Đề tài Ứng dụng hệ thống nuôi cấy bioreactor trong công nghệ sinh học thực vật

khuẩn, côn trùng…Đó là những nguyên nhân mà hiện nay người ta đã có những cải tiến thiết bị trong nuôi cấy lỏng có cung cấp không khí từ bên ngoài [2] 2.2.2. Hệ thống nuối cấy ngập chìm tạm thời Hệ thống ngập chìm tạm thời gọi tắc là TIS, được nghiên cứu cải tiền vào năm 1985. Và nó được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu [23]. Ở nước ta, bước đầu Phân viện Sinh học Đà Lạt đã chế tạo hệ thống nuôi cấy này và đã thành công trong việc nhân giống nhanh loài hoa African violet. Kết quả cho thấy Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 4 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều hệ thống TIS cho hiệu quả nhân chồi và tăng sinh khối chồi hoa African violet cao hơn so với phương pháp nhân giống truyền thống. Cụ thể là số chồi tăng 4,61 lần và sinh khối tăng 23,17 lần [2] 2.2.2.1. Nguyên tắc và cấu tạo Ngoài những hệ thống nuôi cấy nghiêng, Rocker và hệ thống nuôi cấy tự động APCS thì trên thị trường một số hệ thống đã được thương mại hóa như: Hệ thống RITA, hệ thống bình đôi BIT và hệ thống Plantima. Vì đây thực ra là các hệ thống được dùng để nghiên cứu ở nước ta hiện nay. Tất cả các hệ thống này đều tuân theo những điều kiện là tránh sự ngập liên tục, có thể thay đổi môi trường, điều khiển tự động và hạn chế sự nhiểm. Về cấu tạo hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời gồm các bộ phận như máy nén khí tạo áp lực để hút môi trường từ ngăn chứa lên ngăn chứa mẫu cấy và ngược lại, hệ thống cài đặt thời gian dùng để điều khiển chu kỳ ngập, hệ thống ống dẫn và van điều khiển, các màng lọc, bình nuôi cấy thường bằng nhựa polycarbonate hay thủy tinh. 2.2.2.1.1. Hệ thống RITA Hệ thống RITA (Hình 1) là công trình của Teisson và Alvard vào năm 1995. Một bình chứa 1 L gồm có hai phần, phần trên chứa mẫu cấy và phần dưới chứa môi trường. Một áp suất khí dương được cung cấp vào ngăn dưới sẽ đẩy chất lỏng dâng lên ngăn chứa mẫu cấy. Mẫu cấy được ngập chìm trong môi trường lỏng lâu hay mau tùy theo thời gian áp suất vượt mức được duy trì. Trong suốt thời gian ngập, không khí được sục vào trong môi trường lỏng, môi trường được chuyển động làm cho mẫu cấy xoay trở được các mặt tiếp xúc với bề mặt môi trường, áp suất vượt mức sau đó được thoát ra bên ngoài nhờ một ngõ ra phía trên đầu hệ thống. Và hệ thống này thể tích môi trường dinh dưỡng được giữ trong suốt quá trình nuôi cấy mà không cần phải thay mới. Hiện nay, có nhiều hãng sản xuất hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời RITA® như hãng Cirad, Pháp; BIT® Twin Flask của Cuba đã được khảo sát và nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác nhau. Một hệ thống cũng xuất hiện gần đây là hệ thống Plantima® Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 5 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều của công ty Atech, Ðài Loan. Hệ thống này cũng đã được tiến hành khảo sát trên nhiều đối tượng như chuối, hoa Lan… Hình 1: Pha 1:Mô không ngập trong môi trường Pha 2: Hiện tượng ngập được hoạt hóa, các van mở ra cho khí đi qua các màng lọc đẩy môi trường lỏng lên ngập mô cấy. Pha 3: Sự trao đổi khí trong hệ thống Pha 4: Chu kỳ kết thúc, các van đóng lại và môi trường và môi trường lỏng rút xuống ngăn dưới 2.2.2.1.2. Hệ thống bình sinh đôi BIT Hệ thống bình sinh đôi BIT (Hình 2) được thiết kế bởi Escalona và cộng sự (1998) được dự định nhân giống số lượng lớn qua con đường phát sinh phôi soma. Ðối với nhân giống theo con đường phát sinh cơ quan kích thước mẫu cấy đòi hỏi một hệ thống có thể tích lớn hơn và rẻ hơn. Con đường dễ dàng nhất để đạt được trạng thái ngập chìm tạm thời theo chu kỳ nhất định là nối hai bình thủy tinh hay plastic có kích thước từ 250 mL - 10 L bằng một hệ thống ống dẫn, và điều khiển tạo ra áp suất vượt mức để đưa môi trường vào bình chứa mẫu và ngược lại. Hệ thống BIT® được thiết kế đáp ứng với những yêu cầu trên. 2.2.2.1.3. Hệ thống Plantima Hệ thống này được thiết kế tổng thể tương tự như hệ thống RITA tuy nhiên có thay đổi và cải tiến một số chi tiết như hệ thống bơm và vị trí các màng lọc. Hệ thống này được sản xuất và cung cấp bởi Công ty A-tech Bioscientific tại đảo Ðài Loan. Hệ thống này cũng đã được tiến hành khảo sát trên nhiều đối tượng như chuối, hoa Lan…Cấu tạo và phương pháp vận hành cơ bản (Hình 3, Hình 4): Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 6 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều Hình 3: Các bộ phận chính của Plantima Hình 4: Hệ thống điều khiển chu kỳ ngập 2.2.2.2. Ưu và khuyết điểm của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời a. Ưu điểm - Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (Temporary Immersion System) có tác động tích cực lên tất cả các giai đoạn từ nhân nhanh chồi cho tới phát sinh phôi soma trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau. Như khả năng phát sinh chồi và phôi soma không bị biến dị với tần số cao. - Sự sinh trưởng và hệ số nhân nhanh chồi của cây được nuôi cấy trong hệ thống ngập chìm tạm thời luôn cao hơn so với những cây nuôi cấy trong hệ thống thông thường trên môi trường rắn hay trong những hệ thống bioreactor thông thường. - Cây tái sinh và phôi soma thu được trong hệ thống này luôn có chất lượng tốt hơn. - Nuôi trong hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời có tỷ lệ sống sót cao, sinh trưởng khỏe mạnh trong quá trình thuần hoá ngoài vườn ươm. Điều này được chứng minh thông qua việc trồng trực tiếp ra đất củ khoai tây bi và phôi soma cây cà phê. - Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đã kết hợp thành công những ưu điểm của hệ thống nuôi cấy rắn thoáng khí và hệ thống nuôi cấy lỏng giúp cây tránh được những hiện tượng bất lợi do sự thiếu thông thoáng của môi trường lỏng ngập liên tục hay trong hệ thống kín trên môi trường rắn, giúp gia tăng sự hấp thu chất dinh dưỡng. - Hạn chế được hiện tượng thủy tinh thể so, đây là ưu điểm lớn của hệ thống này so với hệ thống Bioreactor thông thường. - Hệ thống này tiết kiệm được công lao động, không gian phòng nuôi cấy giảm số lượng chai lọ nên giảm được chi phí sản xuất, và hệ thống cho hiệu suất sinh học cao. Mô hình này rất thích hợp cho việc mở rộng quy