Đề tài Tuyển chọn và nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số chủng xạ khuẩn phân lập ở núi Pháo - Đại Từ - Thái Nguyên

được dùng để điều trị bệnh bạch cầu cấp tính, bệnh Hodgkin [23]. 1.3. Ứng dụng của chất kháng sinh 1.3.1. Ứng dụng trong y học Kể từ khi CKS được sử dụng và đã cứu sống được bệnh nhân bị nhiễm trùng máu năm 1941 [22], đến nay hàng loạt CKS đã được phát hiện và ứng dụng trong y học đã đóng góp một phần không nhỏ trong công tác phòng và điều trị bệnh tật, nhất là các bệnh nhiễm khuẩn của con người. Nhờ có các loại thuốc kháng sinh mà con người đã khống chế và loại bỏ được nhiều bệnh nguy hiểm như dịch tả, thương hàn v.v… Hiện nay các loại bệnh phổ biến do nấm gây ra như nấm da, nấm tóc, móng chân, móng tay… đều sử dụng kháng sinh để điều trị bằng cách bôi trực tiếp lên da bị nhiễm bệnh hoặc bằng cách uống. Có nhiều loại thuốc được sử dụng để điều trị bệnh này như: nystatin, natamicin, hamicin, rimocyclin… Phần lớn các CKS được sử dụng trong y học có nguồn gốc từ XK, trong đó có tới 1/3 các chất kháng sinh là do xạ khuẩn hiếm sinh ra. Trong y học, kháng sinh có thể được dùng kết hợp cùng lúc nhiều loại kháng sinh nhằm mang lại hiệu quả cộng hợp - tăng liều gấp hai của mỗi loại kháng sinh (khi kết hợp hai KS hãm khuẩn) hoặc hiệu quả cộng lực - tăng hiệu lực của CKS (khi kết hợp hai KS diệt khuẩn) [22]. Căn bệnh ung thư là một trong số những bệnh rất nguy hiểm đối với con người. Trước đây thường sử dụng biện pháp xạ trị và phẫu thuật để điều trị thì ngày nay y học đã biết sử dụng thuốc KS trong trường hợp bệnh đã chuyển sang giai đoạn di căn. Hiện nay y học đã sử dụng thuốc kháng sinh trong điều trị ung thư như daunorubicin được dùng trong điều trị bệnh bạch cầu cấp tính, đối với việc phòng loại bệnh này người ta đã dùng penicillin G hay erythromycin. Các thuốc kháng sinh như mitomycin (do S. cacspitosus sinh ra) được dùng trong điều trị ung thư vú, dạ dày, phổi, đại tràng [22]. Tuy nhiên, cho đến nay chưa có CKS nào có thể điều trị các bệnh do virus gây ra một cách có hiệu quả do virus không chịu tác động của CKS. 1.3.2. Ứng dụng trong bảo vệ thực vật và chăn nuôi thú y Chất kháng sinh không chỉ được sử dụng trong y học để chữa bệnh cho con người mà còn được ứng dụng rộng rãi trong một số lĩnh vực khác như: bảo vệ thực vật, chăn nuôi, bảo quản thực phẩm… Trong chăn nuôi, kháng sinh được dùng để phòng chữa bệnh và kích thích tăng trọng cho gia súc, gia cầm. Kháng sinh bổ sung vào thức ăn chăn nuôi có tác dụng ức chế và loại bỏ sự hoạt động của vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn gây bệnh đường tiêu hóa và hô hấp trên động vật non, làm cho chúng khỏe mạnh, tăng trưởng tốt. Rất nhiều KS được dùng với mục đích này như tetracyclin, bacitraxin, monelzin… Ở Việt Nam, năm 1982 đã sản xuất chế phẩm biovit 5 và terravit trên quy mô 12 tấn/năm. Kết quả thử nghiệm trên gia súc, gia cầm đã tăng trọng 15 - 25%, giảm tiêu tốn thức ăn 8,2%, tăng sản lượng đẻ trứng ở gà 5 - 7% [1]. Hiện nay, biện pháp thường được sử dụng trong công tác bảo vệ thực vật chống lại sâu bệnh là sử dụng các thuốc hóa học. Nhưng thuốc hóa học có nhiều nhược điểm như hiện tượng kháng thuốc của sâu bệnh, mặt khác lại gây ô nhiễm môi trường và nhiều chất độc tồn dư trong sản phẩm có thể gây độc cho con người v.v… Để khắc phục những nhược điểm trên thì việc sử dụng các CKS trong bảo vệ thực vật vừa có tác dụng nhanh, dễ phân hủy, có tính đặc hiệu cao, chỉ tiêu diệt một hoặc một số sâu bệnh nhất định mà không ảnh hưởng đến các loài có ích khác và đặc biệt chất kháng sinh còn có khả năng ức chế các vi sinh vật đã kháng thuốc hóa học. Các kháng sinh được dùng để tiêu diệt các nấm và vi khuẩn gây bệnh cho cây trồng như các bệnh khô vằn, vàng lụa ở lúa, bệnh thối cổ rễ ở các cây có củ… Ngoài ra CKS còn được sử dụng làm chất kích thích tăng trưởng ở những nồng độ nhất định như kích thích sự nảy mầm của hạt. Các CKS được dùng trong công tác bảo vệ thực vật thường ở dạng bột hoặc dung dịch có bổ sung các chất độn để tăng độ bền của CKS. Các CKS có thể được trộn lẫn vào đất, phun trực tiếp lên thực vật hoặc dùng trong quá trình xử lý hạt giống để tiêu diệt các mầm bệnh ở bên trong và bên ngoài hạt. Ngày nay, việc sử dụng các CKS trong công tác bảo vệ thực vật được phổ biến rộng rãi trên thế giới nhất là ở các nước Nga, Nhật, Trung Quốc, Ấn Độ… Năm 1950, Trung Quốc đã tuyển chọn được chủng Streptomyces sp. 5406 có khả năng ức chế Rhizoctonia solani và Verticillium albo – atrum gây thối rễ ở bông non [19]. Năm 2002, ở Ấn Độ đã phân lập được chủng Streptomyces sp. 201 có khả năng sinh CKS mới là z – methylheptyl iso – nicotinate, CKS này có khả năng kháng được nhiều loại nấm gây bệnh như Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium semitectum, Fusarium moniliforme…[17]. Hiện nay, nước ta cũng bắt đầu sử dụng các CKS có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản để thay thế dần cho việc sử dụng các chất hóa học độc hại trong công tác bảo vệ thực vật. Năm 2002, Trung tâm công nghệ sinh học – ĐHQGHN đã phân lập được từ đất chủng XK Streptomyces sp . LD30 có khả năng sinh CKS phổ rộng, kháng vi khuẩn và nấm, nhưng mạnh nhất là chống chủng Pseudomonas solanacearum gây bệnh héo lá ở cây trồng [4]. Ngoài công tác bảo vệ thực vật và chăn nuôi thú y thì CKS còn được sử dụng trong công nghệ thực phẩm. Dùng kháng sinh để bảo quản thực phẩm vừa rẻ vừa đơn giản, vừa không cần trang thiết bị đặc biệt nhưng vẫn đảm bảo chất lượng thực phẩm. Một số CKS được sử dụng trong bảo quản thực phẩm như: clotetraciclin, nisin, subtilin, actidion, biomicin… Tuy nhiên, việc sử dụng CKS trong bảo quản thực phẩm cũng còn có một số tồn tại: chất kháng sinh khó phân hủy và khi tồn dư trong thực phẩm có thể gây ra nhiều mối nguy hiểm cho người, làm xuất hiện nhiều chủng vi sinh vật có khả năng kháng thuốc, làm mất tác dụng của chất kháng sinh trong điều trị. Vì vậy, để khắc phục tồn tại trên việc sử dụng chất kháng sinh trong bảo quản thực phẩm cần phải tuân theo đúng nguyên tắc. 1.4. Khả năng tổng hợp enzyme của vi sinh vật 1.4.1. Ưu thế của vi sinh vật để sinh tổng hợp enzyme Enzyme là những protein được sản xuất tự nhiên từ thực vật, động vật, vi sinh vật, có vai trò quyết định quá trình trao đổi chất của tế bào. Chúng là những chất xúc tác thúc đẩy tốc độ các phản ứng hóa