Đề tài Ứng dụng kĩ thuật phân tử trong xét nghiệm nông nghiệp

ỨNG DỤNG KĨ THUẬT PHÂN TỬ TRONG XÉT NGHIỆM NÔNG NGHIỆPChủ nhiệm bộ môn: LÊ NGỌC TRIỆUTRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠTKHOA SINH HỌC Danh sách thành viênĐặt vấn đề         Nhờ phát minh kĩ thuật PCR mà ngành sinh học phân tử và nhiều ngành khoa học khác có sử dụng kĩ thuật sinh học phân tử được tiếp cận với một phương pháp mới đem lại kết quả có ý nghĩa to lớn, trong đó có các nghiên cứu về các lĩnh vực y tế, khoa học đời sống. PCR là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, có độ nhậy và tính đặc hiệu rất cao; do đó, PCR rất thích hợp cho xét nghiệm chẩn đoán trong lĩnh vực y học, pháp y, bệnh lí cây trồngNHƯ VẬY:- TẠI SAO LẠI LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM BẰNG KĨ THUẬT PCR ?- CƠ SỞ NÀO ĐỂ THIẾT KẾ CÁC MỒI ĐẶC HIỆU CHO MỘT PHẢN ỨNG TRONG MỘT CHUẨN ĐOÁN ?- TRÊN ĐỐI TƯỢNG LÀ VIRUS CẦN CÓ NHỮNG LƯU Ý GÌ TRONG PHẢN ỨNG ?- Ý NGHĨA CỦA VIỆC CHUẨN ĐOÁN BẰNG XÉT NGHIỆM NÀY TRONG NÔNG NGHIỆP ?I. Giới thiệu nguyên lý kỹ thuật PCR II. Nguyên lí hoạt động của PCRIII. Một số ứng dụng của PCR trong nông nghiệp hiện nayI.Giới thiệu nguyên lý kỹ thuật PCR Dựa vào cơ chế tổng hợp gen đặc hiệu trong tế bào, nhà hóa sinh người Mĩ Karry Mullis đã phát minh ra kĩ thuật tổng hợp gen trong ống nghiệm (PCR) vào năm 1985. PCR là phương pháp in vitro để tổng hợp một đoạn DNA đặc thù nhờ công hiệu của 2 mồi oligonucleotide gắn vào 2 sợi đôi của đoạn DNA đích với sự tham gia của DNA polymerase.  Phản ứng PCR được thực hiện qua 3 giai đoạn trong 1 chu kì:- Giai đoạn biến tính (denaturation)- Giai đoạn bắt cặp (annealing)- Giai đoạn kéo dài (elongaction)         Chu kì này được lặp đi lặp lại từ 20 - 40 lần và cho ra các sản phẩm cuối cùng của PCR là các đoạn DNA hoặc RNA phiên bản. Số lượng các bản sao này được tính theo hàm số mũ.Máy PCRII.Nguyên lí hoạt động của PCR1. Các thành phần tham gia vào phản ứng PCR ( PCR mix):- DNA khuôn- Taq. DNA polymerase.- d NTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP).- Primer ( oligonucleotide).- PCR buffer.2. Ba giai đoạn phản ứng PCR thực hiện trên máy luân nhiệt (Thermalcycles) - Giai đoạn biến tính (denaturation): 92 – 98 độ CGiai đoạn bắt cặp (annealing)45 thoi gian 20s-2phut Giai đoạn kéo dài (elongaction) nhiệt độ 68-72 Giới thiêu các bước cơ bản của kỹ thuật PCR trong việc lấy mẫu đem phân tíchCác bệnh phẩm y học Ly trích pre - nucleic acide Ly trích acide nucleic tinh khiết PCR ( RT - PCR) Phân tích phát hiện sản phẩm PCR bằng quang phổ hay điện diThực hiện xét nghiệm chẩn đoán bằng PCRSáu khâu chính của quy trình xét nghiệm bằng kỹ thuật PCR 1. Lấy mẫu: ADN có thể tách chiết từ những mẫu khác nhau, như máu tươi, máu khô, tế bào niêm mạc, nước xúc miệng, tóc, da, phân, v.v... Mẫu có thể lấy tại chỗ hoặc gửi từ xa hàng nghìn kilômet, mất nhiều ngày, trong phong bì bình thường, qua bưu điện, không cần bảo quản lạnh.Kí hiệu-Lấy mẫu đem phân tíchCó thể là DNA kép, đơn, hoặc RNA được tách chiết từ các đối tượng nghiên cứu. DNA mẫu có độ nguyên vẹn cao tránh lẫn tạp chất.Lượng DNA được sử dụng cũng