mô phục vụ cho sản xuất thương mại. - Một ưu điểm khác của hệ thống này là trong việc giảm được hoạt tính của các chất độc ngoại bào hay các chất ức chế sinh trưởng được tiết ra ngoài môi trường trong thời gian nuôi cấy Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 7 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều b. Khuyết điểm - Hiện nay chưa khảo sát được mật độ nuôi cấy [32] - Thời gian ngập tối ưu phải được khảo sát và xác định chính xác cho từng giai đoạn nuôi cấy của từng loại cây cũng như thời gian giữa các lần cấy chuyền đối với những hệ thống không thể bổ sung môi trường mới - Phải khảo sát tối ưu hóa thành phần môi trường cho từng giai đoạn nuôi cấy - Một ưu điểm khác của hệ thống này trong việc giảm được hoạt tính của các chất độc ngoại bào hay các chất ức chế sinh trưởng được tiết ra ngoài môi trường trong thời gian nuôi cấy - Giá thành của các thiết bị nuôi cấy ngập chìm tạm thời ở nước ta hiện nay rất đắt nhưng vẫn chưa được tự chế tạo trong nước. - Những thông số kỹ thuật của hệ thống này cần được khảo sát kỹ lưỡng và tối ưu hóa đối với từng giai đoạn nuôi cấy của từng loại cây 2.2.2.3. Ảnh hưởng của hệ thống ngập chìm tạm thời lên chất lượng cây nuôi cấy Theo nghiên cứu của Escalona và cộng sự (1999), cho thấy khi nuôi cấy chồi trong hệ thống TIS thì lá sẽ nhỏ hơn lá trong nuôi cấy lỏng [9]. Những cụm chồi phát triển từ các chồi bên trong Bioreactor thường có hình cầu và chồi có xu hướng phát triển toả tròn xung quanh tâm. Do đó, một số chồi con có kích thước không lớn và cần được kéo dài trong cùng hệ thống trước khi cho ra rể ngoài ống nghiệm. Ngược lại, chồi cây có thân dài hơn và ra nhiều lá hơn khi nuôi cấy trong hệ thống ngập chìm tạm thời so với nuôi cấy trên thạch [24]. Chồi cây nuôi cấy trong hệ thống này cũng dài và nặng hơn chồi nuôi cấy trên môi trường bán rắn. Những ảnh hưởng có lợi từ hệ thống ngập chìm tạm thời lên sự phát triển chồi có thể là kết quả của việc sử dụng những bình chứa dung tích lớn [4] 2.3. Các yếu tố và thông số ảnh hưởng đến quá trình nuối cấy Khác với nuôi cấy trên bề mặt thạch các thông số kỹ thuật hay các yếu tố ảnh hưởng chỉ là dinh dưỡng, pH, và độ vô trùng; thì đối với nuôi cấy trong hệ thống Bioreactor thì có thêm các thông số như không khí, oxygen hòa tan, sự khuấy trộn và có thể có thêm yếu tố ngập chìm. Ở từng đối tượng cụ thể mà các thông số kỹ thuật có thể được điều chỉnh cho tối ưu. 2.3.1. Không khí Trong không khí thì thành phần các loại gồm Nitrogen (78%), Oxygen (21%) và Cacbon dioxide (0,036%). Lượng không khí trong bình phụ thuộc vào thể tích và độ Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 8 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều thoáng khí của bình. Hệ thống Bioreactor, hai yếu tố quan trọng là môi trường và độ thoáng khí.[3] Trong quá trình hô hấp thực vật sử dụng O2 và thải CO2, còn trong quá trình quang hợp thì ngược lại. Trong pha tối, nồng độ CO2 tăng lên trong nuôi cấy, còn khi điều kiện quang tự dưỡng chiếm ưu thế thì nồng độ đó giảm đi trong pha sáng. Nồng độ CO2 cao có nhiều tác động có lợi trên sự kéo dài chồi và sự phát triển của lá cây Theobroma cacao [4]. Theo Woltering (1990), đã chứng minh được rằng nồng độ CO2 trên 10.000 ppm rất có ích cho cây hoa Hồng và cây hoa Đồng tiền trong việc giảm lão hoá của lá. Tuy nhiên, trong quá trình nuôi cấy In vitro thì ngoài cơ chế trên thì cây còn thải ra trong bình nuôi cấy các chất khí như ethylen(C2H4), ethanol(C2H5OH), acetaldehyde và hydrocacbon. Và theo nghiên cứu của De Proft và cộng sự (1985), thì trong điều kiện nuôi cấy In vitro thành phần môi trường khí khác nhau thì sự phát triển của cây cung khác nhau, cụ thể là là việc hàm lượng CO2 giảm và hàm lượng ethylene tăng. Trong nuôi cấy dùng hệ thống Bioreactor thì cung cấp hay thải các chất khí đã được tính đến trong công nghệ của thiết bị nuôi cấy, và điều này có ý nghĩa rất lớn đến quá trình của mẫu cấy. Lấy trường hợp của củ khoai tây nuôi cấy bằng Bioreactor air-lift, khi chúng ta nuôi cấy chìm liên tục thì quá trình cảm ứng tạo củ bị ức chế và các củ chỉ phát triển sau khi các chồi được kéo dài ra và được tiếp xúc với pha khí ở phần trên của Bioreactor [4]. Các biện pháp tăng cường thêm lượng O2, điều khiển lượng hormone và các điều kiện thẩm thấu đều không có hiệu quả và khó giải thích được hiện tượng trên. Nhưng nếu thay bằng hình thức nuôi cấy 2 pha, môi trường có bổ sung 9% sucrose để cảm ứng tạo củ thì sự tạo củ từ chồi sẽ phát triển, vượt lên cả môi trường, tiếp xúc với pha khí ở phía trên. Ngoài ra, thì thoáng khí còn ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của chồi Hồ Điệp, kết quả khảo nghiệm của các nhà nghiên cứu trên nhiều hệ thống nuôi cấy khác nhau cho thấy nếu sự thông thoáng càng nhiều thì chồi Hồ Điệp càng sinh trưởng và phát triển tốt hơn. Điều này đã cho thấy tầm quan trọng của pha khí trong Bioreactor đối với sự phát triển của thực vật [2]. Một nghiên cứu đi vào khảo sát sự ảnh hưởng của sự thông thoáng đến sự phát triển của nuôi cấy huyền phù Catharanthus roseus trong hệ thống Bioreactor airlift của P. K. Hegarty và cộng sự cho thấy, khối lượng khô sau khi nuôi cấy có thể tăng lên rất nhiều và hàm lượng chất mang hoạt chất thứ cấp rất cao. Vì vậy trong nuôi cấy thì sự sinh trưởng và phát triển của cây không chỉ phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy mà còn phụ thuộc vào thành phần không khí trong hệ thống nuôi cấy. 2.3.2. Oxygen hòa tan Một trong những chức năng của Bioreactor là tăng cường khả năng vận chuyển oxygen từ pha khí sang pha lỏng. Do oxygen chỉ hoà tan một phần trong nước (0.25 Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 9 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều mmol.l -1 ở 250C, 1 atm) nên để đáp ứng nhu cầu oxygen cho sự phát triển của mô thực vật, một lượng lớn oxygen cần được khuếch tán vào môi trường nuôi cấy. Ngoài ra, mức độ đảo trộn cũng là một yếu tố cần quan tâm do oxygen hòa tan trong môi trường cần nhanh chóng được mô và tế bào hấp thu. Tóm lại, đế đáp ứng tốt nhất nhu cầu oxygen cho sự phát triển của mô và tế bào thì lượng oxygen hòa tan trong dung dịch nuôi cấy luôn phải lớn hơn ngưỡng oxygen hòa tan cực đại mà tế bào mô hấp thu (DO2 