học mà không làm thay đổi tính chất của chúng. Việc sản xuất và sử dụng enzyme đã có từ lâu ở nhiều nước trên thế giới. Tuy nhiên, chỉ sau khi con người chứng minh được khả năng xúc tác của enzyme ngoài tế bào thì việc nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng enzyme mới thực sự phát triển mạnh mẽ. Ngày nay, nhiều loại enzyme đã được sản xuất ra với sản lượng lớn và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kinh tế khác nhau như: công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, dệt, hóa chất… Trước đây con người đã tiến hành sản xuất chế phẩm enzyme từ động, thực vật với khối lượng lớn (vạn tấn/năm) nhưng không kinh tế và chưa đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng, do lượng enzyme trong cơ thể động, thực vật rất hạn chế. VSV trái lại có thể tổng hợp được một lượng lớn các enzyme khác nhau. Do vậy VSV là đối tượng chính được sử dụng để sản xuất enzyme trong vòng 30 năm trở lại đây [25]. Hệ enzyme ở VSV vô cùng phong phú: VSV có thể đồng hóa được hầu hết các chất có trong thiên nhiên, từ các hợp chất đơn giản như: N2, S, Fe, CO2, CH4… đến các hợp chất hữu cơ phức tạp như: tinh bột, protein, các pectin, cellulose… chứng tỏ rằng trong tế bào VSV phải có chứa những hệ enzyme tương ứng [3]. Điều đó cho phép con người mở ra khả năng tìm kiếm và chọn lựa những phức hệ enzyme cần thiết phục vụ cho các nhu cầu công nghệ khác nhau, đặc biệt là các nhóm enzyme không thể khai thác được từ nguồn động vật và thực vật. Enzyme VSV có hoạt tính cao hơn enzyme từ các sinh vật khác do VSV có tốc độ chuyển hóa thức ăn rất lớn. VSV sinh trưởng và phát triển rất nhanh chóng, hàm lượng enzyme trong tế bào tương đối lớn nên trên quy mô sản xuất công nghiệp, chỉ sau khoảng thời gian ngắn đã có thể lên men sản xuất được lượng lớn chế phẩm enzyme. Việc lên men sản xuất enzyme có thể triển khai trên quy mô sản xuất công nghiệp nên không bị hạn chế lớn về diện tích và sự biến đổi về thời tiết, khí hậu… Phần lớn các thức ăn để nuôi VSV đều là các nguồn nguyên liệu đơn giản, rẻ tiền và dễ kiếm. Trong thực tiễn sản xuất enzyme hiện nay thường dùng các nguyên liệu chất lượng thấp, các phụ phẩm hay phế thải của một số ngành sản xuất khác và một số muối vô cơ. Do đó việc sản xuất enzyme nhờ VSV có khả năng triển khai với nhiều ưu thế cho phép tạo hiệu quả kinh tế cao. VSV rất nhạy cảm với tác động của môi trường và có khả năng điều chỉnh quá trình trao đổi chất (mà thực chất là điều chỉnh sự sinh tổng hợp hay điều chỉnh hoạt lực của enzyme) để thích nghi nhanh chóng với điều kiện môi trường. Vì vậy, thông qua việc thay đổi thành phần môi trường dinh dưỡng hay điều chỉnh các điều kiện trong quá trình lên men, người ta còn có khả năng điều chỉnh phổ các enzyme sẽ được tổng hợp, làm tăng cường năng lực sinh tổng hợp enzyme hay làm thay đổi hoạt tính của chúng. Ngoài ra, so với nguồn enzyme động vật và thực vật, đối với nhóm enzyme ngoại bào VSV người ta không cần phải phá vỡ tế bào nên có thể sử dụng được tác nhân qua nhiều chu kỳ sản xuất, đồng thời, việc tinh chế thu enzyme ngoại bào VSV thường dễ dàng và chi phí thấp hơn. 1.4.2. Tuyển chọn các chủng sinh enzyme cao từ tự nhiên VSV sống khắp nơi trên Trái Đất, chúng có khả năng biến dị nhanh để duy trì sự sống và tồn tại trong các điều kiện sống thay đổi. VSV có hệ enzyme đa dạng và phong phú. Tuy nhiên không phải tất cả các VSV đều có khả năng sinh enzyme như nhau, ngay cả những chủng cùng một giống cũng không cùng hoạt tính sinh tổng hợp enzyme. Vì vậy, khi tuyển chọn VSV để tìm kiếm, lựa chọn và phân lập chủng có hoạt lực cao trong việc tạo thành enzyme mong muốn là cần thiết. Ví dụ, muốn lựa chọn các chủng VSV sinh enzyme chịu nhiệt nên lựa chọn từ suối nước nóng hay bể ủ rác thải; tuyển chọn các VSV sinh enzyme chịu kiềm, chịu axit phải từ nơi có độ kiềm cao hay axit cao; lựa chọn chủng sinh amylase thì lựa chọn nơi có nhiều tinh bột; lựa chọn chủng sinh enzyme chịu mặn thì nên lựa chọn chủng từ nguồn nước biển; lựa chọn chủng sinh cellulase thường tìm thấy ở các mẫu đất có nhiều xác thực vật bị phân hủy. Như vậy, trong tự nhiên, nhiều loại VSV có khả năng sử dụng trong sản xuất đòi hỏi các bước nghiên cứu công phu, mất nhiều công sức. Tuy hiện nay có nhiều chủng VSV đã đưa vào sản xuất nhưng còn nhiều lĩnh vực đòi hỏi tiếp tục nghiên cứu tuyển chọn các chủng mới nhằm phục vụ cao nhất cho con người. 1.4.3. Một số enzyme phổ biến có nguồn gốc từ vi sinh vật Tuy đã biết hơn 1000 loại enzyme khác nhau nhưng cũng chỉ các enzyme thủy phân mới được sử dụng rộng rãi trong hơn 30 ngành kinh tế khác nhau, đó là các enzyme amylase, cellulase và protease. Lượng các enzyme sản xuất hàng năm: protease từ vi khuẩn là 500 tấn/năm, protease từ nấm mốc là 10 tấn/năm, pectinase là 10 tấn/năm… [26]. Các enzyme này có ứng dụng nhiều trong nông nghiệp, đặc biệt là trong chăn nuôi, với mục đích là làm tăng giá trị dinh dưỡng, tăng hệ số tiêu hóa thức ăn, giảm chi phí thức ăn… Các enzyme được dùng ngày càng nhiều ở các nước trên thế giới. * Enzyme amylase: Amylase là các enzyme đường hóa, có khả năng phân hủy amylose và amylopectin và các polysaccharit tương tự giải phóng glucose. Các enzyme này có ý nghĩa quan trọng trong việc phân hủy phế thải chứa các nguồn tinh bột từ các làng nghề làm bún, bánh đa, bánh cuốn, chế biến nông sản ngô, khoai, sắn... Từ các phế thải lương thực này, nhờ các amylase có thể dùng để sản xuất alcohol. Cũng nhờ các enzyme đường hoá α-amylase và glucoamylase, từ các phế thải lương thực chứa tinh bột của các dây chuyền quy trình chế biến thức ăn có thể sản xuất màng bao gói có tính chất phân huỷ quang học và sinh học [31]. * Enzyme cellulase: Trong thập kỷ qua, enzyme thuỷ phân cellulose ngày càng được quan tâm. Sự quan tâm này là do các enzyme này có khả năng thủy phân chất thải chứa cellulose, chuyển hoá các hợp chất kiểu lignocellulose và cellulose trong rác thải tạo nên nguồn năng lượng thông qua các sản phẩm đường, ethanol, khí sinh học hay các các sản phẩm giầu năng lượng khác. Thí dụ: từ các chất thải nhà máy giấy như các sản phẩm từ bột giấy và giấy có thể thu nguồn năng lượng ethanol [32]. * Enzyme protease: Protease thuộc nhóm enzyme thủy phân protein được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, chẳng hạn trong chế biến cá và thịt. Protease có thể thủy phân các protein có trong chất thải, để sản xuất các dung dịch đặc hoặc các chất rắn khô có giá trị dinh dưỡng cho cá hoặc vật nuôi. Protease thủy phân các protein không tan thông qua nhiều bước, ban đầu chúng được hấp thụ lên các chất rắn, cắt các chuỗi polypeptit tạo thành các liên kết lỏng trên bề mặt. Sau đó, quá trình hoà tan những phần rắn xảy ra với tốc độ chậm hơn phụ thuộc vào sự khuếch tán enzyme lên bề mặt cơ chất và tạo ra những phần nhỏ. Chính vì tính chất trên mà protease được sử dụng, một mặt để tận dụng các phế thải từ nguồn protein để những phế thải này không còn là các tác nhân gây ô nhiễm môi trường, một mặt để xử lý các phế thải protein tồn đọng trong các dòng chảy thành dạng dung dịch rửa trôi không còn mùi hôi thối [35]. Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 21 mẫu đất được lấy từ các địa điểm khác nhau thuộc khu vực núi Pháo - Đại Từ - Thái Nguyên. Đây là khu vực đã và đang có các hoạt động khai thác khoáng sản nhiều năm. 2.2. Đối tượng nghiên cứu 2.2.1. Xạ khuẩn Gồm 70 chủng xạ khuẩn phân lập từ các mẫu đất tại khu vực núi Pháo - Đại Từ - Thái Nguyên được sử dụng để nghiên cứu các hoạt tính sinh học. 2.2.2. Vi sinh vật kiểm định Gồm 11 chủng VSV kiểm định thuộc: vi khuẩn Gram (+), vi khuẩn Gram (-), nấm mốc và 4 chủng nấm phân lập trực tiếp từ các mẫu chè bị bệnh trồng tại Thái Nguyên (bảng 2.1). Bảng 2.1. Các chủng VSV kiểm định Vi sinh vật kiểm định Cơ quan cung cấp VK G (+) Staphylococcus aureus ATCC 25923 Viện Kiểm Nghiệm – Bộ Y tế Bacillus subtilis VTCC-B-888 Viện Bảo tàng giống chuẩn VSV Việt Nam VK G (-) Escherichia coli VTCC-B-883 Viện Bảo tàng giống chuẩn VSV Việt Nam Pseudomonas aeruginosa VTCC-B-481 Viện Bảo tàng giống chuẩn VSV Việt Nam Nấm mốc Fusarium oxysporum VTCC-F-1301 Viện Bảo tàng giống chuẩn VSV Việt Nam Fusarium solani VTCC-F-1302 Viện Bảo tàng giống chuẩn VSV Việt Nam Aspergillus niger VTCC-F-001 Viện Bảo tànggiống chuẩn VSV Việt Nam Nấm gây bệnh trên chè Đ1 Khoa KHSS – Trường ĐH Khoa học – ĐH Thái Nguyên N2 Khoa KHSS – Trường ĐH Khoa học – ĐH Thái Nguyên PL3 Khoa KHSS – Trường ĐH Khoa học – ĐH Thái Nguyên TB4 Khoa KHSS – Trường ĐH Khoa học – ĐH Thái Nguyên 2.3. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 2.3.1. Hóa chất - Các loại đường chuẩn: glucose, saccharose, lactose, fructose, mantose… của hãng Merck (Đức), Trung Quốc sản xuất. - Các loại muối: K2HPO4, KH2PO4, KI, MgSO4.7H2O, KNO3, CaCO3, NaCl, FeSO4.7H2O… nhập từ Anh, Trung Quốc. - Các loại cao: cao thịt, cao nấm men, cao malt, peptone… của hãng Merck (Đức). - Các loại hóa chất khác: Thạch, tinh bột tan, casein, CMC (Carboxyl Methyl Cellulose)… của Nhật, Trung Quốc, Việt Nam sản xuất. 2.3.2. Dụng cụ và thiết bị - KHVQH Olympus (Nhật) - Tủ ấm, tủ sấy Memmert (Đức) - KHVĐT Joel (Nhật) - Cân phân tích, cân kỹ thuật - Máy lắc (Hàn Quốc) - Nồi khử trùng (Đài Loan) - Box cấy vô trùng Nuaire (Mỹ) - Máy đo pH 151 Martini (Nhật) - Máy ly tâm Hettich (Đức) - Máy cất nước Hamilton - Tủ lạnh - Lò vi sóng Sharp - Các dụng cụ thủy tinh của Trung Quốc, Đức, Việt Nam… 2.3.3. Môi trường nghiên cứu * Môi trường Gause I (g/l): Môi trường phân lập và giữ giống xạ khuẩn Tinh bột tan: 20; K2HPO4: 0,5; MgSO4.7H2O: 0,5; NaCl: 0,5; KNO3: 0,5; FeSO4: 0,01; Thạch: 20; Nước máy vừa đủ 1 lít, pH: 7,0 - 7,4. * Môi trường MPA (g/l): Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Cao thịt: 5; pepton: 10; NaCl: 5; thạch: 18; Nước máy vừa đủ 1 lít; pH: 7,0 - 7,2. * Môi trường khoai tây (g/l): Môi trường phân lập và giữ giống nấm mốc chuẩn Khoai tây: 200; Đường: 20; Thạch: 20; Nước máy vừa đủ 1 lít; pH = 7 - 7,4 * Môi trường Crapek - Thom (g/l): ): Môi trường phân lập và giữ giống nấm chè NaNO3: 2; K2HPO4: 1; MgSO4: 0,5; KCL: 0,5; FeSO4: 0,01; Saccharose: 30; Thạch: 20; Nước máy vừa đủ 1 lít; pH = 7 - 7,4 * Môi trường xác định hoạt tính enzyme ngoại bào Môi trường tinh bột tan (g/l): Tinh bột tan: 2; Thạch: 18; Nước cất vừa đủ 1 lít. Môi trường CMC (Carboxyl Methyl Cellulose) (g/l): CMC: 2; Thạch: 18; Nước cất vừa đủ 1 lít. Môi trường casein (g/l): Casein: 2; Thạch: 18; Nước cất vừa đủ 1 lít. 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp lấy mẫu đất Dùng dao lấy khoảng 10 - 15 g đất cách bề mặt từ 5 - 20 cm ở các vị trí khác nhau (4 - 5 vị trí) trong 1 vùng 50 m2. Trộn đều các mẫu đất và đựng vào túi nilông đã khử trùng. Ngoài túi ghi rõ loại đất, ngày và nơi lấy mẫu [12]. Đất lấy về được phân lập ngay hoặc có thể bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 40C trong thời gian 24 giờ. 2.4.2. Phương pháp phân lập xạ khuẩn 2.4.2.1. Phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski Cân 1 g đất cho vào bình nón 50 ml chứa 9 ml nước cất vô trùng, lắc trên máy lắc 30 phút. Dùng pipet vô trùng hút 0,5 ml dịch đất sang ống nghiệm có chứa 4,5 ml nước vô trùng và tiếp tục pha loãng đến 10-2, 10-3… 10-6. Từ mỗi nồng độ pha loãng, nhỏ 0,1 ml dịch sang đĩa Petri chứa môi trường Gause 1. Dùng que gạt vô trùng chang đều, sau đó nuôi ở nhiệt độ phòng từ 4 - 7 ngày. Trên mỗi mẫu đất, khuẩn lạc của xạ khuẩn được cấy ria 3 pha sang đĩa Petri chứa môi trường Gause 1 để làm sạch. Sau đó nuôi ở nhiệt độ phòng 4 - 7 ngày, từ các khuẩn lạc được làm sạch cấy truyền sang ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng Gause 1, tiếp tục nuôi ở điều kiện trên trong 10 - 14 ngày [13]. Theo ISP (Chương trình xạ khuẩn quốc tế), màu sắc khuẩn ty khí sinh của các chủng xạ khuẩn được chia thành 8 nhóm màu: nhóm màu trắng (White), nhóm màu xám (Grey), nhóm màu đỏ (Red), nhóm màu vàng (Yellow), nhóm màu xanh lục (Green), nhóm xanh màu da trời (Blue), nhóm màu tím (Violet), và nhóm màu không xác định (X) [17, 18, 35]. 