Đề tài Ứng dụng kỹ thuật PCR - RFLP xác định các kiểu gen thụ thể prolactin trên giống heo Yorkshire

Khi DNA đi qua các lỗ nhỏ này sự cọ sát giữa các hạt agarose và phân tử DNA tạo lực trở kháng làm ngăn cản sự dịch chuyển này. DNA có kích thƣớc càng lớn thì lực trở kháng càng mạnh do đó sự di chuyển càng chậm và ngƣợc lại. Các DNA cùng kích thƣớc sẽ di chuyển về cùng vị trí 14 và tạo thành các băng, các băng này có thể quan sát đƣợc sau khi nhuộm chúng trong dung dịch ethium bromide và đặt dƣới tia tử ngoại. 2.4 Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) 2.4.1 Giới thiệu về phản ứng PCR Là phản ứng nhân nhanh số lƣợng mẫu DNA nhờ thực hiện cơ chế tự nhân đôi DNA invitro. Quá trình này đƣợc tiến hành nhờ enzyme DNA polymerase. Nguyên tắc phản ứng PCR Phản ứng PCR gồm các bƣớc chủ yếu sau: Bƣớc 1: Biến tính mẫu DNA thành chuỗi đơn ở nhiệt độ 94 - 95oC Bƣớc 2: Giai đoạn bắt cặp giữa primer và mạch khuôn, nhiệt độ bắt cặp tùy thuộc vào trình tự của primer, thông thƣờng khoảng 40 – 50oC. Bƣớc 3: Giai đoạn kéo dài tổng hợp bản sao DNA đƣợc tiến hành ở 72oC Mỗi chu kỳ gồm 3 bƣớc trên đƣợc lập lại nhiều lần. Hình 2.5: Các chu kỳ của phản ứng PCR 2.4.2 Các yếu tố tham gia vào phản ứng PCR 2.4.2.1 Taq polymerase Taq polymerase là enzyme chính tham gia vào quá trình tổng hợp các mạch DNA. Enzyme này còn có khả năng phân hủy primer bắt cặp vào mạch DNA tạo điều kiện cho việc bổ sung các nucleotide vào mạch DNA mới. Taq polymerase đƣợc phân lập từ vi khuẩn suối nƣớc nóng Thermus aquaticus. 2 4 6 8 1 0 Biến tính Ủ bắt cặp Kéo dài Lặp lại n lần 94–95o C 72 o C 45-56o C 15 Enzyme này có tính chịu nhiệt rất cao, nó chịu đƣợc nhiệt độ biến tính DNA khoảng 94o C. Nhiệt độ tối ƣu cho sự hoạt động của Taq polymerase khoảng 70 – 72o C. Trong phản ứng PCR nếu nồng độ enzyme này quá thấp không đủ lƣợng enzyme xúc tác cho phản ứng sẽ tạo ra sản phẩm PCR không mong muốn. 2.4.2.2 Các nucleotid dNTP – deoxyribonucleotide-5-triphosphate. Đây là hổn hợp 4 loại nucleotide dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp mạch DNA mới. Nồng độ nucleotide trong phản ứng PCR mất cân bằng sẽ làm cho phát sinh các lỗi sao chép của Taq polymerase. 2.4.2.3 Primer (mồi) Primer (mồi) là những đoạn oligoribonucleotide mạch đơn có trình tự bổ sung với trình tự của hai đầu mạch khuôn để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA. Chiều dài của mồi thƣờng từ 10 – 35 nucleotide. Mồi khởi đầu cho quá trình tổng hợp mạch mới. Khi mồi bắt cặp vào mạch khuôn thì Taq polymeresa bắt đầu kéo dài chuỗi DNA. 2.4.2.4 Dung dịch đệm Thành phần quan trọng nhất trong dung dịch đệm là ion Mg 2+. Nó rất cần thiết cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme Taq polymerase, làm tăng nhiệt độ nóng chảy của các DNA mạch kép. Nồng độ MgCl2 tối ƣu là 1.5 mM. Môi trƣờng đệm KCl đã và đang áp dụng rộng rãi, cũng có thể là chất đệm hữu dụng cho phản ứng PCR. Tuy nhiên trong nhiều trƣờng hợp môi trƣờng này không hiệu quả nên ngƣời ta vẫn lựa chọn sử dụng Mg 2+. Những đoạn DNA giàu G, C ngƣời ta thƣờng dùng dung dịch đệm amonium sulphate làm giảm những sản phẩm đƣợc phát triển một cách không hoàn toàn trong PCR với Taq . Phƣơng pháp này dùng phát hiện những đoạn gen có kích thƣớc nhỏ chạy trên gel acrylamide. 16 2.4.2.5 DNA khuôn Phản ứng PCR tối ƣu trên DNA thật tinh sạch. Tuy nhiên có nhiều nghiên cứu cho thấy PCR vẫn tốt trên DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào, các vết máu, mẫu khảo cổ, vi khuẩn bị hấp khử trùng…Lƣợng DNA khuôn mẫu sử dụng có khuynh hƣớng giảm từ 1 µg xuống khoảng 20 ng nhằm giảm việc tạo các sản phẩm phụ không mong muốn. 2.4.2.6 Số chu kỳ phản ứng Số lƣợng chu kỳ phản ứng PCR trong thực tế không vƣợt qua 40 chu kỳ. Số chu kỳ cho một phản ứng PCR tùy thuộc vào số lƣợng DNA mẫu ban đầu. Nếu ít chu kỳ thì sản phẩm PCR thu đƣợc ít. Nếu kéo dài tiến trình PCR thì hiệu quả khuyếch đại giảm hẳn do: sự cạn kiệt các thành phần phản ứng, sự mỏi mệt của các enzyme dùng trong phản ứng. 2.4.2.7 Nhiệt độ và pH Những enzyme đƣợc sử dụng rất mẫn cảm với nhiệt độ. Sự thay đổi nhiệt độ có ảnh hƣởng mạnh đến năng suất và độ chuyên biệt của sản phẩm PCR. Để biến tính thì khoảng nhiệt độ từ 94 – 95o C là thích hợp nhất, nếu nhiệt độ cao hơn sẽ làm mất hoạt lực của Taq polymerase. Để kéo dài chuỗi ngƣời ta sử dụng 72o C, đây là nhiệt độ tối ƣu cho Taq polymerase hoạt động. Khoảng nhiệt độ dùng để bắt cặp là khó xác định nhất, khoảng nhiệt độ này đƣợc xác định tùy từng loại primer. Primer có trình tự càng nhiều G, C thì nhiệt độ bắt cặp càng cao. Thông thƣờng nhiệt độ bắt cặp từ 50 – 56o C. Hầu hết các enzyme, mẫu DNA đƣợc đệm trong môi trƣờng tối ƣu có pH = 8. Ở pH này DNA rất ổn định. Trong môi trƣờng acid các bazơ purin rất dể bị tách khỏi sợi DNA, cầu nối phosphodiester bị phá vỡ. Tuy nhiên theo chu kỳ nhiệt độ của phản ứng PCR thì pH có thể thay đổi từ 6,8 – 7,8. 2.4.2.8 Các vấn đề thƣờng gặp trong PCR và phƣơng pháp khắc phục Trong quá trình thực hiện phản ứng PCR chúng ta thƣờng gặp những hiện tƣợng không mong muốn nhƣ: không có hiện diện sản phẩm PCR, sản phẩm PCR ít, xuất hiện các băng phụ. Dƣới đây là bảng trình bày các hiện tƣợng không mong muốn xảy ra khi thực hiện phản ứng PCR và cách khắc phục nó. 17 Bảng 2.3: Các vấn đề thƣờng gặp trong PCR và phƣơng pháp khắc phục 1. Có nhiều sản phẩm chuỗi ngắn không đặc trƣng Gia tăng nhiệt độ ủ bắt cặp Gia tăng thời gian ủ bắt cặp Gia tăng thời gian kéo dài chuỗi Gia tăng nhiệt độ kéo dài chuỗi lên đến 74 – 78o C Giảm nồng độ KCl buffer đến 0,7 – 0,8 nM, giữ nguyên nồng độ MgCl2 ở mức 1,5 – 2 nM. Gia tăng nồng độ MgCl2 lên 3 – 4,5 mM, nhƣng giữ nguyên nồng độ dNTP Giảm lƣợng mồi Giảm lƣợng DNA khuôn Giảm lƣợng tap polymerase 2. Có nhiều sản phẩm chuỗi dài không đặc trƣng Giảm thời gian ủ bắt cặp Gia tăng nhiệt độ ủ bắt cặp Giảm thời gian kéo dài Giảm nhiệt độ kéo dài xuống còn 62 – 68o C Gia tăng nồng độ KCl buffer lên 1,2 – 2 X, vẫn giữ nồng độ MgCl2 ở mức 1,5 – 2 mM Gia tăng nồng độ MgCl2 lên 3 – 4,5 nM, nhƣng vẫn giữ nguyên nồng độ dNTP Giảm lƣợng mồi Giảm lƣợng DNA khuôn Giảm lƣợng Taq polymerase 18 3. Không