có khuynh hướng giảm (từ 1mg xuống còn 100µg) vì thế người ta sử dụng polymerase cho hiệu quả cao .2. Tách chiết ADN: Nhiều quy trình tách chiết ADN khác nhau của thế giới đã được nghiên cứu, thử nghiệm và thích ứng với điều kiện nước ta. Do vậy, góp phần giảm giá thành, tiết kiệm kinh phí. Với mỗi loại mẫu có một quy trình tách chiết thích hợp riêng. Đảm bảo chất lượng và số lượng ADN từ những lượng mẫu nhỏ. Tách chiết ADN Tinh sạch ADN 3. Nhân ADN đặc hiệu: Đây là khâu quan trọng nhất của quy trình. Các hỗn hợp hoá chất khác nhau và các chu trình nhiệt khác nhau đã được thử nghiệm cho từng cặp mồi. Trên cơ sở đó, đã tối ưu hoá thành phần của từng hỗn hợp, từng chu trình nhiệt cho từng cặp mồi, dựa vào những hoá chất sẵn có trên thị trường trong nước Nhân ADN đặc hiệu 4. Điện di: Điện di được dùng để tách biệt các đoạn ADN có độ dài ngắn khác nhau. Độ tách biệt này phụ thuộc nhiều yếu tố. Các yếu tố đã được lựa chọn và tối ưu hoá trên cơ sở vật liệu sẵn có, hạ giá thành đáng kể và tăng độ phân giải lên hàng trăm lần, giúp phân biệt rõ các đoạn ADN chỉ chênh lệch nhau bốn nucleotid. Điện di 5. Nhuộm màu ADN: Chất lượng điện di và kết quả nhân ADN đặc hiệu chỉ có thể hiện rõ trên bản gel với quy trình nhuộm ADN được tối ưu hoá và phương pháp nhuộm thích hợp được lựa chọn. Ngoài ra, kinh nghiệm và kỹ năng của kỹ thuật viên cũng rất cần thiết, góp phần hạ giá thành chung Nhuộm màu ADN 6. Phân tích kết quả: Bản gel sau khi nhuộm xong sẽ có dạng như hình trên. Các đoạn ADN có độ dài khác nhau hiện rõ trên bản gel, có thể quan sát bằng mắt thường và đo đếm. Trong một số trường hợp, có thể xác định trình tự ADN để có kết luận cuối cùng. Hàng nghìn bản gel như thế đã được phân tích và hiện được lưu giữ tại Phòng thí nghiệm. Phân tích kết quả - TẠI SAO LẠI LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM BẰNG KĨ THUẬT PCR ?Ý NGHĨA TRONG NÔNG NGHIỆP ? Độ tinh sach của mẫu không cần cao Dễ thực hiện Rẽ tiền và thời gian thực hiện ngắn Độ chính xác cao đáng tin cậyTrong nông nghiệp hiện đại có nhiều loại bệnh cần phải được chuẩn đoán sớm ngay tại vườn ươm hay trên nguồn hạt giống để loại bỏ tác nhân gây hại trước khi được đưa ra trồng trọt và sản suất đại trà mặt khác trên những đối tượng nghi ngờ đã bị lây nhiễm mầm bệnh có thể loại trừ sớm để tránh việc lây lan nhầm giảm thiểu thiệt hại đến mức thấp nhất. Vì thế những ưu thế của kĩ thuật này giúp đưa ra kết quả một cách chính xác và kịp thời để có thể giải quyết mầm móng các nguồn bệnh.- CƠ SỞ NÀO ĐỂ THIẾT KẾ CÁC MỒI ĐẶC HIỆU CHO MỘT PHẢN ỨNG TRONG MỘT CHUẨN ĐOÁN ?Khi nhiệt độ hạ xuống đến nhiệt độ gắn mồi, một mồi sẽ gắn đặc hiệu vào mạch mang nghĩa trong khi một mồi khác sẽ gắn vào mạch đối nghĩa. Trong đó, mồi là các trình tự oligonucleotide ngắn có thể bám đặc hiệu vào một vùng trình tự nhất định. Mồi sẽ là điểm khởi đầu để các polymerase có thể thực hiển tổng hợp mạch bổ sung mới cũng như xác định đoạn ADN được khuếch đại. Do đó, việc thiết kế mồi sẽ quyết định mức độ đặc hiệu và năng suất của phản ứng.Việc thiết kế mồi đặc hiệu cho một phản ứng đựa vào trình tự bảo tồn nằm trong vùng bảo tồn