2.4.2.2. Phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch Sau khi nuôi cấy ở nhiệt độ và thời gian thích hợp, đếm số lượng khuẩn lạc mọc trong mỗi đĩa Petri, để từ đó tính số lượng tế bào trong 1 g đất. * Cách đếm: Đếm số khuẩn lạc bằng cách úp sấp đĩa Petri, trên mặt đáy phía ngoài của đĩa, dùng bút viết kính đánh dấu các khuẩn lạc đã được đếm. Nếu số lượng khuẩn lạc nhiều, dùng bút chia mặt đáy thành các phần và đếm số khuẩn lạc trong từng phần sau đó cộng lại. Không đếm các đĩa khuẩn lạc mọc quá dày không thể đếm được hoặc các đĩa bị nhiễm ảnh hưởng đến sự phát triển của xạ khuẩn. * Cách tính kết quả: Theo lý thuyết: 1 khuẩn lạc được hình thành từ 1 tế bào. Tuy nhiên trên thực tế khó có thể xác định được chính xác là một khuẩn lạc có thể được hình thành từ 1 hay nhiều tế bào. Vì vậy để tính tổng số tế bào có trong 1 đơn vị thể tích, người ta thường dùng thuật ngữ “đơn vị hình thành khuẩn lạc trong 1 đơn vị thể tích” (CFU - Colony Forming Unit). Như vậy từ số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch có thể suy ra số lượng tế bào (CFU) có trong 1 g đất theo công thức sau: CFU/g = A x 1/K x 1/V Trong đó: A: Số lượng khuẩn lạc trung bình mọc trên các đĩa thạch có cùng độ pha loãng. V: Thể tích dịch đất pha loãng được cấy gạt trên đĩa thạch. K: Độ pha loãng của dịch đất được cấy trên thạch. Số CFU/1 đĩa Petri được coi là tốt để tính tổng số CFU/1 g đất nếu khi cấy 0,1 ml dịch đất pha loãng trên môi trường đếm được từ 30 - 300 khuẩn lạc/1 đĩa. 2.4.3. Phương pháp thuần khiết và bảo quản giống Do mật độ của khuẩn lạc giảm dần theo độ pha loãng của dịch huyền phù nên ở các đĩa thạch có độ pha loãng thấp, các khuẩn lạc thường mọc tách rời nhau và có khả năng được hình thành từ một tế bào riêng rẽ. Dùng que cấy đã vô trùng lấy một ít tế bào từ các khuẩn lạc riêng rẽ trên đĩa cấy vào các ống thạch nghiêng có chứa môi trường Gause 1, để vào tủ ấm 28 - 300C trong thời gian từ 4 - 7 ngày, sau đó kiểm tra thật kỹ độ thuần chủng của các chủng giống, loại bỏ các ống bị nhiễm. Giữ các ống giống này trong tủ lạnh ở nhiệt độ 2 - 40C. Để bảo quản giống cho các nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi tiến hành cấy chuyển giống định kỳ 3 tháng một lần trên môi trường thạch nghiêng Gause 1, trước khi sử dụng cần cấy chuyển giống sang ống thạch mới [9]. 2.4.4. Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh * Phương pháp thỏi thạch Đây là phương pháp để sơ tuyển xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh. Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gause 1, Gause 2, hoặc ISP4 trong đĩa Petri sau 5 - 7 ngày. Nuôi cấy VSVKĐ trên các môi trường thích hợp trong các đĩa Petri (vi khuẩn nuôi trên môi trường MPA, nấm mốc nuôi trên môi trường khoai tây). Dùng khoan nút chai khoan các thỏi thạch có xạ khuẩn được nuôi cấy từ 5 - 7 ngày, sinh trưởng tốt, không bị nhiễm. Đặt các thỏi thạch lên bề mặt môi trường thạch đĩa đã cấy VSV kiểm định. Sau đó đặt các đĩa vào tủ lạnh 40C trong vòng 4 - 5 giờ để chất kháng sinh khuếch tán rồi nuôi ở 28 - 300C. Đọc kết quả sau 24 giờ đối với vi khuẩn kiểm định, 48 - 72 giờ đối với nấm kiểm định. Hoạt tính kháng sinh của mỗi chủng xạ khuẩn được xác định theo kích thước vòng vô khuẩn: D - d (mm), trong đó D là đường kính vòng vô khuẩn, d là đường kính của thỏi thạch. * Phương pháp đục lỗ Đây là phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh của dịch lên men. Xạ khuẩn được nuôi lắc trong môi trường Gause 1 dịch thể trên máy lắc tròn với tốc độ 220 vòng/phút trong 5 - 7 ngày, thu dịch kháng sinh thô bằng cách ly tâm dịch lên men ở 5000 vòng/phút trong 10 phút. Dùng khoan nút chai khoan lỗ trên bề mặt thạch đã cấy VSV kiểm định trong các đĩa Petri. Nhỏ vào mỗi lỗ khoan 0,1 ml dịch kháng sinh cần thử. Các bước tiếp theo tiến hành như phương pháp thỏi thạch [7, 9, 14]. 2.4.5. Phương pháp lên men xạ khuẩn Từ ống thạch nghiêng, giống đã được hoạt hóa được cấy sang các bình nón có dung tích 250 ml chứa 25 ml môi trường Gause 1 và nuôi lắc 220 vòng/phút ở nhiệt độ 28 - 300C trong thời gian 5 - 7 ngày. Sau đó thu dịch lên men, li tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 10 phút để thu riêng sinh khối và phần dịch. Tùy theo mục đích nghiên cứu mà sử dụng phần dịch hay phần sinh khối để xác định hoạt tính kháng sinh của dịch lên men hay của sinh khối tế bào [9]. 2.4.6. Xác định hoạt tính enzyme của xạ khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch Nuôi cấy XK trên môi trường Gause 1 dịch thể trên máy lắc 220 vòng/phút sau 5 - 7 ngày thu dịch enzyme từ môi trường nuôi cấy bằng cách ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút. Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp đục lỗ: dùng khoan nút chai khoan các lỗ trên môi trường cơ chất. Nhỏ vào các lỗ khoan dịch nuôi cấy xạ khuẩn. Sau đó đặt các đĩa vào tủ lạnh 40C trong vòng 4 - 5 giờ để chất kháng sinh khuếch tán rồi để ở nhiệt độ phòng trong thời gian 12 – 24 giờ. Hiện vòng phân giải bằng các thuốc thử tương ứng: đối với tinh bột hiện bằng thuốc thử lugol, đối với CMC hiện bằng đỏ công gô và đối với casein hiện bằng axit tricloaxetic (hay comasie blue). Hoạt tính enzyme được xác định bằng giá trị D - d (mm), trong đó D là đường kính vòng thuỷ phân cơ chất, d là đường kính lỗ thạch. 2.4.7. Phương pháp xác định khả năng chịu nhiệt của enzyme Dịch nuôi cấy sau khi lọc được đun cách thủy ở các mức nhiệt độ: 400C, 500C, 600C, 700C, 800C trong các khoảng thời gian 20, 40 và 60 phút, sau đó để nguội và xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. 2.4.8. Phương pháp xử lý số liệu Kết quả nghiên cứu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm excel. Đây là phần mềm lập trình sẵn, các hàm sử dụng được dựa trên những công thức cơ bản của toán thống kê trong đó có công thức: - Giá trị trung bình (): - Độ lệch chuẩn (): - Sai số m: Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân lập xạ khuẩn 3.1.1. Phân bố của xạ khuẩn ở trong đất Từ 21 mẫu đất thu từ các loại đất khác nhau thuộc khu vực núi Pháo - Đại Từ - Thái Nguyên, chúng tôi đã phân lập và thuần khiết được 70 chủng xạ XK. Số lượng và sự phân bố của xạ khuẩn trong đất được trình bày trên bảng 3.1. Bảng 3.1. Sự phân bố của xạ khuẩn từ các mẫu đất khác nhau Loại đất lấy mẫu Số lượng mẫu pH của đất Số lượng XK/g (CFU/g) Số chủng phân lập được Đất trồng chè 4 4,1 1,5 x 106 5 Đất trồng keo 3 6,2 2,3 x 106 4 Đất trồng màu 3 7,6 5,5 x 106 8 Đất trồng lúa 3 6,7 2,0 x 106 1 Đất vườn 3 7,5 8,7 x 106 40 Đất đồi trọc 5 4,2 4,5 x 106 12 Tổng 21 70 Kết quả trên bảng 3.1 cho thấy sự phân bố của xạ khuẩn trong các mẫu đất là khá phong phú và phụ thuộc nhiều vào đặc điểm, tính chất của từng loại đất. Xạ khuẩn thường phân bố nhiều ở các loại đất tơi xốp, thoáng khí, giàu chất hữu cơ, có pH và độ ẩm thích hợp. Số lượng xạ khuẩn gặp nhiều nhất ở loại đất vườn (8,7 x 106) và đất trồng màu (5,5 x 106). Đây là những loại đất thường xuyên được cuốc xới, bổ sung nguồn dinh dưỡng, có độ ẩm và pH thích hợp. Tất cả các đặc tính này là điều kiện rất thuận lợi cho sự phân bố của xạ khuẩn. Vì vậy, số chủng xạ khuẩn phân lập được từ loại đất này cũng nhiều nhất. Ngược lại, những loại đất nghèo dinh dưỡng, có độ ẩm không thích hợp và đặc biệt là có pH quá cao hay quá thấp, xạ khuẩn phân bố rất ít. Theo các kết quả nghiên cứu, đất chịu ảnh hưởng của các hoạt động khai thác thiếc ở khu vực núi Pháo đều thuộc loại đất chua [15], vì vậy, đây là loại đất không thích hợp cho xạ khuẩn phát triển. Tuy nhiên, những loại đất có hoạt động sản xuất của con người, pH có thể được cải thiện. 