có sản phẩm nào cả Đảm bảo rằng các thành phần PCR đã cho vào phản ứng Đổi dung dịch dNTP do dNTP rất nhạy cảm với việc cấp rã đông. Gia tăng hàm lƣợng mồi Gia tăng hàm lƣợng DNA khuôn mẫu Giảm nhiệt độ bắt cặp xuống 6 – 10o C 4. Sản phẩm PCR ít Giảm nhiệt độ ủ bắt cặp đến mức có thể Gia tăng lƣợng mồi Gia tăng lƣợng DNA khuôn Gia tăng lƣợng Taq polymerase 2.4.2.9 Ứng dụng của PCR PCR có nhiều ứng dụng trong ngành sinh học. PCR với cặp primer đƣợc thiết kế riêng sẽ phân lập đƣợc đoạn DNA mong muốn. Từ đây nó đƣợc ứng dụng trong các lĩnh vực: Y khoa: dùng chẩn đoán bệnh do các tác nhân là vi khuẩn hoặc virus. Nông nghiệp: dùng trong chọn giống và xác định các yếu tố gây bệnh trên cây trồng. Dùng chuẩn đoán bệnh trong công tác chăn nuôi, chọn giống. Dùng phát hiện ra các gen dự tuyển về năng suất sinh sản trong chăn nuôi heo nhƣ việc xác định gen thụ thể estrogen, gen halothan, gen thụ thể prolactin... Thực phẩm: Xác định các tác nhân gây bệnh do vi khuẩn vius có trong mẫu thực phẩm. Dùng chứng nhận sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên hay là sản phẩm chuyển gen… 2.5 Giới thiệu về kỹ thuật RFLP và kỹ thuật PCR – RFLP 2.5.1 Kỹ thuật RFLP ( restriction fragment length polymorphism) Đây là phƣơng pháp so sánh DNA của các cá thể khác nhau sau khi cắt mẫu bằng một enzyme giới hạn (restriction endonuclease) nhằm tìm hiểu xem có hay không đột 19 biến điểm (làm mất hay xuất hiện một vị trí giới hạn mới) hoặc có hay không sự thay đổi một trình tự DNA. Trƣờng hợp trình tự DNA của hai cá thể cùng loài hoàn toàn giống nhau về số lƣợng và kích thƣớc thì sẽ có sự giống nhau về các băng DNA. Ngƣợc lại, nếu có xuất hiện đột biến điểm hoặc thay đổi một trình tự đoạn DNA trên sợi DNA thì sẽ có sự khác nhau về các băng DNA. Các bƣớc để tiến hành kỹ thuật RFLP: Tiến hành phân lập DNA của sinh vật muốn kiểm tra sự đa hình của DNA Xác định enzyme cắt phù hợp nhất với genome của sinh vật kiểm tra Tiến hành phân cắt mẫu DNA thu đƣợc với enzyme cắt Chạy điện di sản phẩm cắt trên gel agarose hoặc polyarylamid Tiến hành lai Southern blot với mẫu dò thích hợp Xác định kích thƣớc của các đoạn đa hình trên phim sau khi thực hiện Southern blot và đƣa ra kết luận Quá trình phân tích RFLP trên nhiễm sắc thể gặp rất nhiều khó khăn. Việc xử lý enzyme giới hạn của DNA này sẽ tạo ra hàng triệu mảnh DNA có kích thƣớc rất khó phân biệt. Nếu chạy điện di trên gel agarose và nhuộm bằng ethium bromide thì không dễ gì phát hiện ra đƣợc sự khác biệt giữa chúng. Kết quả ta nhận đƣợc hình ảnh là một dải liên tục gồm nhiều vệt đậm. Do đó việc thiết kế probe (mẫu dò) để xác định sự đa hình trong kỹ thuật Southern blot là vô cùng quan trọng. 2.5.2 Kỹ thuật PCR – RFLP (polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism) Nhằm khắc phục hiện tƣợng tạo ra quá nhiều băng DNA khi phân cắt genome bằng một enzyme giới hạn và phải thiết kế probe thích hợp trong việc phân tích sự đa hình DNA của kỹ thuật RFLP ngƣời ta đƣa ra kỹ thuật PCR – RFLP. PCR – RFLP là kỹ thuật dựa trên cơ sở khuyếch đại có chọn lọc một đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR trƣớc. Sau đó tiến hành phân cắt đoạn DNA này bằng một enzyme thích hợp. Sự khác nhau của các băng DNA sau khi chạy điện di và nhuộm ethium bromide cho ta biết đƣợc sự đa hình của đoạn DNA. Nhƣ vậy quá trình thực hiện kỹ thuật PCR – RFLP gồm các giai đoạn sau: 20 Tiến hành phản ứng PCR với cặp primer thích hợp để phân lập đoạn DNA cần phân tích sự đa hình. Tiến hành phân cắt đoạn DNA này với một enzyme cắt thích hợp. Chạy điện di xác định sự khác nhau của các băng DNA và đƣa ra kết luận. 2.6 Các enzyme giới hạn Các enzyme giới hạn đƣợc khám phá cuối năm 1960, có khả năng cắt DNA ở những vị trí rất là chính xác, nó đóng vai trò rất quan trọng trong phân tích gen. Ngƣời ta phân ra làm ba loại enzyme : Loại 1: Khi enzyme nhận biết đƣợc trình tự , nó sẽ di chuyển một đoạn khoảng 1000 – 5000 nucleotide và giải phóng khoảng vài chục nucleotide. Loại 2: Enzyme nhận biết trình tự ngay tại vị trí đó. Loại 3: Enzyme nhận biết trình tự cắt DNA ở vị trí cách đó khoảng 20 nucleotide. Loại 2 là nhóm duy nhất đƣợc sử dụng trong công nghệ sinh học phân tử. Mỗi enzyme nhận biết một trình tự cắt từ 4 – 6 nucleotide. Có hai kiểu cắt chính của enzyme là cắt theo đầu dính và cắt theo đầu bằng: Kiểu cắt đầu bằng: Kiểu cắt đầu dính: …TGG CCA… …ACC GGT… …C GGCCG… …GCCGG C… Enzyme Eco52I …AG CT… …TC GA… Enzyme AluI Enzyme BalI 21 PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP KHẢO SÁT 3.1 Thời gian, địa điểm 3.1.1 Thời gian Khóa luận đƣợc tiến hành từ ngày 01 tháng 03 năm 2005 đến ngày 15 tháng 08 năm 2005. 3.1.2 Địa điểm Lấy mẫu máu, da tai tại trại giống Đông Á, huyện Dĩ An tỉnh Bình Dƣơng. Tiến hành xét nghiệm mẫu để phát hiện gen thụ thể prolactin tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh trƣờng đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. 3.2 Đối tƣợng khảo sát Gen thụ thể prolactin trên giống heo Yorkshire ở trại giống. 3.3 Nội dung thực hiện Chọn quy trình ly trích DNA thích hợp từ mẫu máu, da tai. Thực hiện phản ứng PCR trên các mẫu đƣợc lấy từ trại giống. Phân tích kiểu gen của các heo giống Xác định tần số xuất hiện của kiểu gen thụ thể prolactin 3.4 Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1 Vật liệu, dụng cụ, máy móc và thiết bị làm thí nghiệm Vật liệu Vật liệu dùng trong thí nghiệm là mẫu máu và mẫu da tai đƣợc lấy từ các heo nái tại trại giống Đông Á. Dụng cụ Các dụng cụ để tiến hành thí nghiệm bao gồm: ống nghiệm, eppendorf các loại, pipet, đầu tip, lọ thủy tinh đƣng hóa chất, đầu lọc hóa chất, thùng đựng nƣớc đá, bình tam giác. 22 Các thiết bị, máy móc  Tủ cấy vô trùng  Bồn ổn nhiệt  Máy li tâm  Tủ định ôn  Tủ lạnh  Máy đo OD  Tủ sấy dụng cụ  Thiết bị điện di  Máy chụp gel  Lò vi sóng 3.4.