htcđ). Trong trường hợp lượng oxygen hòa tan vào trong môi trường nhỏ hơn (DO2 htcđ), năng lượng ATP của tế bào sẽ bị giảm sút, từ đó ảnh hưởng tiêu cực đến sự phát sinh hình thái và trao đổi chất của tế bào. Tuy nhiên, trong thực tế người ta căn cứ vào giá trị (DO2 htcđ) để thiết kế Bioreactor và giá trị này cũng là yếu tố được quan tâm hàng đầu khi tiến hành phóng đại hệ thống lên quy mô lớn hơn [2]. Theo nghiên cứu của Thanh N. T, Yu K. W, Hahn E. J. và Paek K Y(2005), cho thấy nồng độ Oxygen 40% là phù hợp cho việc sản xuất sinh khối và sản xuất Ginsenoside là tốt nhất, và nếu tăng lên 50% thì lại không thích hợp cho qua trình nuôi cấy tế bào cũng như tích luỹ sản phẩm Ginsenoside [25] 2.3.3. Sự đảo trộn Chỉ gặp ở các thiết bị Bioreactor dạng Air-lift. Thông số về đảo trộn là một yếu tố quan trọng khác vì nó phản ảnh mức độ đồng đều trong việc phân phối chất dinh dưỡng và mẫu cấy trong toàn bộ không gian nuôi cấy. Việc đảo trộn được thực hiện dưới những hình thức như sục khí, khuấy trộn cơ học hoặc kết hợp cả hai hình thức trên. Nó vừa làm tăng khả năng tiếp xúc của mẫu cấy với không khí vừa là biện pháp để cung cấp vào trong bình nuôi cấy. Ở một số trường hợp khi nuôi cấy mẫu trong Bioreactor thì nguồn oxygen thường không đến được với sinh khối ở giữa Bioreactor dẫn đến hậu quả là nhiều khối mô bị lão hóa, vì rể có nhiều nhánh nên nhiều rễ đan xen vào nhau có khả năng cản lại nguồn cung cấp khí cũng như dinh dưỡng cho các rể nằm phía trong; trường hợp này gặp ở nuôi cấy nhân sinh khối rể. Vì vậy mà khả năng thành công để làm nguồn cho sản xuất các chất có hoạt chất sinh học phụ thuộc vào việc thiết kế các hệ thống Bioreactor phù hợp. Tuy nhiên, cần lưu ý chỉ thực hiện quá trình khuấy trộn ở mức vừa phải để vừa kích thích mô, tế bào vừa không làm tổn thương mô tế bào. Sự đảo trộn trong nuôi cấy thì vẫn chưa được nghiên cứu nhiều, chỉ mới công bố ở mảng nuôi cấy tế bào thu nhận các sản phảm thứ cấp. Đối với các thiết bị nuôi cấy cải tiến thì sự đảo trộn thường ít được ứng dụng do các thiết bị này mẫu không bị ngập chìm hoàn toàn vào trong môi trường nuôi cấy. 2.3.4. pH pH là một thông số vật lý ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng phát triển của thực vật [2]. Theo một số tác giả, sự thay đổi độ pH của môi trường trong quá trình nuôi cấy Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 10 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều liên quan đến sự cân bằng của các muối amonium trong môi trường. Mức chịu đựng của thực vật đối với pH môi trường vào khoảng 5,5 đến 6,5; độ pH ảnh hưởng đến sự hoạt động của các nguyên tố đa vi lượng trong môi trường nuôi cấy. Dưới 5,5 thì khả năng hoạt động của P, K, Ca, Mg và Mo giảm đi rất nhanh, trên 6,5 thì Fe và Mn trở nên bất hoạt và nếu môi trường pH tăng quá cao sẽ diển ra sự kết tủa của Ca3(PO4) [6] Theo Lazzeri P. A. và cộng sự (1987), khi pH hạ xuống dưới 5,0 thì mô thực vật sẽ bị ức chế một cách rõ rệt. [12] 2.3.5. Chất dinh dưỡng 2.3.5.1. Nguồn Cacbon Nuôi cấy trong Bioreactor cũng giống như nuôi cấy trên bất kỳ hệ thống nào thì cần thiết phải bổ sung thêm nguồn cacbon vào môi trường, tùy thuộc mục đích nuôi cấy mà có thể bổ sung thêm vào ở những nồng độ và liều lượng nhất định. Sucrose hoặc glucose ở tại nồng độ 2 -4 % thì phù hợp cho nguồn cacbon 2.3.5.2. Dinh dưỡng khoáng Có nhiều loại nguyên tố muối khoáng khác nhau cần cho đời sống thực vật được cung cấp dưới dạng đa lượng và vi lượng. Các nguyên tố đa lượng thường được sử dụng với nồng độ khá lớn (khoảng 0,5 mmol/l), còn các nguyên tố vi lượng được sử dụng với lượng rất nhỏ (khoảng 0,05 mmol/l) [5]. Nuôi cấy trên hệ thống Bioreactor, các nhà khoa học thường sử dụng các loại môi trường khác nhau như SH, MS, B5, Nisch… nhưng môi trường được sử dụng nhiều vẫn là môi trường MS bởi đây là môi trường giàu khoáng, thích hợp cho nhiều đối tượng khác nhau. Trong một số nghiên cứu về sự hình thành củ trong nuôi cấy củ hoa Lily trong Bioreactor thì thu được kết quả sau 16 tuần nuôi cấy như các muối amonium, nitrate, phosphat hầu như được sử dụng hết, trong khi đó các ion K+, Mg2+, Ca2+, Na+, và Cl- vẫn còn một lượng đáng kể trong môi trường. Tuy nhiên một điều đặc biệt là đường sucrose lúc này lại là tác nhân ức chế sự tăng trưởng thay vì là một nguồn dinh dưỡng chính. Theo Y.E. Choi, nồng độ của NH4NO3 trong nuôi cấy cây Panax ginseng để thu sinh khối thì ở từng giai đoạn là khác nhau, giai đoạn phát sinh callus thì nồng độ để cảm ứng callus là khoảng 60mM; trong khi đó, nồng độ khi cấy chuyền là 40mM; và dùng trong quá trình tăng sinh khối thì nồng độ chuẩn là 20 mM. [26]. 2.3.5.3. Chất điều hoà sinh trưởng Tái sinh chồi in vitro và quá trình nhân giống tiếp theo đòi hỏi nguồn cung cấp chất điều hòa sinh trưởng trong môi trường nuôi cấy. Những chất điều hòa sinh trưởng thường được dùng là chất thuộc nhóm auxin và cytokinin riêng lẻ hay dùng chung với tỉ lệ rất đa dạng phụ thuộc vào loài cây và loại mô dùng để nuôi cấy [4]. Theo Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2005), khi nuôi cấy tái sinh callus rể bất định cây nhân sâm thì nồng độ NAA dùng là 3mg/l [8]. Theo A.M. Shohael và cộng sự, khi nuôi cấy phôi callus trong hệ thống Air-lift cây Eleutherococcus sessiliflorus, thì nồng độ 2,4 D phải dùng là 1 mg l－1, Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 11 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều kết quả nghiên cứu cho thấy việc nuôi cấy ở nồng độ như vậy sẽ mang lại lượng sinh khối khá cao và việc tích tụ hợp chất eleutherosides sản xuất từ callus cây Eleutherococcus sessiliflorus tương đối nhiều[7] 2.3.5.4.Vitamin Thực vật tự tổng hợp các Vitamin và chúng được sử dụng như những chất xúc tác trong các quá trình trao đổi chất khác nhau. Khi các tế bào và mô thực vật sinh trưởng trong điều kiện in vitro, một số Vitamin không thể thay thế được tổng hợp nhưng thường không đủ về lượng, do đó phải bổ sung thêm từ bên ngoài vào, đặc biệt là các Vitamin thuộc nhóm B [5]. Theo Masanaru Misawa (1994), Vitamin Thiamine (B1) có ý nghĩa hết sức quan trọng, nó thường thích hợp trong nhiều loại tế bào thực vật và trong một số trường hợp nó như là chất kích thích sự phát triển của thực vật.