3.1.2. Phân bố của xạ khuẩn theo nhóm màu Từ 70 chủng xạ khuẩn phân lập được, chúng tôi nhận thấy màu sắc hệ khuẩn ty rất đa dạng. Theo Shirling và Gottlieb [38], có 6 nhóm màu xuất hiện với số lượng và tỷ lệ khác nhau, được thể hiện trên bảng 3.2, các hình 3.1 và 3.2. Bảng 3.2. Số lượng và sự phân bố của xạ khuẩn theo nhóm màu STT Nhóm màu Số lượng chủng phân lập được Tỷ lệ (%) 1 Xám (Grey) 29 41,4 2 Trắng (White) 23 32,9 3 Xanh (Blue) 10 14,3 4 Nâu (Brown) 5 7,1 5 Hồng (Pink) 2 2,9 6 Vàng (Yellow) 1 1,4 Tổng 70 100 Kết quả trên bảng 3.2 cho thấy như thường lệ, xạ khuẩn thuộc 2 nhóm màu xám và trắng vẫn chiếm ưu thế. Tỷ lệ xạ khuẩn thuộc nhóm xám chiếm 41,4%, tiếp đó là nhóm trắng chiếm 32,9%, các nhóm màu còn lại chiếm tỷ lệ rất thấp. Kết quả của chúng tôi phù hợp với các kết quả đã nghiên cứu trước, khi phân lập xạ khuẩn cũng nhận thấy nhóm màu xám là chiếm ưu thế [9,21]. Tuy nhiên, cũng theo kết quả của một số tác giả khác [6,26] lại nhận thấy xạ khuẩn thuộc nhóm màu trắng chiếm ưu thế hơn, sau đó mới đến nhóm màu xám và các nhóm màu khác. Như vậy, theo nhiều kết quả nghiên cứu, không thể tìm ra một quy luật chung cho sự phân bố của xạ khuẩn theo nhóm màu. Nhưng các kết quả nghiên cứu phân lập xạ khuẩn ở nhiều địa điểm khác nhau trong nước đều nhận thấy là xạ khuẩn thuộc 2 nhóm màu xám và trắng luôn có tần xuất xuất hiện cao hơn so với các nhóm màu khác. Sự khác biệt về màu sắc của hệ khuẩn ty có thể do nhiều nguyên nhân như: điều kiện tự nhiên: khí hậu, nhiệt độ, độ ẩm, tính chất của đất, chất dinh dưỡng, pH,… Chính vì vậy, trước đây, màu sắc hệ khuẩn ty xạ khuẩn được coi là những chỉ tiêu cơ bản để phân loại xạ khuẩn, nhưng do xạ khuẩn có tính biến dị cao nên các đặc điểm hình thái, tính chất nuôi cấy thường không ổn định, rất dễ bị thay đổi, trong đó có đặc điểm về màu sắc hệ khuẩn ty. Vì vậy, các đặc điểm về hình thái và tính chất nuôi cấy thường có giá trị thấp về mặt phân loại. Hình 3.1. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn phân theo nhóm màu Hình 3.2. Một số chủng xạ khuẩn đã thuần khiết 3.2. Hoạt tính kháng sinh của xạ khuẩn phân lập 3.2.1. Hoạt tính kháng sinh của xạ khuẩn phân bố theo nhóm màu Để nghiên cứu và tuyển chọn ra các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao, trước hết, chúng tôi kiểm tra sơ bộ hoạt tính của 70 chủng xạ khuẩn phân lập được bằng phương pháp thỏi thạch. Kết quả có 43 chủng trong tổng số 70 chủng có hoạt tính kháng sinh, chiếm tỷ lệ 61,4%. Đồng thời số lượng và tỷ lệ các chủng có hoạt tính cũng có sự sai khác giữa các nhóm màu (bảng 3.3 và hình 3.3) Bảng 3.3. HTKS của xạ khuẩn theo nhóm màu STT Nhóm màu Số chủng phân lập được Xạ khuẩn có HTKS Tỷ lệ chủng có HTKS so với tổng số (%) Số lượng Tỷ lệ (%) 1 Xám (Grey) 29 16 37,2 22,9 2 Trắng (White) 23 18 41,9 25,7 3 Xanh (Blue) 10 2 4,7 2,9 4 Nâu (Brown) 5 5 11,6 7,1 5 Hồng (Pink) 2 1 2,3 1,4 6 Vàng (Yellow) 1 1 2,3 1,4 Tổng cộng 70 43 100 61,4 So sánh với kết quả đã công bố trước [16, 18], kết quả của chúng tôi cho thấy tỷ lệ xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh là tương đối cao. Điều này đã chứng tỏ, số lượng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh ở đất Thái Nguyên là rất lớn. Đặc biệt, đất ở khu vực núi Pháo, tỷ lệ xạ khuẩn sinh kháng sinh có phần còn cao hơn so với đất ở một số khu vực khác của Thái Nguyên [6, 18]. Kết quả này cho thấy, sự hình thành chất kháng sinh của xạ khuẩn phụ thuộc nhiều vào các yếu tố của môi trường, không phải chỉ phụ thuộc vào nguồn dinh dưỡng. Đây cũng là đặc điểm chung cho quá trình sinh tổng hợp các sản phẩm bậc 2, trong đó có chất kháng sinh. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cũng khác nhau giữa các nhóm màu. Trong số các chủng có hoạt tính, hai nhóm màu xám và trắng, xạ khuẩn phân bố nhiều nhất đồng thời cũng có tỷ lệ chủng có hoạt tính kháng sinh cao nhất. Tuy nhiên, nhóm màu trắng mặc dù có số lượng chủng ít hơn so với nhóm màu xám, nhưng tỷ lệ chủng có hoạt tính kháng sinh lại cao hơn (chiếm 41,9%), tiếp theo mới là nhóm màu xám (chiếm 37,2%). Các nhóm màu còn lại có tỷ lệ rất thấp. Hình 3.3. Tỷ lệ các chủng XK có HTKS phân theo nhóm màu Tuy nhiên, nếu xét riêng từng nhóm màu, các nhóm màu nâu, vàng và hồng, mặc dù xạ khuẩn phân bố rất ít nhưng tỷ lệ chủng có hoạt tính lại rất cao. Đáng chú ý là nhóm màu nâu, chỉ có 5 chủng nhưng tất cả các chủng đều có hoạt tính. Đây là kết quả rất đáng phải quan tâm. 3.2.2. Phổ kháng sinh của các chủng xạ khuẩn phân lập Để kiểm tra hoạt phổ của các chủng xạ khuẩn, chúng tôi sử dụng các nhóm VSV kiểm định là vi khuẩn gram dương, vi khuẩn gram âm và nấm mốc. Kết quả thể hiện trên các bảng 3.4 và hình 3.4. Bảng 3.4. Khả năng ức chế các nhóm VSV kiểm định XK có HT với VK G(+) XK có HT với VK G(-) XK có HT với nấm mốc XK có HT với 2 nhóm VK G(+) và VK G (-) XK có HT với cả 3 nhóm VSV kiểm định Số lượng Tỷ lệ % Số lượng Tỷ lệ % Số lượng Tỷ lệ % Số lượng Tỷ lệ % Số lượng Tỷ lệ % 31 72,09 12 27,90 27 62,79 9 20,93 3 6,97 Trong tổng số 70 chủng có hoạt tính, như thường lệ, số chủng có hoạt tính với nhóm VK G (+) là cao nhất, có 31 chủng (chiếm 72,09%), tiếp theo là hoạt tính với nấm mốc, có 27 chủng (chiếm 62,79%) và thấp nhất là hoạt tính với nhóm VK G (-), chỉ có 12 chủng (chiếm 27,9%). Đáng chú ý, trong số đó có 9 chủng (chiếm 20,93%) có hoạt tính với cả 2 nhóm VK G(+) và G(-) và đặc biệt là có 3 chủng (chiếm 6,97%) có hoạt tính với cả 3 nhóm VSV kiểm định. Hình 3.4. Tỷ lệ XK có HT với các nhóm VSV kiểm định Kết quả này một lần nữa cho thấy, không chỉ xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh chiếm tỷ lệ cao mà xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm cũng khá cao so với nhiều nghiên cứu trước đây [16, 21]. Trong số các chủng có hoạt tính