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.2.1 Thu thập mẫu Các mẫu đƣợc lấy ngẫu nhiên trên các heo nái giống Yorkshire. Các loại mẫu lấy bao gồm: Lấy máu từ tỉnh mạch tai Lấy mẫu da tai Mỗi con heo thì lấy đồng thời mẫu máu và mẫu da tai. Cách thu thập và bảo quản mẫu Mẫu máu: lấy khoảng 1-1.5 ml máu ở mỗi cá thể heo. Máu đƣợc cho vô ống nghiệm vô trùng chứa sẵn 4mg Na2ETDA. Mẫu da: lấy khoảng 20 g mẫu da tai cho vào túi vô trùng. Tất cả các loại mẫu lấy đƣợc mang về Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh bảo quản. Mẫu da đƣợc bảo quản ở - 70o C, mẫu máu đƣợc bảo quản ở - 20o C. khi nào dùng thì tiến hành rã đông và phân tích. 23 3.4.2.2 Ly trích DNA Ly trích DNA từ mẫu máu (dựa theo qui trình ly trích DNA từ máu của Roe và ctv, 1998) 1. Rã đông hoàn toàn mẫu máu, hút 500 l máu vào eppendorf 1.5 ml sau đó thêm 400 l TE 1X, trộn đều, ly tâm 12000 vòng / phút trong 1 phút ở 10o C, lấy cặn. 2. Cho vào 500 l TE 1X, vortex cho tan cặn, ly tâm 12000 vòng/ phút trong 1 phút, ở 10 oC, lấy cặn. Lặp lại bƣớc này cho đến khi phần cặn trở nên trắng. 3. Cho vào 200 l natri acetate 0.2 M, vortex trong 10 giây; sau đó thêm 15 µl SDS 10 %; 3 µl proteinase K (20 mg / ml), ủ hỗn hợp gần 1 giờ trong tủ ấm ở 55o C. 4. Cho vào 60 l hổn hợp phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25:24:1), vortex nhẹ, ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10o C. 5. Lấy phần nƣớc nổi bên trên chuyển vào tube 1.5 ml mới, sau đó cho vào 500 l ethanol tuyệt đối lạnh, trộn đều, ủ - 20o C trong 2 giờ. 6. Ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10oC, bỏ phần nổi lấy phần cặn, làm ráo. 7. Cho vào 100 l TE 1X, vortex, ủ 55o C trong 15 phút. 8. Cho vào 10 l natri acetate 2 M, trộn đều, tiếp tục cho vào 250 l ethanol tuyệt đối lạnh, trộn đều, ủ ở - 20o C trong 15 phút. Ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10 oC, bỏ phần nổi, lấy phần cặn. 9. Rửa cặn bằng 500 l ethanol 70 %, ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10o C, lấy cặn. 10. Làm khô cặn trong tủ ấm ở 55o C. 11. Hòa tan cặn bằng 100 l TE 1X, ủ 55o C qua đêm, vortex cho tan cặn. Sản phẩm sau khi ly trích đƣợc trữ ở - 20o C hoặc sử dụng ngay. Ly trích DNA từ da (dựa theo quy trình của Saner và ctv, 2000 đƣợc Lê Thị Thu Phƣơng (2004) điều chỉnh) 1. Cho khoảng 5 mm3 da vào eppendorf 1.5 ml. Dùng chày nghiền nhuyễn mẫu. 24 2. Cho 60 l dung dịch đệm (50 mM Tris-HCl, 20mM NaCl, 1mM EDTA và 1% SDS, pH = 8) và 3 l proteinase K (20 mg / ml). Ủ hổn hợp ở 55oC trong 1 giờ. 3. Cho vào 375 l natri acetate 0,2 M, vortex trong 10 giây. 4. Cho vào 200 l hổn hợp phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25:24:1), vortex nhẹ, ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10o C. 5. Lấy phần nƣớc nổi bên trên chuyển vào tube 1,5 ml mới, sau đó cho thêm 1 ml ethanol tuyệt đối lạnh, trộn đều, ủ ở - 20oC trong 2 giờ. 6. Ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10o C, lấy cặn, làm ráo. 7. Cho vào 180 l TE 1X, vortex, ủ ở 55oC trong 15 phút. 8. Cho vào 20 l natri acetate 2 M, trộn đều, tiếp tục cho vào 500 l ethanol tuyệt đối lạnh, trộn đều , ủ ở - 20o C trong 15 phút. Ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10o C, bỏ phần nổi, lấy phần cặn. 9. Rửa cặn bằng 1ml ethanol 70 %, ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10o C, lấy cặn. 10. Làm khô cặn trong tủ ấm 55o C 11. Hòa tan cặn bằng 200 l TE 1X, ủ 55o C qua đêm, vortex cho tan cặn. Sản phẩm sau khi ly trích đƣợc trữ ở - 20o C hoặc sử dụng ngay. 3.4.2.3 Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế Tiến hành đo sản phẩm DNA ly trích bằng quang phổ kế ở bƣớc sóng 260 – 280 nm. Nồng độ DNA đƣợc tính bằng công thức: Nồng độ (ng / μl) = OD260 nm*62,9 - OD280 nm*36 DNA đƣợc xem là tinh sạch khi tỉ số mật độ quang ở bƣớc sóng 260 – 280 nm nằm trong khoảng 1,8 – 2. 3.4.2.4 Ứng dụng phƣơng pháp PCR – RFLP khảo sát sự đa hình của gen PRLR 3.4.2.4.1 Xây dựng qui trình khuyếch đại PCR và cắt enzyme giới hạn Xây dựng qui trình phản ứng PCR o Xác định nhiệt độ và thời gian phản ứng PCR 25 Phản ứng PCR đƣợc thực hiện bởi máy luân nhiệt (Thermal cycler version 2.11.32) trên mẫu máu và mẫu da sau khi ly trích với cặp primer: Forward primer: 5’-CCC AAA ACA GCA GGA GAA CG- 3’ Reverse primer: 5’-GGC AAG TGG TTG AAA ATG GA- 3’ Hai primer F và R có nhiệt độ bắt cặp khác nhau chênh lệch nhau khoảng 4 o C. Vincent (1998) đã đƣa ra khoảng nhiệt độ trung bình giữa hai nhiệt độ này để thực hiện phản ứng PCR. Với các điều kiện máy móc thiết bị ở phòng thí nghiệm của nƣớc ta khác với điều kiện tại nơi Vincent tiến hành nên chúng tôi tiến hành 2 qui trình phản ứng PCR theo hai nhiệt độ bắt cặp khác nhau (Bảng 3.1) Bảng 3.1: Nhiệt độ và thời gian của 2 qui trình phản ứng PCR Qui trình 1 Qui trình 2 Bƣớc Nhiệt độ (o C) Thời gian (giây) Nhiệt độ (o C) Thời gian (giây) 1 2 3 4 5 93 93 60 72 72 180 30 60 60 3 93 93 62 72 72 180 30 60 60 3 Từ bƣớc 2 đến bƣớc 4 lặp lại 35 lần  Ghi chú:  Qui trình 1 là qui trình do A.L. Vincent (1998) đề xuất trong việc phát hiện gen PRLR (qui trình 2 trang 26)  Qui trình 2 là qui trình thí nghiệm với các điều kiện máy móc thiết bị tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hoá Sinh trƣờng đại học Nông Lâm TP. HCM o Xác định nồng độ primer tham gia phản ứng PCR 26 Một trong những khái niệm quan trọng nhất của PCR là tỉ lệ tối hảo giữa primer và DNA mẫu. Nếu tỉ lệ này quá cao, hiện tƣợng primer – dimer sẽ xuất hiện, tƣơng tự nhƣ trƣờng hợp DNA mẫu quá ít. Do đó việc xác định tỉ lệ giữa nồng độ primer và DNA mẫu trong phản ứng PCR là vô cùng quan trọng. Để xác định nồng độ thích hợp của primer trong phản ứng PCR phát hiện gen PRLR chúng tôi tiến hành thực hiện ba qui trình phản ứng PCR theo nồng độ primer khác nhau ở (bảng 3.2) Bảng 3.2: Nồng độ cuối của 3 qui trình thực hiện phản ứng PCR theo qui trình nhiệt 2 Thành phần Nồng độ cuối Qui trình 1 Qui trình 2 Qui trình 3 PCR bufer 10X MgCl2 (25 mM) dNTPs ( 2,5 mM / µl) Mồi xuôi (10 pmol / µl) Mồi ngƣợc (10 pmol / µl) Taq polymerase (5UI / µl) DNA khuôn 1 X 2 mM 1 mM 5 pmol 5 pmol 0,6 UI 20 ng 1 X 1 mM 1 mM 10 pmol 10 pmol 0,6 UI 20 ng 1 X 1 mM 1 mM 15 pmol 15 pmol 0,6 UI 20 ng Thể tích ( l) 25 25 25 Ghi chú:  Qui trình 2 là qui trình do A.L. Vincent (1998) đề xuất trong công tác phân tích sự đa hình của gen PRLR  Qui trình 1, 3 là qui trình thí nghiệm xác định nồng độ primer thích hợp nhất Xác nồng