Đề tài Vai trò của glucide và protein trong sự phát triển của vi sinh vật

Vi sinh vật học thực phẩm Chương 1. Vai trò của glucide với VSV 4 BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BỘ MÔN: VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM  ĐỀ TÀI: VAI TRÒ CỦA GLUCIDE VÀ PROTEIN TRONG SỰ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT TP.HỒ CHÍ MINH - 2012 Vi sinh vật học thực phẩm Chương 1. Vai trò của glucide với VSV 5 CHƯƠNG 1. VAI TRÒ CỦA GLUCIDE TRONG SỰ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT 1.1. Định nghĩa Glucide Glucide (carbonhydrate) là một nhóm các chất hữu cơ phổ biến trong cơ thể động thực vật và vi sinh vật. Trong đó glucide có nhiều nhất là trong thực vật, chiếm khoảng 80% khối lượng khô của thực vật. Glucide có bản chất hóa học là polyhydroxy aldehyde hoặc polyhydroxy ketone. Đa số các glucide có công thức tổng quát là (Cm(H2O)n). Ngoài ra còn có một số loại glucide đặc biệt, trong cấu trúc của chúng ngoài C, H, O còn có thêm S, N, P. Glucide được chia làm ba nhóm chính: monosaccharide, oligosaccharide, polysaccharide. - Monosaccharide (đường đơn), có chứa 1 đơn vị carbonhydrate C6H12O6, thường gặp là glucose, fructose và galactose. - Oligosaccharide có chứa ít hơn 10 đơn vị carbonhydrat, thường gặp nhất là các chất như sau:  Các disaccharide (đường đôi) là saccharose (sucrose), maltose, lactose...  Trisaccharide là raffinose,...  Tetrasaccharide là stachyose,... - Polysaccharide chứa n monosaccharide. Các polysaccharide khó hòa tan trong nước hơn là các mono – và các oligosaccharide. Thường gặp nhất là tinh bột, cellulose và pectin. Glucide có vai trò rất quan trọng trong cơ thể sống. Glucide có vai trò như sau: - Tham gia mọi hoạt động của tế bào. Vi sinh vật học thực phẩm Chương 1. Vai trò của glucide với VSV 6 - Là nguồn chất dinh dưỡng dự trữ để huy động, cung cấp chủ yếu các chất trao đổi đổi trung gian và năng lượng cho tế bào. - Tham gia vào cấu trúc của thành tế bào thực vật vi khuẩn: hình thành bộ khung (vỏ) của nhóm động vật có chân khớp. - Tham gia vào thành phần cấu tạo của nhiều chất quan trọng như: DNA, RNA,... 1.2. Các quá trình trao đổi chất ở vi sinh vật Trao đổi chất là quá trình gồm các phản ứng hóa học do tế bào thực hiện và gồm hai loại: các phản ứng giải phóng năng lượng và các phản ứng thu năng lượng. Năng lượng tế bào sử dụng đi theo hai hướng chính: hướng tổng hợp các chất xây dựng vật chất cấu trúc tế bào (vỏ nhầy, tiên mao, vách, màng, bào quan, nhân...) và hướng cung cấp năng lượng cho các hoạt động sống (di động, bài tiết, tiếp hợp,...). Các quá trình trao đổi chất được chia làm hai nhóm lớn: - Quá trình dị hóa (catabolism) nhằm phân hủy các phân tử hữu cơ phúc tạp để thu nhận năng lượng dưới dạng ATP và lực khử. - Quá trình đồng hóa (anabolism) sử dụng năng lượng và lực khử để xây dựng các phân tử hữu cơ phức tạp, đặc thù và cần thiết. Một trong các con đường trao đổi chất quan trọng là đường phân (glycolysis), con đường này không cần oxy. Mỗi phân tử glucose trải qua con đường này sẽ tạo thành bốn phân tử ATP và đây là phương thức thu nhận năng lượng chính của các vi khuẩn kị khí. Đối với các vi sinh vật hiếu khí, các phân tử pyruvat, sản phẩm của đường phân, sẽ tham gia vào chu trình Krebs (hay còn gọi là chu trình TCA) để phân hủy hoàn toàn thành CO2 và H2O, đồng thời thu nhận thêm nhiều ATP. Ở sinh vật Eukaryote, chu trình TCA tiến hành trong ti thể trong khi sinh vật prokaryote lại tiến hành ở ngay tế