[15]. Và là chất rất cần trong môi trường nuôi cấy, B1 có thể bị nhiệt phân khi khử trùng môi trường nhưng khi nuôi cấy tế bào có thể tổng hợp lại chúng thành phân tửu B1 ban đầu. [5]. Trong số các môi trường nuôi cấy thì môi trường MS được xem là môi trường tốt nhất trong nuôi cấy mô vì ngoài thành phần B1 trong môi trường còn có các loại Vitamin khác với liều lượng thích hợp cho sự phát triển của thực vật. 2.3.6. Thời gian ngập chìm mẫu Yếu tố này chỉ lưu ý đối với hệ thống Bioreactor ngập chìm tạm thời (TIS). Đây là yếu tố để hệ thống TIS được coi là khắc phục các nhược điểm của hệ thống Bioreactor Air-lift. Nó tạo nên hiệu quả do có sự kết hợp giữa vấn đề thoáng khí và sự tiếp xúc theo chu kỳ giữa mô thực vật và môi trường nuôi cấy [4]. Và trong quá trình nuôi cấy chu kỳ và tần số ngập chìm là những chỉ số chủ yếu. Theo Etienne và cộng sự (1997), thời gian ngập chìm dài (1giờ ngập trong chu kỳ 6 giờ) tỏ ra hiệu quả cho sự hình thành củ của cây Khoai tây bi, thời gian ngập chìm ngắn (1 phút ngập trong chu kỳ 12 giờ) lại phù hợp cho sự hình thành phôi soma ở cây Cà phê và Cao su. Còn theo nghiên cứu của Harris và Mason (1983) cho thấy, tần số ngập chìm cao (30 giây ngập chìm, 30 giây rút) thì hiệu quả nhân chồi Nho cao khi nuôi cấy trong hệ thống Bioreactor nghiêng lắc [28]. Và ở tần số ngập chìm 22 phút trong chu kỳ 7 giờ thì tỷ lệ nhân chồi Cây chuối cao.[S. Roels và cộng sự] 2.3.7. Thể tích môi trường dinh dưỡng Theo Lorenzo và cộng sự (1998), xác định thể tích môi trường 50 ml cho một mẫu cấy là tối ưu khi nhân chồi Saccharum ssp.trong hệ thống Bioreactor bình đôi BIT. Khi tăng dần thể tích môi trường từ 5 đến 50 ml/ mẫu cấy, hệ số nhấn chồi tăng từ 8,3 chồi lên 23,9 chồi sau 30 ngày nuôi cấy. Vào năm 1999, cũng trên hệ thống nuôi cấy tương tự thì nhóm tác giả Escalona và cộng sự lại chứng minh rằng thể tích tối ưu cho nhân chồi dứa là 200 ml/mẫu cấy. 2.4. Sự phát triển của thực vật trong Bioreactor Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 12 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều 2.4.1. Quá trình phát sinh phôi soma Sự phát sinh phôi soma cũng được áp dụng trong việc nhân giống cây trồng với số lượng lớn trong Bioreactor tự động. phôi soma dể sử dụng do chúng có kích thước tương đối nhỏ và đồng đều về kích cỡ, chúng không cần phải được cắt thành những mảnh nhỏ và tách rời khi nuôi cấy trong môi trường tăng sinh. Tính toàn thể của tế bào thực vật, khả năng tạo phôi mới và sự biểu hiện kiểu hình là cơ sở để đưa ra giả thiết về sự phân lập và nuôi cấy tế bào thự vật trong môi trường lỏng, đặc biệt giúp kích thích tạo phôi đơn bội. Quá trình phát sinh phôi soma được thực hiện bằng cách sử dụng môi trường kích thích có chứa auxin (thường sử dụng 2,4 D) và nước dừa ban đầu. Sau đó, dùng nhiều xytokinin. Myo-inositol và giảm lượng nitrogen. Khi các cụm tiền phôi được tạo thành thì phải hạ thấp hoặc lấy bớt nồng độ auxin trong môi trường. Sau đó, trình tự giống như quá trình tạo phôi giao tử (đơn bội) sẽ diển ra Quá trình phát sinh phôi soma được quan sát lần đầu tiên ở một chi của họ Umbelliferae được nuôi cấy trong môi trường lỏng. Kể từ đó, quá trình này còn được công bố ở nhiều cây hạt trần và cây hạt kín, bao gồm các loài cây cảnh, cây rau và cây lương thực cũng như cây thân gỗ. Phôi soma thường nhỏ và thích hợp cho các quy trình nhân sinh khối, chúng có thể được phân tách, đưa vào và khuấy trộn bằng một hệ thống tự động, sau đó có thể được cất trữ hay tạo ra cây con trực tiếp [2]. Sản lượng và chất lượng phôi soma của nhiều loài thực vật đã được cải thiện nhờ vào hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời. Kết quả nghiên cứu của Cabasson và cộng sự (1997), đã so sánh quá trình phát triển phôi soma trong nhiều hệ thống nuôi cấy khác nhau. Phôi soma hình thành từ nuôi cấy huyền phù tế bào được cấy vào môi trường thạch, lỏng lắc và tạm thời, thì 60% phôi trên môi trường thạch phát triển sang giai đoạn lá mầm, nhưng có hiện tượng mọng nước; mẫu trong hệ thống lỏng lắc thì ngăn cản sự hình thành của lá mầm và vỏ mô phân sinh ngọn do phôi soma không thể phát triển tiếp sau giai đoạn phôi cầu; trong hệ thống RITA, sự phát triển phôi soma được kích thích 66% phôi phát triển lá mầm và có hình thái tương tự như phôi nhân.[4] 2.4.2. Sự nhân chồi Hệ thống ngập chìm có tác dụng thức đẩy việc nhân chồi. khi nuôi cấy trên hệ thống lỏng, kết quả sinh trưởng chồi thu được là tốt hơn trên đối tường cây Pinus radiata thay vì cấy chuyền mỗi tháng trên môi trường rắn. Trong hệ thống Bioreactor, chồi có thể tăng trưởnglieen tục, vì thế cho phép thu hoạch chồi sau mỗi tháng trong khoảng thời gian 18 Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 13 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều tháng mà không cần cấy chuyền. Điều quan trọng là chồi thu được trong hệ thống nuôi cấy ngập chìm co chất lượng tốt hơn và dài hơn so với chồi thu được trên môi trường rắn [4]. Theo Tisserat và Vandercook (1985), thì nuôi cấy trong hệ thống ngập chìm tạm thời APCS sự phát triển của đỉnh chồi Potinera nhanh hơn trên môi trường rắn. Cả hai thống số tươi và khô đều tăng gấp 4 lần. 3. KẾT QUẢ 3.1. Kết quả của ứng dụng hệ thống Bioreactor trong nhân sinh khối tế bào 3.1.1. Nhân sinh khối callus Trong những năm gần đây, việc ứng dụng nuôi cấy nhân sinh khối callus đang được chú ý nhiều để sản xuất các hoạt chất thứ cấp, không chỉ các trung tâm nghiên cứu mà cả những công ty sản xuất dược phẩm bởi nhiều ưu điểm của chúng. Khi nuôi cấy callus trên hệ thống Bioreactor để thu nhận các sản phẩm thứ cấp thì hiệu suất mang lại rất cao. Hiện nay cũng đã có một số sản phẩm quan trọng sản xuất từ hệ thống này như Alkaloid: morphinan alkaloid, berberine, tropane alkaloid, cardinolides; các hợp chất kháng ung thư: camptothecin, homoharringtonine, podophyllotoxin, vinca alkaloid, taxol, saponin… Và cung đã có một số thành công trong việc sử dụng Bioreactor nuôi cấy huyền phù tế bào như cây thông đỏ, cây dừa cạn, cây sam Triều Tiên, cây lan gấm…với thể tích của bình nuôi cấy từ vài chục lít đến vài chục nghìn lít [2]. Saurabh C. và cộng sự (2001), khi nuôi cấy trong hệ thống Bioreactor 3L, thì sinh khối và hợp chất podophyllotoxin thu được từ nuôi cấy huyền phù cây Podophyllum hexandrum là 6,5 g/l và 4,26 mg/l trong 22 ngày [19]. 