Đề tài Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật để nhân nhanh và bảo tồn cây Mắt trâu của Vườn Quốc gia Cúc Phương

PHẦN I MỞ ĐẦU Lí do chọn đề tài Hiện nay, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những kỹ thuật rất quan trọng của công nghệ sinh học thực vật. Những thành tựu mà nuôi cấy mô tế bào thực vật đạt được đã chứng tỏ khả năng ứng dụng hiệu quả trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là nhân nhanh và bảo tồn các loài thực vật quí hiếm [1]. Đặc trưng của rừng nhiệt đới là sự đa dạng về loài, song thường là các loài hiếm do kích thước quần thể nhỏ, mật độ thấp, nhiều loài bị suy giảm mạnh do tàn phá rừng. Hiểu biết của con người về mối tương tác và sự phụ thuộc lẫn nhau giữa các loài trong hệ sinh thái còn ít. Do vậy những nghiên cứu để bảo tồn đa dạng sinh học cần phải tiến hành đồng thời với việc bảo tồn hiệu quả giữa các loài và hệ sinh thái. Bảo tồn nguồn gen thực vật là việc cấp thiết và thường xuyên nhằm bảo vệ đa dạng sinh học ở nước ta [12], [13]. Trong kho tàng cây thuốc Việt Nam có rất nhiều cây thuốc quí, trong số đó cây Mắt trâu (Micromelum hisutum Oliv. ) là một trong những loài thực vật trong danh mục cần được bảo tồn của Vườn Quốc gia Cúc Phương [11], [14]. Ngoài công dụng chữa một số bệnh thông thường như trị ghẻ, sâu đốt, ngộ độc thức ăn hay bệnh vàng da thì cây Mắt trâu còn phục vụ cho công tác nghiên cứu tìm ra hoạt chất phòng và chống bệnh [9], [41], [42]. Theo Ma và cộng sự thì trong dịch chiết vỏ thân cây Mắt trâu phân tích được micromeline, 5 hợp chất alkaloids mới có khả năng kháng chủng vi khuẩn H37Rv gây bệnh lao [32]. Bên cạnh đó, cây Mắt trâu còn có giá trị về mặt bảo tồn quần thể thực vật Vườn Quốc gia Cúc Phương. Tuy nhiên, chưa có những nghiên cứu sâu về tác dụng chữa bệnh của cây Mắt trâu. Vì vậy, cần có những nghiên cứu đầy đủ hơn về ứng dụng cũng như nhân giống và bảo tồn loài cây này. Với những lý do trên chúng tôi tiến hành đề tài: Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật để nhân nhanh và bảo tồn cây Mắt trâu của Vườn Quốc gia Cúc Phương. Mục đích, nội dung nghiên cứu Mục đích Xây dựng qui trình hoàn chỉnh để nhân nhanh và bảo tồn in vitro cây Mắt trâu (Micromelum hisutum Oliv.) của Vườn Quốc gia Cúc Phương. Nội dung Khử trùng được mẫu sạch để nuôi cấy in vitro. Xác định công thức môi trường thích hợp tạo đa chồi in vitro. Xác định công thức môi trường thích hợp tạo cây in vitro hoàn chỉnh. Xác định giá thể thích hợp cho cây in vitro nuôi trồng ngoài tự nhiên. PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu chung về cây Mắt trâu Cây Mắt trâu có tên khoa học là Micromelum hissutum Oliv. Thuộc bộ: Rutales (Cam) Họ: Rutaceae (Cam) Đặc điểm sinh học, sinh thái Mắt trâu là cây gỗ nhỏ có thể cao đến 6m. Thân ít phân cành, cành có nhiều lông nhung, màu hung, lá màu xanh sẫm, kép lông chim lẻ, lá chét từ 5 - 9, mọc so le, thuôn mũi mác hay mũi mác, dài 1,7 - 13cm, rộng 1 - 5cm, không cân ở góc và mũi nhọn sắc, đài dài, hơi có răng, có lông nhung ở mặt dưới. Hoa trắng, hay vàng xanh, thành cụm hoa phủ lông nhung, ngắn hơn lá, cánh hoa có lông cứng. Quả nạc dạng bầu dục, màu đỏ, cam hay hung và có mùi thơm. Mùa hoa tháng 1 - 4, mùa quả chín tháng 4 - 5 [2], [6], [34]. Cây Mắt trâu phân bố ở một số khu vực như Ninh Bình, Nha Trang, Hòa Bình, Thanh Hóa. Loài cây này cũng được tìm thấy ở Ấn Độ, Malayxia, Lào, Campuchia, Thái Lan [8], [39]. Lá cây Mắt trâu dùng trị bệnh ghẻ, nấu xông chữa bệnh vàng da hay ngộ độc thức ăn. Sử dụng lá giã ra cùng với lá me sau đó thêm ít muối dùng đắp vào da làm dịu đau khi bị sâu đốt. Theo nghiên cứu của các tác giả Ma và Cộng sự (2005) trong dịch chiết của vỏ cây Mắt trâu (Micromelum hissutum Oliv.) chứa chất có khả năng kháng chủng vi khuẩn gây bệnh lao H37Rv. Các thí nghiệm đang trong giai đoạn thử nghiệm trên chuột [32], [42]. Cây Mắt trâu nằm trong danh sách các loài thực vật cần được bảo tồn của VQG Cúc Phương. Vì vậy, mà ngoài giá trị về làm thuốc hay dùng trong nghiên cứu thì loài cây này còn đóng góp vốn gen của mình vào trong quần thể thực vật VQG Cúc Phương, hiện đang được lưu giữ và bảo tồn nguồn gen trong các phòng thí nghiệm [39], [41]. Trên thế giới, nhờ ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã bảo tồn thành công nhiều cây thuốc như Centella aistica, Rehmannia glutinosa [22], [38]. Năm 2009 Geetha và cộng sự đã thông qua phương pháp vi nhân giống hai loài cây Holostemma adakodien và Ipomoea mauritiana đồng thời cũng tuyên truyền cho người dân biết bảo tồn các cây thuốc quí trước thảm họa bị tuyệt chủng [27]. 2.2. Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật trong nhân giống và bảo tồn nguồn gen thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những kỹ thuật quan trọng của công nghệ sinh học, là nền tảng để nghiên cứu và áp dụng các công nghệ khác trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật. Trải qua hơn 100 năm phát triển và đã đạt được những thành tựu nhất định trong lĩnh vực nhân giống, bảo quản nguồn gen cây trồng [16]. 2.