kháng sinh, khả năng ức chế các VSV kiểm định cũng có sự khác nhau. Kết quả thể hiện trên bảng 3.5 nhận thấy, với 7 chủng VSV kiểm định, số chủng xạ khuẩn có khả năng ức chế Staphylococcus aureus chiếm tỷ lệ cao nhất (có 26 chủng - chiếm 60,46%), tiếp theo là Bacillus subtilis (có 24 chủng – chiếm 55,81%) và thấp nhất là Pseudomonas aeruginosa (chỉ có 2 chủng – chiếm 4,65%). Đặc biệt, trong số các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm, số chủng có hoạt tính với 2 chủng Fusarium oxysporum và Aspergillus niger đều chiếm tỷ lệ khá cao. Bảng 3.5. Phổ kháng sinh của các chủng XK đã phân lập Vi sinh vật kiểm định Chủng XK có HTKS Số lượng Tỷ lệ (%) VK G(+) Staphylococcus aureus ATCC 25923 26 60,46 Bacillus subtilis VTCC-B-888 24 55,81 VK G(-) Escherichia coli VTCC-B-883 12 27,90 Pseudomonas aeruginosa VTCC-B-481 2 4,65 Nấm mốc Fusarium oxysporum VTCC-F-1301 15 34,88 Fusarium solani VTCC-F-1302 12 27,90 Aspergillus niger VTCC-F-001 16 37,20 Hình 3.5. Khả năng đối kháng của các chủng XK với các VSV kiểm định S.a: Staphylococcus aureus ATCC 25923; B.s: Bacillus subtilis VTCC-B-888; E.co: Escherichia coli VTCC-B-883; P.a: Pseudomonas aeruginosa VTCC-B-481; F.o: Fusarium oxysporum VTCC-F-1301; F.s: Fusarium solani VTCC-F-1302; A.ni: Aspergillus niger VTCC-F-001. 3.2.3. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có HTKS cao Căn cứ vào kết quả kiểm tra sơ bộ hoạt tính kháng sinh, chúng tôi đã chọn ra 5 chủng xạ khuẩn có hoạt tính mạnh nhất để tiếp tục sàng lọc bước 2. Các chủng này ký hiệu là: HT12.2, HT19.2, HT19.1, HT17.8, HT17.18. Trên bảng 3.6 và hình 3.6 là kết quả kiểm tra sơ bộ hoạt tính kháng sinh của 5 chủng lựa chọn. Bảng 3.6. HTKS của 5 chủng XK lựa chọn trên môi trường thạch Vi sinh vật kiểm định Hoạt tính kháng sinh (D-d, mm) HT17.8 HT19.1 HT12.2 HT19.2 HT17.18 VK G (+) S. aureus ATCC 25923 38,1 ± 0,6 35,1 ± 0,3 11,8 ± 0,3 + 19,1 ± 0,2 B. subtilis VTCC-B-888 35,3 ± 0,1 35,2 ± 0,4 10,2 ± 0,7 7,1 ± 0,1 7,3 ± 0,1 VK G (-) E. coli VTCC-B-883 38,3 ± 0,3 38,1 ± 0,4 15,9 ± 0,3 10,5 ± 0,3 7,6 ± 0,5 P. aeruginosa VTCC-B-481 34,2 ± 0,8 34,4± 0,3 7,2 ± 0,2 10,2 ± 0,3 10,5 ± 0,3 Nấm mốc F. oxysporum VTCC-F-1301 15,1±0,1 + 10,2 ± 0,1 10,2±0,1 6,2 ± 0,1 F. solani VTCC-F-1302 32,4±0,5 20,1± 0,1 + 10,7 ± 0,1 8,9 ± 0,1 A. niger VTCC-F-001 + + + + + Chú thích: (+): Hoạt tính yếu (≤ 4 mm) Hình 3.6. HTKS của 5 chủng XK lựa chọn S.aureus: Staphylococcus aureus ATCC 25923; B.subtilis: Bacillus subtilis VTCC-B-888 Bước tiếp theo, các chủng xạ khuẩn này được nuôi lắc trong môi trường dịch thể để kiểm tra hoạt tính của dịch lên men. Kết quả kiểm tra được thể hiện trên bảng 3.7. Bảng 3.7. HTKS của dịch lên men 5 chủng XK đã lựa chọn Vi sinh vật kiểm định Hoạt tính kháng sinh (D-d, mm) HT17.8 HT19.1 HT12.2 HT19.2 HT17.18 VK G (+) S. aureus ATCC 25923 10,2 ± 0,1 15,2 ± 0,2 15,4 ± 0,3 13,2 ± 0,1 - B. subtilis VTCC-B-888 10,2 ± 0,2 17,2 ± 0,3 11,2 ± 0,1 - 15,3 ± 0,3 VK G (-) E.coli VTCC-B-883 10,2 ± 0,1 20,8 ± 0,7 12,2 ± 0,2 10,3 ± 0,3 15,3 ± 0,3 P. aeruginosa VTCC-B-481 11,2 ± 0,1 20,5 ± 0,5 15,3 ± 0,5 10,2 ± 0,2 6,0 ± 0,7 Nấm mốc F. oxysporum VTCC-F-1301 15,1 ± 0,1 23,8 ± 0,7 17,5 ± 0,5 5,0 ± 0,4 - F. solani VTCC-F-1302 16,8 ± 0,7 27,8 ± 0,7 11,2 ± 0,1 15,2 ± 0,2 9,2 ± 0,1 A. niger VTCC-F-001 - - - - - Chú thích: (-) : Không có hoạt tính Kết quả trên cho thấy, cả 5 chủng xạ khuẩn lựa chọn đều vẫn giữ được hoạt tính kháng sinh tương đối ổn định khi chuyển từ môi trường thạch sang môi trường dịch thể. Có 3 chủng là HT17.8, HT19.1, và HT12.2 có hoạt tính cao với tất cả các VSV kiểm định, đặc biệt là có hoạt tính kháng nấm khá mạnh (hình 3.7). Tuy nhiên, tất cả các chủng đều không có hoạt tính với nấm Aspergillus niger VTCC-F-001. Hình 3.7. Hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn lựa chọn 1: HT17.8 ; 2. HT18.4 ; 3. HT19.1 ; 4. HT18.5 S.aureus: Staphylococcus aureus ATCC 25923; B.subtilis: Bacillus subtilis VTCC-B-888; E.coli: Escherichia coli VTCC-B-883; F.oxysporum: Fusarium oxysporum VTCC-F-1301; F.solani: Fusarium solani VTCC-F-1302 Với hướng nghiên cứu tuyển chọn ra các chủng có hoạt tính kháng sinh cao, có hoạt phổ rộng và đặc biệt là có hoạt tính kháng nấm gây bệnh thực vật, 3 chủng xạ khuẩn HT17.8, HT19.1 và HT12.2 được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu. Tiếp theo, để tìm hiểu khả năng ứng dụng của 3 chủng xạ khuẩn đã lựa chọn, chúng tôi tiến hành kiểm tra hoạt tính kháng nấm của 3 chủng này với 4 chủng nấm gây bệnh trên chè - là các chủng Đ1, N2, PL3 và TB4. Kết quả cho thấy, cả 3 chủng xạ khuẩn đều có hoạt tính với ít nhất 1 trong 4 chủng nấm gây bệnh trên chè (bảng 3.8). Bảng 3.8. HT kháng nấm gây bệnh trên chè của 3 chủng XK lựa chọn Ký hiệu chủng nấm gây bệnh trên chè Hoạt tính kháng sinh (D-d, mm) HT19.1 HT17.8 HT12.2 Đ1 22,2 ± 0,1 23,1 ± 0,5 16,2 ± 0,1 N2 15,1 ± 0,1 10,2 ± 0,2 - PL3 + 10,3 ± 0,1 - TB4 + + + Chú thích: ( +) : Hoạt tính yếu (≤ 4 mm) (-) : Không có hoạt tính Chủng HT17.8 có khả năng ức chế được 3 chủng: Đ1, N2 và PL3, chủng HT19.1 ức chế được 2 chủng: Đ1 và N2, còn chủng HT12.2 chỉ ức chế được chủng Đ1. Đáng chú ý, chủng HT17.8 và HT19.1 có hoạt tính khá mạnh với cả 2 chủng nấm Đ1 và N2 là những nấm phân lập được từ những lá chè non bị các bệnh đốm xám và đốm nâu (hình 3.8). Hình 3.8. HT kháng nấm gây bệnh chè của 3 chủng xạ khuẩn Bệnh đốm xám và đốm nâu là những bệnh gặp rất phổ biến trên các vùng trồng chè ở nước ta, trong đó có các vùng chè ở Thái Nguyên. Khi chè bị dịch hại này thì không những ảnh hưởng đến năng suất mà chất lượng chè cũng bị ảnh hưởng. Chính vì vậy, các kết quả nghiên cứu này là những khảo sát bước đầu làm cơ sở cho hướng nghiên cứu ứng dụng tiếp theo, để có thể mở rộng hơn nữa khả năng ứng dụng của chủng HT17.8 và HT19.1 vào thực tiễn. 3.3. Tuyển chọn xạ khuẩn có hoạt tính enzyme 3.3.1. Hoạt tính enzyme của xạ khuẩn Trong quá trình sống, xạ khuẩn cần phải tổng hợp nên các enzyme. Các enzyme được hình thành trong tế bào và một số được tiết ra môi trường xung quanh. Trong sản xuất enzyme từ xạ khuẩn chủ yếu là thu nhận các enzyme ngoại bào. Không phải tất cả các VSV đều có khả năng sinh enzyme như nhau, vì vậy, khi tuyển chọn chủng giống phải tiến hành phân lập, kiểm tra và lựa chọn các chủng có hoạt tính enzyme mạnh, sinh nhiều enzyme mong muốn theo từng mục đích. Các chủng xạ khuẩn