3.1.2. Nhân sinh khối rể Mặc dù các tế bào chưa biệt hóa chủ yếu được nghiên cứu, nhưng phương pháp nuôi cấy rễ và các cơ quan khác cũng được quan tâm rất nhiều. Khi nuôi cấy rể có thể không cần sử dụng nguồn mẫu cấy rể ban đầu nhiều vì chúng có tốc độ tăng trưởng rất cao. Vấn đề chính của việc nuôi cấy rể trong Bioreactor là nguồn cung cấp Oxygen không đến được với sinh khối ở giữa Bioreactor dẫn đến hậu quả là nhiều khối mô lão hóa. Vì rể có nhiều nhánh nên nhiều rể đan xen vào nhau có khả năng cản lại nguồn cung cấp khí cũng như dinh dưỡng cho các rể nằm phía trong. Khả năng nuôi cấy rể thành công để làm nguồn cho việc sản xuất các chất có hoạt tính sinh học phụ thuộc vào việc thiết kế các hệ thống Bioreactor phù hợp, trong đó để đáp ứng được yêu cầu về nuôi cấy, việc theo dõi những chỉ số vật lý và hóa học trong Bioreactor không kém phần quang trọng [29]. Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 14 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều Hoạt chất thứ cấp được nghiên cứu sản xuất nhiều bằng nuôi cấy Bioreactor là Gingsenoside, là thành phần dược tính quan trọng trong cây nhân sâm, và nó có đặc điểm lá có tính miễn dịch, chống sự mệt mỏi, điều hoà sinh lý và có một số tác dụng dược tính khác [27]. Công ty Mitsui Petrochemical Industry tại Nhật Bản đã thành công trong việc sản xuất hợp chất shikonin mục đích thương mại từ cây Lithospermum erythrorhizon và trong lúc đó, cũng tại Nhật một công ty khác là Nitto Denko sản xuất sinh khối của cây Panax ginseng trong tank 20 lit [15] Và một công ty khác là Meiji Seika, đã chứng minh đựơc rằng quy tắc của sản xuất tế bào Panax ginseng là trong thể tích lớn. K.Y. Paek và cộng sự (2000), nhận thấy hàm lượng saponin sẽ tăng sau 40 ngày nuôi cấy trong hệ thống Air-lift 20 L [14] Khi nghiên cứu sự phát triển sinh khối trong nuôi cấy huyền phù tế bào và nuôi cấy rể bất định cấy nhân sâm trong hệ thống Bioreactor, L. Langhansova và cộng sự nhận thấy, khi nuôi cấy dịch huyền phù tế bào hàm lượng Gingsenoside sẽ cao hơn nhiều so với nuôi cấy rể bất định. Cụ thể là nuôi cấy dịch huyền phù hàm lượng Gingsenoside chiếm 4,34 % hàm lượng chất khô, so với nuôi cấy rể bất định là 1,45 % [13]. 3.2. Kết quả ứng dụng hệ thống bioreactor trong vi nhân giống vô tính thực vật 3.2.1. Trên đối tượng hoa Lily Năm 2005, tại Phân viện Sinh học Đà lạt đã nghiên cứu thành công nuôi cấy cây hoa lily trong hệ thống nuôi cấy Bioreactor. Kết quả sau khi đưa ra ứng dụng cho thấy, có thể sản xuất hàng loạt củ giống hoa Lyli (cụ thể là trong một mẽ nuôi cấy đã tạo ra khoảng 10000 củ giống) chính điều này đã cung cấp nguồn giống rất lớn cho các cơ sở trồng hoa, và góp phần giảm giá thành của củ giống. Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 15 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều Theo TS.Nhựt và cộng sự (2005), củ Lily sau 4 tuần nuôi cấy trong hệ thống Bioreactor hình cầu dung tích 3L với 300ml môi trường thì củ tăng trưởng mạnh mẽ với trọng lượng thu được tăng vọt so với trọng lượng mẫu ban đầu( 107.03g so với 25g). Đặc biệt là kích thước củ gia tăng rất nhanh ( đường kính củ 9.9 mm). Đây là những yếu tố rất phù hợp cho công tác nhân giống hoa Lily, vì kích thước củ quyết định rất lớn đến thời gian củ đạt kích thước ra hoa vì chất lượng hoa thu được phụ thuột rất nhiều vào kích thước của củ mẹ. Trong môi trường hệ thống nuôi cấy bằng Bioreactor, mẫu nuôi cấy thỏa mản được 2 yêu cầu chung cho sự sinh trưởng là dinh dưỡng và độ thoáng khí. Sự tiếp xúc trực tiếp trong dinh dưỡng lỏng giúp mẫu cấy hấp thu chất dinh dưỡng tốt hơn trong khi sự thoáng khí lại giúp loại bỏ các thành phần khí độc trong môi trường, cung cấp oxygen hòa tan cho mẫu hô hấp và tăng trưởng. Vì vậy hiện nay trên thế giới, hệ thống nuôi cấy này đã được ứng dụng thành công ở nhiều mục đích khác nhau( nuôi cấy chồi, củ, rễ…) ở quy mô công nghiệp. Sau 14 tuần nuôi cấy, khi các thành phần dinh dưỡng bắt đầu cạn kiệt. Sự hóa nâu và chết mẫu xảy ra làm giảm hiệu suất của hệ thống nuôi cấy. Ngoài ra, có sự lão hóa và chết những vảy bên ngoài của những củ có kích thước lớn và sự phát triển cơ quan lá ở những củ nổi trên bề mặt môi trường. Có thể trong lúc này, khi dinh dưỡng cạn kiệt, củ bắt đầu hình thành các cơ quan quang hợp, duy trì sự sống của củ. Quan sát sự đóng mở khí khổng của lá nuôi cấy in vitro cho thấy củ nuôi cấy bằng hệ thống Bioreactor ít bị hiện tượng thủy tinh thể hơn so với nuối cấy lỏng tĩnh Như vậy, có thể khẳng định rằng hệ thống nuối cấy bằng Bioreactor thực sự rất hiệu quả trong nuôi cấy tăng sinh khối củ lily in vitro chỉ với thời gian 4 tuần nuôi cấy. Điều này rất ý nghĩa trong nhân giống thương mại hoa lily vì không những cung cấp được số lượng lớn củ có kích thước lớn mà còn rút ngắn được thời gian nuôi cấy, một hạn chế to lớn của nghành công nghiệp nuôi cấy mô [3]. Theo S.K. Kim và cộng sự (2000), khi nuôi 20 tuần và lưu giữ 4 tuần trong nhà kính ở nhiệt độ 4oC thì đường kính tăng 5mm, và đạt từ 6 – 9 cm sau 8 tháng nuôi cấy củ hoa Lily trong hệ thống Air-lift 20L.[20] 3.2.2. Trên đối tượng lan Hồ điệp Hiện nay, sau khi thành công trên đối tượng hoa Lily thì các nhà khoa học Việt Nam đang bắt tay vào nghiên cứu “ Ứng dụng hệ thống ngập chìm tạm thời trong nhân giống cây lan hồ điệp lai (Phalaenopsis hybrid)” nhằm đáp ứng nhu cầu cây giống cho thị trường và góp phần giảm giá thành của cây giống ở nước ta hiện nay. Trong nghiên cứu này, hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời sử dụng trong nhân giống thực vật sản xuất tại Đài Loan, Plantima được sử dụng và so sánh với phương pháp nuôi cấy thông thường Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 16 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều được sử dụng bởi các phòng nuôi cấy mô ở Việt Nam như nuôi cấy trên thạch, nuôi cấy lỏng, lỏng có lắc trong việc nhân nhanh Protocorm-like bodies – PLBs, tái sinh chồi từ PLBs và nuôi cấy cây Hồ Điệp con hoàn chỉnh. Đối tượng thí nghiệm là một loài Lan Hồ Điệp lai. Trên từng giai đoạn phát triển của mẫu cây, các tác giả đã tiến hành nuôi trên các môi trường dinh dưỡng thích hợp để đưa ra các thí nghiệm khảo sát việc ứng dụng hệ thống nuôi