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô và tế bào thực vật Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các loại nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo, ở điều kiện vô trùng. Bao gồm: - Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành - Nuôi cấy cơ quan - Nuôi cấy phôi - Nuôi cấy mô sẹo - Nuôi cấy tế bào trần Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật đó là tính toàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra năm 1902. Theo quan niệm sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cơ thể sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào. Trong đó: Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau. Khi các tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng riêng biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình mà trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào ngược lại với sự phân hóa tế bào. Phân hóa tế bào Tế bào phôi sinh Tế bào phân chia Tế bào chuyên hóa Phản phân hóa tế bào Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hóa để biểu hiện tính trạng mới, còn một số gen khác lại bị ức chế hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc phân tử ADN của mỗi tế bào, khiến quá trình sinh trưởng của cơ thể thực vật luôn được hài hòa. Như vậy, kỹ thật nuôi cấy mô và tế bào thực vật xét cho cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng). Đây là một điểm rất quan trọng vì trên cơ sở đơn vị mô, tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện kỹ thuật tiên tiến cho việc chọn, cải thiện và cả lai tạo giống cây trồng [7], [10], [16]. 2.2.2. Các bước chính trong nhân giống vô tính in vitro Theo George (1993) quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm các bước sau: Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận cây mẹ (nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt là sạch vi rút và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu nuôi cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu. Bước 2: Nuôi cấy khởi động Là giai đoạn khử trùng và đưa mẫu cấy in vitro. Các giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu sau: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, các mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây. Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách sau đó là đỉnh chồi hoa, cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá. Bước 3: Nhân nhanh Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông qua các con đường hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính. Chúng ta cần phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả cao nhất. Theo nguyên tắc chung môi trường có nhiều cytokinin sẽ kích thích tạo chồi. Nhiệt độ nuôi cấy thường là 25 - 27oC thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường độ ánh sáng 2000 - 4000 lux. Tuy nhiên, đối với mỗi loại đối tượng nuôi cấy đòi hỏi có chế độ ánh sáng nuôi cấy khác nhau. Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh Để tạo rễ cho chồi người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất kích thích sinh trưởng. Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo những yêu cầu sau: Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây). Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp giá thể sạch tơi xốp, thoát nước. Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sáng vườn ươm cũng như có chế độ dinh dưỡng phù hợp [5], [17]. 2.2.3. Phương pháp nhân đa chồi Trong phương pháp nhân đa chồi, chồi ngọn được tách và nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng và các chồi bên từ nách lá phát triển dưới ảnh hưởng của cytokinin với nồng độ cao. Vai trò của cytokinin lúc này là ức chế ưu thế ngọn để chồi bên phát triển. Các chồi này tiếp tục được chuyển sang môi trường mới có bổ sung cytokinin thì các chồi mới tiếp tục được tạo ra. Sau đó, các chồi này được chuyển sang môi trường ra rễ và được đưa ra vườn ươm khi đã có rễ hoàn chỉnh [16]. Những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự hình thành đa chồi: Nhu cầu về loại và nồng độ cytokinin khác nhau. Nồng độ cytokinin thay đổi tùy theo giai đoạn nuôi cấy, thông thường trong quá trình tạo chồi người ta sử dụng auxin với nồng độ thấp, phối hợp cùng với cytokinin ở nồng độ cao. Không nên cảm ứng tạo mô sẹo với nồng độ cytokinin quá cao vì có thể tạo ra chồi bất định mang các đột biến. Trong trường hợp chồi bên không tăng trưởng được thì cần phải cắt bỏ chồi ngọn hoặc làm chết chồi ngọn thì chồi bên mới có thể hoạt động. Khi cấy chuyển nhiều lần tốc độ sinh khối bị thay đổi [18]. Hiện nay nhân nhanh bằng phương pháp nhân chồi bên được áp dụng rộng rãi ở nhiều loài thực vật, quá trình nhân chồi thường được thực hiện theo các bước sau [10]: Cây tự nhiên Khử trùng mẫu Nhân đa chồi Tạo cây in vitro hoàn chỉnh Trồng cây trong bầu Cây trồng ngoài tự nhiên Sơ đồ tổng quát nhân nhanh trong in vitro 2.2.4. Vai trò của các chất kích thích sinh trưởng đối với tái sinh cây in vitro Các chất kích thích sinh trưởng thực vật có vai trò quan trọng trong kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Bằng cách cung cấp các chất kích thích sinh trưởng ở một mức độ thích hợp, chúng ta có thể điều khiển được chiều hướng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy. Auxin và cytokinin là hai chất kích thích sinh trưởng được sử dụng phổ biến nhất trong nuôi cấy mô. Đặc tính của Auxin Auxin là chất kích thích sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái đặc biệt là khi nó được sử dụng với cytokinin. Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào: Kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu, hàm lượng auxin nội sinh của mẫu nuôi cấy, sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh. Auxin có vai trò kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào. Cùng với cytokinin các nhóm auxin kích thích sự phân chia tế bào. Các hormone của nhóm này có hoạt tính như: Tăng trưởng chiều dài thân, lóng, tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, kích thích ra rễ và phân hóa mạch dẫn. Tác động của các auxin thường liên quan tới độ dài của thân, đốt, chồi chính, rễ ... Đối với nuôi cấy mô và tế bào thực vật, auxin được sử dụng để kích thích phân chia tế bào và phân hóa rễ. Những auxin thường dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật: IBA (Indoly Butyric Acid), IAA (Indoly Acetic Acid), NAA (α - Naptalen Acetic Acid), 2,4 - D (Dichlorphenoxy Acetic Acid) [18]. Đặc tính của cytokinin Cytokinin là dẫn xuất của adenine, hormone liên quan chủ yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Các cytokinin thường xuyên được sử dụng nhất là BAP (6 - Benzyl Amino Purin), kinetin (N - (2 - furfurylamin) - 1 - H - 6 - amin ), zeatin (6 - (4 - hydroxy - 3metyl - trans - 2 butanylamin) purin). Hàm lượng sử dụng các loại cytokinin dao động từ 0,1 - 0,2 mg/l. Ở nồng độ cao hơn, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy. Ngoài hai nhóm chính là auxin và cytokinin, trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật người ta còn sử dụng thêm gibberellin để kích thích sự kéo dài tế bào, qua đó làm tăng kích thước chồi nuôi cấy… là loại gibberellin được sử dụng nhiều nhất. Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật có loại mẫu chỉ cần auxin hoặc cytokinin, tuy nhiên người ta hay dùng phối hợp cả auxin và cytokinin ở tổ hợp tỷ lệ khác nhau sẽ cho hiệu quả tốt hơn [19]. 2.2.5. Thành tựu bảo tồn nguồn gen cây trồng sử dụng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã trở thành một trong những phương thức quan trọng nhất để nhân nhanh, đặc biệt là đối với cây trồng khó nhân nhanh bằng phương pháp truyền thống. Dưới đây là một số thành tựu đã đạt được. Trong nước Ở Việt Nam việc áp dụng kỹ thuật này để bảo tồn các loài thực vật nhiệt đới quí hiếm, có giá trị kinh tế cũng được các nhà nghiên cứu quan tâm, bắt đầu từ các cây Thông (Taxus sps.) là một loài có chứa các hoạt chất chữa ung thư hiệu quả như Taxoid và các hợp chất và một số loài thực vật có giá trị làm thuốc [20]. Cây Màng tang (Litsea verticillata) là loại cây thân gỗ có chứa một số hợp chất có khả năng kháng HIV (+)- demethoxyepiercelsin và verticillatol [29], [40]. Tác giả Lê xuân Đắc và Cộng sự đã thành công trong việc nhân nhanh và bảo tồn cây Màng tang (Litsea verticillata) được tìm thấy ở Vườn Quốc gia Cúc Phương bằng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật [4]. Cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) được biết là một vị thuốc quí trong việc chữa một số bệnh ung thư. Tác giả Lưu Trường Sinh và Cộng sự đã tạo ra cây Trinh nữ hoàng cung bằng phương pháp in vitro có chất lượng tương đương với cây trồng theo phương pháp truyền thống [15]. Các tác giả Nguyễn Thanh Danh và Cộng sự (2005) đã nghiên cứu thành công nhân nhanh in vitro cây Vù hương (Cinamomum balansae Lecomte.), sử dụng phôi hạt của quả Vù hương xanh thu hái trước khi chín 30 ngày đã nhân giống được cây Vù hương bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi hạt xanh [3]. Thế giới Năm 2003, Bedir và Cộng sự đã vi nhân giống thành công giống Hydrastis Canadensis, một loài thực vật có nguy cơ tuyệt chủng ở miền Bắc nước Mỹ [23]. Cũng cùng năm 2003 Part và Cộng sự đã thành công trong việc nhân nhanh và bảo tồn cây thuốc Anemopaegma arvense trong ống nghiệm trên môi trường MS có chứa 4% đường sorbitol, kết quả sau 6 tháng mới phải cấy chuyển một lần [36]. Năm 2008 Balaraju và Cộng sự đã nhân giống và tái sinh in vitro thành công cây thuốc Vitex agnus castus bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào và tế bào thực vật từ mô phân sinh đỉnh trên môi trường MS có bổ sung 0,1mg/1ml IBA [21]. Gần đây những thành tựu trong việc hoàn thiện qui trình nuôi cấy in vitro cây thuốc đang có nguy cơ bị tuyệt chủng như Gynura procumbens, Crotalaria verrucosa, Momordica tuberosa [24], [30], [33]. Năm 2009 bằng kỹ thuật vi nhân giống in vitro các nhà khoa học trên thế giới đã thành công trong việc nhân nhanh nhiều cây thuốc quí hiếm như Phyllanthus urinaria hay cây Givotia rottleriformis [31], [37]. Park và Cộng sự (2009) tái sinh thành công loài Rehmannia glutinosa quí hiếm đang bị khai thác quá mức [35]. Hiện nay những công trình nghiên cứu thành công trong lĩnh vực tái sinh cây thuốc quí bằng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật vẫn đang được tiến hành. 2.2.6. Phương pháp bảo tồn thực vật quí hiếm Ngày nay nhiều nguồn gen thực vật bị đe dọa có nguy cơ tiệt chủng, nhiều giống cây trồng bị thoái hóa không giữ được đặc điểm nguyên sơ ban đầu như chất lượng hay khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi, thì việc sử dụng kỹ thuật nhân giống in vitro để nhân nhanh và bảo tồn nguồn gen là hết sức cần thiết. Bảo quản trong điều kiện in vitro được coi là giải pháp công nghệ có triển vọng đối với cây trồng nhân giống vô tính và cây có hạt dễ mất khả năng nảy mầm ở nhiệt độ và độ ẩm thấp. Bảo tồn in situ Là biện pháp bảo tồn hiệu quả nhất bao hàm các quần thể tái sinh nhân tạo bằng nguồn hạt giống thu hái tại chỗ, thu hái từ cây mẹ mà không áp dụng có định hướng. Điều này có ý nghĩa lớn đối với việc xây dựng rừng giống cho các loài cây có phân bố rải rác, như vậy quần tụ bảo tồn được dùng làm nguồn cung cấp vật liệu giống cho tái sinh nhân tạo [12]. Hầu hết các loài cây bản địa đều cần được ưu tiên bảo vệ theo hình thức bảo tồn in situ, song hai vấn đề được quan tâm là: - Có qui hoạch cụ thể và xác định vùng cần bảo vệ cho mỗi loài sao cho cá thể vẫn giữ nguyên được toàn bộ biến dị di truyền của loài. - Kết hợp bảo tồn với việc thu hái hạt giống phục vụ tái sinh tự nhiên, tái sinh nhân tạo, xây dựng quần tụ bảo tồn mới, xây dựng giống và phục vụ trồng rừng. Bảo tồn ex situ Bảo tồn ex situ được thực hiện bằng cách tách rời cây hoặc vật liệu nhân giống ra khỏi vùng phân bố tự nhiên để đưa vào các bộ sưu tập cây sống, rừng trồng với mục đích bảo tồn [12]. Ba nhiệm vụ chính của bảo tồn ex situ là: - Thu thập các mẫu gen tiêu biểu; - Duy trì chúng ở điều kiện tốt trong thời gian dài; - Làm tăng số lượng mẫu thu thập được; Khó khăn nhất trong bảo tồn ex situ là chi phí cao mà diện tích của một quần tụ bảo tồn được đề xuất với 10 ha cho mỗi loài hoặc xuất xứ và được lượng biến dị đủ lớn nghĩa là thu hạt từ càng nhiều kiểu gen càng tốt. PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 3.1.1. Vật liệu nghiên cứu Vật liệu thực vật Cây Mắt trâu được thu thập từ VQG Cúc Phương, do Trạm nghiên cứu khoa học - VQG Cúc Phương cung cấp. Dụng cụ, hóa chất Dụng cụ nghiên cứu là các trang thiết bị như: box cấy vô trùng, panh, kéo, dao cắt, đèn UV, cân kỹ thuật, cân phân tích, tủ sấy, hệ thống giàn đèn, nồi hấp tiệt trùng, máy đo PH, máy khuấy từ... (của các hãng chuyên dụng như: Sanyo, Metler Toledo, Satorius...). Hóa chất: Môi trường MS sử dụng trong nghiên cứu gồm các muối đa lượng và vi lượng, các chất hữu cơ và vitamin theo Murashige và Skoog (1962), đường saccharose, agar, các chất kích thích sinh trưởng như BAP, IAA, NAA, kinetin, IBA... (của các hãng chuyên dụng như: Sigma, Merck, Invitrogen...). Nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ 25 - 27°C và chế độ chiếu sáng 12h/12h với cường độ chiếu sáng là 2000 lux. 3.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu Địa điểm: Phòng Công nghệ tế bào thực vật và Trại thực nghiệm sinh học - Viện Công nghệ sinh học, thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Thời gian: Từ tháng 4/2008 đến 4/2010. 3.2. Phương pháp nghiên cứu Các chỉ tiêu nghiên cứu được chia thành các công thức thí nghiệm khác nhau và có công thức đối chứng. Số mẫu của mỗi công thức thí nghiệm lớn hơn hoặc bằng 30. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần. 3.2.2. Khử trùng mẫu Khử trùng mẫu bao gồm các bước sau: Cắt cành cây Mắt trâu thành đoạn dài 6 - 8 cm; Rửa mẫu bằng nước xà phòng loãng; Rửa sạch nước xà phòng loãng dưới vòi nước; Rửa 2 lần bằng nước cất vô trùng; Rửa trong cồn 70 °C (Trong 15 giây); Rửa bằng nước cất khử trùng 3 lần; Khử trùng trong dung dịch 1% NaClO, lắc trong 10 phút; Rửa 4 lần bằng nước cất vô trùng; Thấm khô bằng giấy thấm đã khử trùng; Thu mẫu: Mẫu sau khi khử trùng được cắt tỉa thành những đoạn dài khoảng 1,0 - 1,5 cm có từ 1 - 2 đốt thân và được cấy vào môi trường MS. Sau khoảng 20 ngày, chồi non phát sinh in vitro các chồi non này được sử dụng làm nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo [4]. 3.2.3. Nhân nhanh bằng phương pháp nhân đa chồi Môi trường sử dụng trong các thí nghiệm là môi trường MS + 30g/l đường saccharose + 9g/l agar và bổ sung các chất kích thích sinh trưởng với nồng độ khác nhau tùy theo mục đích của từng thí nghiệm với pH = 5,8. Nhân đa chồi cây Mắt trâu Thí nghiệm 1: Thăm dò nồng độ BAP và NAA đối với khả năng tạo chồi Thí nghiệm nhằm xác định nồng độ BAP và NAA thích hợp nhất cho sự tạo chồi. CT Môi trường Chất KTST BAP (mg/l) NAA (mg/l) ĐC 0 0 MT1 0,5 0,5 MT2 1,0 0,5 MT3 1,5 0,5 MT4 2,0 0,5 MT5 2,5 0,5 MT6 3,0 0,5 Thí nghiệm 2: Thăm dò nồng độ BAP và IBA đối với khả năng tạo đa chồi Khảo sát sự tác động đồng thời của BAP và IBA đến khả năng phát sinh chồi và tăng trưởng chồi Mắt trâu. CT Môi trường Chất KTST BAP (mg/l) IBA (mg/l) ĐC 0 0 MT7 0,5 0,5 MT8 1,0 0,5 MT9 1,5 0,5 MT10 2,0 0,5 MT11 2,5 0,5 M12 3,0 0,5 Thí nghiệm 3: Thăm dò nồng độ BAP và kinetin đối với khả năng tạo chồi Khảo sát sự tác động đồng thời của BAP và kinetin đến khả năng tạo chồi cây Mắt trâu. CT Môi trường Chất KTST BAP (mg/l) kinetin (mg/l) ĐC 0 0 MK1 0,5 0,5 MK2 1,0 0,5 MK3 1,5 0,5 MK4 2,0 0,5 MK5 2,5 0,5 MK6 3,0 0,5 Các thí nghiệm 1, 2 và 3 được bố trí ở điều kiện: Nhiệt độ 25 - 27°C Cường độ ánh sáng 2000 lux Mẫu nuôi cấy trong môi trường MS + 30g/l đường saccharose + 9g/l agar, pH = 5,8. Cành Mắt trâu được cắt toàn bộ lá chỉ giữ lại phần thân, thân được cắt thành đoạn có chiều dài 2 - 3 cm gồm 1 - 3 chồi nách. Nhân đa chồi bằng cách cấy thẳng đứng trên môi trường thạch, quan sát khi đếm: Số chồi phát sinh/mẫu. Công thức thích hợp sẽ được chọn để áp dụng cho các lần tạo đa chồi tiếp theo. 3.2.4. Tạo cây Mắt trâu in vitro hoàn chỉnh Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá, rễ để chuyển ra trồng ngoài tự nhiên. Cây con phải khỏe mạnh, sức đề kháng tốt nhằm nâng cao sức sống khi ra môi trường bên ngoài. Các chất kích thích sinh trưởng có tác dụng tạo đa chồi được loại bỏ và thay vào đó là chất kích thích sinh trưởng tạo rễ như IBA, NAA… Thí nghiệm 4: Thăm dò nồng độ IBA đối với khả năng tạo rễ Mục đích là khảo sát nồng độ IBA đến khả năng tạo rễ cây Mắt trâu CT Môi trường Nồng độ IBA (mg/l) ĐC 0 MTI1 0,3 MTI2 0,6 MTI3 0,9 MTI4 1,2 MTI5 1,5 Thí nghiệm 5: Thăm dò nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ Mục đích thí nghiệm là khảo sát nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ cây Mắt trâu nhằm chuẩn bị đưa cây con khỏe mạnh ra ngoài vườn ươm. CT Môi trường Nồng độ NAA (mg/l) ĐC 0 MTN1 0,3 MTN2 0,6 MTN3 0,9 MTN4 1,2 MTN5 1,5 Trong các thí nghiệm 4 và thí nghiệm 5 được bố trí ở điều kiện như sau: Nhiệt độ 25 - 27°C Cường độ ánh sáng là 2000 lux. Mẫu nuôi cấy trong môi trường MS + 30g/l đường saccharose + 9g/l agar, pH = 5,8. Các chồi có kích thước 2 - 3 cm được sử dụng cấy thẳng đứng trên môi trường thạch. Chỉ tiêu quan sát: Số rễ/mẫu 3.2.5. Trồng cây trong bầu Đây là một trong những giai đoạn quan trọng trong quá trình nhân giống in vitro. Giai đoạn này cây non cần sự thích nghi dần với điều kiện bên ngoài ống nghiệm. Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2 - 3 tuần trong thời gian này cây non phải được bảo vệ và chăm sóc tốt trước những yếu tố bất lợi. Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của các giá thể đến hiệu quả trồng cây Mắt trâu Mục đích thí nghiệm là tìm ra giá thể thích hợp trồng cây Mắt trâu trong bầu Công thức Thành phần giá thể Tỷ lệ 1 Đất trồng cây 1 2 Đất trồng cây : Trấu hun 1:1 3 Trấu hun 1 Ghi chú: Đất trồng cây là hỗn hợp đất phù sa + 5% NPK + 15% mùn do Trại thực nghiệm sinh học cung cấp. 3.2.6. Các chỉ tiêu nghiên cứu Để đánh giá và tìm ra được môi trường thích hợp nhất chúng tôi sử dụng các chỉ tiêu sau: Tổng số mẫu tạo chồi Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) = x 100 Tổng số mẫu nuôi cấy Tổng số chồi Số chồi TB/mẫu = Tổng số mẫu tạo chồi Tổng số chồi ra rễ Tỷ lệ chồi ra rễ (%) = x 100 Tổng số chồi nuôi cấy Tổng số rễ Số rễ TB/chồi = Tổng số chồi ra rễ Tổng số cây sống Tỷ lệ cây sống (%) = x 100 Tổng số cây đem trồng 3.2.7. Phương pháp xử lí số liệu thí nghiệm Các số liệu được xử lí thống kê sinh học. Kết quả được mô phỏng bằng các bảng và hình. Chúng tôi đã sử dụng những công thức thống kê sau: Trung bình số học: = Độ lệch chuẩn : Độ lệch trung bình: m = Tiêu chuẩn độ tin của hiệu: = : Giá trị trung bình cộng; X: Giá trị của kết quả đo đếm được ở mỗi đối tượng mỗi lần nhắc lại; n: Số lần nhắc lại của mỗi đợt thí nghiệm (30 ≤ n); m: Sai số của trung bình số học; : Độ lệch chuẩn; d: Hiệu của giữa đối chứng và thí nghiệm; : Sai số của hiệu các trung bình số học; Khi tiêu chuẩn độ tin của hiệu được so với - giá trị chuẩn của tiêu chuẩn Studen với số bậc tự do là (: Số lần nhắc lại của công thức thí nghiệm; : Số lần nhắc lại của công thức đối chứng). Sai khác giữa các trị số trung bình chỉ có ý nghĩa khi lớn hơn hoặc bằng giá trị tương ứng với mức xác suất 0,95. PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Tạo nguyên liệu vô trùng cây Mắt trâu Cành Mắt trâu sau khi khử trùng xong mẫu được cắt tỉa thành những đoạn gồm 1 - 2 đốt thân và được cấy vào môi trường MS. Kết quả sau 30 ngày nuôi cấy đã thu được các chồi vô trùng, các chồi non được sử dụng làm nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo. Hình 1: Chồi Mắt trâu vô trùng sau 2 tuần nuôi cấy 4.2. Tạo đa chồi Trong môi trường nghiên cứu in vitro khi bổ sung các chất kích thích sinh trưởng như auxin, cytokinin, gibberellin sẽ kích thích sự sinh trưởng phát triển và phân hóa của các cơ quan, từ đó tạo nên sức sống tốt cho các mô và tổ chức. Tuy nhiên, mỗi loài thực vật lại thích hợp với một loại và nồng độ chất kích thích sinh trưởng khác nhau. Vì vậy, nên sử dụng phối hợp các chất kích thích sinh trưởng trong môi trường nuôi cấy để cho hiệu quả tối ưu nhất. Việc tìm ra công thức môi trường với nồng độ và tỷ lệ chất kích thích sinh trưởng phù hợp với từng loài cây, từng giai đoạn phát triển là bước rất quan trọng trong qui trình nhân giống in vitro. 4.2.1. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng tạo đa chồi Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái trong các hệ thống nuôi cấy. Khi tỷ lệ auxin/cytokinin cao thì sẽ phát sinh mô sẹo hoặc hình thành rễ. Ngược lại sẽ dẫn tới phát sinh chồi và chồi nách. Chúng tôi tiến hành thử nghiệm các công thức tạo đa chồi với các tổ hợp của BAP và NAA ở các nồng độ khác nhau. Kết quả thể hiện rõ ở bảng 1, hình 2a, hình 2b và hình 3 sau 2 tháng nuôi cấy. Bảng 1: Ảnh hưởng của nồng độ BAP và NAA đến khả năng tạo đa chồi CTMT BAP (mg/l) NAA (mg/l) Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Số chồi TB/ mẫu ( ± m) Mô sẹo ĐC 0 0 100 1,19 ± 0,10 - MT1 0,5 0,5 100 2,61 ± 0,18 - MT2 1,0 0,5 100 2,90 ± 0,21 + MT3 1,5 0,5 100 2,93 ± 0,16 + MT4 2,0 0,5 100 3,17 ± 0,15 - MT5 2,5 0,5 100 2,69 ± 0,18 + MT6 3,0 0,5 100 2,50 ± 0,21 - Ghi chú:+ Xuất hiện mô sẹo; - Không xuất hiện mô sẹo Hình 2a: Tạo đa chồi cây Mắt trâu trên môi trường MT4 ( Không xuất hiện mô sẹo) Theo kết quả nghiên cứu trên cây Bạch đàn (Eucalyptus) của Dibax và Cộng sự (2005), nồng độ của BAP cao hơn nồng độ NAA sẽ cho hiệu quả tạo chồi cao hơn [26]. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu giữ nguyên nồng độ của NAA là 0,5 mg/l, còn nồng độ của BAP tăng dần từ 0,5 mg/l đến 3 mg/l trong các công thức môi trường từ MT1 đến MT6. Kết quả thu được ở bảng 1 cho thấy: Các môi trường đều cho tỷ lệ mẫu tạo chồi là 100%, ở môi trường MT2, MT3 tỷ lệ số chồi trung bình đạt được lần lượt là 2,90; 2,93 chồi, xung quanh gốc có xuất hiện nhiều mô sẹo dạng bở, lá của chồi xoăn nhiều. Ở môi trường MT6, MT1, MT5 hiệu quả tạo chồi lần lượt là 2,50; 2,69; 2,61 chồi nhỏ và yếu. Đối với môi trường MT4 có nồng độ BAP là 2,0 mg/l tỷ lệ tạo chồi đạt 3,17 chồi. Sau 2 tháng nuôi cấy chồi con nhiều, to và không có mô sẹo ở gốc, riêng ở các môi trường MT2, MT3, MT5 xuất hiện mô sẹo với kích thước khác nhau ở quanh gốc. Hình 2b: Tạo đa chồi cây Mắt trâu trên môi trường MT3 (Xuất hiện mô sẹo) Vì vậy, trong thí nghiệm này chúng tôi lựa chọn môi trường thích hợp tạo đa chồi cây Mắt trâu là MT4 (2,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA) Hình 3: Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng tạo chồi cây Mắt trâu 4.2.2. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA đến khả năng tạo đa chồi Trong thí nghiệm này chúng tôi chọn nồng độ BAP là 0,5 mg/l còn nồng độ IBA thay đổi theo hướng tăng dần từ 0,5 mg/l đến 3,0 mg/l trên các công thức môi trường nuôi cấy. Sau 2 tháng nuôi cấy kết quả thu được thể hiện qua bảng 2, hình 4a, 4b, hình 5. Hình 4a: Tạo đa chồi cây Mắt trâu trên môi trường MT9 Hình 4b: Cây Mắt trâu trên môi trường MT11 xuất hiện lá vàng úa Bảng 2: Ảnh hưởng của nồng độ BAP và IBA đến khả năng tạo đa chồi CTMT BAP (mg/l) IBA (mg/l) Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Số chồi TB/ mẫu ( ± m) ĐC 0 0 100 1,19 ± 0,10 MT7 0,5 0,5 100 2,46 ± 0,18 MT8 1,0 0,5 100 2,37 ± 0,16 MT9 1,5 0,5 100 3,29 ± 0,13 MT10 2,0 0,5 100 2,71 ± 0,15 MT11 2,5 0,5 100 2,96 ± 0,20 MT12 3,0 0,5 100 3,04 ± 0,24 Kết quả thu được ở bảng 2 ta thấy: Các môi trường đều cho tỷ lệ mẫu tạo chồi là 100%. Ở môi trường MT11, MT12 tỷ lệ số chồi trung bình đạt được lần lượt là 2,96; 3,04 chồi nhiều và to nhưng về sau xuất hiện nhiều lá vàng. Còn ở môi trường MT8, MT7, MT10 hiệu quả tạo chồi lần lượt là 2,37; 2,46; 2,71 các chồi ít hơn và thường có kích thước bé. Đối với môi trường MT9 có nồng độ BAP là 1,5 mg/l thì tỷ lệ tạo chồi đạt 3,29 chồi. Ngoài ra sau 2 tháng nuôi cấy có số chồi nhiều các chồi phát triển tốt và khỏe, màu sắc lá xanh đậm. Vì vậy, trong thí nghiệm này chúng tôi lựa chọn môi trường thích hợp tạo đa chồi cây Mắt trâu là MT4 (1,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l IBA). Hình 5: Ảnh hưởng của BAP và IBA đến khả năng tạo chồi cây Mắt trâu 4.2.3. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và kinetin đến khả năng tạo đa chồi Thân cây Mắt trâu được cắt thành các đoạn nhỏ có kích thước từ 2 - 3cm, có từ 1 đến 3 chồi nách được cấy vào môi trường MS có bổ sung BAP và kinetin ở các nồng độ khác nhau. Trong thí nghiệm này chúng tôi chọn nồng độ BAP là 0,5 mg/l còn nồng độ kinetin thay đổi theo hướng tăng dần từ 0,5 mg/l đến 3,0 mg/l trên các công thức môi trường nuôi cấy. Sau 2 tháng nuôi cấy chúng tôi tiến hành quan sát, thu thập và xử lí số liệu kết quả thu được thể hiện qua bảng 3, hình 6, hình 7. Bảng 3: Ảnh hưởng của nồng độ BAP và kinetin đến khả năng tạo đa chồi CTMT BAP (mg/l) kinetin (mg/l) Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Số chồi TB/ mẫu ( ± m) ĐC 0 0 100 1,36 ± 0,15 MK1 0,5 0,5 100 2,45 ± 0,16 MK2 1,0 0,5 100 2,20 ± 0,13 MK3 1,5 0,5 100 3,22 ± 0,22 MK4 2,0 0,5 100 2,50 ± 0,17 MK5 2,5 0,5 100 2,64± 0,15 MK6 3,0 0,5 100 2,64 ± 0,20 Kết quả thu được ở bảng 2 cho thấy: Các môi trường đều cho tỷ lệ mẫu tạo chồi là 100%. Ở các môi trường MK5; MK6 thì tỷ lệ tạo chồi trung bình như nhau là 2,64 chồi. Còn ở môi trường MK2; MK1; MK4 hiệu quả tạo chồi lần lượt là 2,20; 2,45; 2,50. Đối với môi trường MK3 có nồng độ BAP là 1,5 mg/l tỷ lệ tạo chồi tương đối cao (3,22 chồi). Trên môi trường quan sát thấy chồi kích thước to, khỏe và màu sắc lá xanh đậm, tỷ lệ tạo chồi cao. Từ kết quả thực nghiệm thu được chúng tôi chọn môi trường thích hợp tạo đa chồi cây Mắt trâu trong thí nghiệm này là MK3 (1,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l kinetin). Hình 4: Tạo đa chồi cây Mắt trâu trên môi trường MK3 Hình 7: Ảnh hưởng của BAP và Kinetin đến khả năng tạo chồi cây Mắt trâu Qua ba thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo đa chồi cây Mắt trâu, chúng tôi tổng hợp lại ở bảng sau đây. Bảng 4: Kết quả tổng hợp thí nghiệm tạo đa chồi Mắt trâu CTMT Số chồi TB/ mẫu ( ± m) MT4 (2,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA) 3,17 ± 0,15 MT9 (1,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l IBA) 3,29 ± 0,13 MK3 (1,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l Kinetin) 3,22 ± 0,22 Từ kết quả ở bảng 4, chúng ta thấy ở công thức môi trường MT9 cho hệ số tạo chồi khá cao là 3,29 chồi các chồi phát triển tốt. Còn hai môi trường MT4, MK3 lần lượt cho tỷ lệ tạo chồi là 3,17; 3,22. Kết hợp với quan sát mẫu thực tế thu được về sự phát triển của chồi và màu sắc lá cho thấy công thức môi trường MT9 (1,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l IBA) là môi trường thích hợp nhất để tạo đa chồi cây Mắt trâu. 4.3. Tạo cây hoàn chỉnh Kích thích tạo rễ là khâu cuối cùng của giai đoạn nghiên cứu in vitro. Các chất kích thích NAA, IBA đóng vai trò quan trọng trong sự phân chia tế bào và hình thành rễ. 4.3.1. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng hình thành rễ cây Mắt trâu Sử dụng các chồi nhận được từ môi trường nhân đa chồi có chiều dài từ 2 - 3 cm cấy vào môi trường có chất kích thích ra rễ để xác định môi trường thích hợp để tạo rễ cây Mắt trâu. Trong thí nghiệm chúng tôi sử dụng IBA ở các nồng độ khác nhau lần lượt là: 0,3; 0,6; 0,9; 1,2; 1,5 (mg/l) để nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ cây Mắt trâu. Kết quả thu được ở bảng 5, hình 8. Bảng 5: Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ CTMT IBA (mg/l) Số chồi nuôi cấy Số chồi ra rễ Tỷ lệ ra rễ (%) ĐC 0 35 0 0 MTI1 0,3 35 10 28,57 MTI2 0,6 35 18 51,43 MTI3 0,9 35 25 71,43 MTI4 1,2 35 30 85,71 MTI5 1,5 35 24 68,57 Kết quả ở bảng 5 cho thấy, chồi Mắt trâu có thể tạo rễ trên tất cả môi trường có chất kích thích, trừ môi trường đối chứng MS không có chất kích thích sinh trưởng nên chồi nuôi cấy không xuất hiện rễ. Tuy nhiên, trên môi trường có chất kích thích sinh trưởng là IBA thì tỷ lệ ra rễ ở môi trường MTI1, MTI2 tương ứng với các nồng độ IBA (0,3; 0,6) mg/l là tương đối thấp chỉ đạt 28,57%; 51,43%, rễ nhỏ, ngắn cây phát triển chậm và yếu. Trên môi trường MTI3, MTI5 tỷ lệ ra rễ đạt 71,43%; 68,57% khi quan sát ở phía gốc của cây con có xuất hiện những khối mô sẹo xốp, thân có nhiều chồi nách nhỏ, điều này ảnh hưởng không tốt khi ra cây. Riêng ở môi trường MTI5 (1,5 mg/l IBA) nồng độ cao hơn môi trường MTI3 (0,9 mg/l IBA) nhưng lại cho tỷ lệ ra rễ thấp hơn vì khi nồng độ chất kích thích sinh trưởng cao nó sẽ gây hiệu quả ngược lại là ức chế quá trình phát sinh rễ. Trên môi trường MTI4 có tỷ lệ ra rễ khá cao chiếm tới 85,71%, rễ to nhiều và dài. Cây phát triển tốt màu sắc lá xanh đậm và dày, ở gốc chỉ có một khối mô sẹo nhỏ xuất hiện. Vậy trong thí nghiệm này chúng tôi lựa chọn môi trường MTI4 (1,2 mg/l IBA) là môi trường thích hợp để tạo rễ. Hình 8: Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ cây Mắt trâu 4.3.2. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ Chúng tôi thử nghiệm sự ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến sự hình thành rễ cây Mắt trâu với các nồng độ khác nhau là: 0,3; 0,6; 0,9; 1,2; 1,5 (mg/l) NAA. Kết quả được thể hiện ở bảng 6, hình 9, hình 10. Bảng 6: Ảnh hưởng của NAA lên sự hình thành rễ CTMT NAA (mg/l) Số chồi nuôi cấy Số chồi ra rễ Tỷ lệ ra rễ (%) ĐC 0 35 0 0 MTN1 0,3 35 24 68,57 MTN2 0,6 35 29 82,86 MTN3 0,9 35 32 91,43 MTN4 1,2 35 26 74,29 MTN5 1,5 35 23 65,71 Qua quan sát sự phát triển hình thành của rễ, thân và màu sắc lá cũng như sự hình thành các chồi mới chúng tôi thấy: Trên môi trường MTN3 cây phát triển tốt nhất tỷ lệ tạo rễ cao đến 91,43%, rễ to và dài nhiều, lá xanh cây con to khỏe chỉ có một khối mô sẹo nhỏ ở gốc, không có các chồi con ở gốc. Còn trên môi trường MTN1, MTN2, MTN4, MTN5 tỷ lệ ra rễ tương đối cao nhưng ở gốc lại có nhiều mô sẹo xốp nên không tốt cho việc ra cây. Riêng hai môi trường MTN4 (1,2 mg/l), MTN5 (1,5 mg/l) NAA do nồng độ NAA quá cao sẽ ức chế sự hình thành rễ vì vậy mà tỷ lệ ra rễ càng giảm dần khi nồng độ NAA càng cao cụ thể là MTN4 (74,29%), MTN5 (65,71%). Vì vậy, chúng tôi lựa chọn môi trường MTN3 (0,9 mg/l NAA) là môi trường tạo rễ thích hợp nhất. Hình 9: Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ cây Mắt trâu Qua hai kết quả ở bảng 5 và bảng 6 và thực tế quá trình làm thí nghiệm chúng tôi rút ra kết luận như sau: Môi trường MTN3 là môi trường thích hợp nhất để tạo rễ cây Mắt trâu. Hình 10: Cây Mắt trâu in vitro trên môi trường tạo rễ sau 30 ngày 4.4. Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây trong bầu Cây con có đầy đủ thân lá và rễ được đưa ra trồng trong bầu, giai đoạn này cần phải có chế độ chăm sóc đặc biệt phải đảm bảo được độ ẩm và ánh sáng vừa phải để cây con thích nghi dần với điều kiện tự nhiên. Kết quả thống kê sau một tháng trồng cây trong bầu được trình bày ở bảng 7, hình 11. Bảng 7: Ảnh hưởng của giá thể đến cây trồng trong bầu TT Công thức Tỷ lệ Số cây trồng Số cây sống sót Cây sống (%) 1 Đất trồng cây 1 34 14 41,18 2 Đất trồng cây: Trấu hun 1 : 1 34 26 76,47 3 Trấu hun 1 34 32 94,12 Từ kết quả ở bảng 7 ta rút ra nhận xét: Trên giá thể là đất trồng cây tỷ lệ cây sống đạt rất thấp là 41,18% do cây con đang còn non yếu mà lại được trồng trong giá thể không tơi xốp nên cây không thích nghi được với loại giá thể này nên chỉ có 14 cây sống trên tổng số 34 cây được trồng. Đối với giá thể là đất trồng: Trấu hun tỷ lệ cây sống đạt 76,47% là tương đối cao tuy vậy đây cũng không phải là giá thể thích hợp để trồng cây vì một số cây con không thích nghi được đã bị chết. Còn trên giá thể trấu hun tỷ lệ cây con sống cao đạt 94,12% giá thể thoáng khí và tơi xốp là môi trường lý tưởng cho cây con phát triển tốt trong giai đoạn đầu, tán lá rộng. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn giá thể thích hợp nhất để trồng cây Mắt trâu ngoài tự nhiên là giá thể trấu hun. A B C D Hình 11: Cây Mắt trâu trồng trên các loại giá thể A. Giá thể đất trồng; B. Giá thể đất trồng: trấu hun; C. Giá thể trấu hun; D. Cây Mắt trâu trồng ngoài vườn ươm sau 2 tháng PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1. Bước đầu đã nhân thành công cây Mắt trâu bằng phương pháp nuôi cấy in vitro. 2. Môi trường thích hợp để tạo đa chồi cây Mắt trâu là môi trường MT9 (MS + 30 g/l đường saccharose + 9 g/l agar + 1,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l IBA) với hệ số nhân chồi là 3,29 lần. 3. Môi trường tốt nhất để tạo cây hoàn chỉnh là môi trường MTN4 (MS + 30 g/l đường saccharose + 9 g/l agar + 0,9 mg/l NAA) với tỷ lệ tạo rễ là 91,43% và cây sinh trưởng, phát triển tốt nhất. 4. Giá thể thích hợp để trồng cây sau in vitro cho cây Mắt trâu là trấu hun với tỷ lệ cây con sống là 94,12%. Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu sự sinh và trưởng phát triển của cây Mắt trâu nuôi cấy in vitro ở ngoài tự nhiên. PHỤ LỤC Các thành phần cơ bản của môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) Thành phần khoáng đa lượng Nồng độ (mg/l) NH4NO3 1650 KNO3 1900 CaCl2.2H2O 440 MgSO4.7H2O 370 KH2PO4 170 Thành phần khoáng vi lượng Nồng độ (mg/l) MnSO4.H2O 23,3 ZnSO4.7H2O 8,6 H3BO3 6,2 KI 0,83 Na2MoO4.2H2O 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 Na2EDTA 37,3 FeSO4.7H2O 27,8 Vitamin Nồng độ (mg/l) Thiamine HCl 0,1 Nicotinic Acid 0,5 Pyridoxine HCl 0,5 Glyxine 2,0 Một số hình ảnh minh họa khi làm thí nghiệm Hình 12: Quan sát mẫu nuôi cấy trong phòng cây của phòng công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học Hình 13: Thao tác cấy chuyển mẫu nuôi cấy trong box vô trùng TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng, NXB Nông nghiệp Hà Nội. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, TP HCM. Nguyễn Thành Danh, Lê Xuân Đắc, Lê Thị Xuân (2005), Kết quả bước đầu nhân giống in vitro cây Vù hương (Cinamomum balansae Lecomte.) bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi hạt xanh góp phần bảo tồn đa dạng sinh học. Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa học Sự sống, báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc 2005, NXB Khoa học và Kỹ thuật: 450-453. Lê Xuân Đắc, Hà Hồng Hải, Đào Thị Thu Hà, Nguyễn Thanh Danh, Lê Thị Xuân, Nông Văn Hải, Lê Trần Bình (2004). Nhân nhanh và bảo tồn cây Màng tang (Litsea verticillata) được tìm thấy ở Vườn Quốc gia Cúc Phương bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật, Tạp chí Công nghệ sinh học, 2(4): 479-486. Lê Văn Hoàng (2007), Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật, NXB Khoa học và Kỹ thuật. Phạm Hoàng Hộ (1993), Cây cỏ Việt Nam, tập 2(2), NXB Montréal. 