độ các hoá chất cắt enzyme giới hạn AluI Thể tích của các chất tham gia trong việc xử lý enzyme giới hạn đƣợc trình bày nhƣ bảng 3.3 sau: 27 Bảng 3.3: Nồng độ và thể tích của các qui trình cắt enzyme AluI Thành phần Nồng độ 1 Nồng độ 2 Nồng độ 3 Thể tích (µl) Thể tích (µl) Thể tích (µl) Nƣớc cất RE 10X Buffer Acetylated BSA (10 µg / µl) DNA (*) Enzyme (10 UI / µl) 16,3 2 0,2 1 0.5 17,2 2 0,4 20 0,4 11,75 2,5 0,6 10 0,15 Tổng thể tích 20 40 25  Ghi chú:  (*) – Nồng độ DNA ở cả 3 qui trình khác nhau: ở qui trình 1 nồng độ DNA theo đề nghị của nhà sản xuất là 1 µg / µl; qui trình 2, 3 là sản phẩm PCR  Qui trình 1 là qui trình đề nghị của nhà sản xuất  Qui trình 2 đƣợc đề nghị bởi A.L. Vincent (1998)  Qui trình 3 là qui trình thí nghiệm Ủ hỗn hợp 3 - 12 giờ. 3.4.2.4.2 Ứng dụng PCR phát hiện ra gen thụ thể prolactin và xác định tần số các kiểu gen PRLR trên các mẫu phân tích Chọn qui trình PCR và qui trình cắt enzyme giới hạn thích hợp nhất để phát hiện ra gen thụ thể prolactin. Yêu cầu của các qui trình đƣợc áp dụng để phát hiện ra gen thụ thể prolactin nhƣ sau:  Qui trình PCR xem là thích hợp khi nó có tính ổn định cao, phát hiện ra sự hiện diện của gen thụ thể một cách chính xác không xuất hiện trƣờng hợp âm tính giả hoặc dƣơng tính giả. Các sản phẩm PCR thu đƣợc không xuất hiện các băng phụ mà chỉ hiện diện sản phẩm chính. 28  Khi chọn qui trình xử lý enzyme giới hạn không những căn cứ vào hiệu quả của việc cắt mà còn căn cứ vào hiệu quả kinh tế của việc sử dụng enzyme và hoá chất Xác định sự hiện diện của gen PRLR  Tiến hành phản ứng PCR với các mẫu DNA đã đƣợc ly trích  Tiến hành điện di sản phẩm PCR với nồng độ gel 1,5 %, 100 V, 250 mA, trong 30 phút. o Qui trình điện di đƣợc tiến hành nhƣ sau : Cân 0,6 g agarose LMP (low melting agarose) cho vào bình chứa 40 ml dung dich TBE 0,5X Tiến hành đun agarose trong bồn nhiệt (70oC) cho đến khi tan hết. Để nguội ở nhiệt độ phòng cho đến khi nhiệt độ gel bằng với nhiệt độ phòng là đƣợc Đặt lƣợt vào khay đổ gel, tiến hành đổ gel sao cho tránh bọt khí Để nguội khoảng 2 giờ đến khi gel cứng hoàn toàn, rút lƣợt ra Cho gel vào bồn điện di chứa dung dịch TBE 0,5X sao cho dung dịch này ngập miếng gel khoảng 1 – 1,5 cm Cho DNA vào giếng : Trộn 8 l với loading dye trên giấy nhôm hoặc giấy parafin dùng pipet bơm vào các giếng. Điều chỉnh các thông của bồn điện di : 100 V, 250 mA, trong 30 phút. Nhuộm gel với ethium bromide trong 30 phút Đọc kết quả điện di sản phẩm PCR  Thống kê kết quả phản ứng PCR thành công và kết luận tỉ lệ phần trăm xuất hiện của gen PLRL Xác định tần số xuất hiện của các kiểu gen PRLR  Tiến hành phân cắt enzyme giới hạn AluI các mẫu có phản ứng PCR thành công.  Tiến hành điện di sản phẩm phân cắt với loại gel LMP có nồng độ cao (3,5%) để phân tách các đoạn DNA có kích thƣớc nhỏ (60 bp đến 130 bp) , do gen PRLR sau 29 khi phân cắt tạo thành các đoạn có kích thƣớc dƣới 60 bp. Các thông số của quá trình điện di: 50 V, 48 mA, 60 phút. Để đo kích thƣớc của các đoạn DNA sau khi xử lý enzyme khi điện di chúng ta cho thêm ladder 25 bp vào một giếng, dùng ladder này để đo kích thƣớc của các đoạn DNA.  Đọc kết quả trên gel trên máy chụp gel (máy Gel doc) nối với máy vi tính sử dụng phần mềm Quantity one Gen thụ thể prolactin có 2 alen là A, B. Enzyme AluI cắt sản phẩm PCR thành các băng có kích thƣớc khác nhau : 124 bp, 110 bp, 90 bp, 79 bp, 76 bp nhƣng có sự xuất hiện của băng DNA 90 bp là alen A, 110 bp là alen B. 30 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Hiệu quả ly trích DNA từ mẫu máu và mẫu da tai 4.1.1 Mẫu máu Việc thu thập mẫu máu bị hạn chế do các yếu tố khách quan nhƣ: Các heo lấy mẫu là các heo nái đang mang thai Muốn lấy mẫu máu phải dùng các dụng cụ để khớp mỏ heo lại Thời tiết vào thời gian lấy mẫu rất nóng nực Đây là các yếu tố rất dễ gây stress dẫn đến sảy thai, đẻ non, các heo con sinh ra không đƣợc khỏe mạnh.. Do đó chỉ thu đƣợc 10 mẫu máu của 10 heo nái, còn lại là các mẫu da tai. Việc lấy mẫu da tai tƣơng đối đơn giản. Tai heo đƣợc bôi cồn sát trùng sau đó dùng kiềm bấm một mẫu da tai nên không gây ảnh hƣởng nhiều lên heo. Nồng độ và độ tinh sạch của mẫu DNA thu đƣợc từ các mẫu máu. Bảng 4.1: Tỉ số OD và hàm lƣợng DNA thu đƣợc từ các mẫu máu Mẫu Tỉ số OD260 nm / 280 nm OD260 nm OD280 nm Nồng độ (ng / µl) 1 1,41 0,17 0,12 6,37 2 1,45 0,16 0,11 6,1 3 1,16 0,12 0,06 5,39 4 1,45 0,21 0,12 8,89 5 1,52 0,09 0,06 3,5 6 1,33 0,13 0,1 4,58 7 1,5 0,15 0,10 5,84 8 1,33 0,20 0,15 7,18 9 1,45 0,12 0,06 5,39 10 1,6 0,09 0,056 3,65 Trung bình ( X ) 1,42 0,14 0,09 5,51 Độ lệch chuẩn ± 0,12 ± 0,04 ± 0,03 ± 1,75 Tỉ số OD của các mẫu máu thu đƣợc tƣơng đối thấp, OD260 nm / 280 nm trung bình là 1,42. Mẫu DNA ly trích đƣợc xem là sạch, không tạp nhiễm protein nằm trong khoảng 1,8 – 2 (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998). Theo nghiên cứu của Lê Thị Thu Phƣơng (2003) thì độ tinh sạch của mẫu máu cao hơn mẫu da tai. Kết quả này ngƣợc với kết 31 quả do chúng tôi tiến hành. Điều này có thể lý giải do việc ly trích DNA từ máu rất phức tạp, để thu đƣợc mẫu máu tinh sạch cần tốn rất nhiều thời gian ly tâm với dung dịch TE 1X để tách các phân tử hemolobin từ máu, các tế bào máu có thể theo dung dịch tẩy rửa ra ngoài qua quá trình hút rửa. Nồng độ DNA ly trích cao hay thấp phụ thuộc vào việc pha loãng DNA mẫu bằng dung dịch đệm. Để có mẫu DNA có độ tinh sạch cao, nồng độ cao trong quá trình ly trích chúng ta cho vào một thể tích dung dịch đệm tƣơng đối ít. Ví dụ ta có mẫu DNA có tỉ số OD260 nm / 280 nm= 1,85 muốn mẫu này có nồng độ DNA trong mẫu cao thay vì cho vào 200 µl dung dịch đệm TE 1X chúng ta chỉ cho vào từ 50 – 100 µl dung dịch TE 1X thì nồng độ DNA trong mẫu tăng lên đáng kể phù hợp với các yêu cầu nghiên cứu. 4.1.1 Mẫu da tai Độ tinh sạch và hàm lƣợng DNA của các mẫu da tai tƣơng đối cao, tỉ số OD260 nm / 280 nm đạt mức trung bình là 1,82, nồng độ DNA trung bình trên một mẫu là 8,98 ng / µl tƣơng đối phù hợp với yêu cầu thực hiện phản ứng PCR. Mẫu da tai sau khi giã nhuyễn đƣợc xử lý proteinase K không cần phải qua các thao tác tẩy rửa phức tạp, proteinase K phân cắt các