,08 Gly 0,40 Glu 0,25 Arg 0,10 Thr 0,41 Gly 0,25 H-Pro 0,11 H-Pro 0,50 His 0,28 Gly 0,12 Ala 0,54 Ser 0,28 Ser 0,12 Tyr 0,63 Ala 0,32 Glu 0,14 His 0,68 Thr 0,32 Pro 0,15 Met 0,76 H-Pro 0,34 Thr 0,15 Val 0,76 Pro 0,35 Ala 0,19 Ile 0,81 Val 0,45 Tyr 0,33 Lys 0,82 Ile 0,54 Met 0,37 Leu 0,83 Leu 0,57 Val 0,37 Pro 0,85 Met 0,58 Trp 0,41 Phe 0,87 Phe 0,59 Phe 0,45 Arg 0,89 Trp 0,62 Ile 0,49 Tyr 0,64 Leu 0,50 LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -26- 1.3.2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ Phương pháp sắc ký khí thường phải dùng các phản ứng pentafluorobenzyl, N-heptafluorobutyryl hóa, để tạo ra các dẫn xuất dễ bay hơi cho các amino acid. Tuy nhiên, khả năng phân tách của phương pháp này cũng không cao (xem hình 2.1). Hình 2. 1. Sắc ký đồ phân tách dẫn xuất pentafluorobenzyl-AA tiêu biểu 1.3.3 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) Sắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp phân tích amino acid phổ biến nhất hiện nay. Nhiều công trình phân tích amino acid dựa trên phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đã được công bố và nó đã trở thành phương pháp tiêu chuẩn để phân tích amino acid. LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -27- Hệ thống thiết bị HPLC: Sơ đồ hệ thống thiết bị: Dung môi Bơm Bộ tiêm mẫu Cột bảo vệ Cột phân tích Đầu dò Thải Máy ghi tín hiệu Dung môi pha động Dung môi pha động gồm một hoặc nhiều dung môi khác nhau để rửa giải chất cần phân tích ra khỏi cột. Có thể sử dụng dung môi rửa giải có thành phần không đổi trong suốt quá trình phân tích, tuy nhiên đối với một hỗn hợp phức tạp một thành phần pha động thường không thích hợp từ đầu đến cuối. Do đó thường sử dụng phương pháp gradient nồng độ (thay đổi thành phần pha động theo tỉ lệ đã được chương trình hóa) cho phép tách tốt trong thời gian vừa phải. Yêu cầu đối với dung môi pha động : • Có độ tinh khiết cao, cần loại bỏ tạp chất và đuổi khí trước khi sử dụng. • Có độ nhớt thấp, không tạo áp lực khi vào cột. • Không tương tác với pha tĩnh, không làm lão hóa cột tách và làm thay đổi các đặc tính của nó. • Không hấp thu trong vùng ánh sáng phân tích. LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -28- Cột sắc ký Cột sắc ký thường làm bằng thép không rỉ, thông thường cột có chiều dài từ 10-30cm, đường kính trong từ 4-10mm, đường kính của chất nhồi cột từ 3-10µm. Yêu cầu đối với cột sắc ký: cột phải trơ có thành phẳng và chịu được áp suất cao. Cột sắc ký là bộ phận quan trọng quyết định hiệu quả của việc tách các chất. Trong đề tài nghiên cứu này chúng tôi nghiên cứu về thành phần amino acid có trong Trùn Quế bằng phương pháp HPLC để góp phần vào sự hiểu biết thêm về loài động vật thân mềm này. 1.4 PHẢN ỨNG DANSYL HÓA AMINO ACID H2N CH C R O ON H3C H3C Cl O O O NH CH C R ON H3C H3C O O pH 9 + H+ + Cl-+ Phản ứng Dansyl hóa amino acid. Phản ứng Dansyl hóa là phản ứng thế thân hạch để chuyển hóa các amino acid có độ phân cực lớn thành các dẫn xuất có độ phân cực kém hơn. Sản phẩm sau phản ứng có thể ghi nhận bởi hai loại đầu dò phổ biến hiện nay là UV và huỳnh quang. Phản ứng có độ chuyển hóa cao và dễ thực hiện. Có thể phản ứng đồng thời với amino acid