cấy này vào việc nhân giống cây lan Hồ điệp. Kết quả thu được, trung bình trong mỗi bình Plantima có trên 2300 PLBs thu được từ khoảng 100 PLBs ban đầu. PLBs tạo thành có kích thước lớn, màu xanh nhạt hình thái bình thường và tốt hơn so với PLBs tạo thành trên môi trường đặc và trên nuôi cấy lỏng. Mặc dù vậy, nếu tính sự vượt trội và trung bình PLBs tạo thành từ 1 PLBs ban đầu thì kết quả vẫn chưa thật sự thuyết phục (23,4 PLBs trong hệ thống TIS so với 18 và 16 PLBs lần lượt trong hệ thống lỏng lắc và trên môi trường thạch). Điều này có thể giải thích là do các thông số như chu kỳ ngập được cài đặt trong thí nghiệm này chưa tối ưu cho việc nhân nhanh PLBs, thời gian ngập tương đối ngắn chỉ 2 phút 30 giây sau mỗi 2 giờ. Ngoài ra mật độ mẫu cấy và thể tích môi trường cũng tác động rất lớn lên quá trình nhân PLBs, vì vậy để đạt được hiệu quả cao nhất khi sử dụng hệ thống TIS trong quá trình nhân PLBs, cần khảo sát và tối ưu hóa các thông số về mật độ, thể tích và chu kỳ ngập chìm của hệ thống TIS. Bảng 1: Ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy đến sự tạo thành PLBs sau 2 tháng Hệ thống nuôi cấy Số PLBs Lỏng lắc 18,6 Thạch 16.4 TIS 23,4 Trên hệ thống TIS, từ một PLBs ban đầu rất nhiều cây được tái sinh cho lượng cây tái sinh vượt trội so với các hệ thống còn lại. Trong bình Plantima trung bình số cây tái sinh từ một PLB ban đầu là 18,75 so với 3,26 PLBs trong hộp nhựa tròn. Thêm vào đó, sự sinh trưởng và phát triển của chồi tái sinh trong hệ thống TIS đều vượt trội hơn chồi trong hộp nhựa tròn về các chỉ tiêu chiều cao thân, chiều dài, chiều rộng lá. Trong hệ thống TIS, môi trường không khí luôn luôn có sự trao đổi giữa bên trong và bên ngoài bình thông qua hệ thống bơm và các màng lọc. Do được sinh trưởng trong môi trường thoáng khí tốt nên chồi Hồ Điệp tái sinh trong hệ thống TIS phát triển rất tốt so với trong hệ thống hộp nhựa tròn kín thông thường. Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 17 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều Kết quả cho thấy hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời khắc phục được những hiện tượng bất lợi do sự thiếu thông thoáng của môi trường lỏng ngập liên tục hay trong hệ thống kín trên môi trường rắn, giúp gia tăng sự hấp thu chất dinh dưỡng. Sự nuôi cấy được đồng bộ hóa vì chất dinh dưỡng được khuếch tán đều do đó thúc đẩy sự tăng trưởng đồng đều của các chồi nuôi cấy. Chồi được nhân giống trong hệ thống này sẽ phát triển nhanh hơn, năng suất cao hơn, phẩm chất tốt hơn. Kết quả của sự hình thành rể sau khi cac chồi được cho sử lý ra rể, hệ thống ngập chìm tạm thời đã hội tụ đủ những điều kiện cần thiết như sự ngập không quá lâu, thoáng khí tốt giúp cây không bị thủy tinh thể, cây tăng cường khả năng quang hợp nên cây phát triển khá đều đặn, thích hợp cho quá trình tạo bộ rễ khỏe mạnh trước khi ra vườn ươm. Tóm lại khi nuôi cấy trong hệ thống TIS giúp cây phát triển nhanh và mạnh hơn những cây được nuôi cấy trong hệ thống kín thông thường giúp rút ngắn thời gian để cây đạt được kích thước để ra vườn ươm. Tuy là thành công bước đầu nhưng hệ thống này cho thấy được những ưu điểm lớn so các hệ thống nuôi cấy truyền thống, và nó tạo ra một hướng đi mới cho CNSH Thực vật ở nước ta nói chung cũng như lĩnh vực nhân giống cây trồng nói riêng. 3.2.3.Trên đối tượng hoa Thu hải đường (THĐ). Nuôi cấy Thu hải đường thông qua con đường nuôi cấy lát mỏng tế bào (TCL) thì khả năng nhân chồi khi nuôi cấy trong Bioreactor cao gấp 10 lần so với nuôi cấy trên môi trường thạch và 3 lần so với nuôi cấy lỏng tĩnh [16] Theo nghiên cứu của TS Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2005), cho thấy sau khi nuôi cấy từ 4 – 6 tuần thì khả năng tăng sinh khối của cụm chồi Thu hải đường trong hệ thống Bioreactor gấp 42 lần so với sinh khối của mẫu cấy ban đầu. Trong khi đó, với các phương pháp nuôi cấy khác như nuôi cấy trên agar, sinh khối tắng cao nhất cũng chỉ đạt 6 lần; nuôi cấy lỏng tĩnh là 6,5 lần; nuôi cấy lỏng lắc là 23 lần. Điều đó chứng tỏ khả năng to lớn của hệ thống nuôi cấy Bioreactor trong việc nhân số lượng lớn sinh khối thực vật. Cũng trong nghiên cứu này, một kết quả đáng ghi nhận khác là khả năng ra rể rất tốt của cụm chồi thu được sau 6 tuần nuôi cấy và 8 tuần giãn chồi. Điều này có thể giải thích được là do mẫu cấy đã có được sự tăng trưởng tốt trong hệ thống Bioreactor nên khi chuyển sang môi trường ra rể thì sự ra rễ được dể dàng hơn. Cây con sau khi ra rể thì khả năng sống sót của cũng rất tốt và sinh trưởng phát triển bình thường sau 3 tháng [1] Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 18 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều 4. KẾT LUẬN Bioreactor sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào được cải tiến từ hệ thống Bioreactor nuôi cấy tế bào vi sinh. Bioreactor với hệ thống cung cấy xả môi trường, hệ thống cấp và thoát khí vô trùng được thiết kế có khả năng tạo ra một môi trường nuôi cấy vô trùng, kiểm soát các yếu tố môi trường bên trong như sự lắc, sự thoáng khí, nhiệt độ, oxy hòa tan, pH… [33]. Các ưu điểm của Bioreactor đã đưa đến sự phát triển của một kỹ thuật thích hợp cho việc nhân giống trên quy mô lớn thực vật qua nuôi cấy phôi, mô và tế bào. Tuy nhiên, một số loài thực vật không thích hợp với việc nuôi cấy trong môi trường lỏng. Hiện tượng thủy tinh thể thường xuyên xảy ra với các mô, chồi được nuôi cấy trong môi trường lỏng và khi chuyển những chồi này ra vườn ươm thì chúng dễ bị úa vàng cũng như bị mất nước do độ ẩm bên ngoài thấp, từ đó dẫn đến tỷ lệ sống sót thấp. Đối với việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy trong Bioreactor, vấn đề cần thiết hướng đến là cải thiện các điều kiện về môi trường hóa lý, như gia tăng sự trao đổi không khí, tăng cường ánh sáng và lượng khí CO2 để kỹ thuật này được áp dụng tốt hơn trong thực tế [29]. Về hệ thống TIS, với điều kiện Việt Nam hiện nay, giá thành của những hệ thống nuôi cấy TIS tương đối cao do phải nhạp hệ thống này ở nước ngoài như Pháp, Cuba, Đài Loan do đó nếu muốn ứng dụng rộng rải thì những hệ thống này nhất thiết phải được nghiên cứu thiết kế ở trong nước để giảm giá thành. Ngoài ra, những thống số kỹ thuật của hệ thống này cần được khảo sát kỹ lượng và tối ưu hóa đối với từng giai đoạn nuôi cấy của từng loại cây, có được những điều kiện như vậy thì chúng ta mới co khả năng ứng dụng hệ thốngnayf một cách rộng rải trong sản xuất cây giống [32]. Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời là một hệ thống không những tận dụng được các ưu điểm của nuôi cấy lỏng và nuôi cấy trên thạch mà còn hạn chế được nhược điểm của hai hệ thống Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 19 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều nuôi cấy trên giúp tạo ra môi trường nuôi cấy thoáng khí, cây con khỏe mạnh, tỉ lệ sống sót cao, giảm chi phí nhân công, tiết kiệm và giảm chi phí môi trường nuôi cấy do sử dụng ít môi trường trên một mẫu cấy và không sử dụng thạch, hệ số nhân được gia tăng nhiều lần so với khi nhân giống trên hệ thống nuôi cấy thông thường.[31] Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 20 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt 1. Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Thành Hải, Mai Xuân Phán, Phân Xuân Huyên, Đinh Văn Khiêm (2005), Nuôi cấy lắc và nuôi cấy Bioreactor trong nhân giống cây hoa Thu hải đường (Begonia tuberous), Tạp chí Công nghệ Sinh học 3(3): 363-372 2. Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Thành Hải (2006), Hệ thống nuôi cấy Bioreactor trong Công nghệ Sinh học Thực vật, Tạp chí Công nghệ Sinh học 4(3): 265-283 3. Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Thanh Hải, Nguyễn Thị Thúy Hằng, Nguyễn Thụy Minh Hạnh, Nguyễn Thị Huyền Trâm, Phạm Quốc Tuấn, Nguyễn Trí Minh, Nguyễn Văn Bình, Vũ Quốc Luận, Bùi Văn Lệ, Nguyễn Minh Tuấn, Thái Xuân Du (2005), Bước đầu nghiên cứu khả năng sản xuất củ giống Lily (Lilium spp.) bằng hệ thống Bioreactor, Báo cáo Khoa học: Những vấn đề nghiên cứu cơ bản của Khoa học sự sống. 4. Dương Tấn Nhựt (2007), Công nghệ Sinh học Thực vật tập 1, NXB Nông nghiệp. 5. Huỳnh Văn Kiệt (2006), Giáo trình Công nghệ Tế bào Thực Vật, Trường Cao Đẳng LTTP Đà Nẵng. 6. Võ Thị Bạch Mai (2003), Thủy canh cây trồng, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. Tài liệu Tiếng Anh 7. A.M. Shohael, D. Chakrabarty, K.W. Yu, E.J. Hahn and K.Y. Paek (2005), Application of bioreactor system for large-scale production of Eleutherococcus sessiliflorus somatic embryos in an air-lift bioreactor and production of eleutherosides, Research Center for the Development of Advanced Horticultural Technology, Chungbuk National University, Cheongju, South Korea 8. D. T. Nhut, B. N. Huy , P. T. Phong , N. T. Hai , T. C. Luan (2005), Primary study on multiplication of adventitious roots of panax vietnamensis – a valuable material source for saponin isolation 9. Escalona M., Lorenzo J.C., Gonzolez B., Daquinta M., Fundora Z., Borroto C.G., Espinosa D., Arias E., Aspiolea M.E., (1998), New system for in vitro propagation of pineapple , Pineapple New 5: 5-7 10. F. Mavituna and S. Buyukalaca, Somatic embryogenesis of pepper in bioreactors: a study of bioreactor type and oxygen-uptake rates, Applied Microbiology and Biotechnology J., Volume 46, Number 4 / November, 1996, 327-333. 11. Hiroyuki Honda, Kousuke Hiraoka, Eiji Nagamori, Mariko Omote, Yoshihito Kato, Setsuro Hiraoka and Takeshi Kobayashi (2003),Enhanced anthocyanin production from grape callus in Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 21 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều an Air-Lift type bioreactor using a viscous additive-supplemented medium, Scientia Horticulturae Volume 97, Issue 1, 41-48 12. Lazzeri P. A., Hildebrand D. E., Collin G. B. (1987), Soybean somatic embryogenesis: effect of nutritional, physical and chemical factors. Plant cell Tiss Org Cult 10: 209-220. 13. L. Langhansova, P. Marsik and T. Vanek (2005), Production of saponins from Panax ginseng suspension and adventitious root cultures, Biologia Plantarum vol 49 (3), 463-465 14. K.-Y. Paek (2000), Increase of saponin contents via elicitor treatments in bioreactor culture of ginseng (panax ginseng c.a. meyer) adventitious roots, Springerlin J. 15. Masanaru Misawa (1994), plant tissue culture: an alternative for production of useful metabolite, Agricultural services bulletin no. 108 16. Nhut D. T., Phan M. X. (2005), Thin cell layer technology and Bioreactor culture in rapid propagation of Begonia tuberous. 17. Paek K.Y., Debasis C (2003), Micropropagation of Woody plant using Bioreactor, Micropropagation of Woody trees anf fruits J.: 735-756. 18. R. R. Henke, K. W. Hughes, M. J. Constantin, and A. Hollaender (eds.), Tissue culture of forestry and agriculture. Plenum Press, New York. 19. Saurabh C., Ashok K.L., Sant S.B. and Virendra S. (2001), Production of Podophyllotoxin by Plant Cell Cultures of Podophyllum hexandrum in Bioreactor, sprigerlin J. 20. S.K. Kim, J.S. Lee, K.H. Huang, B.J. Ahn (2000), Utilization of embryogenic cell cultures for the mass production of bulblets in oriental and easter lilies, ISHS Acta Horticulturae 625: XXVI International Horticultural Congress: Biotechnology in Horticultural Crop Improvement: Achievements, Opportunities and Limitations. Springerlin J. 21. Smart, N. J., and M. W. Fowler. 1984. An airlift column bioreactor suitable for large-scale cultivation of plant cell suspensions. J. Expt. Bot. 35:531–537 22. Styer, D. J. 1985. Bioreactor technology for plant propagation. p. 117–130. In: R. R. Henke, K. W. Hughes, M. J. Constantin, and A. Hollaender (eds.), Tissue culture of forestry and agriculture. Plenum Press, New York 23. Teisson C, Alvard D (1995), A new concept of plant in vitro aultivation liquid medium: temporary immersion. In: Terzi M et al. Current Issues in plant molecular and cellular Biology, 105-110. Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 22 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều 24. Tisserat B., Vandercook C.E. (1985), Development of an automated plant culture system. Plant cell tiss org cult 5: 107-117 25. Thanh N. T, Yu K. W, Hahn E. J. và Paek K Y(2005), High-density cultivation of panax ginseng cells in alloon type bioreactors: role of oxygen supply on biomass and ginsenoside production 26. Y.E. Choi , J.H. Jeong và C.K. Shin (2004), Hormone-independent embryogenic callus production from ginseng cotyledons using high concentrations of NH4NO3 and progress towards bioreactor production, Plant Cell, Tissue and Organ Culture J. 72(3), 229-235 27. Zhang YH, Zhong JJ (1997). Hyper-production of ginseng saponin and polysaccharide by high-density cultivation of P. notoginseng cells. Enzyme Microb. Tech. 21: 59-63. 