phân tử protein có cấu trúc phức tạp thành các đoạn acid amin ngắn. Các đoạn acid amin này dể dàng bị loại bỏ qua quá trình rửa phenol / chloroform / isoamyl alcohol. Sau khi ly tâm thì toàn bộ DNA nhân của các mô liên kết đƣợc giữ lại ở phần nƣớc nổi bên trên, protein và cặn chìm xuống phía dƣới, lấy nƣớc nổi này và tiến hành thu DNA Đây chính là lý do mà mẫu da tai sau khi ly trích có độ tinh sạch và hàm lƣợng DNA cao. 32 Bảng 4.2: Tỉ số OD và hàm lƣợng DNA thu đƣợc từ các mẫu da tai Mẫu Tỉ số OD260 nm / 280 nm OD260 nm OD280 nm Nồng độ DNA (ng / µl) 1 1,83 0,11 0,06 4,76 2 1,89 0,15 0,07 6,92 3 1,73 0,92 0,53 38,79 4 1,8 0,64 0,35 27,66 5 1,71 0,12 0,07 5,03 6 1,75 0,21 0,12 8,89 7 1,85 0,17 0,09 7,45 8 1,83 0,25 0,14 10,69 9 1,94 0,21 0,11 9,25 10 1,86 0,26 0,14 11,31 11 1,85 0,15 0,08 6,56 12 1,84 0,08 0,04 3,59 13 1,88 0,12 0,06 5,39 14 1,95 0,22 0,11 9,88 15 1,7 0,16 0,09 6,82 16 1,75 0,21 0,12 8,89 17 1,90 0,12 0,068 5,1 18 1,8 0,09 0,05 3,86 19 1,96 0,10 0,06 4,13 20 1,73 0,15 0,08 6,56 21 1,84 0,16 0,09 6,82 22 1,85 0,16 0,09 6,82 23 1,83 0,08 0,044 3,45 24 1,90 0,37 0,19 16,43 25 1,78 0,10 0,056 4,27 26 1,84 0,17 0,092 7,38 27 1,7 0,09 0,052 3,79 28 1,85 0,16 0,086 6,97 29 1,71 0,13 0,076 5,44 30 1,85 0,07 0,037 3,07 Trung bình ( X ) 1,82 0,198 0,12 8,47 Độ lệch chuẩn ± 0,074 ±0,174 ±0,11 ±7,46 33 4.2 Kết quả việc thực hiện phản ứng PCR 4.2.1 Kết quả thực hiện phản ứng PCR theo các qui trình khác nhau 4.2.1.1 Qui trình phản ứng PCR theo nhiệt độ bắt cặp khác nhau Để tiến hành xác định nhiệt độ bắt cặp nào là tối hảo cho cặp primer đang tiến hành thí nghiệm chúng tôi tiến hành thực hiện 15 phản ứng trên mẫu da tai cho mỗi qui trình. Mẫu da tai đƣợc chọn do hàm lƣợng DNA cao, độ tinh sạch tƣơng đối chuẩn, phù hợp với yêu cầu của phản ứng PCR. Kết quả của hai qui trình phản ứng đƣợc trình bày ở (Bảng 4.3) Bảng 4.3: So sánh tỉ lệ thành công giữa hai qui trình nhiệt độ khác nhau Qui trình PCR Số mẫu thực hiện Số mẫu thành công Tỉ lệ thành công (%) 1 15 10 66,7 2 15 10 66,7 Với kết quả này thì hai qui trình nhiệt độ đều phát hiện tốt sự hiện diện của gen PRLR. Ở qui trình 1, nhiệt độ bắt cặp thấp hơn, các primer không hoàn toàn bắt cặp đặc hiệu với trình tự đích, có một số lƣợng nhỏ primer bắt cặp không đặc hiệu, tạo thành các sản phẩm phụ chuỗi dài và ngắn hơn sản phẩm PCR. Sản phẩm PCR sau khi chạy điện di xuất hiện những vệt dài sáng (giống nhƣ hiện tƣợng sao chổi) kèm theo đó là các băng phụ của các đoạn DNA kích thƣớc nhỏ. Ở qui trình 2 nhiệt độ bắt cặp cao hơn 2o C, các sản phẩm PCR thu đƣợc rất đặc hiệu, không xuất hiện vệt dài sáng nhƣ ở qui trình 1. Nhƣ vậy, qui trình của Vincent khi tiến hành tại điều kiện phòng thí nghiệm của chúng ta không phù hợp và phải điều chỉnh nhiệt độ bắt cặp tăng lên khoảng 2o C. 34 Hình 4.1: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình nhiệt 1 với nồng độ gel 1,5 % 1, 3, 5, 7: Các giếng có hiện diện sản phẩm PCR, cả 4 giếng này đều xuất hiện các vệt sáng dài 2, 4, 6, 8: Các giếng không có sự hiện diện sản phẩm PCR Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình nhiệt 2 với nồng độ gel LMP 1,5 % Giếng 1, 2, 3, 4: Sản phẩm PCR thực hiện theo qui trình 2 1 2 3 4 5 6 7 8 Các vệt dài sáng Sản phẩm PCR 1’ 1 2’ 2 3’ 3 4’ 4 Sản phẩm PCR Các băng phụ kích thƣớc nhỏ (hiện tƣợng dimer – primer) 35 4.2.1.2 Qui trình phản ứng PCR theo nồng độ primer khác nhau Để tiến hành xác định nồng độ primer thích hợp nhất cho phản ứng PCR phát hiện gen thụ thể prolactin, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR trên mẫu da tai. Mỗi qui trình tiến hành 15 phản ứng. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau (Bảng 4.4): Bảng 4.4: So sánh tỉ lệ thành công giữa ba qui trình phản ứng PCR theo nồng độ primer khác nhau Qui trình PCR Số mẫu thực hiện Số mẫu thành công Tỉ lệ thành công (%) 1 15 0 0 2 15 9 60 3 15 9 60 Qua kết quả ở Bảng 4.4 thì qui trình 2, 3 phát hiện tốt sự hiện diện của gen PRLR. Qui trình 1 không phát hiện đƣợc sự hiện diện của gen PRLR. Sản phẩm PCR sau khi điện di và nhuộm gel thì không thấy xuất hiện các băng DNA. Ở qui trình 3 nồng độ primer cao, primer sau khi bắt cặp vào DNA khuôn còn thừa tạo ra các băng phụ kích thƣớc nhỏ (hiện tƣợng dimer – primer). Qui trình 2 cho kết quả hoàn toàn nhƣ mong muốn, các băng DNA xuất hiện rõ ràng, các băng DNA hiện diện rõ ràng. Sản phẩm PCR của qui trình này có thể dùng xử lý enzyme giới hạn. 36 Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình 1 với nồng độ gel LMP 1,5 % Các giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8: Không có sự hiện diện sản phẩm PCR Hình 4.4: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình 2 với nồng độ gel LMP 1,5 % Giếng 1’, 2’, 3’, 4’: sản phẩm PCR đƣợc thực hiện bởi cặp primer của Drogemuller đƣợc thực hiện bởi Bùi Thị Trà Mi lớp Chăn Nuôi – Thú Y 27 Giếng 1, 2, 3, 4: Sản phẩm PCR thực hiện theo qui trình 2 1 2 3 4 5 6 7 8 1’ 1 2’ 2 3’ 3 4’ 4 Sản phẩm PCR theo qui trình 2 37 Hình 4.5: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình 3 với nồng độ gel 1,5 % 4.2.2 Kết quả thực hiện phản ứng PCR theo hai loại mẫu khác nhau Chúng tôi đã tiến hành thực hiện phản ứng PCR với 2 loại mẫu khác nhau, kết quả thu đƣợc nhƣ Bảng 4.5 sau: Bảng 4.5: So sánh tỉ lệ thành công của phản ứng PCR với hai loại mẫu khác nhau Loại mẫu Số mẫu thực hiện Số mẫu thành công Tỉ lệ thành công (%) Máu 10 3 30 Da tai 10 7 70 Mẫu máu có tỉ lệ thành công thấp hơn mẫu da tai. Các loại protein của máu chủ yếu là các phân tử hemoglobin có chứa nhóm heme (Nguyễn Phƣớc Nhuận, 2003). Theo Erlich nhóm này ức chế mạnh đến hoạt động của Taq polymerase ( trích dẫn bởi Lê Thị Thu Phƣơng, 2003). Do Taq polymerase bị ức chế nên phản ứng PCR có hiệu quả thấp trong việc xác định gen PRLR. 1 2 3 4 5 6 7 8 Các băng phụ chuỗi ngắn 38 Hình 4.6: Kích thƣớc của sản phẩm PCR Ghi chú: 1, 2,3 :sản phẩm PCR đƣợc thực hiện bởi cặp primer của A.L Vincent LD (ladder): 100 bp 4.3 Kết quả thực hiện cắt enzyme giới hạn trên các nồng độ khác nhau Việc xử lý enzyme là một trong những công đoạn quan trọng trong việc xác định tần số xuất hiện của các