bậc một và bậc hai, có thể bảo vệ nhóm thiol của cysteine tự do. LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -29- CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 THIẾT BỊ, HÓA CHẤT VÀ VẬT LIỆU 2.1.1 Thiết bị Hệ thống sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Agilent 1100 bao gồm: bơm đôi hai kênh, bộ tiêm tay với loop 20µl. Cột sắc ký Zorbax extend - C18 (4,6mmID x 250mm), cột bảo vệ, lò cột, đầu dò UV – bước sóng 250nm. Dụng cụ thủy tinh bộ lọc với cỡ lổ xốp trung bình của giấy lọc là 0,45 mμ . 2.1.2 Hóa chất Dung môi 5 % ACN, 5 % IPA, 90 % hệ đệm pH 2,8 của 0,1 % • Pha động A: (v/v) TFA, điều chỉnh pH với TEA. 40 % ACN, 40 % IPA, 20 % hệ đệm pH 1,8 của 0,14 • Pha động B: % (v/v) TFA, điều chỉnh pH với TEA. Thuốc thử và chất chuẩn • Đệm Na2BB4O7 0,2M (pH=9). . • Dung dịch NaOH 0,4M • Dung dịch các amino acid chuẩn (11 amino acid: Arg, Ser, Asp, Glu, Thr, Gly, Aba, Ala, Met ,Val và Leu) được hòa tan trong dung dịch Na2B4O7 0,2M (pH=9) . • Dung dịch Dansyl clorur (Dns-Cl) 0,25%(mg/ml), 0,5%(mg/ml), 1,0%(mg/ml), được chuẩn bị bằng cách hòa tan Dansyl clorur (Merck) trong dung môi aceton (Merck). 2.1.3 Vật liệu LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -30- Trùn Quế (Perionyx excavatus ) được lấy từ trang trại nuôi trùn Quế ở trường đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh. 2.2 PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 2.2.1 Cách tiến hành phản ứng Dansyl hóa tạo dẫn xuất Dansyl của amino acid chuẩn ,5 ml dung dịch amino acid (chuẩn/mẫu) được pha trong đệm borat 0,Cho 0 2M ở pH 9 vào ống nghiệm, tiếp tục thêm 0,5 ml dung dịch thuốc thử Dansyl clorur 0 25%(w/v) pha trong aceton, phản ứng được thực hiện ở 600C trong 30 phút. , 2.2.2 Khảo sát điều kiện tối ưu để tiến hành phản ứng tạo dẫn xuất Dansyl Khảo sát pH của phản ứng Dansyl hóa. Khảo sát nồng độ thuốc thử Dansyl clorur. Khảo sát thời gian của phản ứng Dansyl hóa. Khảo sát sự thay đổi tỉ lệ dung môi aceton và đệm borat 2.2.3 Khảo sát pH của phản ứng Dansyl hóa Để khảo sát pH của phản ứng Dansyl hóa, chúng tôi thực hiện phản ứng trong môi trường đệm Borat 0,2M với các pH khác nhau(pH=8;9;10) và các thông số khác như nồng độ Dansyl là 0,5 %, nhiệt độ phản ứng 600C, thời gian phản ứng 30 phút. 2.2.4 Khảo sát nồng độ thuốc thử Dansyl clorur Thực hiện phản ứng Dansyl hóa 11 amino acid tại pH = 9 với nồng độ thuốc thử Dansyl clorur là: 0,25 %; 0,5%; 1,0%; còn các thông số khác như nhiệt độ phản ứng 600C, thời gian phản ứng 30phút. 2.2.5 Khảo sát theo thời gian của phản ứng Dansyl hoá Chúng tôi tiến hành khảo sát các thời gian khác nhau T=30, 60, và 90 phút của phản ứng Dansyl hóa, còn các thông số khác như nhiệt độ phản ứng 600C, pH=9 (của đệm Borat 0,2M), nồng độ Dansyl clorur 0,5%. LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -31- 2.2.6 Khảo sát sự thay đổi tỉ lệ dung môi Aceton và đệm Na2BB4O7 Chúng tôi tiến hành khảo sát ở ba loại tỉ lệ dung môi và đệm khác nhau như bảng 3.5 còn các thông số khác như thời gian phản ứng là 30phút, pH=9 (của đệm borat 0,2M), nồng độ Dansyl clorur 0,5%(w/v). 