528. Nguyễn Như Khanh (2006), Sinh học phát triển thực vật, NXB Giáo dục Hà Nội. Phùng Ngọc Lan, Nguyễn Nghĩa Thìn, Nguyễn Bá Thụ (1996), Tính đa dạng thực vật ở Cúc Phương, NXB Nông Nghiệp Hà Nội. Đỗ Tất Lợi (2005), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học. 526-527. Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thuỷ Tiên (2006), Công nghệ tế bào, NXB Đại Học Quốc gia Hồ Chí Minh. Trần Kim Liên (2003), Danh lục thực vật Việt Nam 2, NXB Nông Nghiệp. 969. Nguyễn Hoàng Nghĩa (1997), Bảo tồn nguồn gen cây trồng, NXB Nông Nghiệp Hà Nội. Nguyễn Hoàng Nghĩa (2006), Một số loài cây bị đe dọa ở Việt Nam, NXB Nông Nghiệp Hà Nội. Hoàng Thị Sản, Hoàng Thị Bé (2006), Phân loại học thực vật, NXB Đại học Sư Phạm. Lưu Trường Sinh, Hoàng Văn Lương (2005), nghiên cứu hoàn thiện qui trình nhân giống cây Trinh nữ hoàng cung bằng phương pháp in vitro. Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa học Sự sống, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc 2005, NXB Khoa học và Kỹ thuật. Nguyễn Đức Thành ( 2000), Nuôi cây mô tế bào thực vật nghiên cứu và ứng dụng, NXB Nông nghiệp Hà Nội. Nguyễn Văn Uyển (1996), Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật, NXB Nông Nghiệp TPHCM. Đỗ Năng Vịnh (2005), Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2005), Công nghệ sinh học (tập 2), NXB Giáo dục Hà Nội. Lê Thị Xuân, Schemluck M, Mai Văn Trì (1996) Cây Thông đỏ Lâm Đồng (Taxus walli chiana) một nguồn nguyên liệu quí để sản xuất các thuốc chữa ung thư nhóm Taxoid, Tạp chí hóa học, 34(1): 80-81. Tài liệu tiếng Anh Balaraju K, Agastian P, Preetamraj JP, Arokiyaraj S, Ignacimuthu S (2008), Micropropagation of Vitex agnus catus (Verbenaceae) A valuable medicinal plant, In vitro Cellular and Developmental Biology Plant, 44(5): 436-441. Bangaru NT, Nageswara RS, Sarada MN, Jagan MYSYV, Sudhakar P (2010), Conservation of an endangered medicinal plant Centella asiatica through Plant Tissue culture, Drug Invention Today, 2(1): 17-21. Bedir E, Lata H, Schaneberg B, Khan IA, Morase RM (2003), Micropropagation of Hydrastis canadensis: Goldenseal a North American endangered species, Planta Med: 86-88. Chan LK, Lim SY, Pan LP (2009), Micropropagation of Gynura procumbens (Lour.) Merran important medicinal plant, Journal of Medicinal Plants, 3(3): 105-111. Dibax R, Eisfeld CL, Cuquel FL, Koehler H, Quoirin M (2005), Plant regeneration from cotyledonary explants of Eucalyptus camaldulensis, Science Agriculture, 62: 406-412. Geetha SP, Raghu AV, Martin G, George S, Balachandran I (2009), In vitro Propagation of Two Tuberous Medicinal Plants: Holostemma adakodien and Ipomoea mauritianaProtocols for In vitro Cultures and Secondary Metabolite Analysis of Aromatic and Medicinal Plants, Springer Protocols, (547)7: 81-92. George EF (1993), plant propagation by tissue culture (2), Exegetics Ltd, Edin. Guillaumin A (1912), Rutacéae, Flore Gesnesneerale de L Indo-chine. Hoang VD, Tan GT, Zhang HJ, Tamex PA, Hung NV, Cuong NM, Soejarto DD, Fong HH, Pezzuto JM (2002), Natural anti - HIV agents part I : (+)- demethoxyepiexcelsin and verticillatol from Litsea verticillata, Phytochemistry, 59(3): 325-329. Hussain MT, Chandrasekhar T, Rama GG (2008), In vitro propagation of Crotalaria verrucosa L. animportant ethnobotanical plant, Journal of Medicinal Plants, 2(9): 242-245. Kalidass C, Mohan VR (2009), In vitro Rapid clonal propagation of Phyllanthus urinaria Linn. (Euphorbiaceae), A Medicinal Plant, 1(4): 56-59. Ma C, Case RJ, Wang Y, Zhang HJ, Tan Gt, Nguyen Van Hung, Nguyen Manh Cuong, Eranzblau SG, Soejato DD, Fong HH, Panli GE (2005), Anti tuberculosis consituents from the Stembark of Micromelum hissutum, Planta Med, 71(3): 261-267. Mahender A, Srinivasa RK, Venugopal RK (2009), Efficient in vitro Regeneration and Micropropagation of Medicinal Plant Momordica tuberosa Roxb., Journal of Herbs, Spices & Medicinal Plants, 2(15): 141-148. Nguyen Ngoc Chinh, Cao Thuy Chung, Vu Van Can, Nguyen Xuan Dung, Nguyen Kim Đao, Tran Hop, Tran Tuyet Oanh, Nguyen Boi Quynh, Nguyen Nghia Thin (1996), Viet Nam Forest trees, Agricultural Publishing house. Park SU, Kim YK, Lee SY (2009), Improved in vitro plant regeneration and micropropagation of Rehmannia glutinosa L., Journal of Medicinal Plants, 3(1): 031-034. Park AM, Amui SF, Bertoni BW, Moraes RM, Franca SC (2003), Micropropagation of Anemopaegma arvense: Conservation of an endangered medicinal plant, Planta Med, 69(6): 571-573. Samuel K, Debashish D, Madhumita B, Padmaja G, Siva RP, Murthy BRV, Rao PS (2009), In vitro germination and micropropagation of Givotia rottleriformis Griff., In vitro Cellular & Developmental Biology. Sang Un Park, Nam I Park, Yong Kyoung Kim, Seung Yeon Suh, Seok Hyun Eom, Sook Young Lee (2009), Application of plant biotechnology in the medicinal plant, Rehmannia glutinosa Liboschitz, Journal of Medicinal Plants, 3(13): 1258-1263. Soejarto DD, Nguyen Tien Hiep, Phan Ke Loc, Nguyen Manh Cuong, Le Kim Bien, Tran Đinh Đai, Regalado Jt, Kadushin MR, Nguyen Thi Thanh Huong, Truong Quang Bich (2004), Seed plants of Cuc Phuong National Park Viet Nam, Documented Checklist. Zhang HJ, Tan GT, Santarsiero BD, Mesecar AD, Hung NV, Cuong NM, Soejarto DD, Pezzuto JM, Fong HH (2003), New Sesquiterpenes from Litsea verticillata, J Nat Prod, 66(5): 609-615. Tài liệu từ Internet MỤC LỤC