genome của sinh vật, trình tự bảo tồn thể hiện đặc trưng riêng biệt cho từng sinh sinh vật cụ thể mà dựa vào đó có thể thiết kế các mồi đặc hiệu cho từng loài sinh vật. - Trình tự đích quan trọng trong phát hiện vi sinh vật- Trình tự vừa có vùng bảo tồn cao cho một nhóm vi sinh vật và vừa có vùng biến động đặc trưng cho từng loài riêng biệt.Thiết kế mồi đặc hiệu cho loàiTRÊN ĐỐI TƯỢNG LÀ VIRUS CẦN CÓ NHỮNG LƯU Ý GÌ TRONG PHẢN ỨNG ?Hoạt tính RNase H: hoạt tính RNase cho phép phá hủy đặc hiệu RNA trong phức hợp (RNA-RNA bổ trợ), hiện tượng này không có lợi cho PCR nếu quá trình phá hủy khuôn mẫu RNA cạnh tranh với quá trình tổng hợp DNA khi tạo sợi DNA đầu tiên. Nói cách khác nếu trong phản ứng test virus ta bổ sung thêm RNase thì phản ứng chuyển RNA sẽ không đạt kết quảEnzmye phiên mã ngược ( ReverseTransciptase): các enzyme ReverseTransciptase phụ thuộc RNA, xúc tác quá trình tổng hợp RNA->DNA đầu tiên sau đó DNApolimerase mới thực hiện phản ứng tổng hợp chuỗi DNA của virus.MỘT VÍ DỤ VỀ XÉT NGHIỆM VIRUS DÂU TÂY(Strawberry)Bảy virus rệp truyền qua đường được tái chuyển trong dâu tây:Strawberry crinkle virus (SCV)SMYEVStrawberry mottle virus (SMoV)Strawberry vein banding virus (SVBV)Strawberry pseudo mild yellow edge virus (SPMYEV)Strawberry chlorotic fleck virus (SCFV)Strawberry latent C virus (SLCV)Trong đó: SCV, SMYEV, SMoV, và SVBV đã được coi là bốn virus quan trọng nhất về kinh tế của dâu tây.A: xuất hiện hóa đỏ trên toàn vườn, tang trưởng không đềuB: các dãi đỏ lây lanC: cận cảnh sự hóa đỏ, còi cọc, méo mó quả nhỏ của dâuẢnh điên di phân tích kết quả test virus trên một số chủng dâu tây phổ biến tại Đà LạtCác triệu chứng suy giảm trong cây dâu tây:A: mạch dẫn hóa đỏB: lá biến dạng, mạch dẫn hóa đỏ, tổn thương trên cuống láMỞ RỘNG: PCR ĐA MỒI- MULTIPLEX PCRMultiplex PCR là phương pháp sử dụng nhiều cặp mồi cùng lúc để khuếch đại nhiều khu vực trên trình tự DNA đích, có thể sử dụng kĩ thuật này để định nhóm hoặc phân loại virus bằng các trình tự Nucleic acidTrong một xét nghiệm để tăng độ tin cậy cho kết quả và tiết kiệm thời gian, chi phí, phản ứng cần được “Mix” hỗn hợp mồi ta có thể phát hiện cùng lúc nhiều virus trên cùng một mẫu. Do tính chất đặc hiệu của mồi nên việc phối hợp sẽ đạt hiệu quả cao trong xét nghiệm mà không làm ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệmPhản ứng multiplex PCR có thể chia thành 2 loại:a) Phản ứng multiplex PCR dùng một khuônPhương pháp này sử dụng một loại khuôn, thường là ADN hệ gen, cùng với các cặp mồi (các mồi xuôi và mồi ngược) để khuếch đại một vùng gen cụ thể có chứa trong sợi khuôn.b) Phản ứng multiplex PCR dùng nhiều khuônCó thể thực hiện duy nhất một phản ứng với nhiều loại khuôn và nhiều cặp mồi. Tuy nhiên sự có mặt của nhiều cặp mồi có thể dẫn đến việc liên kết chéo giữa các mồi với nhau và có thể có sự bắt cặp nhầm giữa mồi này và khuôn kia. Do đó việc thiết kế mồi là rất quan trọng.Phản ứng ELISAĐặt vấn đề:Ngoài việc xét nghiệm các bệnh lí do sinh vật gây ra, trong nông nghiệp việc sử dụng các loại hóa chất, thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) cũng là một yếu tố