2.2.7 Qui trình thủy phân trùn Quế bằng acid và phản ứng Dansyl hóa Cân 0,1g trùn Quế đã sấy khô ( ở nhiệt độ 1100C trong 5h) cho vào ống Hach, thêm 3ml nước cất 2 lần và 3ml HCl đậm đặc. Lắc đều và dùng khí nitrogen thổi vào miệng ống trong 30giây để đuổi khí oxygen rồi đóng nắp lại. Đưa ống Hach vào lò nung COD đun tại 110oC trong 24h. Phần dung dịch còn lại cho vào bình định mức 25ml và định mức. Lọc qua màng lọc 0,45µm. Lấy 0,1ml dung dịch cho vào ống Hach mới, thêm 0,2ml aceton vào và thổi khô bằng khí nitrogen. Sau khi thổi khô thêm 1ml dung dịch đệm borat 0,2M (pH=9,0), lắc đều. Thêm tiếp 1ml dung dịch Dansyl clorur (0,5 % w/v trong aceton). Đậy nút lại và cho ống Hach vào bể nước 600C trong 30 phút. Sau 30 phút lấy ống Hach ra để nguội, thêm vào 1ml toluen và lắc đều, ly tâm, sau khi tách lớp rút bỏ toluen và thổi khô phần còn lại bằng khí nitrogen. Sau đó dùng 1ml pha động A để hòa tan sản phẩm Dansyl hóa. Dung dịch này được lọc qua màng lọc 0,45µm sau đó tiêm vào máy HPLC-UV. 2.2.8 Qui trình thủy phân trùn Quế bằng baz và phản ứng Dansyl hóa Cân 0,1g trùn Quế đã sấy khô ( ở nhiệt độ 1100C trong 5 h) cho vào ống Hach, thêm 3ml nước cất 2 lần và 3ml NaOH 8 M . Lắc đều và dùng khí nitrogen thổi vào miệng ống trong 30giây để đuổi khí oxygen rồi đóng nắp lại. Đưa ống Hach vào lò nung COD đun tại 110oC trong 24h. Để nguội, lấy dung dịch đó cho vào bình định mức 25 ml và định mức. Lọc qua màng lọc 0,45µm. Lấy 0,1ml dung dịch cho vào ống Hach mới, thêm 0,2ml aceton vào và thổi khô bằng khí nitrogen. Sau khi thổi khô thêm 1 ml dung dịch đệm borat 0,2M (pH=9,0), lắc đều. Thêm tiếp 1ml dung dịch Dansyl clorur (0,5% w/v trong aceton). Đậy nút lại và cho ống Hach vào bể nước 600C trong 30phút. Sau 30phút lấy ống Hach ra để nguội, thêm vào 1ml toluen và lắc đều, ly tâm, sau khi tách lớp rút bỏ toluen và thổi khô phần còn lại bằng khí nitrogen. Sau đó dùng 1ml pha động A để hòa tan sản phẩm Dansyl hóa. Dung dịch này được lọc qua màng lọc 0,45µm sau đó tiêm vào máy HPLC-UV. LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -32- CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 NGHIÊN CỨU PHẢN ỨNG TẠO DẪN XUẤT DANSYL CỦA AMINO ACID CHUẨN 3.1.1 Cách tiến hành phản ứng Dansyl hóa Lấy 0,5ml dung dịch Na2B4O7 0,2M (pH=9) có chứa các amino acid chuẩn (11 amino acid: Arg, Ser, Asp, Glu, Thr, Gly, Aba, Ala, Met ,Val và Leu) vào ống nghiệm, tiếp tục thêm 0,5ml dung dịch thuốc thử Dns-Cl 0,25% (2,5mg Dns-Cl /1ml acetone). Sau khi lắc đều, ngâm ống nghiệm này vào bể nước 60oC trong 30phút. 3.1.2 Khảo sát điều kiện tối ưu để tiến hành phản ứng tạo dẫn xuất Dansyl hóa Các yếu tố như pH, nhiệt độ, thời gian phản ứng, nồng độ tác chất … đóng vai trò quan trọng trong phản ứng Dansyl hóa. Trong các thí nghiệm khảo sát này, dung dịch chuẩn chứa 11 amino acid gồm Arg, Ser, Asp, Glu, Thr, Gly, Aba, Ala, Met ,Val và Leu. Mỗi amino acid nồng độ xác định được pha trong hệ đệm Borat dùng để khảo sát điều kiện tối ưu tiến hành phản ứng Dansyl hóa. Sau đó, các dẫn xuất Dansyl được xác định bằng phương pháp HPLC tại bước sóng λ = 254nm, nhiệt độ cột phân tích 50oC. 5 % ACN, 5 % IPA, 90 % hệ đệm pH 2,8 của 0,1 % • Pha động A: (v/v) TFA, điều chỉnh pH với TEA. 40 % ACN, 40 % IPA, 20 % hệ đệm pH 1,8 của 0,14 • Pha động