bào chất liên kết với màng tế bào. Vi sinh vật học thực phẩm Chương 1. Vai trò của glucide với VSV 7 1.2.1. Sự phân giải glucide Nguyên liệu glucide trong thực phẩm ở dạng tinh bột hoặc các loại đường trong đó các loại đường thường dễ được vi sinh vật sử dụng nhất. Glucose là loại đường đơn cấu thành tinh bột, rất phổ biến trong tự nhiên. Các vi sinh vật khác nhau thì có những con đường chuyển hóa glucose khác nhau, có khi hoạt động cùng lúc. Ở vi khuẩn nhân thật hầu hết glucose đều được chuyển hóa thông qua con đường đường phân (glycolysis). Sản phẩm của con đường đường phân là pyruvat. Pyruvate tiếp tục được chuyển hóa tùy thuộc vào hệ enzyme của vi sinh vật. Nếu vi sinh vật hoạt động trong điều kiện hiếu khí thì pyruvate sẽ bị oxi hóa hoàn toàn theo chu trình TCA thành CO2 và H2O. Nếu vi sinh vật hoạt động trong điều kiện kị khí thì pyruvate sẽ được chuyển hóa theo con đường lên men và tùy thuộc vào hệ enzyme từng loài mà có các sản phẩm lên men khác nhau. 1.2.2. Các con đường phân giải glucide ở vi sinh vật Sự phân cắt glucose bao gồm các giai đoạn: hầu hết các vi sinh vật phân cắt glucose theo con đường glycolysis tùy thuộc vào từng loại vi sinh vật và điều kiện sống mà có thể glucose theo con đường pentose – phosphate hoặc con đường ED (KDPG), vận chuyển pyruvat đến acetyl – CoA, chu trình Krebs, và chuỗi chuyền điện tử. 1.2.2.1. Con đường đường phân (con đường Embden – Meyerhof – Parnas pathway) Đây là con đường phổ biến nhất dùng phân giải glucose thành pyruvate trong giai đoạn hai của dị hóa. Đường phân gặp ở tất cả các nhóm chủ yếu của vi sinh vật và hoạt động trong sự có mặt cũng như vắng mặt của oxy. Quá trình này diễn ra trong phần nền tế bào chất của cơ thể nhận nguyên thủy và nhân thật. Vi sinh vật học thực phẩm Chương 1. Vai trò của glucide với VSV 8 Đường phân có thể được chia thành hai phần. Trong chặng mở đầu 6-carbon glucose được phosphoryl hóa hai lần, cuối cùng được chuyển thành fructose – 1,6 – biophosphate. Các đường khác thường nhập vào con đường đường phân thông qua việc chuyển hóa thành gluco – 6 – phosphate hoặc fructo– 6 – phosphate. Chặng mở đầu này không sinh năng lượng, trái lại phải tiêu thụ hai phân tử ATP cho một phân tử glucose. Tuy nhiên, nhờ việc gắn phosphate vào mỗi đầu của đường mà các phosphate này sẽ được dùng để tạo ATP. Chặng 3 – carbon của đường phân bắt đầu khi enzyme fructo – 1,6 – bisphosphate aldolase xúc tác phân giải fructo– 1,6 – bisphosphate thành hai nửa, mỗi nửa đều chứa nhóm phosphate. Một trong các sản phẩm là glyceraldehyde-3-phosphate được chuyển trực tiếp thành pyruvate trong quá trình gồm năm bước. Sản phẩm thứ hai là dihydroxyacetone-phosphate có thể dễ dàng chuyển thành glyceraldehyde-3- phosphate, do đó cả hai nữa của fructo-1,6-bisphosphate đều được sử dụng trong chặng 3-carbon. Trước hết, glyceraldehyde-3-phosphate bị oxi hóa nhờ AD+ là chất nhận electron, đồng thời một nhóm phosphate được gắn vào để tạo thành 1,3-bisphosphate glycerate là một phân tử cao năng. Sau đó phosphate cao năng ở carbon 1 được chuyển cho ADP và xuất hiện ATP. Việc tổng hợp ATP nói trên được gọi là phosphoryl hóa ở mức độ cơ chất vì quá trình phosphoryl hóa ADP liên kết với sự phân giải ngoại năng của một phân tử cơ chất cao năng. Một quá trình tương tự tạo thành một phân tử ATP thứ hai cũng nhờ phosphoryl hóa ở mức độ cơ chất. Nhóm phosphate trên 3-phosphorusglycerate được chuyển sang carbon 2 và 2-phosphorusglycerate bị loại nước để tạo thành một phân