28. Harris RE, Mason EB (1983), Two machines for in vitro propagation of plant in liquid media. Can J plant Sci 63: 311-316. 29. K.Y Paek, D. Chakrabarty, E.J. Hahn (2005), Application of Bioreactor systems for large scale production of horticultural and medicinal plant. Plant cell, tissue and organ culture 81:287-300. 30. Etienne H., Berthouly M. (2002), Temporary immersion system in plant micropropagation. Plant cell, Tissue and Organ culture 69: 215-231. Tài liệu Mạng 31. Bước đầu ứng dụng thành công hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong nhân giống Lan Hồ Điệp lai – Phalaenopsis hydrid. Web: www.hcmbiotech.com.vn/reseach_detai.php?id=10 31. Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (05-01-2007), Web: www.hcmbiotech.com.vn/reseach_detai.php?cateid=3&ID=45 33. Ứng dụng hệ thống Bioreactor trong sản xuất số lượng lớn cây dược liệu và hoa cảnh (10/11/2006). Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 23 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều Mục lục Trang 1. MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1 2. MỘT SỐ HỆ THỐNG BIOREACTOR .......................................................................... 2 2.1. Cấu tạo chung ............................................................................................................... 2 2.2. Phân loại ....................................................................................................................... 2 2.2.1. Bioreactor không có cánh khuấy .............................................................................. 2 2.2.2. Hệ thống nuối cấy ngập chìm tạm thời ..................................................................... 4 2.2.2.1. Nguyên tắc và cấu tạo ............................................................................................. 4 2.2.2.1.1. Hệ thống RITA .................................................................................................... 4 2.2.2.1.2. Hệ thống bình sinh đôi BIT ................................................................................. 5 2.2.2.1.3. Hệ thống Plantima ............................................................................................... 6 2.2.2.2. Ưu và khuyết điểm của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời ............................. 6 a. Ưu điểm ............................................................................................................... 6 b. Khuyết điểm ....................................................................................................... 7 2.2.2.3. Ảnh hưởng của hệ thống ngập chìm tạm thời lên chất lượng cây nuôi cấy ........... 7 2.3. Các yếu tố và thông số ảnh hưởng đến quá trình nuối cấy ........................................... 8 2.3.1. Không khí .................................................................................................................. 8 2.3.2. Oxygen hòa tan .......................................................................................................... 9 2.3.3. Sự đảo trộn ................................................................................................................ 9 2.3.4. pH ............................................................................................................................ 10 2.3.5. Chất dinh dưỡng ...................................................................................................... 10 2.3.5.1. Nguồn Cacbon ...................................................................................................... 10 2.3.5.2. Dinh dưỡng khoáng .............................................................................................. 10 2.3.5.3. Chất điều hoà sinh trưởng .................................................................................... 11 2.3.5.4.Vitamin .................................................................................................................. 11 2.3.6. Thời gian ngập chìm mẫu ........................................................................................ 12 2.3.7. Thể tích môi trường dinh dưỡng .............................................................................. 12 2.4. Sự phát triển của thực vật trong Bioreactor ................................................................ 12 2.4.1. Quá trình phát sinh phôi soma ................................................................................. 12 2.4.2. Sự nhân chồi ............................................................................................................ 13 3. KẾT QUẢ ...................................................................................................................... 13 3.1. Kết quả của ứng dụng hệ thống Bioreactor trong nhân sinh khối tế bào ................... 13 3.1.1. Nhân sinh khối callus .............................................................................................. 13 3.1.2. Nhân sinh khối rể ..................................................................................................... 14 3.2. Kết quả ứng dụng hệ thống bioreactor trong vi nhân giống vô tính thực vật ........... 15 Đồ án chuyên môn Công nghệ Tế bào Thực vật GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 24 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều 3.2.1. Trên đối tượng hoa Lily ........................................................................................... 15 3.2.2. Trên đối tượng lan Hồ điệp .................................................................................... 16 3.2.3.Trên đối tượng hoa Thu hải đường (THĐ). .............................................................. 18 4. KẾT LUẬN .................................................................................................................. 19 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 20