B: % (v/v) TFA, điều chỉnh pH với TEA. LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -33- Bảng 3.1: Chương trình gradient pha động A và B. T(phút) % A % B 0.0 100,0 0,0 20.0 85,0 15,0 25.0 59,0 41,0 30.0 50,0 50,0 33.0 0,0 100,0 3.1.3 Khảo sát pH của phản ứng Dansyl hóa Đối với phản ứng Dansyl hóa, pH là yếu tố quan trọng và cần giữ cố định trong suốt thời gian phản ứng. Khi pH quá thấp nhóm amin của amino acid bị proton hóa, còn khi pH quá cao ion OH- sẽ phản ứng với Dansyl clorur tạo thành Dansyl hydroxid. Để khảo sát pH chúng tôi thực hiện phản ứng Dansyl hóa trong môi trường đệm borat 0,2M với các pH khác nhau và các thông số khác như nồng độ Dansyl là 0,5%, nhiệt độ phản ứng 600C, thời gian phản ứng 30 phút. Kết quả thực nghiệm được nêu ở bảng 3.2 và hình 3.1. LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -34- Bảng 3.2: Diện tích peak của 11dẫn xuất Dansyl ở các pH khác nhau Stt Dẫn xuất pH=8 pH=9 pH=10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Dns-Arg Dns-Ser Dns-Asp Dns-Glu Dns-Thr Dns-Gly Dns-Aba Dns-Ala Dns-Met Dns-Val Dns-Leu 970,1 618,3 855,3 760,2 738,3 903,5 866,1 1048,2 703,2 761,4 807,3 1218,1 742,2 1042,5 1011,7 830,7 1083,6 1097,3 1339,0 1060,1 1078,3 1129,4 730,1 289,3 451,2 600,2 392,2 956,3 905,1 1274,0 1007,1 1147,2 1282,1 LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -35- Hình 4.1: Diện tích các mũi dẫn xuất Dansyl theo pH tiến hành phản ứng Dansyl hóa. 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Dns- Arg Dns- Ser Dns- Asp Dns- Glu Dns- Thr Dns- Gly Dns- Aba Dns- Ala Dns- Met Dns- Val Dns- Leu Dẫn xuất Dansyl-amino acid pH=8 pH=9i n tíc h m ũ pH=10 D iệ Hình 3.1. Diện tích các mũi dẫn xuất Dansyl theo pH tiến hành phản ứng Dansyl hóa Nhận xét: Dựa vào đồ thị ở hình 3.1 cho thấy tại pH = 9 hiệu suất chuyển hóa của phản ứng Dansyl hóa cho kết quả tối ưu. LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -36- 3.1.4 Khảo sát nồng độ thuốc thử Dansyl clorur Thực hiện phản ứng Dansyl hóa 11 amino acid tại pH = 9 với nồng độ thuốc thử thay đổi từ 0,25 % đến 1,0%; còn các thông số khác như nhiệt độ phản ứng 600C, thời gian phản ứng 30 phút. Kết quả khảo sát được trình bày ở bảng 3.3. Bảng 3.3. Diện tích peak của 11dẫn xuất Dansyl hóa ở các nồng độ thuốc thử khảo sát. Stt Dẫn xuất [Dns-Cl]=0.25% [Dns-Cl]=0.5% [Dns-Cl]=1.0% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Dns-Arg Dns-Ser Dns-Asp Dns-Glu Dns-Thr Dns-Gly Dns-Aba Dns-Ala Dns-Met Dns-Val Dns-Leu 1157,1 536,6 820,8 946,1 321,8 960,1 1062,1 1437,3 1163,3 1185,8 1298,1 1218,1 742,2 1042,5 1011,7 830,7 1083,6 1097,3 1339,0 1060,1 1078,3 1129,4 1040,0 685,5 992,6 819,2 839,1 991,0 959,6 1149,2 840,3 837,8 902,4 LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -37- 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Dns- Arg Dns- Ser Dns- Asp Dns- Glu Dns- Thr Dns- Gly Dns- Aba Dns- Ala Dns- Met Dns- Val Dns- Leu Dẫn xuất Dansyl-amino acid D Iệ n tíc h m ũi [Dns-Cl]=0.25% [Dns-Cl]=0.5% [Dns-Cl]=1.0% Hình 3.2. Diện tích các mũi dẫn xuất Dansyl-amino acid theo nồng độ thuốc thử khảo sát của phản ứng Dansyl hoá. Nhận xét: Từ kết quả biểu diễn ở bảng 3.3 và hình 3.2 cho thấy: • Ở nồng