kiểu gen thụ thể prolactin. Đây là công đoạn rất tốn kém, đòi hỏi chi phí cao khi thao tác trên số lƣợng mẫu lớn. Do đó, việc xác định nồng độ, thể tích của các enzyme tham gia vào quá trình phân cắt sao cho hiệu quả nhất và kinh tế nhất là rất cần thiết. Kết quả của việc cắt enzyme theo các qui trình khác nhau đƣợc trình bày ở bảng 4.6 dƣới đây: Bảng 4.6: So sánh tỉ lệ thành công giữa các nồng độ cắt enzyme khác nhau Nồng độ Số mẫu thực hiện Số mẫu thành công Tỉ lệ % thành công 1 10 0 0 2 10 10 100 3 10 10 100 Xử lý enzyme theo qui trình của nhà sản xuất không thành công. Sản phẩm sau khi xử lý enzyme không thấy sự phân cắt của enzyme. Đây là qui trình chuẩn yêu cầu 1000 bp 400 bp 390 bp LD 1 2 3 4 5 39 lƣợng DNA của mẫu đƣa vào tƣơng đối chính xác, lƣợng enzyme sử dụng tƣơng đối cao. Sản phẩm PCR của chúng ta sau khi thu đƣợc thể tích khoảng 25 µl, nồng độ rất khó định lƣợng, không thể đạt đến mức 1000 ng / µl . Nhƣ vậy, việc thực hiện theo qui trình này vừa không hiệu quả, vừa tốn kém. Ở qui trình 2, qui trình 3 các sản phẩm sau khi điện di cho kết quả rất tốt, các băng thể hiện rất rõ. Nhƣ vậy không có sự khác biệt giữa qui trình 2 và qui trình 3. Nhƣng vì lý do kinh tế nên chúng tôi quyết định chọn qui trình 3 sử dụng trong công tác phân tích gen thụ thể prolactin. Trong việc xử lý enzyme giới hạn này có nhiều vấn đề cần đƣợc quan tâm: Nồng độ gel dùng để điện di: Sản phẩm phân cắt enzyme là các đoạn DNA có kích thƣớc tƣơng đối ngắn từ 50 – 121 bp. Nên chúng ta cần sử dụng nồng độ gel cao từ 2.5 – 6 %. Nếu chúng ta sử dụng nồng độ gel thấp thì các băng DNA sau khi phân cắt sẽ bị nhoè, không phân biệt rõ ràng. Trƣờng hợp cụ thể ở đây là sử dụng nồng độ gel 3.5 %, nhƣng theo các nghiên cứu về gen PRLR của Vincent thì ông sử dụng nồng độ gel 6 %.Với nồng độ gel đậm đặc nhƣ thế sẽ tạo ra kích thƣớc lổ gel nhỏ giúp cho các đoạn DNA kích thƣớc nhỏ phân biệt một cách rõ ràng, nhƣng khá tốn kém. Hình 4.7: Kết quả điện di sản phẩm xử lý enzyme giới hạn AluI với nồng độ gel 2 % LD: ladder 25 bp Các giếng 1, 2, 3,...,16 không thể phân biệt đƣợc các băng DNA Hiệu điện thế và cƣờng độ dòng điện 1 2 3 4 LD 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 LD Các băng DNA bị nhoè 40 Hiệu điện thế và cƣờng độ dòng điện đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình điện di. Hiệu điện thế và cƣờng độ dòng điện cao quá sẽ làm cho các đoạn DNA di chuyển nhanh, các đoạn DNA phân tán không tập trung lại thành một băng có kích thƣớc lớn gây khó khăn trong việc xác định, phân biệt kích thƣớc của các đoạn DNA. Hiện tƣợng này chỉ đƣợc thấy rõ qua các đoạn DNA có kích thƣớc dƣới 100 bp. Các nghiên cứu của tác giả A.L. Vincent thì sự xuất hiện của các băng DNA có kích thƣớc 90 bp: alen A; 110 bp: alen B sau khi phân cắt là có thể xác định đƣợc kiểu gen của heo. Hình 4.8: Kết quả điện di sản phẩm xử lý enzyme với gel LMP 3,5 % Các giếng bỏ trống và đánh số không phải sản phẩm cắt enzyme trong khoá luận này AB, BB: Các kiểu gen PRLR 4.4 Tần số xuất hiện của các kiểu gen trong quần thể Sau khi xây dựng thành công qui trình thực hiện kỹ thuật PCR và qui trình cắt enzyme hiệu quả nhất thì chúng tôi tiến hành áp dụng các kết quả đạt đƣợc vào việc xác định sự hiện diện của gen thụ thể prolactin và tần số xuất hiện của các kiểu gen thụ thể prolactin. 110 bp AB BB LA BB BB BB LA 66 bp 25 bp 76 bp 124 bp 41 Sự hiện diện của gen thụ thể prolactin Bảng 4.7: Tỉ lệ xuất hiện của gen PRLR Số mẫu Tỉ lệ % Có sự hiện diện của gen PLRL 23 76,67 Không có sự hiện diện của gen PLRL 7 23,33 Tỉ lệ sự xuất hiện của các kiểu gen PRLR Với 30 mẫu ly trích sau khi thực hiện phản ứng PCR thì thu đƣợc 23 mẫu có sự xuất hiện gen PRLR. Xử lý 23 mẫu này với AluI theo qui trình 2 bảng 3.3 để xác định kiểu gen. Kết quả đƣợc trình bày nhƣ bảng 4.8 sau: Bảng 4.8: Tỉ lệ xuất hiện của các kiểu gen PRLR Kiểu gen Số mẫu Tỉ lệ, % AA 1 3,33 AB 7 23,33 BB 15 50 42 3.33 23.33 50 0 10 20 30 40 50 60 1 2 3 Kiểu gen Series1 Hình 4.9: Tỉ lệ xuất hiện của các kiểu gen PRLR Tỉ lệ (%) AA AB BB 43 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua thời gian khảo sát chúng tôi ghi nhận đƣợc các kết quả sau: Tần số xuất hiện của gen thụ thể prolactin Qua quá trình phân tích kiểm tra 30 mẫu lấy lừ 30 heo nái giống Yorkshire thì tần số xuất hiện của gen này chiếm tỉ lệ 76,67 % so với tổng số mẫu phân tích. Tỉ lệ này chiếm khá cao. Tần số xuất hiện của các kiểu gen thụ thể prolactin Cả ba kiểu gen thụ thể prolactin đều xuất hiện trên giống Yorkshire. Tần số kiểu gen BB chiếm tỉ lệ cao nhất (50 %), kiểu gen AB chiếm tỉ lệ 23,3 %, kiểu gen AA chiếm tỉ lệ thấp nhất (3,33 %). Các heo nái có kiểu gen AA theo các báo cáo của A. L. Vincent (1998), Drogemuller (2001)…có năng suất sinh sản cao hơn các kiểu gen khác nhƣng do số mẫu phân tích chƣa đủ lớn nên không có những kết luận về mối tƣơng quan giữa năng suất sinh sản với kiểu gen AA. 5.2 Kiến nghị Đƣa kỹ thuật xét nghiệm này vào công tác di truyền và chọn giống Tiếp tục khảo sát với lƣợng mẫu lớn hơn, thu thập đầy đủ các số liệu về năng suất sinh sản của các heo nái để có cơ sở đánh giá chính xác ảnh hƣởng của gen thụ thể prolactin lên năng suất sinh sản của nái. 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Bùi Chí Bửu - Nguyễn Thị Lang, 1999, Di truyền phân tử những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng, NXB Nông Nghiệp TP. HCM 2. Trần Thị Dân, 2000, Bài giảng sinh lý học gia súc, khoa Chăn Nuôi - Thú Y bộ môn sinh lý, sinh hóa trƣờng Đại học Nông Lâm TP. HCM. 3. Lê Đình Lƣơng, 2001, Nguyên lý kỹ thuật di truyền, NXB khoa học kỹ thuật Hà Nội 4. PGS. TS Nguyễn Phƣớc Nhuận, 2003, Giáo trình sinh hoá học - Phần I: Sinh hoá học tĩnh, NXB Đại học quốc gia TP. HCM 5. Lê Thị Thu Phƣơng, 2003, Ứng d ụng k ỹ thuật PCR phát hiện gen thụ thể estrogen và gen halothan, LVTS khoa Chăn nuôi Thú y trƣờng đại học Nông Lâm TP. HCM. 6. W. D. Phillips – T.J. Chilton, 1998, Sinh học - Tập 1, NXB Giáo Dục 7. Trịnh Ngọc Thu Trang, 2004, Khảo sát sức sinh sản của một số nhóm giống tại xí nghiệp lợn giống Đông Á, LVTN khoa Chăn Nuôi - Thú Y trƣờng đại học Nông Lâm TP. HCM. 8. Trần Thị Thuỳ Trang, 2003, Khảo sát ảnh hưởng của gen thụ thể estrogen và gen halothan lên năng suất sinh sản của heo nái, LVTN khoa chăn nuôi thú Y trƣờng đại học Nông Lâm TP. HCM. 9. Bùi Trang Việt, 2003, Giáo trình sinh học phân tử, đại học quốc gia TP. HCM khoa sinh học trƣờng ĐH KHTN. TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI 1. T.A. Brown, 1999, Gen clonning an introduction – Third editor, Chapman and hall, London, UK 2. C. Drogemuller, H. Hamann, and O. Distl, 2001, Cadidate gene markers for litter size in different German pigs line, J. Anim. Sci. 2001. 