tiếp tục được nghiên cứu về khả năng sinh enzyme ngoại bào. Trong các thí nghiệm, chúng tôi sử dụng 3 loại cơ chất để kiểm tra khả năng sinh enzyme là: tinh bột, carboxymetylcellulose (CMC) và casein. Kết quả kiểm tra bước đầu, chúng tôi đã chọn ra 5 chủng có hoạt tính enzyme mạnh nhất và kí hiệu là: HT10.6, HT12.7, HT12.5, HT17.15, HT18.8. Kết quả kiểm tra hoạt tính enzyme của 5 chủng lựa chọn được trình bày trên bảng 3.9. Bảng 3.9. Hoạt tính enzyme của 5 chủng xạ khuẩn lựa chọn Kí hiệu chủng Hoạt tính enzyme (D - d, mm) Amylase Cellulase Protease HT10.6 12,1 ± 0,1 11,9 ± 0,1 12,1 ± 0,2 HT12.7 6,9 ± 0,5 9,9 ± 0,1 10,1 ± 0,1 HT12.5 + 10,9 ± 0,1 11,2 ± 0,1 HT17.15 + 10,0 ± 0,6 9,9 ± 0,1 HT18.8 + 7,2 ± 0,2 7,1 ± 0,1 Chú thích: ( +) : Hoạt tính yếu (≤ 4 mm) Bước tiếp theo, 5 chủng lựa chọn trên được nuôi lắc trên môi trường dịch thể để kiểm tra hoạt tính enzyme của dịch lên men. Kết quả kiểm tra được trình bày trong bảng 3.10 cho thấy, nhìn chung, các chủng giữ được cả 3 hoạt tính enzyme nói trên, nhưng mức độ biểu hiện hoạt tính có sự khác nhau. Hoạt tính protease biểu hiện mạnh nhất và yếu nhất là hoạt tính amylase. Bảng 3.10. Hoạt tính enzyme của dịch lên men 5 chủng XK đã lựa chọn Kí hiệu chủng Hoạt tính enzyme (D - d, mm) Amylase Cellulase Protease HT10.6 + 10,2 ± 0,1 12,2 ± 0,3 HT12.7 12,5 ± 0,1 16,1 ± 0,1 16,2 ± 0,3 HT12.5 + + 4,9 ± 0,1 HT17.15 + 8,0 ± 0,1 12,2 ± 0,7 HT18.8 + + + Chú thích: (+): Hoạt tính yếu (≤4 mm) Chủng HT12.7 có hoạt tính enzyme mạnh nhất, đặc biệt là hoạt tính cellulase và protease, tiếp theo là các chủng HT10.6 và HT17.15, 2, 2 chủng còn lại là HT12.5 và HT18.8, cả 3 hoạt tính enzyme đều biểu hiện rất yếu (hình 3.9). Hình 3.9. HT enzyme của 5 chủng xạ khuẩn lựa chọn 1: HT17.15 2: HT12.7 3: HT12.5 4: HT10.6 5: HT18.8. Căn cứ từ kết quả trên, chúng tôi đã lựa chọn chủng HT12.7 để tiếp tục nghiên cứu khả năng chịu nhiệt của enzyme. 3.3.2. Khả năng chịu nhiệt của enzyme Các enzyme ngoại bào được ứng dụng nhiều trong công tác bảo vệ môi trường để xử lý các rác thải hữu cơ. Chính vì vậy, khả năng chịu nhiệt của enzyme là một trong các đặc điểm cần phải được nghiên cứu. Để xác định khả năng chịu nhiệt của enzyme từ chủng HT12.7, chúng tôi tiến hành nuôi lắc chủng xạ khuẩn này trong môi trường dịch thể để thu dịch enzyme thô. Tiến hành xử lý dịch enzyme thô ở các mức nhiệt độ: 400C; 500C; 600C; 700C và 800C trong thời gian 20, 40, và 60 phút. Hoạt tính enzyme được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Kết quả được trình bày trên bảng 3.11. Bảng 3.11. Khả năng bền nhiệt của dịch enzyme chủng HT12.7 Thời gian (phút) Enzyme Hoạt tính enzyme (D-d, mm) 400C 500C 600C 700C 800C 20 Amylase 17,1 ± 0,2 16,8 ±0,2 11,1 ±0,1 - - Cellulase 22,1 ± 0,1 21,5 ±0,7 11,2 ±0,1 9,9 ± 0,1 9,8 ± 0,1 Protease 24,8 ±0,1 23,8 ±0,1 17,8 ±0,2 11,2,±,0,2 9,1 ± 0,1 40 Amylase 16,9 ± 0,2 16,8 ±0,1 5,3 ± 0,5 - - Cellulase 20,2 ± 0,6 20,1 ±0,7 11,0 ±0,1 6,0 ± 0,1 4,9 ± 0,1 Protease 24,1 ± 0,5 22,9 ±0,1 15,8 ±0,3 11,4 ± 0,4 6,7 ± 0,1 60 Amylase 15,9 ± 0,3 15,8 ±0,2 3,9 ± 0,1 - - Cellulase 18,9 ± 0,1 17,9 ±0,1 10,0 ±0,1 6,1 ± 0,1 - Protease 23,9 ± 0,1 22,9 ±0,1 13,1 ±0,1 11,1 ± 0,1 6,1 ± 0,1 Đối chứng (dịch enzyme chưa xử lý nhiệt độ): Amylase: 17,2 ± 0,1; Cellulase: 22,1 ± 0,3; Protease: 24,8 ± 0,5; ( -) : Không có hoạt tính Kết quả trên cho thấy, hoạt tính enzyme của chủng HT12.7 tương đối bền vững với nhiệt độ, hoạt tính có sự thay đổi khi tăng dần thời gian xử lý ở cùng một mức nhiệt độ. Khả năng phân giải 3 nguồn cơ chất có sự khác nhau. Hoạt tính của 3 loại enzyme đều tương đối ổn định ở 2 mức nhiệt độ 400C và 500C. Hoạt tính giảm rất nhanh ở các mức nhiệt độ 600C, 700C và 800C. Các enzyme cellulase và protease có khả năng chịu nhiệt tốt hơn, ở 800C hoạt tính enzyme vẫn không bị mất, trong khi đó, với enzyme amylase, hầu như không còn hoạt tính ở 700C và 800C. Hình 3.10. Khả năng chịu nhiệt của Cellulase Hình 3.11. Khả năng chịu nhiệt của Amylase Hình 3.12. Khả năng chịu nhiệt của Protease Hình 3.13. Vòng phân giải cơ chất của enzyme sau khi đã xử lý với nhiệt độ trong thời gian 20 phút KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1. Sự phân bố của xạ khuẩn trong các loại đất là khác nhau. Số lượng xạ khuẩn phân bố trong các loại đất dao động từ 1,5 × 106 CFU/g đất - 8,7× 106 CFU/g đất. Số lượng xạ khuẩn phân bố trong đất vườn là nhiều nhất, có tới 8,7 × 106 CFU/g đất. 2. Từ 21 mẫu đất thu từ các loại đất khác nhau tại khu vực núi Pháo - Đại Từ - Thái Nguyên, chúng tôi đã phân lập và thuần khiết được 70 chủng xạ khuẩn. Tỷ lệ các chủng thuộc nhóm xám chiếm 41,4%, tiếp đó là nhóm trắng chiếm 32,9%, các nhóm xanh chiếm 14,3%, nhóm nâu chiếm 7,1%, nhóm hồng chiếm 2,9%, và nhóm vàng chiếm 1,4%. 3. Trong tổng số 70 chủng xạ khuẩn phân lập được có 43 chủng có HTKS, chiếm 61,4%. Trong tổng số các chủng có HTKS có: tỷ lệ kháng vi VK G (+) là 72,09%, kháng VK G (-) là 27,9%, kháng nấm mốc là 62,79%, kháng cả 2 nhóm VK G (+) và VK G (-) là 20,93% và kháng cả 3 nhóm VSV kiểm định là 6,97%. 4. Tuyển chọn được 3 chủng xạ khuẩn có HTKS cao, có hoạt phổ rộng để tiếp tục nghiên cứu. Các chủng xạ khuẩn này được ký hiệu: HT17.8, HT19.1 và HT 12.2. 5. Kiểm tra hoạt tính enzyme: amylase, Cellulase và protease của các chủng xạ khuẩn và đã tuyển chọn được 2 chủng có hoạt tính enzyme cao được ký hiệu là: HT12.7 và HT10.6. Đồng thời đã nghiên cứu được khả năng chịu nhiệt của các enzyme chủng HT12.7. KIẾN NGHỊ 1. Nghiên cứu các đặc điểm sinh lý, sinh hóa, phân loại và khả năng tổng hợp chất kháng sinh của 3 chủng xạ khuẩn đã lựa chọn: HT17.8, HT19.1, HT12.2. 2. Nghiên cứu tính chất lý hóa của chất kháng sinh từ 3chủng xạ khuẩn đã lựa chọn. TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Ngô Đình Bính,Vi sinh vật học công nghiệp, Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia, tr. 53-71, 2005. 2. Nguyễn Văn Cách, Công nghệ lên men các chất kháng sinh, NXB Khoa học và kĩ thuật, tr.17, 2004. 3. Nguyễn Văn Cách, Lê Văn Nhương, Cơ sở công nghệ sinh học, tập 4 - công nghệ vi sinh, NXB Giáo dục Việt Nam, 2009. 4. Nguyễn Hoàng Chiến, Nghiên cứu chủng xạ khuẩn streptomyces V6 sinh chất kháng sinh chống vi khuẩn gây bệnh héo xanh cà chua, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Hà Nội, 2000. 