tử cao năng thứ hai là phosphorusenol pyruvate. Phân tử này chuyển nhóm phosphate sang ADP tạo thành một ATP thứ hai và pyruvate là sản phẩm cuối cùng của con đường đường phân. Vi sinh vật học thực phẩm Chương 1. Vai trò của glucide với VSV 9 Hình 1.1. Con đường đường phân (glycolysis/EMP) Con đường đường phân phân giải một glucose thành hai pyruvate qua chuỗi phản ứng mô tả trên. ATP và NADH cũng được tạo thành. Sản lượng của ATP và NADH có thể tính được khi xem xét hai chặng riêng rẽ. Trong chặng 6-carbon hai ATP được dùng để tạo thành fructo-1,6-bisphosphate. Vì 2 glyceraldehyde-3-phosphate xuất hiện từ một glucose (1 từ dihydroxyacetone-phosphate) chặng 3-carbon tạo thành 4 ATP và 2 NADH từ 1 glucose. Nếu trừ ATP dùng trong chặng 6-carbon ta sẽ được sản Vi sinh vật học thực phẩm Chương 1. Vai trò của glucide với VSV 10 lượng thực là 2 ATP/glucose. Do đó sự phân giải glucose thành pyruvate trong đường phân có thể được biểu thị trong phương trình đơn giản sau: Glucose 2 2 2 2 2 2 2ADP Pi NAD Pyruvate ATP NADH H        1.2.2.2. Con đường pentose-phosphate (con đường hexo – monophosphate) Con đường này có thể được dùng đồng thời với con đường đường phân và con đường Entner -Doudoroff, diễn ra trong điều kiện hiếu khí cũng như kị khí và có vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp cũng như phân giải. Con đường pentose-phosphate bắt đầu với việc oxy hóa gluco-6-phosphate thành 6-phosphorus-gluconat, tiếp theo là oxy hóa 6-phosphorusgluconat thành ribulo- 5-phosphate và CO2. (Hình 1.2) NADPH được tạo thành trong các phản ứng oxy hóa nói trên. Sau đó ribulo-5- phosphate được chuyển thành một hỗn hợp gồm các đường phosphate 3 đến 7-carbon. Hai enzyme đặc trưng của con đường đóng vai trò trung tâm trong những sự chuyển hóa này là: 1) Transketolase xúc tác chuyển nhóm ketol 2-carbon. 2) Transaldolase xúc tác chuyển nhóm 3-carbon từ sedoheptulo – 7 – phosphate với glyceraldehyde-3-phosphate (Hình 1.3). Kết quả chung là 3 gluco-6-phosphat được chuyển thành 2 fructo-6-phosphate, glyceraldehyde-3-phosphate và ba phân tử CO2 theo phương trình sau: 3 gluco-6-phosphate + 2 26 3 2 6 3 3 6 6NADP H O fructose phosphate glyceraldehyde phosphate CO NADPH H             Vi sinh vật học thực phẩm Chương 1. Vai trò của glucide với VSV 11 Các chất trung gian nói trên được sử dụng trong hai con đường. Fructo-6- phosphate có thể được chuyển trở lại thành gluco-6-phosphat, còn glyceraldehyde-3- phosphate cũng có thể trở lại con đường pentose-phosphate qua việc tạo thành gluco-6- phosphat. Điều này dẫn đến sự phân giải hoàn toàn gluco-6-phosphat thành CO2 và tạo thành một lượng lớn NADPH: Glucose-6-phosphate 2 212 7 6 12 12NADP H O CO NADPH H Pi       Con đường pentose-phosphate có một số chức năng dị hóa và đồng hóa, chẳng hạn: 1. NADPH từ con đường pentose-phosphate được dùng làm nguồn electron trong việc khử các phân tử trong sinh tổng hợp. 2. Con đường tổng hợp các đường 4-carbon và 5-carbon dùng vào một số mục đích. Đường 4-carbon erytro-4-phosphate được dùng để tổng hợp các acid amin thơm và vitamin B6 (piridoxal). Ribo-5-phosphate là thành phần chủ yếu của các acid nucleic và ribulo-1,5-diphosphate là chất nhận CO2 đầu tiên trong quang hợp. Tuy nhiên, khi một vi sinh vật đang sinh trưởng trên một nguồn carbon là pentose, con đường cũng có thể cung cấp carbon cho việc tổng hợp hexose (glucose cần cho việc tổng hợp peptidoglican). Vi sinh vật học thực phẩm Chương 1. Vai trò của glucide với VSV 12 Hình 1.2. Con đường pentose – phosphate Ở đây , 3 phân tử glucose -6- phosphate được chuyển hóa thành 2 fructo -6- phosphate và glyceraldehyde-3-phosphate. Fructo -6- phosphate được chuyển hóa trở lại thành glucose -6- phosphate. Glyceraldehyde-3-phosphate có thể được chuyển thành Pyruvate hay kết hợp với một phân tử Dihydroacetone-phosphate (từ glyceraldehyde- 3-phosphate tạo thành ở vòng thứ 2 của đường) để sản ra fructo -6- phosphate (Theo: Prescott và cs, 2005). Vi sinh vật học thực phẩm Chương 1. Vai trò của glucide với VSV 13 Hình 1.3. Các phản ứng xúc tác của Transketolase và Transaldolase 3. Các chất trung gian trong con đường pentose-phosphate có thể được dùng để tạo ATP. Glyceraldehyde-3-phosphate từ con đường có thể đi vào chặng 3-carbon của con đường đường phân và được chuyển thành ATP và Pyruvate. Pyruvate có thể bị oxy hóa trong chu trình acid tricarboxylic để cung cấp nhiều năng lượng hơn. Ngoài ra, một phận NADPH có thể được chuyển thành NADH để Vi sinh vật học thực phẩm Chương 1. Vai trò của glucide với VSV 14 sản ra ATP khi NADH bị oxy hóa trong chuỗi vận chuyển electron. Vì các đường 5-carbon là những chất trung gian trong con đường do đó con đường pentose-phosphate có thể được dùng để chuyển hóa pentosese cũng như hexose. Mặc dù có thể là nguồn năng lượng đối với nhiều vi sinh vật nhưng con đường pentose-phosphate thường có vai trò quan trọng hơn trong sinh tổng hợp. Hơn nữa, tuy cả hai con đường đường phân và pentose-phosphate đều sử dụng glucose-6-phosphate nhưng mức độ hoạt động của mỗi con đường tùy thuộc vào trạng thái sinh trưởng của tế bào. Trong giai đoạn sinh trưởng mạnh mẽ nhất hai con đường được sử dụng với tỉ lệ 2:1 (EMP : Pentose-phosphate). Tuy nhiên, khi sinh trưởng chậm lại năng lực sinh tổng hợp cũng giảm theo, đồng thời NADPH cũng như các phosphate đường C5 và C4 cấn ít hơn khiến cho tỉ lệ giữa hai con đường bây giờ trở thành 10:1 thậm chí 20:1. Phương trình tóm tắt: Glucose  2Pyruvate + ATP + NADH2 + NADPH2 1.2.2.3. Con đường Entner-Doudoroff Mặc dù đường phân là con đường phổ biến nhất dùng chuyển hóa các hexose thành Pyruvate nhưng một con đường khác, tương tự cũng đã được phát hiện. Con đường Entner-Doudoroff mở đầu với các phản ứng chi như con đường pentose- phosphate tức là tạo thành gluco-6-phosphate và 6-phosphorus-gluconat (Hình 1.4). Vi sinh vật học thực phẩm Chương 1. Vai trò của glucide với VSV 15 Hình 1.4. Con đường Entner-Doudoroff Tuy nhiên, sau đó 6-phosphorus-gluconat không bị oxy hóa tiếp mà bị loại nước tạo thành 2-keto-3-deoxy-6-phosphorusgluconat (KDPG) là chất trung gian chủ yếu trong con đường này. KDPG sẽ bị phân giải bởi KDPG aldolase thành pyruvate và glyceraldehyde-3-phosphate. Glyceraldehyde-3-phosphate được chuyển thành pyruvate ở phần cuối của con đường đường phân. Con đường Entner-Doudoroff phân giải glucose thành pyruvate, 1ATP, 1NADH và 1 NADPH. Vi sinh vật học thực phẩm Chương 1. Vai trò của glucide với VSV 16 Hầu hết vi khuẩn sử dụng các con đường đường phân và pentose-phosphate nhưng một số lại sử dụng con đường Entner-Doudoroff thay cho đường phân. Con đường Entner-Doudoroff thường gặp ở các chi Pseudomonas, Rhizobium, Azotobacter, Agrobacterium và một vài vi khuẩn gram âm khác. Trong số các vi khuẩn gram dương mới chỉ phát hiện Enterrococcus faecalis sử dụng con đường nói trên. Do con đường Entner-Doudoroff không tạo thành các phosphate đường C5 và C4 nên tế bào vẫn cần sự hoạt động đồng thời của cả con đường pentose-phosphate. Thử nghiệm đối với khả năng oxy hóa glucose bởi con đường Entner-Doudoroff đôi khi được sử dụng để xác định Pseudomonas trong phòng thí nghiệm lâm sàng. 1.2.2.4. Chu trình Acid Tricarboxylic (hô hấp hiếu khí) Mặc dù một phần năng lượng có thể thu được từ sự phân giải glucose thành pyruvate qua các con đường khác (con đường đường phân – Glycolysis/EMP, con đường Pentose Phosphate_PP, con đường 2-keto-3deoxy-6-phospho- gluconate_KDPG) nhưng phần lớn năng lượng lại được giải phóng khi pyruvate bị phân giải hiếu khí thành CO2 trong giai đoạn 3 của sự dị hoá. Phức hợp đa enzyme pyruvate dehydrogenase trước hết oxy hoá pyruvate thành CO2 và acetyl - CoA cũng là một phân tử cao năng bao gồm coenzyme A và acid acetic nối với nhau qua liên kết cao năng tiol este(Hình 1.5). Acetyl-CoA xuất hiện từ sự phân giải của nhiều hidrat carbon, lipit và các acid amin có thể bị phân giải tiếp trong chu trình Acid tricarboxylic (TCA) hoặc cũng gọi là chu trình Krebs. Cơ chất đối với chu trình TCA là Acetyl-CoA. Khi xem xét chu trình này ta cần chú ý đến các chất trung gian, các sản phNm và hoá học của mỗi chặng. Trong phản ứng thứ nhất Acetyl-CoA kết hợp với Oxaloacetate (chất trung gian 4C) thành citrat và mở đầu chặng 6C. Citrat (chứa 3 gốc COOH) được sắp xếp lại tạo thành izocitrat. Sau đó izocitrat bị oxy hoá và loại carboxyl hai lần sản ra _- ketoglutarat rồi Vi sinh vật học thực phẩm Chương 1. Vai trò của glucide với VSV 17 succinyl-CoA. Ở chặng này 2N ADH được tạo thành và 2C bị tách khỏi chu trình như CO2 (Chú ý: Ở vi khuNn phản ứng izocitrat → α-ketoglutarat sử dụng N ADP+). Vì 2C được bổ sung ở dạng Acetyl-CoA lúc ban đầu nên cân bằng được duy trì và không có carbon nào bị mất. Bây giờ chu trình đi vào giai đoạn 4C trong đó qua hai bước oxy hoá xuất hiện một FADH2 và một N ADH. N goài ra, GTP (một phân tử cao năng tương đương ATP) được tạo thành từ succinyl-CoA nhờ phosphoryl hoá ở mức độ cơ chất. Cuối cùng 0xaloacetat được tái tạo và sẵn sàng kết hợp với một phân tử acetyl- CoA khác. Từ nhận thấy chu trình TCA sản ra 2 CO2, 3 N ADH, 1 FADH2 và 1GTP đối với mỗi phân tử Acetyl-CoA bị oxy hoá. Hình 1.5. Chu trình acid tricarboxylic Chu trình có thể được chia thành 3 giai đoạn dựa vào số lượng các chất trung gian. 3 giai đoạn được tách riêng bởi 2 phản ứng loại carboxyl. (phản ứng trong đó Vi sinh vật học thực phẩm Chương 1. Vai trò của glucide với VSV 18 nhóm carboxyl bị mất đi ở dạng CO 2 . Phức hệ Pyruvate-dehydrogenase tạo thành Acetyl-CoA qua oxy hóa Pyruvate. (Theo: Prescott và cs, 2005). Đứng về mặt chức năng có thể xem chu trình TCA là con đường oxy hoá Acetyl- CoA thành CO2. Ở đây, bước đầu tiên là việc gắn nhóm acetyl vào chất mang acetyl tức là oxaloacetate để tào thành citrat. Bước thứ hai bắt đầu với citrat và kết thúc với việc tạo thành succinyl-CoA. Ở đây, phần mang acetyl của citrat mất đi 2C khi bị oxy hoá để cho 2CO2. Bước thứ ba và bước cuối cùng chuyển succinyl-CoA trở lại oxal-acetat (chất mang acetyl) rồi chất này lại kết hợp với một nhóm acetyl khác. Các enzyme của chu trình TCA gặp phổ biến trong vi sinh vật. Chu trình hoàn toàn hoạt động ở nhiều vi khuẩn hiếu khí, động vật nguyên sinh sống tự do, hầu hết tảo và nấm. Điều này là dễ hiểu vì chu trình là nguồn năng lượng rất quan trọng. Tuy nhiên, E. coli kị khí không bắt buộc không sử dụng chu trình đầy đủ trong điều kiện kị khí hay khi nồng độ glucose cao nhưng sử dụng chu trình đầy đủ trong những trường hợp khác. Mặc dù thiếu chu trình hoàn chỉnh nhưng E. coli thường vẫn có hầu hết các enzyme củaTCA vì một trong các chức năng chủ yếu của chu trình này là cung cấp bộ khung carbondùng cho sinh tổng hợp. Tóm tắt chu trình: Hô hấp hiếu khí sẽ oxy hóa glucose thành CO2 và H2O đồng thời giải phóng 38ATP trong điều kiện có O2. Vi sinh vật học thực phẩm Chương 1. Vai trò của glucide với VSV 19 Bảng 1.1. Một số vi sinh vật tham gia phân giải hexose thông qua ba con đường STT TÊN VI SINH VẬT EMP (%) HMP (%) ED (%) 1 Saccharomyces cerivisiae 88 12 - 2 Candida utilis 66 – 81 19 – 34 - 3 Streptomyces griseus 97 3 - 4 Penecillium chrysogenum 77 23 - 5 Escherichia coli 72 28 - 6 Pseudomonas saccharophila - - 100 7 Bacillus subtilis 74 26 - 8 Gluconobacter oxydans - 100 - 9 Alcaligenes eutrophus - - 100 10 Zymomonas mobilis - - 100 11 Sarcina lutea - - 100 12 Pseudomonas aeruginosa - 29 71 Vi sinh vật học thực phẩm Chương 2. Vai trò của protein với VSV 20 CHƯƠNG 2. VAI TRÒ CỦA PROTEIN TRONG SỰ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT 2.1. Định nghĩa protein Protein là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà các đơn phân là các axit amin. Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptide (gọi là chuỗi polypeptide). Các chuỗi này có thể xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu trúc không gian khác nhau của protein. 2.2. Sự phân giải protein ở vi sinh vật (quá trình thối rữa) Quá trình thủy phân các protein dưới tác dụng của vi sinh vật gọi là quá trình thối rữa. Quá trình này rất quan trọng trong vòng tuần hoàn vật chất. Sản phẩm làm thối rữa có thể làm ô nhiễm môi trường sống và các vi sinh vật gây thối rữa là nguyên nhân chính gây hư hỏng thực phẩm giàu protein. Muốn phân giải protein, cũng giống như đối với các hợp chất cao phân tử khác, đầu tiên vi sinh vật phải tiết ra các enzyme phân giải protein ngoại bào và làm chuyển hóa protein thành các hợp chất có phân tử nhỏ hơn (các polipeptit và các oligopeptit). Các chất này hoặc tiếp tục được phân hủy thành axit amin nhờ các peptidaza ngoại bào, hoặc được xâm nhập ngay vào tế bào vi sinh vật sau đó mới chuyển hóa thành axit amin. Một phần các axit amin này được vi sinh vật sử dụng trong quá trình tổng hợp protein của chúng, một phần khác được tiếp tục phân giải theo những con đường khác nhau để sinh NH3, CO2 và nhiều sản phẩm trung gian khác. Những vi sinh vật không có khả năng sinh ra các enzyme phân giải protein ngoại bào rõ ràng là không có khả năng đồng hóa được các loại protein thiên nhiên. Vi sinh vật học thực phẩm Chương 2. Vai trò của protein với VSV 21 Chúng chỉ có thể sử dụng được các sản phẩm thủy phân của protein (polipeptit, oligopeptit, axit amin). Vi sinh vật là tác nhân chủ yếu gây thối rữa, bao gồm hai nhóm, một nhóm là những vi sinh vật tồn tại trong nguyên liệu trong quá trình sinh sống, còn một nhóm là do ô nhiễm trong quá trình bảo quản và chế biến. Rất nhiều loài vi sinh vật khác nhau tham gia vào quá trình phân giải protein, đáng chú ý nhất là các loại sau: VI KHUẨN: Bacillus mycoides, B. mesentericus, B. subtilis, B. cereus, B. megaterium, B. histoliticus, Proteus vulgaris, Chromobacterium prodigiosum, Pseudomonas fluorescens, P. aeruginosa, P. putreficans, E. coli, C. sporogenes, C. welchii… XẠ KHUẨN VÀ NẤM: Streptomyces griseus, S. rimosus, S. fradiae, Aspergillus oryzae, A. flavus, A. terricola, A. niger, A. saitoi, A. awamori, A. alliaceus, Penicillium camemberti, Ceplialothecium, spp., Rhizopus, spp., Mucor, spp., Gliocladium roseum… Trong cơ thể vi sinh vật, các axit amin thường được chuyển hóa nhờ quá trình khử amin, và quá trình khử cacboxyl hoặc đồng thời vửa khử amin vừa khử cacboxyl. Sản phẩm quá trình thối rữa tùy thuộc vào từng loại vi sinh vật, phụ thuộc vào tính chất của protein, vào độ thoáng khí, độ ẩm và nhiệt độ. Trong quá trình thối rữa chủ yếu là phân hủy các axit amin thành các chất cấp thấp như indol, skatol, phenol, các loại axit có đạm, axit béo cấp thấp, H2S, CH4, NH3, CO2… nhưng cũng còn phân giải, phân hủy các chất khác. Quá trình thối rữa không phải dựa theo một quy luật mà do các điều kiện thích hợp hiện tại quyết định. Những tác dụng oxi hóa khử hoặc do những chất bị phân giải ra, lại hợp thành những chất khác… thường thường thì rất nhiều sự biến hóa lẫn lộn với Vi sinh vật học thực phẩm Chương 2. Vai trò của protein với VSV 22 nhau khó mà tìm ra được quy luật đặc trưng nhưng cũng có những sự biến hóa đơn độc. Trong sản phẩm thối rữa có chất độc tồn tại cho nên khi ăn phải những sản phẩm đó sẽ bị trúng độc. Một số chất độc hay thấy nhiều nhất là histamin, methylamin, một số chất khác ít hơn là cholin, muscarin, tyramin, cadaverin, putrescin, monoamin…… và một số chất khác, cá biệt như: Gadinin (ܥ଻ܪଵ଻ܱଶ) tìm thấy trong thịt cá tuyết thối rữa. Paridin (ܥଽܪଵଷܰ) trong cá thu, ngừ thối rữa. Coridin (ܥଵ଴ܪଵହܰ) có trong thịt cua thối rữa. Sardinin (ܥଵଵܪଵଵܱܰଶ) có trong thịt cá trích thối rữa. Scombrin (ܥଵ଻ܪଷ଼ܰ) có trong thịt cá thu thối rữa. Pepton là sản phẩm phân giải chưa hoàn toàn của protein, có thể sản xuất công nghiệp nhờ enzyme pepsin thủy phân protein. Đây là hợp chất được dùng nhiều trong các phòng thí nghiệm để nuôi cấy vi sinh vật. Pepton gồm khoảng 30% acid amin tự do, phần còn lại là dipeptide, tripeptide và polypeptide hòa tan trong nước, nhưng không còn bị kết tủa khi đun nóng hay tác dụng bởi acid. 2.3. Các ứng dụng của quá trình phân giải protein ở vi sinh vật 2.3.1. Trong sản xuất nước mắm Nước mắm là dung dịch đạm mà chủ yếu là các acid amin, được tạo thành do quá trình thủy phân protein cá nhờ hệ enzym protease có trong cá. Ngoài ra nước mắm còn dùng để chữa một số bệnh như đau dạ dày, phỏng, cơ thể suy nhược, cung cấp năng lượng. Nước mắm được sản xuất ở hầu hết các nước Châu Á. Mỗi nước có kiểu Vi sinh vật học thực phẩm Chương 2. Vai trò của protein với VSV 23 sản xuất khác nhau tạo ra sản phẩm có giá trị dinh dưỡng và giá trị cảm quan khác nhau. Hình 2.1. Sản xuất nước mắm tại Phú Quốc 2.3.1.1. Giá trị dinh dưỡng của nước mắm Các chất đạm Chiếm chủ yếu và quyết định giá trị dinh dưỡng của nước mắm như đạm tổng số (tổng lượng nitơ có trong nước mắm), đạm amin (tổng lượng đạm nằm dưới dạng acid amin), đạm amon… Ngoài ra trong nước mắm còn chứa đầy đủ các acid amin, đặc biệt là các acid amin không thay thế: valin, leucin, methionin, isoleucin, phenylalanin, alanin... Các thành phần khác có kích thước lớn như tripeptid, peptol, dipeptid. Chính những thành phần trung gian này làm cho nước mắm dễ bị hư hỏng do hoạt động của vi sinh vật. Các chất bay hơi Hàm lượng các chất bay hơi trong nước mắm mg/100g nước mắm: Vi sinh vật học thực phẩm Chương 2. Vai trò của protein với VSV 24 - Các chất cacbonyl bay hơi: 407-512 (formaldehyde). - Các acid bay hơi: 404-533 (propionic). - Các amin bay hơi: 9,5-11,3 (izopropylamin). - Các chất trung tính bay hơi: 5,1-13,2 (acetaldehyde). Mùi trong nước mắm được hình thành chủ yếu do hoạt động của vi sinh vật yếm khí trong quá trình sản