79: 2565 – 2570 3. S.T Nicholl, 1994, An introduction to geneticengineering, Camdridge University, UK A.M Griffin, H.G Griffin, PCR technology current innovation, CRC press, London, UK 4. A. L. Vincent, G. Evans’, T.H. Short, C.K. Tuggle, and M.F. Rothschild’, 1998, The prolactin receptor gene is asociated with increased litter size in pigs, Department of Animal Science, Iowa State University, Ames 500011 45 CÁC TRANG WEB TỪ INTERNET: =12559630&dopt=Citation ef_uid=582 46 MỤC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề .............................................................................................................. 1 1.2 Mục đích - yêu cầu ................................................................................................. 1 1.2.1 Mục đích .......................................................................................................... 1 1.2.2 Yêu cầu ............................................................................................................ 1 PHẦN 2: TỔNG QUAN ................................................................................................. 3 2.1 Giới thiệu sơ lƣợc về giống heo Yorshire .............................................................. 3 2.1.1 Prolactin .......................................................................................................... 3 2.1.1.1 Nguồn gốc, cấu tạo ................................................................................... 3 2.1.1.2 Tác dụng của prolactin ............................................................................. 3 2.1.1.3 Cơ chế tác động của prolactin .................................................................. 4 2.1.1.4 Gen thụ thể prolactin ................................................................................ 5 2.2 Giới thiệu về DNA (Deoxiribonucleotide acid) .................................................... 6 2.2.1 Cơ chế tự nhân đôi của DNA .......................................................................... 8 2.2.2 Gen, allen và sự đa hình của gen................................................................... 10 2.2.2.1 Gen ......................................................................................................... 10 2.2.2.1.1 Sự biểu hiện của gen hay sự điều hoà hoạt động của gen ............... 10 2.2.2.1.2 Sự liên kết giữa gen và marker ........................................................ 11 2.2.2.2 Allen và sự đa hình của gen ................................................................... 11 2.2.3 Phƣơng pháp chiết tách DNA từ mô động vật .................................... 12 2.2.4 Phƣơng pháp định tính và định lƣợng cho DNA .......................................... 13 2.2.4.1 Định lƣợng bằng phƣơng pháp đo OD (optical density) ........................ 13 2.2.4.2 Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di ............................................ 13 2.3 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) ....................................................... 14 2.3.1 Giới thiệu về phản ứng PCR ......................................................................... 14 2.3.2 Các yếu tố tham gia vào phản ứng PCR ....................................................... 14 2.3.2.1 Taq polymerase ...................................................................................... 14 2.3.2.2 Các nucleotid ..................................................................................... 15 2.3.2.3 Primer (mồi) ....................................................................................... 15 2.3.2.4 Dung dịch đệm ................................................................................... 15 47 2.3.2.5 DNA khuôn ......................................................................................... 16 2.3.2.6 Số chu kỳ phản ứng ................................................................................ 16 2.3.2.7 Nhiệt độ và pH ....................................................................................... 16 2.3.2.6 Các vấn đề thƣờng gặp trong PCR và phƣơng pháp khắc phục ............. 16 2.3.2.7 Ứng dụng của PCR ................................................................................. 18 2.4 Giới thiệu về kỹ thuật RFLP và kỹ thuật PCR – RFLP ....................................... 18 2.4.1 Kỹ thuật RFLP ( restricton fragment length polymorphism)........................ 18 2.4.2 Kỹ thuật PCR – RFLP ................................................................................... 19 2.5 Các enzyme giới hạn ....................................................................................... 20 PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP KHẢO SÁT .......................................... 21 3.1 Thời gian, địa điểm ............................................................................................. 21 3.1.1 Thời gian ...................................................................................................... 21 3.1.2 Địa điểm ....................................................................................................... 21 3.2 Đối tƣợng khảo sát ............................................................................................. 21 3.3 Nội dung thực hiện ............................................................................................. 21 3.4 Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................. 21 3.4.1 Vật liệu, dụng cụ, máy móc và thiết bị làm thí nghiệm ........................... 21 3.4.2 Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................... 22 3.4.2.1 Thu thập mẫu .......................................................................................... 22 3.4.2.2 Ly trích DNA .......................................................................................... 23 3.4.2.3 Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế..................................................... 24 3.4.2.4 Ứng dụng phƣơng pháp PCR – RFLP khảo sát sự đa hình của gen PRLR .... 24 3.4.2.4.1 Xây dựng qui trình khuyếch đại PCR và cắt enzyme giới hạn ........ 24 3.4.2.5 Ứng dụng PCR phát hiện ra gen thụ thể prolactin và xác định tần số các kiểu gen PRLR trên các mẫu phân tích .................................................................. 27 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 30 4.1 Hiệu quả ly trích DNA từ mẫu máu và mẫu da tai .............................................. 30 4.1.1 Mẫu máu ........................................................................................................ 30 4.1.1 Mẫu da tai ...................................................................................................... 31 4.2 Kết quả việc thực hiện phản ứng PCR ................................................................. 33 4.2.1 Kết quả thực hiện phản ứng PCR theo các qui trình khác nhau ................... 33 4.2.1.1 Qui trình phản ứng PCR theo nhiệt độ bắt cặp khác nhau ..................... 33 48 4.2.1.2 Qui trình phản ứng PCR theo nồng độ primer khác nhau ...................... 35 4.3 Kết quả thực hiện cắt enzyme giới hạn trên các qui trình khác nhau .................. 38 4.4 Tần số xuất hiện của các kiểu gen trong quần thể ....................................... 40 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 43 5.1 Kết luận ................................................................................................................... 43 5.2 Kiến nghị ................................................................................................................. 43 49 PHỤ LỤC Khối lƣợng phân tử của một số hoá chất sử dụng trong thí nghiệm Tris HCl ( pH = 8) 157.64 g / mol Na2EDTA 372,24 g / mol SDS 288,38 g / mol MgCl2.6H2O 203,3 g / mol KCl 74,55 g / mol NaCl 58.5 g / mol H3PO4 61.81 g / mol Sodium acetat 163.1 g / mol Hoá chất cho ly trích TE 1X Tris HCl Na2EDTA Nƣớc cất 2 lần vô trùng vừa đủ Proteinase K Phenol / chloroform / isoamyl (25:24:1) Ethanol lạnh Ethanol tuyệt đối Hoá chất dùng cho PCR Taq polymerase Primer F Primer R dNTPs PCR buffer 10X Tris HCl Hoá chất dùng cho cắt enzyme Buffer 10 X BSA (Bovine serum albumin) AluI 50 Hoá chất dùng cho điện di TBE 0.5 X 0.9 M Na2EDTA 20 mM Tris bazơ 0.9 M Nƣớc cất vô trùng vừa đủ Hoá chất dùng cho nhuộm gel Dung dịch ethium bromide 10 mg / ml TBE 1X Loading dye Bromophenol blue 0.25 % Sucrose 40 % TE 1X vừa đủ 100 % DANH MỤC CÁC HÌNH 51 Hình 2.1: Cơ chế tác động của prolactin tại tế bào mục tiêu .......................................... 4 Hình 2.2: Cấu trúc của các loại bazơ hữu cơ ................................................................... 7 Hình 2.3: Cấu trúc tổng quát của 4 loại nucleotide ......................................................... 7 Hình 2.4: Sự nhân bản DNA ........................................................................................... 9 Hình 2.5: Các chu kỳ của phản ứng PCR ...................................................................... 14 Hình 4.1: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình nhiệt 1 với nồng độ gel 1,5 % ......... 34 Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình nhiệt 2 với nồng độ gel LMP 1,5 %... 34 Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình 1 với nồng độ gel LMP 1,5 % ........ 36 Hình 4.4: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình 2 với nồng độ gel LMP 1,5 % ........ 36 Hình 4.5: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình 3 với nồng độ gel 1,5 % ................ 37 Hình 4.6: Kích thƣớc của sản phẩm PCR ...................................................................... 38 Hình 4.7: Kết quả điện di sản phẩm xử lý enzyme giới hạn AluI với nồng độ gel 2 % ........ 39 Hình 4.8: Kết quả điện di sản phẩm xử lý enzyme với gel LMP 3,5 % ........................ 40 Hình 4.9: Tỉ lệ % xuất hiện của các kiểu gen PRLR ..................................................... 42 DANH MỤC CÁC BẢNG 52 Bảng 2.1: Các thông số của gen thụ thể prolactin lấy từ genbank .................................. 6 Bảng 2.2: Các yếu tố cần thiết cho sự tự nhân đôi của DNA .......................................... 9 Bảng 2.3: Các vấn đề thƣờng gặp trong PCR và phƣơng pháp khắc phục ................... 17 Bảng 3.1: Nhiệt độ và thời gian của 2 qui trình phản ứng PCR .................................... 25 Bảng 3.2: Nồng độ cuối của 3 qui trình thực hiện phản ứng PCR ................................ 26 Bảng 3.3: Nồng độ và thể tích của các qui trình cắt enzyme AluI ................................ 27 Bảng 4.1: Tỉ số OD và hàm lƣợng DNA thu đƣợc từ các mẫu máu ............................. 30 Bảng 4.2: Tỉ số OD và hàm lƣợng DNA thu đƣợc từ các mẫu da tai ........................... 32 Bảng 4.3: So sánh tỉ lệ thành công giữa hai qui trình nhiệt độ khác nhau .................... 33 Bảng 4.4: So sánh tỉ lệ thành công giữa ba qui trình phản ứng PCR theo nồng độ primer khác nhau ........................................................................................................... 35 4.2.2 Kết quả thực hiện phản ứng PCR theo hai loại mẫu khác nhau ........................... 37 Bảng 4.5: So sánh tỉ lệ thành công của phản ứng PCR với hai loại mẫu khác nhau ..... 37 Bảng 4.6: So sánh tỉ lệ thành công giữa các qui trình cắt enzyme khác nhau ................... 38 Bảng 4.7: Tỉ lệ % xuất hiện của gen PRLR................................................................... 41 Bảng 4.8: Tỉ lệ % xuất hiện của gen PRLR................................................................... 41