hết sức quan trọng. Dư lượng thuốc BVTV trong nông sản hiện nay là vấn đề của xã hội. ELISA- một phương pháp xét nghiệm đã được ứng dụng từ lâu trong xét nghiệm các bệnh lí, gần đây phát triển theo hướng kiểm tra, đánh giá mức độ ô nhiểm dư lượng các hợp chất BVTV trong nông sản và trong môi trường sinh thái nông nghiệpĐịnh nghĩa:ELISA ( Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay_ Xét nghiệm hấp thu miễn dịch liên kết với enzyme) dựa trên sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu, phản ứng tạo sản phẩm có màu hay phát sáng. Trong đó tính chất họat hóa của enzyme và độ đặc hiệu của kháng thể là không đổi.Nguyên tắc: Sử dụng KT đơn dòng(Mabs) phủ bề mặt những đĩa giếng. Nếu có sự hiện diện của KN trong mẫu,KN sẽ tạo phức hợp với KT cố định trên giếng và KT tự do có gắn enzyme tạo thành một phức hợp kép(sandwich).Khi bổ sung cơ chất đặc hiệu của enzyme vào giếng,enzyme xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra các sản phẩm có màu hay phát sáng.Ðĩa plastic sử dụng để tiến hành xét nghiệm ELISA Có hai phương pháp xét nghiệm ELISA:Phương pháp ELISA gián tiếp(indirect ELISA): dùng để phát hiện kháng thể chuyên biệt trong huyết thanh Phương pháp ELISA trực tiếp( direct ELISA): dùng để phát hiện kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm.Các loại enzyme thường dùng:Alkaline phosphatasePeroxydaseGlucoxydaseβ-galactosidase bộ KIT Elisa. Thí nghiệm kiểm tra sốt dengue bằng bộ KIT Elisa. Ưu điểm:Ưu điểm quan trọng nhất của phương pháp ELISA là độ nhạy cao, có thể phát hiện được phức hợp nhỏ KN_KT, cho phép phát hiện sớm tác nhân gây bệnh ở giai đoạn sớm khi mầm bệnh mới xâm nhiễm.Nhanh,thao tác đơn giản.Rẻ tiền, ít tốn sinh phẩm,hóa chất,số lượng mẫu lớn, rất thích hợp với việc phân tích đối với nguyên liệu thô.Nhược điểm: độ chính xác không caoPhương pháp ELISA cạnh tranh dùng cho phân tích các thuốc trừ sâu(1) Cạnh tranh trực tiếp: Cố định kháng thể(2) Cạnh tranh gián tiếp: Cố định cộng hợp kháng nguyênTrong kiểu (1), kháng thế là thuốc trừ sâu được phủ lên một giếng nhựa nhỏ. Một hapten(kháng nguyên không hoàn toàn) mô phỏng thuốc trừ sâu được gắn với một Enzyme đánh dấu tạo nên cộng hợp enzyme có khả năng liên kết với kháng thể. Khi cho dịch chiết mẫu và cộng hợp enzyme vào trong các giếng, thuốc trừ sâu trong dịch chiết và cộng hợp enzyme sẽ cùng cạnh tranh nhau để liên kết với kháng thể. Sau khi rữa trôi những chất dư thừa sau pư cơ chất tương ứng với enzyme sẽ được cho vào dưới sự xúc tác của các enzyme pư tạo màu hay phát huỳnh quang sẽ xuất hiện trong giếng. Thuốc trừ sâu nhiều thì cộng hợp enzyme do kém cạnh tranh nên kháng thể giử lại ít màu sẽ nhạt và ngược lạiTrong kiểu (2) cộng hợp giữa KN- Protein sẽ được cố định trên bề mặt rắn. Thuốc trừ sâu và một lượng kháng thể cố định được cho vào, thuốc trừ sâu là một KN tự do sẽ cạnh tranh với KN cố định bám vào KT. Lượng KN tự do càng nhiều thì KT bị KN giữ cố định càng ít. Sau khi rữa trôi chất thừa sau pư người ta dùng một KT thứ 2 có đánh dấu bằng enzyme để phát hiện KT ban đầu bị giữ lại. Từ đó ta có thể định lượng được thuốc trừ sâu trong mẫu.