độ thuốc thử Dansyl clorur 0,5% (w/v), hiệu suất chuyển hóa của phản ứng tối ưu. Vậy nồng độ thuốc thử Dansyl clorur tối ưu cho phản ứng Dansyl hóa là 0,5%(w/v). LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -38- 3.1.5 Khảo sát theo thời gian của phản ứng Dansyl hoá Theo các tài liệu tham khảo[6],[8],[12], thời gian tối ưu cho phản ứng Dansyl hóa các amino acid khoảng 30phút. Vì vậy trong phần này chúng tôi thử tiến hành khảo sát các thời gian dài hơn 30phút nhằm tăng hiệu suất phản ứng còn các thông số khác như nhiệt độ phản ứng 600C, pH=9(của đệm borat 0,2M), nồng độ Dansyl 0,5%. Kết quả thực nghiệm được nêu ở bảng 3.4 và hình 3.3. Bảng 3.4: Diện tích các mũi dẫn xuất Dansyl-amino acid theo thời gian của phản ứng Dansyl hoá. Stt Dẫn xuất T = 30 phút T = 60 phút T = 90 phút 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Dns-Arg Dns-Ser Dns-Asp Dns-Glu Dns-Thr Dns-Gly Dns-Aba Dns-Ala Dns-Met Dns-Val Dns-Leu 1126,0 691,3 982,9 933,4 759,6 1003,3 1026,2 1332,3 969,2 1023,4 1114,3 1216,9 740,2 1032,4 1000,7 829,1 1072,3 1099,2 1433,8 1060,1 1120,5 1330,3 1209,8 744,7 1051,0 1012,8 851,4 1080,1 1112,3 1426,3 1056,9 1104,9 1189,2 LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -39- 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Dns- Arg Dns- Ser Dns- Asp Dns- Glu Dns- Thr Dns- Gly Dns- Aba Dns- Ala Dns- Met Dns- Val Dns- Leu Dasyl-amino acid D iệ n tíc h m ũi T = 30 phút T = 60 phút T = 90 phút Hình 3.3: Diện tích các mũi dẫn xuất Dansyl-amino acid theo thời gian của phản ứng Dansyl hoá. Nhìn chung diện tích mũi của các dẫn xuất Dansyl-amino acid tăng khi thời gian tiến hành phản ứng tăng. Nhưng khi thời gian phản ứng trên 30phút, sự tăng này là không nhiều. ƒ Thời gian tiến hành phản ứng tối ưu là 30phút. 3.1.6 Khảo sát sự thay đổi tỉ lệ dung môi aceton và đệm Na2B4O7 Thuốc thử Dansyl hòa tan tốt trong dung môi hữu cơ nhưng các amino acid lại hòa tan tốt trong môi trường đệm Na2B4O7. Khi thay đổi tỉ lệ dung môi aceton và đệm Na2BB4O7, khả năng hòa tan các amino acid và thuốc thử Dansyl clorur thay đổi dẫn đến thay đổi cân bằng phản ứng. Ở đây chúng tôi tiến hành khảo sát ở ba loại tỉ lệ dung môi và đệm khác nhau như bảng 3.5, còn các thông số khác như thời gian phản ứng là 30phút, pH=9(của đệm borat 0,2M), nồng độ Dansyl clorur là 0,5%(w/v). LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -40- Bảng 3.5: Diện tích của 11 mũi dẫn xuất theo tỉ lệ dung môi và đệm thực hiện phản ứng Stt Dẫn xuất Aceton : Na2B4O7 (1:1) Aceton :Na2BB4O7 (3:1) Aceton:Na2B4O7 (1:3) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Dns-Arg Dns-Ser Dns-Asp Dns-Glu Dns-Thr Dns-Gly Dns-Aba Dns-Ala Dns-Met Dns-Val Dns- leu 580,0 337,2 470,1 495,5 344,2 496,7 539,1 713,4 534,6 575,4 623,0 371,6 274,6 461,8 430,6 300,9 450,8 316,3 295,6 255,1 126,9 623,8 655,3 364,9 462,2 524,8 379,9 520,3 561,4 784,1 643,2 625,1 670,2 LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -41- 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 Dns- Arg Dns- Ser Dns- Asp Dns- Glu Dns- Thr Dns- Gly Dns- Aba Dns- Ala Dns- Met Dns- Val Dns- leu Dansyl-amino acid D iệ n tíc h m ũi Aceton : Na2B4O7 (1:1) Aceton :Na2B4O7 (3:1) Aceton:Na2B4O7 (1:3) Hình 3.4. Diện tích của 11 mũi dẫn xuất theo tỉ lệ dung môi và đệm thực hiện phản ứng. Nhận xét: Với tỷ lệ aceton : đệm Na2B4O7 (1:3, v/v), hiệu suất chuyển hóa của phản ứng tối ưu. Qui trình phân tích hỗn hợp Dansyl–amino acid chuẩn trên thiết bị HPLC-UV 9 To cột = 50oC. 9 Bước sóng của đầu dò UV = 254nm. 9 Pha động A: 5 % ACN, 5 % IPA, 90 % hệ đệm pH 2,8 của 0,1 % (v/v) TFA, điều chỉnh pH với TEA. 9 Pha động B: 40 % ACN, 40 % IPA, 20 % hệ đệm pH 1,8 của 0,14 % (v/v) TFA, điều chỉnh pH với TEA. 9 Chương trình gradient như bảng 3.1. LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -42- Hình 3.5. Sắc ký đồ đo độ hấp thu của 20 Dns-amino acid chuẩn. LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -43- Bảng 3.6. Định danh 20 Dns-amino acid cho sắc ký đồ ở hình 3.5 Số thứ tự Tên Dns-amino acid Thời gian lưu (phút) 1 Dns-Ser 15,024 2 Dns-Arg 15,507 3 Dns-Asp 16,235 4 Dns-Glu 16,691 5 Dns-Hpro 17,495 6 Dns-Gly 19,754 7 Dns-Thr 20,459 8 Dns-Ala 24,532 9 Dns-Aba 27,670 10 Dns-Met 29,218 11 Dns-Trp 29,523 12 Dns-Val 29,775 13 Dns-Phe 31,621 14 Dns-Cystin 32,207 15 Dns-I-Leu 32,584 16 Dns-Leu 32,981 17 Dns-Orn 33,212 18 Dns-Lys 33,903 19 Dns-His 34,561 20 Dns-Tyr 35,519 LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -44- 3.2 KHẢO SÁT KHOẢNG TUYẾN TÍNH VÀ ĐƯỜNG CHUẨN CỦA 20 DẪN XUẤT DANSYL-AMINO ACID CHUẨN Thực hiện 5 phản ứng Dansyl hóa của 20 amino acid chuẩn có nồng độ lần lượt là 0,5mg/mL, 1,0mg/mL, 2,0mg/mL, 4,0mg/mL và 8,0mg/mL ở điều kiện phản ứng tối ưu, để tiến hành dựng đường chuẩn cho các dẫn xuất Dansyl-amino acid chuẩn. LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -45- Bảng 3.7. Kết quả dựng đường chuẩn của 20 dẫn xuất Dns-amino acid chuẩn: Diện tích mũi stt Dẫn xuất 0,5mg/mL 1,0mg/mL 2,0mg/mL 4,0mg/mL 8,0mg/mL 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Dns-Ser Dns-Arg Dns-Asp Dns-Glu Dns-HPro Dns-Gly Dns-Thr Dns-Ala Dns-Aba Dns-Met Dns-Trp Dns-Val Dns-Phe Dns-Cystine Dns-I leu Dns-Leu Dns-Orn Dns-Lys Dns-His Dns-Tyr 67,2 49,9 54,6 49,4 78,2 44,7 72,3 57,2 103,9 58,9 56,1 61,1 152,7 173,7 190,5 64,7 352,1 136,5 90,9 115,8 147,9 83,8 106,9 90,8 155,0 82,2 120,2 108,2 159,9 143,4 117,7 113,5 217,0 436,7 247,9 246,0 452,2 291,2 241,7 224,4 245,6 152,2 200,3 174,7 290,8 167,8 215,1 241,8 319,7 249,4 252,4 282,7 390,2 789,3 336,9 706,1 783,5 575,6 516,9 470,3 496,1 298,9 394,3 374,8 567,0 309,8 495,0 455,4 589,6 479,5 472,4 541,1 745,7 1550,6 591,7 1405,3 1417,4 1210,1 1000,8 1100,7 990,0 601,4 820,0 759,3 1159,0 631,4 853,7 937,5 1199,9 974,0 977,4 1100,6 1516,2 3040,0 1062,6 2944,7 2615,3 2465,6 2028,7 2194,7 LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -46- Từ bảng số liệu thu được qua quá trình khảo sát ta thấy tất cả 20 dẫn xuất Dns- amino acid chuẩn đều tuyến tính trong khoảng nồng độ 0,5mg/mL đến 8,0mg/mL với phương trình hồi qui và hệ số tương quan được nêu ở bảng 3.8 như sau. Bảng 3.8. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của 20 Dns-amino acid chuẩn Stt Dẫn xuất Phương trình hồi qui Hệ số tương quan R2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Dns-Ser Dns-Arg Dns-Asp Dns-Glu Dns-HPro Dns-Gly Dns-Thr Dns-Ala Dns-Aba Dns-Met Dns-Trp Dns-Val Dns-Phe Dns-Cystine Dns-I leu Dns-Leu Dns-Orn Dns-Lys Dns-His Dns-Tyr y = 12,210x + 10,858 y = 7,373x + 8,679 y = 10,178x – 0,288 y = 9,534x – 5,750 y = 14,358x + 4,854 y = 7,794x + 5,575 y = 10,440x + 12,521 y = 11,725x – 3,454 y = 14,657x + 20,221 y = 12,032x + 8,042 y = 12,214x + 3,446 y = 13,903x - 11,179 y = 18,329x + 36,146 y = 37,787x + 26,758 y = 11,701x + 123,9 y = 38,259x – 112,66 y = 30,943x + 170,88 y = 31,105x – 28,446 y = 25,615x – 18,271 y = 28,105x – 50,071 0,9994 0,9997 0,9994 0,9995 0,9997 0,9995 0,9994 0,9995 0,9993 0,9992 0,9994 0,9993 0,9988 0,9994 0,9989 0,9993 0,9995 0,9998 0,9996 0,9989 LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -47- 3.3 QUI TRÌNH PHÂN TÍCH AMINO ACID CỦA TRÙN QUẾ 3.3.1 Qui trình thủy phân trùn Quế bằng acid và phản ứng Dansyl hóa 600C, 30phút 1100C 1ml Dansyl clorur 0,5%(w/v) Hỗn hợp Amino acid 0.1g trùn Quế 3 mL nước cất 3 mL HCl đđ Dans- amino acid HPLC-UV 24h 3.3.2 Qui trình thủy phân trùn Quế bằng bazơ và phản ứng Dansyl hóa 60 0C, 30phút 24h 1ml Dansyl clorur 0,5%(w/v) Dans- amino acid HPLC-UV 1100C Hỗn hợp Amino acid 0.1g trùn Quế 3 mL nước cất 3 mL NaOH 8M 3.3.3 Qui trình phân tích Dansyl-amino acid của Trùn Quế trên thiết bị HPLC-UV Thực hiện giống như qui trình phân tích hỗn hợp Dansyl-amino acid chuẩn trên thiết bị HPLC-UV. LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -48- Hình 3.6. Sắc ký đồ đo độ hấp thu các Dns-amino acid của trùn Quế thuỷ phân acid LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -49- Bảng 3.9. Định danh Dns-amino acid cho sắc ký đồ ở hình 3.6 Số thứ tự Tên Dns-amino acid Thời gian lưu (phút) 1 Dns-Ser 14,994 2 Dns-Arg 15,460 3 Dns-Asp 16,007 4 Dns-Glu 16,519 5 Dns-Gly 19,713 6 Dns-Thr 20,423 7 Dns-Ala 24,508 8 Dns-Met 29,210 9 Dns-Val 29,770 10 Dns-Phe 31,619 11 Dns-Cystin 32,202 12 Dns-I-Leu 32,577 13 Dns-Leu 32,976 14 Dns-Lys 33,906 15 Dns-His 34,563 16 Dns-Tyr 35,518 LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -50- Hình 3.7. Sắc ký đồ đo độ hấp thu các Dns-amino acid của trùn Quế thuỷ phân baz Bảng 3.10. Định danh Dansyl-amino acid cho sắc ký đồ ở hình 3.7 Số thứ tự Tên Dns-amino acid Thời gian lưu (phút) 1 Dns-Trp 29,546 LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -51- 3.4 KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT Ta thấy nồng độ amino acid tỷ lệ thuận với nồng độ Dansyl-amino acid và tỷ lệ thuận với diện tích mũi Dansyl-amino acid. Từ phương trình hồi qui: với S là diện tích mũi và CA là nồng độ amino acid (mg/mL). a,b là hệ số của phương trình hồi qui. Ta suy ra được nồng độ amino acid từ diện tích mũi. Áp dụng công thức S=a.CA+b % AA= CA.Vdd.250 / m % AA : Nồng độ phần trăm theo khối lượng của amino acid CA : nồng độ amino acid (mg/mL) Vdd : thể tích dung dịch chứa sản phẩm Dansyl hoá (mL) m : khối lượng mẫu trùn Quế (mg) 250 : hệ số pha loãng. LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -52- Chương 4 KẾT LUẬN Chúng tôi đã khảo sát được các điều kiện tối ưu cho phản ứng Dansyl hóa và sự tách đồng thời 20 dẫn xuất Dansyl-amino acid bằng phương pháp HPLC-UV. ( Điều kiện tối ưu cho phản ứng Dansyl hóa: ¾ Nhiệt độ phản ứng 60oC. ¾ Môi trường đệm của phản ứng là Na2B4O7 0,2M ở pH = 9. ¾ Thời gian tiến hành phản ứng Dansyl hóa 30 phút. ¾ Nồng độ thuốc thử Dansyl clorur là 0,5% (w/v). ¾ Tỷ lệ dung môi aceton : đệm Na2B4O7 là 1:3 (v/v). LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -53- KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN AMINO ACID CỦA TRÙN QUẾ Tên amino acid Kết quả (% W) Arginin 1,34 Serin 1,52 Aspartic acid 2,01 Glutamic acid 2,37 Hidroprolin 0,00 Glycin 1,89 Threonin 1,12 Alanin 1,39 Amino butyric acid 0,00 Methionin 3,47 Tryptophan 1,64 Valin 1,43 Phenylalanin 0,67 Cystin 0,03 Iso-Leucin 1,10 Leucin 0,84 Ornithin 0,00 Nor-Leucin 0,00 Lysin 1,76 Histidin 0,79 Tyrosin 0,92 LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -54- ( Hướng phát triển đề tài Phân lập từng amino acid riêng biệt có trong trùn Quế để ứng dụng trong ngành công nghiệp dược và thực phẩm. LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -55- TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: [1] Lâm Thị Kim Châu, Văn Đức Chín, Ngô Đại Nghiệp (2004), Thực tập lớn sinh hóa, Nxb Đại Học Quốc Gia, Tp.HCM, trang 25 – 69. [2] Phạm Thị Ánh Hồng (2003), Kỹ thuật sinh hóa, Nxb Đại Học Quốc Gia, Tp.HCM, trang 27 – 116. [3] Nguyễn Đình Huyên, Hà Ái Quốc, Đồng Thị Thanh Thu (2006), Sinh hóa cơ bản - Tủ sách trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Tp.HCM, trang 29-32. [4] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nxb Đại Học Quốc Gia, Tp.HCM, trang 323-354. [5] Đồng Thị Thanh Thu (2006), Sinh hóa cơ bản, Tủ sách trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Tp.HCM, trang 43-61. Tiếng Anh: [6]: Marini Bettolo, G. B; Automated amino acid analysis using precolumn derivatization with Dansyl chloride and reversed – phase high – performance liquid chromatopraphy; Journal of Chromatography, 1990, pp.129-138. [7]: Javier Hernández-Borges, Giovanni D’Orazio, Zeineb Aturki, Salvatore Fanali; Nano-liquia chromatography analysis of dansylatated biogenic amines in wines; Journal of ChromatographyA, 2007, pp.192-199. [8]: Rakesh Minocha, Stephanie Long; Simutaneous separation and quantitation of amino acids and polyaimes of forest tree tissues; Journal of Chromatography A,2004,1035, pp. 63-73. [9]: Judy A. White and R. J. Hart; Leatherhead Food Research Association, Leatherhead, Surrey, England , pp.76-82. [10]: Hernandez-Borges, Fanali S. Nano liquia chromatography analysis of dansylatated biogenic amines in wines, J. Chromatogr. A,2007,1147 (2), pp. 192- 199. LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -56- [11]: Jansen E.H.J.M., Van den Berg R.H., Both- miedema R. And Doorn L., Advantages and limitations of pre-column derivatization of amino acids with dabsyl chloride, J. Chromatogr., 1991,535,pp. 123-133. [12]: Kato T., Sasaki M., Application of the dansylation reaction to the characterization of low molecular weight peptides by dodecyl sulfate- polyacrylamide-gel electrophoresis; Anal. Biochem., 1975, 6695,pp. 15-522. Trang web: [13] [14] www.ctu.edu.vn/institutes/biotech/19.pdf [15] www.elearning.hueuni.edu.vn/file.php/71/pdf/c5.pdf [16] [17] LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG