Đề tài Ứng dụng vi sinh vật trong sản xuất giấm

Môn: Vi Sinh Vật Môi Trường Đề Tài: ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG SẢN XUẤT GIẤM Giáo Viên Hướng Dẫn: ThS. Nguyễn Ngọc Tâm Huyên NHÓM LÊN MEN GIẤM 1. Hoàng Tăng Nhật 2. Nguyễn Chánh Nguyên 3. Đinh Công Lợi 4. Huỳnh Minh Thiện 5. Nguyễn Xuân Dự 6.Nguyễn Hùng Minh MỤC LỤC Chương 1: GIỚI THIỆU    Giấm là rượu đã bị chua.    Giấm là dung dịch nước chứa 3% axit axetic. Giấm có thể tính tuổi từ năm 1000 trước công nguyên và đời xưa dùng giấm là nước uống Jessus. 1.1 Lịch sử Ứng dụng của giấm làm gia vị đã được hàng thế kỉ. Giấm được dùng như vị thuốc, tác nhân phá hủy và chất bảo quản. Vào thời trung nguyên, những nhà luyện kim đổ giấm lên trên chì  để tạo chì axetate.     Thời kì Phục hưng, làm giấm là nghề đem lại lợi nhuận ở Pháp. Nước này đã sản xuất gần 150 loại giấm có mùi vị từ việc bổ sung tiêu, cỏ ba lá, hoa hồng, thìa là, và mâm xôi. Sản xuất giấm cũng được phát triển ở Anh, sinh lời đến nỗi năm 1693 Nghị viện thiết lập thuế trên giấm – bia. Vào thời kì đầu ở Mỹ, sản xuất giấm rượu táo là nền tảng của nông nghiệp và kinh tế hộ gia đình, được giá gấp 3 lần rượu táo thô truyền thống.     Sự chuyển từ rượu hay nước trái cây sang giấm là quá trình hóa học trong đó rượu ethylic bị oxy hóa tạo axid axetic. Về mặt lịch sử, nhiều phương pháp khác đã được dùng để tạo giấm. Ở phương pháp chậm, tự nhiên vại rượu táo để mở đặt trong nhiệt độ phòng. Suốt khoảng vài tháng, nước trái cây lên men thành rượu và sau đó bị oxy hóa thành axit axetic. Phương pháp Orleans (Pháp) được gọi là phương pháp liên tục. Nước trái cây được thêm định kì vào những mẻ giấm nhỏ và trữ trong thùng gỗ. Khi nước trái cây chua, ta sẽ vớt ra ở trên thùng. Cả phương pháp chậm và liên tục đều đòi hỏi vài tháng để sản xuất giấm. Trong sản xuất giấm thương mại hiện nay, phương pháp thông thường và phương pháp lên men chìm được ứng dụng. Những phương pháp này dựa trên mục tiêu pha trộn nhiều oxy đến mức có thể vào sản phẩm rượu. 1.2. Tổng quan về giấm 1.2.1.Phân loại giấm Giấm có thành phần giấm cất (chưng) và giấm pha chế Hình ảnh: Giấm nuôi bằng chuối Giấm cất (cũng gọi là giấm gạo) lấy lương thực, đường làm nguyên liệu chính, thông qua việc ủ vi sinh vật lên men. Thành phần dinh dưỡng của nó có axit axetic, đường, axit hữu cơ, vitamin, muối vô cơ… rất tốt cho việc trao đổi chất cơ thể. Còn giấm pha chế (giấm hóa học) thì lấy axit axetic tinh của thành phần hóa học làm nguyên liệu chính , thêm H2O pha loãng mà thành, không có thành phần dinh dưỡng khác. Nếu sử dụng axit axetic công nghiệp để làm giấm dùng pha chế để ăn đối với cơ thể là có hại. Hình ảnh về giấm mật Giấm cất ở Châu Á có lịch sử lâu đời hơn 2000 năm nhiều chủng loại. Do hoàn cảnh địa lý, nguyên liệu không giống nhau, giấm ăn ở các nước cũng không giống nhau. Phát triển dần theo nhu cầu người ta đã chia theo hiệu lực và công dụng của giấm từ loại đơn thuần gia vị phát triển thành loại dùng để nấu nướng, loại làm ngon cơm, loại giữ sức khỏe và loại nước uống Loại nấu nướng: độ axit axetic 5% vị nồng thơm dịu, vốn có tác dụng tẩy mùi tanh, giúp tươi thịt. Đối với thịt, cá, hải sản…vô cùng thích hợp. Nếu như dùng giấm trắng cất, vẫn không thể ảnh hưởng màu sắc thức ăn vốn có Loại ngon cơm: Độ axit axetic 4%, vị khá ngọt thích hợp để trộn thức ăn, nước chấm như trộn dưa chuột, điểm tâm…có tác dụng tươi giòn. Loại giấm này có giấm gạo hoa hồng, giấm gạo cất và giấm làm ngon cơm Loại bảo vệ sức khỏe: Độ axit axetic khá thấp khoảng 3%. Khẩu vị khá ngon, mỗi buổi sáng sớm hay sau khi ăn uống 1 thìa là tốt, có thể tăng cường thân thể và tác dụng phòng chống bệnh, loại giấm này có hơn 10 loại. Loại nước uống: độ axit axetic 1%. Trong quá trình lên men thêm đường, trái cây… hình thành trào lưu là nước uống axit amin. Loại thức uống này từ giấm gạo có vị chua ngọt, dễ uống, thường cho thêm nước trái cây như táo, lê… cho thêm đá và gas CO2    1.2.2.Thành phần dinh dưỡng của giấm: Có axit amin phong phú: 18 loại axit amin cơ thể người không tổng hợp được trong giấm đều có, có 8 loại acit amin thực vật cung cấp. Hàm lượng axit hữu cơ trong giấm khá nhiều, giá trị thức ăn của giấm gạo càng cao. Axit hữu cơ lấy axit axetic là thành phần chính còn có hơn 10 loại axit lactic, axit gốc xeton, axit citric, axit axetic…Một số axit hữu cơ này cũng là kết quả của việc tổng hợp và phân giải trong quá trình quá trình trao đổi chất từ 3 loại chất dinh dưỡng lớn protid, mỡ, đường trong quá trình phản ứng sinh học cung cấp năng lượng cho cơ thể. Việc tổng hợp axit hữu cơ làm vị axit của thức ăn chua càng thanh, dịu ngọt, lưu lại lâu trong miệng (giấm hóa học không có chất hữu cơ vào miệng chua, nếm sẽ lưu vị đắng) làm giấm càng có vị tươi và ngon. Hơn nữa giấm mà có nhiều axit hữu cơ có thể tăng sự ngon miệng, giúp tiêu hóa. Trong nấu nướng thêm 1 chút giấm, trong giấm có axit hữu cơ có thể làm thành phần dinh dưỡng trong thức ăn được chế biến làm cơ thể càng dễ hấp thụ. Trong giấm có vitamin B1, B2, C … bắt nguồn từ kết quả trao đổi chất vi sinh vật trong quá trình lên men thức ăn và nguyên liệu. Một số sinh tố dinh dưỡng loại này là thành phần tạo thành men phụ của một số men trong quá trình trao đồi chất cơ thể, có tác dụng quan trọng trong cuộc sống của con người.Muối vô cơ trong giấm vô cùng phong phú Na, K, Ca, Fe, Cu, Zn, P… một số khoáng chất lấy từ nguyên liệu giấm, đồ chứa thức ăn trong quá trao đổi chất hay tăng thêm do người gia công thêm vào. Như muối có tác dụng điều hòa ngũ vị, làm cho giấm càng thêm mùi vị, có tác dụng quan trọng cân bằng môi trường axit kiềm trong cơ thể. Sắt là 1 thành phần tạo thành hồng huyết cầu giúp việc vận chuyển O2  và tạo máu cho cơ thể  Nguyên tố vi lượng Ca, Fe, Cu, P… giúp quá trình sinh lý chống già yếu và quá trình sinh trưởng ở tuổi dậy thì hoặc là thành phần không thể thiếu trong việc trao đổi chất  1.2.3 Chức năng đối với con người Đẩy lùi và trừ bệnh tật : có axit hữu cơ nhiều xúc tiến thay thế đường và làm cho axit lactic và axit axetic tồn trữ trong cơ bắp gây nên việc phân giải các chất gây mệt mỏi nên hết bệnh. Điều tiết độ kiềm axit dịch thể, duy trì tương đối ổn định của môi trường trong cơ thể: theo các nhà dinh dưỡng học phân tích giấm là loại thực phẩm tính kiềm sinh lý, qua sự thay thế trao đổi chất trong cơ thể sản sinh phản ứng tính kiềm. Do cơ thể mỗi ngày dùng một lượng lớn thức ăn tính axit như : thịt, cá, trứng… uống một chút giấm có thể trung hòa phản ứng tính axit, từ đó duy trì cân đối axit kiềm trong môi trường cơ thể . Hình: công dụng của giấm trong chế biến thức ăn Giúp tiêu hóa, lợi cho hấp thụ: thức ăn chua có thể nâng cao độ axit dịch dạ dày, các chất trong giấm cũng như axit amin… có thể kích thích trung khu thần kinh não của người làm cho bộ máy tiêu hóa tiết ra giúp tăng cường chức năng tiêu hóa của dạ dày. Đồng thời giấm có khả năng làm hòa tan các chất dinh dưỡng muối vô cơ phosphat, Fe, Ca… trong thức ăn càng nhiều, nó có khả năng phòng chống sự phá hoại của vitamin C. Ở đây không những nâng cao giá trị dinh dưỡng của thức ăn, lại có lợi cho tiêu hóa và hấp thu. Phòng già yếu : giấm có khả năng ức chế và hạ thấp trong cơ thể hình thành loại mỡ oxi hóa có tác dụng trì hoãn cơ thể già yếu. Diệt khuẩn kháng độc : có tính diệt khuẩn mạnh, ức chế khả năng của vi trùng, ví dụ như vi trùng que bệnh thương hàn, vi trùng qua đại tràng… gặp giấm điều bị tiêu diệt hoặc ngừng phát triển. Phòng trị cao huyết áp và sơ cứng động mạch : Đông y có tác dụng tàn huyết làm cho mạch máu chảy bình thường, huyết áp ổn định. Tây y nơi giấm có thể xúc tiến bài tiến ion Na, ức chế sự dư thừa muối trong cơ thể, từ đó ổn định huyết áp. Nói chung giấm đối với huyết áp và sơ động mạch có tác dụng trị liệu rất tốt. Tăng cường chức năng bài tiết của thận, phòng ngừa sỏi thận trong cơ thể. Nước tiểu của con người thường mang tính axit, dễ dàng làm muối trong nước tiểu kết tinh thành sỏi, giấm có thể làm nước tiểu biến thành kiềm tính, có thể phòng chống sỏi đồng thời làm hòa tan sỏi thận tính axit. Phòng trị bệnh béo phì : theo nghiên cứu giấm chứa axit amoni, ngoài việc thúc đẩy mỡ chuyển hóa nhiều trong cơ thể người thành năng lượng tiêu hao của cơ thể còn có thể làm cho việc trao đổi chất của chất dinh dưỡng như protid, đường hấp thụ vào… tiến hành thuận lợi, do đó có tác dụng phòng giảm béo phì tốt.       Diệt kí sinh trùng như giun đũa, giun kim. Kháng ung thư. Làm đẹp da : không những ức chế sắc tố da, giảm vết nhăn ở người già mà có thể tăng tuần hoàn máu cho da thay tế bào già, co rút lỗ chân lông lại, làm cho da vừa mịn vừa láng. Làm tỉnh rượu : các chất axit trong giấm có thể cùng hấp thụ axit axetic cồn trong cơ thể người, phát sinh phản ứng hình thành axit axetic làm giảm độc tính cồn đối với thần kinh nhờ đó đạt được công hiệu làm tỉnh rượu. Chương 2 :TÁC NHÂN VI SINH VẬT Vi khuẩn Acetobacter là tác nhân chính của quá trình lên men axetic nên còn được gọi là vi khuẩn axetic. Đây là những vi khuẩn phổ biến trong tự nhiên, có trên bề mặt lá, quả, hoa, tạo axit axetic từ rượu etylic. 2.1 Đặc điểm hình thái Vi khuẩn axetic là vi khuẩn gram âm, không sinh bào tử. Về hình dạng tế bào vi khuẩn axit axetic là trực khuẩn hình que tới elip, kích thước tế bào 0.3-0.6 x 1.0-8.0μm. Các tế bào đứng tách riêng rẽ, 1 số xếp 2 tế bào, 1 số khác xếp thành chuỗi dài. Một số loại đặc biệt có tế bào hình cầu, có loại hình chỉ. Tùy điều kiện pH môi trường, nhiệt độ nuôi 1 số loài có thể có dạng hình bán nguyệt. Nhiều loài vi khuẩn axetic khi phát triển trên môi trường thiếu thức ăn hay môi trường đã nuôi cấy lâu (môi trường già) dễ sinh ra hình thái đặc biệt (tế bào phình to hay kéo dài ra) có thể phân nhánh. Hình ảnh: Acetobacter Vi khuẩn axetic có khả năng tạo bào tử và màng nhày, một số có khả năng di động nhờ tiên mao, 1 số không có khả năng này Trên môi trường đặc chúng phát triển thành những khuẩn lạc tròn, đều đặn, đường kính trung bình 3 nm. Trên môi trường lỏng vi khuẩn actic chỉ phát triển trên môi trường tạo thành những lớp màng dày mỏng khác nhau. Một số loài tạo thành màng dày như sứa (0.5mm), nhẵn và trơn, khi lắc chúng chìm xuống đáy bình và thay vào đó 1 lớp màng mỏng mới lại tiếp tục phát triển. Dung dịch dưới màng bao giờ cũng trong suốt. Khi nuôi cấy màng người ta thấy có sợi cellulose giống như ở trong sợi bông. Loại 2 có màng mỏng như giấy celophan, 1 số khác trên bề mặt của màng không nhẵn mà nhăn nheo, 1 số nữa tạo màng mỏng dễ vỡ bám trên thành bình và dung dịch nuôi không trong. 2.2 Đặc điểm sinh trưởng Vi khuẩn axetic phát triển tốt trên môi trường nước bia, các môi trường có chứa cao nấm men, glucose, rượu etylic hay manitol. Phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí bắt buộc, nhiệt độ 25-30oC, pH 5,4-5,8. Tính chất đặc trưng của vi khuẩn axetic là khả năng oxy hóa rượu etylic thành axit axetic ở pH 4.5. Ngoài ra còn thực hiện quá trình oxy hóa axit axetic oxy hóa lactate, chuyển glucose thành  gluconate, oxy hóa không hoàn toàn các hợp chất hữu cơ khác (các loại đường và dẫn xuất của chúng) để tạo thành các hợp chất ketone, hay các axit hữu cơ tương ứng. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn axetic đối với nguồn C, N và chất sinh trưởng cũng rất đa dạng. Vi khuẩn axetic sử dụng đường, etylic và các axit hữu cơ làm nguồn C, muối amon làm nguồn N. Trong quá trình phát triển vi khuẩn acetic có nhu cầu đối với 1 số axit amin như valin, alanin, prolin, isolosine. Một số chất kích thích sinh trưởng như axit nicotine, axit amin, folic và biotin… có vai trò  quan trọng trong sinh trưởng của vi khuẩn axetic. Một số vi khuẩn axetic có khả năng tổng hợp poly saccaride phân tử lớn như cellulose, tinh bột, dextran… và người ta ứng dụng khả năng này trong sản xuất công nghiệp. Một số loài tổng hợp được những sợi cellulose giống như bông A. xylimum, acetigenum, viizingianum 2.3 Phân loại  Năm 1950 Frateur chính thức đưa ra khóa phân loại mới dựa trên tiêu chuẩn Khả năng tạo catalase Khả năng tổng hợp các keto từ các rượu bậc cao như glycerol,manitol, sorbitol Khả năng oxy hóa axetate thành CO2 và H2O Khả năng oxy hóa glucose thành axit gluconic Khả năng sử dụng muối amon làm nguồn nitơ và sử dụng rượu etylic làm nguồn cacbon Tạo sắc tố nâu Tổng hợp cellulose Trên cơ sở này, Frateur chia vi khuẩn acetid làm 4 nhóm Tên nhóm Vi khuẩn đại diện Đặc điểm Subosydans Acetobacter subosydaz, Acetobacter melanogennum Không có khả năng oxy hóa axit axetic thành CO2 và H2O Mezoxydans Acetobacter aceti, Acetobacter xylinum, Acetobacter mezoxydan Có đầy đủ các đặc điểm trên Oxydans Acetobacter ascendans Acetobacter ransens Actobacter lovaniens Không có khả năng tạo các hợp chất keto Peroxydans Acetobacter peroxydans Acetobacter paradoxum Không chứa catalase, không oxy hóa glucose Bảng 1.1 Phân loại vi khuẩn axit theo Frateur 2.4 Một số vi khuẩn thường sử dụng trong lên men giấm Để quá trình lên men giấm đạt hiệu quả cao, lựa chọn những chủng vi khuẩn thỏa điều kiện: Phải oxy hoá etylic tốt nhất. Tạo giấm có nồng độ axit axetic cao, chịu được độ cồn và axit cao. Các tính chất ban đầu được giữ nguyên trong suốt quá trình lên men. Các điều kiện phân lập, nuôi cấy, bảo quản giống đơn giản không tốn kém nhiều phù hợp với điều kiện Việt Nam. Người ta thường sử dụng những giống sau: - A.suboxydans  Vikhuẩn:A.suboxydans Vi khuẩn A.suboxydans được sử dụng nhiều trong công nghệ sản xuất vitamin C. Chúng có khả năng chịu đựng được nồng độ cồn rất cao. Nếu trong môi trường, ta cho thêm một lượng nhỏ các chất dinh dưỡng cần thiết, ví dụ như glucose, vi khuẩn này có thể chuyển hóa hoàn toàn cồn thành axit axetic. Lượng axit axetic tạo được từ quá trình lên men có thể lên đến 13%.  Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn này tiến hành lên men là 28-30oC. Thời gian lên men xảy ra rất nhanh, chỉ cần 48h, lượng axit axetic có thể đạt được đến 13% Trong quá trình lên men cần phải thông khí liên tục vì vi khuẩn này cần lượng oxy rất nhiều cho quá trình chuyển hóa cồn thành axit axetic và cho quá trình phát triển. - A. aceti: Vi khuẩn: A. aceti Trực khuẩn ngắn có dạng hình que kích thước 0,4-0,8μm và 1-1,2μm, không di động thường xếp thành chuỗi dài. Gram âm, màu vàng với thuốc nhuộm iod. Chúng tạo thành khuẩn lạc to, sáng trên gellatin với dịch lên men chứa 10% đường saccharose, tạo thành màng dày nhẵn, không được nâng lên theo thành bình, có khả năng phát triển trên môi trường có nồng độ rượu khá cao (11%), có khả năng tích lũy 6% axit axetic. Nhiệt độ thích hợp phát triển 34oC. Nếu nhiệt độ cao quá 43oC sẽ gây ra hiện tượng co tế bào và tạo thành hình quả lê. Thường phát triển trên bia. - A. xylinum Vi khuẩn :A. xylinum xylium  Trực khuẩn dạng hình que 2 μm, đứng riêng rẽ hay xếp thành chuỗi không di động. Các tế bào được bao bọc bởi chất nhầy, tạo váng nhẵn khá dày, bắt màu xanh với thuốc nhuộm iod và H2SO4 (phản ứng của hemicellulose) vì váng có chứa hemicellulose, có thể oxy hóa  rượu tạo 4.5% axit axetic trong môi trường, ngoài ra chúng còn có khả năng oxy hóa tiếp axit axetic thành CO2 và H2O. - A. pasteurianum Trực khuẩn ngắn, hình thái gần giống A. aceti, nhưng khi ta nhuộm chúng với iot, tế bào sẽ cho màu xanh.  Khả năng chịu nổng độ cồn của chúng thấp hơn của A. aceti. Trong điều kiện môi trường phát triển thuận lợi, chúng có khả năng tạo được 5-6% axit axetic. - A. orleaneuse Hình thái vi khuẩn này giống hai vi khuẩn trên, nhưng lại có kích thước nhỏ hơn nhiều. Đặc biệt hai đầu của tế bào thường nhỏ lại. Nhiều trường hợp người ta lẫn lộn vi khuẩn này với vi khuẩn kỵ khí Clostridium. Trong dịch nước cấy, chúng thường tạo ra một váng rất mỏng trên bề mặt. Váng vi khuẩn thường rất chắc, khi nhuộm với iot, tế bào sẽ chuyển sang màu vàng. Vi khuẩn này chịu đựng được lượng cồn đên12%V, và trong điều kiện lên men thích hợp, chúng có thể tạo ra được 9,5% axit axetic. Vi khuẩn này thuộc vi khuẩn hình que, nhưng kích thước của chúng dài hơn các giống đã trình bày ở trên. Chúng không tạo bào tử, không có khả năng chuyển động và thuộc vi khuẩn gram (-).  Khi phát triển ở môi trường lỏng, chúng tạo ra lớp màng dày nhưng không chắc. Ở các nước Trong điều kiện môi trường thuận lợi, chúng có khả năng tạo được 11-12% axit axetic.   - A. curvum Trong môi trường lên men thuận lợi, vi khuẩn này có thể tạo ra được 10-11% axit axetic. Vi khuẩn A. curvum tạo váng rất chắc trên bề mặt môi trường. Nhiệt độ lên men tối ưu của vi khuẩn này là 35-37oC. 2.5 Anh hưởng của các điều kiện môi trường dinh dưỡng tới quá trình lên men axetic 2.5.1 Anh hưởng độ thoáng khí Lượng oxy cần thiết lớn gấp 2 lần lượng oxy lý thuyết, càng thoáng khí năng suất càng cao. Ở phương pháp chậm do bề mặt tiếp xúc giữa tế bào và không khí bị hạn chế bở sự bao phủ bề mặt dịch lên men của lớp váng giấm và độ dày lớp dung dịch. Vì vậy mà quá trình lên men kéo dài 3-5 tuần, nồng độ giấm thu được 3-7% axetic. Phương pháp tuần hoàn tạo bề mặt tiếp xúc lớn, quá trình giảm 5-7 ngày, phương pháp chìm thời gian 72-96h, nồng độ giấm 7-14%.  2.5.2 Anh hưởng nhiệt độ Acetobacter thuộc nhóm ưa ấm, nhiệt độ thích hợp cho chúng là từ 25-32oC. Nhiệt độ thấp quá trình lên men xảy ra chậm, nhiệt độ cao ức chế hoạt động và đến mức độ nào đó sẽ đình chỉ sự sinh sản của tế bào làm tăng sự tổn thất của vi khuẩn và hiệu suất của quá trình lên men giảm do sự bay hơi của axetic và etylic. Nhiệt độ thích hợp cho quá trình sản xuất giấm 22-35oC, nhiệt độ tối ưu là 18-24oC, 27-32oC. 2.5.3Anh hưởng của các nguồn C, N, P và các nguyên tố vi lượng a. Sự axit hóa của dịch lên men  Trong sản xuất giấm người ta thường cho vào cơ chất ban đầu 1 lượng giấm nhất định để axit hóa môi trường nhằm: Ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật các loại Đưa vào dịch lên men một lượng tế bào nhất định Độ axit ban đầu 2-6%. Hàm lượng cao hạn chế sự sinh trưởng của vi khuẩn và giảm khả năng lên men. Nồng độ axit axetic 8% ức chế hoạt động của vi khuẩn rất lớn. b. Hàm lượng etylic trong dịch lên men Etylic là chất sát khuẩn với vi khuẩn axetic được sử dụng như cơ chất. Hàm lượng rượu 2-10% thể tích, cao hơn làm giảm năng suất lên men. Để tránh hiện tượng oxy hoá tiếp tục axit axetic thành CO2 và H2O cần có 1 lượng rượu sót trong sản phẩm từ 0.2-0.5%, lượng rượu sót có tác dụng ức chế sự tổng hợp enzyme oxy hóa axit axetic và muối axetate. c. Các chất C, N, P và nguyên tố vi lượng Để quá trình oxy hóa xảy ra nhanh trong dịch lên men cần bổ sung 1 số muối khoáng (NH4)2SO4, KH2PO4, CaHPO4, FeCl3… tùy theo nhu cầu cụ thể từng loài. Ngoài ra trong môi trường dinh dưỡng còn được bổ sung vitamin, chất kích thích sinh trưởng như pepton, cao nấm men… Trong môi trường dinh dưỡng còn được bổ sung sake, muối đậu nành, axit lactic, glycerine.   Chương 3:  BẢN CHẤT SINH HÓA Lên men axetic là quá trình oxy hóa rượu thành axit axetic, nhờ vi khuẩn axetic, trong điều kiện hiếu khí. Phương trình tổng quát:  C2H5OH + O2                           CH3COOH + H2O + 117 Kcal  Phản ứng xảy ra trong tế bào của vi khuẩn. Muốn phản ứng được xảy ra, C2H5OH va O2 phải được thẩm thấu vào trong tế bào. Khi đó các enzyme oxy hóa có trong tế bào của vi khuẩn tham gia oxy hóa rượu tạo thành CH3COOH. CH3COOH được tạo thành sẽ thoát ra khỏi tế bào và tan trong dung dịch môi trường. Ethanol C2H5OH O2 CH3COOH CH3COOH Môi trường Tế bào   Hình 3.1 Quá trình oxy hóa rượu thành axit axetic Trong sự oxy hóa ethanol thành axit axetic, chuyển hóa thực chất là 1 sự sử dụng cơ chất. Ở đây NADPH2 xuất hiện được chuyển hóa qua chuỗi hô hấp để thu năng lượng, song cơ chất không bị phân giải hoàn toàn do vậy quá trình cũng còn được gọi là sự oxy hóa không hoàn toàn. Loại chuyển hóa này có thể trải qua nhiều bước. Các đại diện của vi khuẩn axetic (Acetobacter, gluconobacter) oxy hóa không chỉ etanol mà cả 1 phổ rộng các rượu bậc 1, 2 cũng như các polyol. Người ta phân biệt các loài vi khuẩn mà sản phẩm của chúng được giữ lại được gọi là các loài oxy hóa thấp (suboxidant), thuộc về nhóm này có vi khuẩn acetic tạm thời sau đó lại bị oxy hóa tiếp được xếp vào nhóm oxy hóa cao (peroxidant) chẳng hạn A.peroxidans, A. pasteurianum, giữa 2 nhóm này có sự chuyển tiếp. Sản xuất giấm Các phản ứng được dùng để sản xuất giấm ăn nhờ A. suboxidans  CH3CH2OH CH3CHO + 2H Sau sự hydrate hóa acetaldehyde sẽ diễn ra 1 loại H2 lần thứ 2  CH3CH(OH)2 CH3COOH + 2H Hidro được NADP nhận và qua các citochrome được chuyển đến O2 là chất nhận điện tử cuối cùng. Chương 4: KỸ THUẬT SẢN XUẤT AXIT AXETIC 4.1.Những yêu cầu kỹ thuật 4.1.1.Nồng độ axetic Axit axetic sinh ra sẽ gây ảnh hưởng ức chế đến sinh lý của vi khuẩn axetic. Nếu nồng độ của axit axetic đạt 8% sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn và nếu nồng độ axit axetic 12-14% sẽ ức chế toàn bộ của vi khuẩn.  4.1.2.Nồng độ rượu Tùy từng loại mà chúng có khả năng tồn tại ở những nồng độ rượu khác nhau. Thông thường người ta sử dụng nồng độ rượu từ 11-13%. Nếu trong môi trường không có rượu thì vi khuẩn tiếp tục oxy hóa axit axetic để thu nhận năng lượng dùng cho sự sống. Vì thế đây là một quá trình có hại. Trong sản xuất, người ta thường giữ lại độ rượu trong môi trường là 0,3-0,5%.  4.1.3.Nhiệt độ Tùy theo từng loài mà nhiệt độ tối ưu cho quá trình oxy hóa. Nhưng trong sản xuất, người ta dùng những loài vi sinh vật thích ứng cho quá trình oxy hóa là 30-40oC.  4.1.4.Độ thoáng khí Oxy là một yếu tố quan trọng cho quá trình lên men giấm. Quá trình oxy hóa chỉ xảy ra khi trong môi trường vi khuẩn được tiếp xúc với không khí. Càng được thoáng khí khả năng oxy hóa càng tốt. Trong môi trường dinh dưỡng, ngoài rượu ra cần có các chất vô cơ, gluxit và các hợp chất hữu cơ chứa nito dễ hấp thụ. Khi sử dụng một hectolit rượu cần 25g supepphosphat, 25g sunphat amon, 0,9g K2CO3 và 500g glucose hoặc tinh bột được thủy phân. RƯỢU TRẮNG 4.2 Qui trình làm giấm  NƯỚC ĐÓNG CHAI LÃO HOÁ SẢN PHẨM BẢO QUẢN LÊN MEN TRỘN ĐỀU GIỐNG VI SINH VẬT ĐƯỜNG 4.3 .Các phương pháp lên men ACETOBACTER ORLEANEUSE AXIT AXETIC 4.3.1.Phương pháp lên men chậm SẢN PHẨM THÙNG GỖ 250-300L LÊN MEN Phương pháNƯỚC NHO p này được người Pháp thực hiện từ rất lâu và được coi như là phương pháp truyền thống của người Pháp. Nguyên liệu dùng để sản xuất axit axetic là nước nho. Giống vi khuẩn axetic được sử dụng cho quá trình sản xuất là Acetobacter orleaneuse. Người ta thường cho vào thùng lên men bằng gỗ có dung tích 250-300 l bằng gỗ sồi hình tang trống 1/5 thể tích lượng axit axetic và sau đó cho vào thùng dung dịch nước ép nho sao cho toàn bộ khối lượng đạt ½ thể tích thùng lên men ( hoặc 2/3 thể tích thùng lên men). Sở dĩ người ta cho axit axetic trước để tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển, mặt khác để ngăn ngừa các vi khuẩn khác phát triển, không bị nhiễm. Tiến hành quá trình lên men ở nhiệt độ thường. Sau một thời gian, trên bề mặt sẽ tạo thành váng chứa nhiều axit axetic. Vì thế mà quá trình oxy hóa xảy ra chậm và kết thúc sau vài tuần. Khi kiểm tra rượu còn lại 0.3-0.5% sẽ lấy giấm ra, cho dịch dinh dưỡng mới vào. Nếu để lâu, chất lượng giấm bị giảm nhanh do quá trình oxy hóa giấm xảy ra tiếp tục. Giấm thu đuợc thường có lượn axit 5-6%. Muốn để lâu phải đem thanh trùng Pasto. THỔI KHÍ TỪ DƯỚI LÊN GIỐNG VK AXETIC OXY HÓA RƯỢU DÒNG MÔI TRƯỜNG TỪ TRÊN XUỐNG NƯỚC VÔ TRÙNG LỚP PHOI BÀO AXIT AXETIC 3-5% 4.3.2. Phương pháp lên men nhanh THU NHẬN ĐÁY THIẾT BỊ LÊN MEN CH3COOH Phương pháp này do người Đức thực hiện theo qui mô công nghiệp.  Thiết bị lên men là một thùng gỗ cao 2,5-6m, có đường kính 1,2-3m. Tỷ lệ đường kính đáy so với chiều cao khoảng ½ là thích hợp nhất. Trong thùng được chất đầy phoi bào hay lõi bắp. Phoi bào hay lõi bắp được xem như chất mang, giữ vi sinh vật trong quá trình lên men, nhờ đó mà vi sinh vật không đi theo vào sản phẩm cuối cùng. Ngoài ra, ở đáy thiết bị, người ta cho lắp một hệ thống phân phối, không khí đưa từ dưới lên. Môi trường được đưa vào từ trên xuống. Đầu tiên, người ta dùng axit axetic có nồng độ 3-5% chảy qua lớp phoi bào hay lõi bắp để vừa có mục đích thanh trùng vừa có tác dụng axit hóa vật liệu chất mang để vi sinh giống dễ thích nghi trong quá trình lên men. Sau đó, dùng nước vô trùng rửa qua và nạp giống vi khuẩn axetic vào. Vi khuẩn axetic sẽ bám vào phoi bào hay lõi bắp. Tiếp đó người ta cho dòng môi trường từ trên xuống qua hệ thống phân phối như một vòi hoa sen trong buồng tắm. Môi trường sẽ được phân phối đều khắp vật liệu phoi bào hay lõi bắp. Cùng lúc, người ta thổi khí từ dưới lên. Môi trường được đưa từ trên xuống, chảy qua lớp chất mang có chứa các tế bào vi khuẩn. Cồn sẽ thẩm thấu vào tế bào vi khuẩn, không khí được đưa từ dưới đáy thiết bị lên trên, thẩm thấu vào trong tế bào vi khuẩn. Vi khuẩn tiến hành quá trình oxy hóa rượu thành CH3COOH sẽ thẩm thấu qua màng tế bào ra ngoài và theo dung dịch xuống đáy thiết bị lên men. Người ta thu nhận từ đáy thiết bị lên men.  Quá trình lên men được thực hiện ở nhiệt độ 24-37oC. Thời gian lên men kéo dài 8-10 ngày. Trong trường hợp dịch lên men cuối cùng chứa lượng axit axetic thấp, người ta tiến hành tái lên men bằng cách bơm chúng ngược lại từ trên xuống. Ngoài ra còn có những phương pháp lên men nhanh khác: Phương pháp nhúng: người ta thiết kế thùng lên men hình trụ, bên trong lắp nhiều giỏ chứa đầy chất mang( mạt cưa, lõi bắp, than củi hay các vật liệu cellulose có khả năng giữ vi sinh vật trên đó). Các giỏ này có thể nâng lên hoặc hạ xuống được. Người ta chuẩn bị môi trường và đổ môi trường váo thùng lên men. Vi sinh vật sẽ được làm bám dính vào các vật liệu đựng trong giỏ. Giỏ chứa vật liệu có vi sinh vật sẽ được nhúng xuống dung dịch lên men rồi lại nhấc chúng lên khỏi dung dịch. Khi chiếc giỏ chứa chất mang có vi sinh vật thấm đầy môi trường và được nhấc lên không khí, quá trình oxy hóa rượu được xảy ra. Thao tác này được lặp đi lặp lại nhiều lần sẽ có tác dụng oxy hóa hết lượng cồn có trong dung dịch. Phương pháp hình trống quay: người ta thiết kế thiết bị lên men có hình trụ nằm ngang bên trong một thùng chứa dung dịch lên men hở nắp. Thiết bị hình trụ này được bọc một lớp vật liệu có khả năng thấm nước và có khả năng giữ vi sinh vật. Một nửa thiết bị này nằm trong lòng dung dịch lên men, một nửa nằm trên dung dịch lên men và được tiếp xúc với không khí. Khi vận hành, một nửa thiết bị luôn luôn được tiếp xúc với không khí. Người ta thiết kế hệ thống quay này với vận tốc rất chậm để đủ thời gian cho quá trình oxy hóa cồn thành axit axetic. 4.3.3 Phương pháp lên men chìm Người ta thiết kế hệ thống lên men axetic được gọi là acetator. Người ta cho dung dịch lên men vào thiết bị và tiến hành thổi khí rất mạnh. Khi đó trong dung dịch lên men sẽ tạo ra thể huyền phù và dung dịch lên men. Hai thể này luôn luôn được trộn lẫn nhau và như vậy, quá trình oxy hóa xảy ra rất mãnh liệt. 4.3.4 Phương pháp kết hợp: Người ta thiết kế hệ thống lên men bao gồm hai phần: phần trên là lớp đệm hay lớp chất mang chứa vi sinh vật ( giống phương pháp nhanh), lớp giữa chỉ là một thùng chứa dung dịch sau khi lên men ở phần trên chảy xuống. Dưới cùng là hệ thống thổi khí mạnh, khí sẽ được thổi qua phần dung dịch này rồi chuyển ngược lên phần trên( giống thiết bị lên men chìm). 4.4 Phương pháp nâng cao nồng độ axit axetic trong dịch lên men Hàm lượng axit axetic có trong dịch lên men thường không cao, trong khoảng 5-10%. Axit axetic có trong dịch lên men thường lẫn với các chất khác, do đó, dịch sau lên men chỉ có thể sử dụng để chế biến thực phẩm. Trong nhiều nghành cần sử dụng axit axetic, người ta yêu cầu hàm lượng axit axetic trong dung dịch phải cao và có độ tinh khiết. Chính vì thế việc nâng cao hàm lượng axit axetic trong dung dịch lên men và làm sạch axit axetic là việc làm rất cần thiết. Những phương pháp để nâng cao hàm lượng và tinh chế axit axetic:  4.4.1 Phương pháp chưng cất: Mục đích sử dụng phương pháp này để nhận axit axetic có hàm lượng cao hơn. Phương pháp này rất đơn giản và dễ thực hiện. Tuy nhiên, phương pháp này thường tiêu hao nhiều năng lượng và hàm lượng axit axetic thường không cao. 4.4.2 Phương pháp chưng cất bằng muối: Người ta sử dụng một cấu tử có khả năng phân ly mạnh làm thay đổi trạng thái cân bằng lỏng-hơi. Trong chưng cất có sự tham gia của muối CaCl2 hoặc CH3COONa, hiệu suất thu nhận axit axetic thường rất cao. Phương pháp này có ưu điểm: Tốn ít năng lượng. Sản phẩm đạt độ tinh khiết cao. Tuy nhiên, phương pháp này cũng có những nhược điểm: Phải hoàn nguyên cấu tử phân ly nên tốn thiết bị và năng lượng cho quá trình này. Gây ăn mòn thiết bị. 4.4.3 Phương pháp chưng cất- trích ly: Phương pháp này được thực hiện trên cơ sở những cấu tử phân ly có độ bay hơi nhỏ hơn cấu tử đã có trong hỗn hợp. Cấu tử phân ly này sẽ kết hợp với một cấu tử có trong dung dịch tạo ra một hỗn hợp khó bay hơi và thoát ra ở dưới đáy tháp chưng cất. Cấu tử phân ly cần có tính chất hòa tan chọn lọc và không được hòa tan cấu tử cần tách. Đặc điểm của phương pháp này như sau: - Sử dụng một cấu tử trung gian để làm thay đổi độ bay hơi tương đối của các cấu tử trong hỗn hợp. - Người ta thường thu hồi cấu tử phân ly để sử dụng lại. - Các cấu tử phân ly có tính chọn lọc cao, nên trong quá trình chưng cất cần chọn đúng chất phân ly. 4.4.4 Phương pháp chưng cất chân không: Phương pháp này rất phức tạp. Tuy nhiên, phương pháp này có ưu điểm là thu nhận được sản phẩm có chất lượng cao. Chương 5: BIẾN ĐỘNG SINH HÓA 5.1 Biến động vi sinh vật  Giấm vẩn đục và giảm chua: Trong quá trình oxy hóa rượu thành giấm đôi khi gặp hiện tượng oxy hóa sâu sắc axit axetic tới CO2 và nước. Nguyên nhân là do nhiễm các nấm men tạo màng thuộc giống Candida mycoderma. Ngoài ra, còn có thể do nhiễm các vi khuẩn axetic khác như Acetobacter xylinum, Acetobacter aceti… Chúng dễ oxy hóa axit axetic. Acetobacter xylinum phát triển trong giấm tạo thành màng nhầy trên bề mặt, làm cho giấm thành phẩm có cặn nhầy. Acetobacter aceti làm vẩn đục giấm. Khi cho môi trường vào thùng lên men phân bổ không đều, tạo cho khối phoi bào có những vùng có độ axit thấp và ở đây chính là các ổ nhiễm có điều kiện cho các vi sinh vật tạp dẫn phát triển. Lươn giấm: trong thùng lên men và giấm thành phẩm hay gặp một loại giun tròn nhỏ, gọi là lươn giấm Angillula aceti. Con đực trưởng thành dài tới 1mm, con cái 1-2 mm. Lươn giấm sinh trưởng và phát triển trong những điều kiện không nghiêm ngặt. Chúng phát triển mạnh trong nồng độ giấm thấp (6% axit axetic). CÒn ở nồng độ cao (9-10%) chúng bị ức chế, nhưng không hoàn toàn ngừng sinh sản, ở nồng độ 12% chúng còn sống được 1.5 tháng, nồng độ cao hơn chúng bị chết. Lươn giấm chủ yếu sống bằng axit axetic, nhưng chúng cũng có thể ăn một phần rượu, axit axetic, đường, các chất nitơ và các chất khoáng hòa tan. Chúng không làm ảnh hưởng đến hiệu suất lên men và không độc cho người, nhưng số lượng lớn chúng làm vỡ màng giấm, làm, vẩn đục giấm.    5.2 Biến động hóa học pH giảm dần trong quá trình lên men. Rượu: nồng độ giảm nhưng sau lên men cần để lại nồng độ rượu khoảng 0.3-0.5%. Axit axetic: nồng độ tăng dần. Hàm lượng đường giảm. 5.3 Một số dạng hư hỏng axit axetic 5.3.1 Giấm bị đục và giảm độ chua Trong sản xuất giấm, thường xảy ra hai quá trình oxy hóa: Quá trình oxy hóa C2H5OH thành CH3COOH Quá trình oxy hóa CH3COOH thành CO2 và H2O Quá trình oxy hóa C2H5OH thành CH3COOH là quá trình có lợi cho sản xuất. Quá trình oxy hóa CH3COOH thành CO2 và H2O là quá trình có hại cho sản xuất. Trong quá trình oxy hóa này có thể xảy ra hai hướng: oxy hóa hóa học và oxy hóa sinh học. Oxy hóa sinh học chuyển CH3COOH thành CO2 và H2O xảy ra do nấm men Candida(mycoderma), Acetobacter xylinum, Acetobacter aceti gây ra. Các giống vi sinh vật này có khả năng tạo màng nhầy làm cho giấm đục và tạo cặn. 5.3.2 Hiện tượng lươn giấm Lươn giấm có tên khoa học là Angiullula aceti. Chúng thuộc loại động vật như giun tròn, rất nhỏ, có màu hồng. Con đực ở tuổi trưởng thành có kích thước 1mm, con cái ở tuổi trưởng thành có kích thước 1-2 mm. Nếu nồng độ giấm 9%, chúng bị ức chế và không thể phát triển được. Lươn giấm thường sử dụng vi khuẩn axetic như nguồn dinh dưỡng. Tuy nhiên, chúng cũng có khả năng sử dụng C2H5OH, CH3COOH, đường, các chất hữu cơ chứa nito để phát triển. Chúng thường không gây độc cho người mà chỉ gây đục giấm và làm giảm hiệu suất lên men. 5.3.3 Bọ giấm Trong sản xuất giấm, người ta thường thấy hai loại bọ giấm. Loại to, màu trắng, có kích thước 0,8-1,5 mm. Loại nhỏ, màu nâu, có kích thước 0,3-0,4 mm. Bọ giấm làm thay đổi chất lượng của giấm. Nhiều khi bọ giấm xuất hiện với một lượng 5.3.4 Ruồi giấm Ở những cơ sở sản xuất giấm, người ta thường thấy có rất nhiều ruồi giấm. Ruồi giấm thường có màu nâu đỏ, có kích thước khoảng 2,5-3 mm. Ruồi giấm thường phát triển ở phần trên, phần dưới của thiết bị lên men. Chúng làm giảm axit axetic, sinh ra những ấu trùng ăn vi khuẩn lactic và thường là vật trung gian lây nhiễm các vi sinh vật gây hại giấm. Chúng phát triển  mạnh khi có sự oxy hóa mạnh. Chúng đồng hóa rượu, axit axetic và các loại vi khuẩn .  Chương 6 MỘT SỐ ỨNG DỤNG QUAN TRỌNG CỦA AXIT AXETIC 6.1 Ứng dụng trong chế biến mủ cao su Trong sản xuất mủ cao su, người ta rất sợ hiện tượng đông đặc của mủ trước khi đưa đi chế biến. Để chống đông mủ cao su, người ta thường dùng NH3 3%. Lượng NH3 được sử dụng tùy theo loại mủ đem sơ che. Mủ đổ xông khói, người ta sử dụng lượng NH3 là 0,6-1g/l mu. Mủ đánh đông không pha loãng, người ta thường sử dụng lượng NH3 là 0,3-0,6g/l. Khi đổ mủ vào xô hoặc thùng chứa, người ta thường dùng NH3 để chống đông. Theo đó, mủ được pha loãng với nước đến độ cao su thô ( DRC) khoảng 14%, pH=4,7. Tuy nhiên, tùy theo hệ thống máy cán, người ta có thể thay đổi pH hoặc độ cao su thô cho thích hợp. Sau khi pha loãng và khuấy trộn mủ với NH3, người ta cho thêm vào dung dịch axit axetic 2,5% với lượng là 3,5- 10kg/tấn dung dịch mủ cao su, khi cho axit vào người ta khuấy liên tục. Nhu cầu về axit axetic trong chế biến mủ cao su là hết sức lớn. Hiện nay, nước ta vẫn phải nhập axit axetic từ bên ngoài. 6.2 Ứng dụng axit axetic trong công nghệ thực phẩm Với hàm lượng axit axetic từ 5-10%, người ta gọi dung dịch này là dầu ăn. Dầu ăn được sử dụng trong công nghệ thực phẩm để chế biến đồ hộp rau, quả, gia vị trong các bữa ăn gia đình. Lượng dầu ăn được sử dụng trong công nghệ thực phẩm rất lớn, do đó, việc sản xuất dầu ăn không chỉ mang tính chất thủ công mà đã trở thành một ngành sản xuất theo qui mô công nghiệp ở nhiều nước trên thế giới.  6.3 Ứng dụng trong công nghiệp khác Axit axetic còn được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như công nghiệp sản xuất chất màu, dung môi hữu cơ, tổng hợp chất dẻo tơ sợi. Những ngành sản xuất này đòi hỏi lượng axit axetic nhiều và có chất lượng cao hơn dung dịch axit axetic dùng trong công nghệ thực phẩm và trong công nghệ chế biến mủ cao su.  TÀI LIỆU THAM KHẢO Kiều Hữu Anh, “ Giáo trình vi sinh vật công nghiệp”, NXB Khoa học và kĩ thuật 1999 Nguyễn Đức Lượng, “Công nghệ vi sinh vật” tập 1, NXB Quốc gia TpHCM, 2004 Nguyễn Đức Lượng, “ Công nghệ vi sinh” tập 2, “ Vi sinh vật học công nghiệp”, NXB Đại học Quốc gia Tp.HCM, 2002 Nguyễn Hữu Phúc, Các phương pháp lên men thực phẩm truyền thống ở Việt Nam và các nước trong vùng, NXB Nông nghiệp,1998 Đinh Thị Kim Nhung, “ Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Acetobacter và ứng dụng trong lên men axetic theo phương pháp chìm”, Luận án phó tiến sĩ năm 1996. Lương Đức Phẩm, “Công nghệ vi sinh vật”, NXB Nông nghiệp 2004 Lý Bích Thân và các tác giả, “Trứng và giấm-Khả năng trị bệnh kì diệu”, NXB Thanh niên 2000