5. Vi Thị Đoan Chính, Nghiên cứu khả năng nâng cao hoạt tính kháng sinh của chủng Streptomyces rimosus R77 và Streptomyces hygroscopicus 5820 bằng kỹ thuật dung hợp tế bà o trần, Luận án TS sinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà Nội, 2000. 6. Vi Thị Đoan Chính, Tuyển chọn và nghiên cứu xạ khuẩn có khả năng đối kháng với một số chủng vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện, Báo cáo tổng kết đề tài khoa học và công nghệ cấp Bộ. Mã số B2009 - TN07 - 02. 7. Nguyễn Lân Dũng, Thực tập vi sinh vật học NXB Đại học và Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội, 1993. 8. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học - Tập III, NXB khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, 1978. 9. Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty, Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập I, NXBKHKT Hà Nội, 1972. 10. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Vi sinh vật học - tập II, Nhà xuất bản Đại học và Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội, 1977. 11. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, 2007. 12. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Kim Nữ Thảo, Các nhóm vi khuẩn chủ yếu, Vietscience, 2006. 13. Nguyễn Thành Đạt, Cơ sở sinh học vi sinh vật, tập 1, NXB Đại học sư phạm, 2007. 14. Nguyễn Thành Đạt, K.A. Vinogradva V.A.Poltorac, Tính biến dị bề mặt bào tử xạ khuẩn sinh choromomycin , Act.A. buraviensis, microbiologia, TXL III, N5, NXB Academia cccp, 1974. 15. Lê Đức, Nguyễn Quốc Việt, Tác động của hoạt động khai thác khoáng sản tại Đại Từ, Đồng Hỷ, Thái Nguyên đến môi trường khu vực. Hội thảo KH Quốc gia “ Những vấn đề môi trường và phát triển bền vững vùng Đông Bắc”, Tr. 153 – 159, 2007. 16. Bùi Thị Việt Hà, Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 2006. 17. Đỗ Thu Hà, Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Quảng Nam – Đà Nẵng, luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội, 2004. 18. Trịnh Ngọc Hoàng, Nghiên cứu tính đối kháng của xạ khuẩn với một số VSV gây nhiễm trùng bệnh viện, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, 2009. 19. Lê Mai Hương, Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh phân lập ở Hà Nội và vùng phụ cận, Luận văn phó tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 1993. 20. Lê Gia Hy, Cơ sở công nghệ vi sinh vật và ứng dụng, NXB Giáo dục Việt Nam, 2010. 21. Lê Gia Hy, Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn và thối cổ rễ phân lập ở Việt Nam, Luận án Phó tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 1994. 22. Nguyễn Khang, Kháng sinh học ứng dụng, NXB Y học, Hà Nội, 2005. 23. Phan Quốc Kinh, Công nghiệp hóa chất, Thông tin Kinh tế & Công nghệ, số 1, 2004. 24. Phan Quốc Kinh, Vài nét về tình hình sản xuất hóa dược trên thế giới, Tạp chí công nghiệp hóa chất, số 4, 2002. 25. Nguyễn Xuân Thành, Giáo trình vi sinh vật học công nghiệp, NXB Giáo dục, 2007. 26. Đặng Văn Tiến, Nguyễn Đình Tuấn, Vi Thị Đoan Chính, Ngô Đình Bính, Nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh kháng vi khuẩn Xanthomonasoryzae gây bệnh bạc lá lúa. “Báo cáo khoa học Hội nghị CNSH toàn quốc ”, 2009. B. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 27. Ashutosh K, Pharmaceutical Microbiology, New Age International (P) Ltd, pp. 89 – 101, 2008. 28. Chen M., Xiao X., Wang P., Zeng X., Wang F, Arthrobacter ardleyensis sp. nov. isolated from Antarctic lake sediment and deep-sea sediment, Arch Microbiol, 183, pp. 301- 305, 2008. 29. Fred C. Tenover, Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria, Amer.J. Med, 119, pp. 3–10, 2006. 30. Hozzein W.N., Li W.J., Ali M.I.A., Hammouda O., Mousa A.S., Xu L.H., Jiang C.L., Nocardiopsis alkaliphila sp. nov., a novel alkaliphilic actinomycete isolated from desert soil in Egypt, Int. J. Syst. Evol. Microbiol, 54, pp. 247-252, 2004. 31. J.H. Auh, H.Y. Chae, Y.R.Kim, K.H.Shim, S.H. Yoo, K.H. Park, Modification of Rice Starch by Seclective Degradation of Amylose Using Alkalophilic Bacillus Cyclomaltodextrinase, J. Agric, Food Chem, 2006. 32. MA. Elberson, F. Malekzadeh, M.T. Yazdi, N. Kameranpour, M.R. Noori – Daloii, M.H. Matte, M. Shahamat, R.R. Colwell, K.R. Sower, Cellulomonas persica sp. nov. and Cellulomonas iranensis sp. nov., mesophilic cellulose – degrading bacteria isolated from forest soils, J. Syst. Evol. Microbiol 50, p.993, 2000. 33. Pasti M. B., Pometto A. P., Nuti M. P., Crawford D. L., Lignin-solubilizing ability of actinomycetes isolated from termite (Termitidae) gutt, Appl Environ Microbiol, pp. 2213-2218, 1990. 34. Ramasamy Vijaykumar, Chinnasamy Muthukumar, Nooruddin Thajuddin, nnamalai Panneerselvam, and Rengasamy Saravanamuthu, Studies on the diversity of actinomycetes in the Palk Strait region of Bay of Begal, India, Actinomycetologica, 2007. 35. R. Gupta, O.K Beg, P. Lorenz, Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial applications, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59 (1) ,p. 15, 2002. 36. Saga T., Yamaguchi K, History of antimicrobial agents and resistant bacteria, J Japan Med Assoc, 137, pp. 513 – 517, 2008. 37. Seong C.N., Kim Y.S., Baik K.S., Lee S.D., Hah Y.C., Kim S.B., Goodfellow M, Mycolic acid-containing actinomycetes associated with activated sludge foam, J Microbiol, 37, pp. 66-72, 1999. 38. Shirling E.B., D. Gottlieb, Methods for characterization of streptomyces species. Vol. 16. No. 3. International Journal of Systematic Bacteriology. 39. Steger K, PhD. Thesis: Composition of microbial communities in composts. A tool to assess process development and quality of the final product. Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala, 2006. 40. Stuart H, Essential microbiology, John Wiley & Sons Ltd., England, pp. 191 – 369, 2005. 41. Waksman, S.A, The Actinomycetes. Classification, identification and descriptions of genera and species, vol 2, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, USA, 1961. 42. Zhang JF, Liu JJ, Lu MQ, Cai Cj, Yang Y, Li H ,Xu C, Chen GH, Rapamycin in hibits cell growth by induction of apoptosis on hepatocellular carcinoma cells in vitro, Transpl Immunol, 2007. MỘT SỐ TRANG WEB: 43. PHỤ LỤC Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của 4 chủng nấm gây bệnh trên lá chè phân lập tại Thái Nguyên Khuẩn lạc chủng N2 Khuẩn lạc chủng Đ1 Khuẩn lạc chủng TB4 Khuẩn lạc chủng PL3