xuất nước mắm tạo ra. Các chất khác Các chất vô cơ: NaCl chiếm 250-280g/l và một số các chất khoáng như: S, Ca, Mg, P, I, Br. Vitamin: B1, B12, B2, PP. 2.3.1.2. Quá trình thủy phân của cá a) Bản chất của quá trình sản xuất nước mắm Bản chất của quá trình này chính là quá trình thủy phân protein trong cá: Quá trình thủy phân protein đến acid amin là một quá trình rất phức tạp. Đặc hiệu của enzym là chỉ tác dụng lên một vài chất nào đó với vài kiểu liên kết nhất định, như enzym peptidase chỉ tác dụng lên mối nối liên kết peptid để thủy phân nối liên kết này: Vi sinh vật học thực phẩm Chương 2. Vai trò của protein với VSV 25 Sự tham gia của enzym trong quá trình thủy phân theo cơ chế xúc tác: ES : hợp chất trung gian giữa enzym và cơ chất. P : sản phẩm. Sản phẩm chủ yếu của quá trình phân giải protein là acid amin và các peptid cấp thấp. Sự tạo thành và chuyển biến hợp chất ES qua 3 bước:  Bước 1: Enzym kết hợp với protein tạo thành phức chất enzym protein, bước này xảy ra khá nhanh, liên kết không bền.  Bước 2: Xảy ra sự chuyển biến của các phân tử protein dẫn đến làm phá vỡ các mối liên kết đồng hóa trị tham gia vào phản ứng. Khi đó phức chất ES đồng thời xảy ra hai quá trình là sự dịch chuyển thay đổi electron, dẫn đến sự cực hóa của mối liên kết tham gia vào phản ứng và sự biến dạng hình học của nối liên kết đồng hóa trị trong phân tử protein cũng như trong trung tâm hoạt động của enzym, làm cho protein hoạt động, quá trình thủy phân dễ dàng hơn.  Bước 3: Giai đoạn tạo thành các acid amin và peptid cấp thấp, giải phóng enzym. Theo nghiên cứu của Beddow, ba bước tạo thành và chuyển hóa hợp chất ES tương ứng với 3 chặng đường biến đổi hợp chất nitrogen trong quá trình thủy phân cá.  Pha 1 (0 - 25 ngày): Có sự gia tăng thể tích của phần chất lỏng nổi ở trên bề mặt sản phẩm và protein hòa tan. Vi sinh vật học thực phẩm Chương 2. Vai trò của protein với VSV 26  Pha 2 (80 - 120 ngày): Mô tế bào bị phá vỡ, protein của tế bào trở nên tiếp xúc với enzym, sản phẩm của quá trình tự phân protein được phóng thích. Hầu như tất cả mô tế bào đều bị phân hủy và biến mất sau 120 - 140 ngày.  Pha 3 (140 - 200 ngày): Enzym phóng thích và tấn công vào các phần protein hòa tan. Đây là nguyên nhân làm thay đổi hợp chất Nitơ. 2.3.1.3. Các hệ enzyme trong sản xuất nước mắm a) Hệ enzym Metalo-protease (Aminodipeptidase): Hệ enzym này tồn tại trong nội tạng của cá và chịu được nồng độ muối cao nên ngay từ đầu nó đã hoạt động mạnh, giảm dần từ tháng thứ 3 trở về sau. Loại enzym này có hoạt tính khá mạnh, có khả năng thủy phân rộng rãi đối với các loại peptid. Đây là nhóm thủy phân enzym trung tính, pH tối thích từ 5-7, pI = 4-5, nó ổn định với ion Mg2+, Ca2+và mất hoạt tính với Zn2+, Ni2+, Pb2+, Hg2+.. b) Hệ enzym serin-protease: Điển hình là enzym tripsin, tồn tại nhiều trong nội tạng của cá. Ở giai đoạn đầu của quá trình sản xuất nước mắm hoạt động của nó yếu đến tháng thứ 2 và phát triển dần đạt giá trị cực đại ở tháng tứ 3 rồi giảm dần đến khi chượp chín (protein phân giải gần như hoàn toàn không còn ở dạng peptol). Hệ enzym này luôn bị ức chế bởi chuỗi acid amin trong cấu trúc của enzym. Để tháo gỡ chuỗi này phải nhờ đến hoạt động của men cathepsin B nhưng men cathepsin B dễ bị ức chế bởi nồng độ muối cao. Vì vậy để men cathepsin B hoạt động được người ta thực hiện phương pháp cho muối nhiều lần. Enzym serin-protease hoạt động mạnh ở pH từ 5-10, mạnh nhất ở pH=9. c) Hệ enzym acid-protease: Vi sinh vật học thực phẩm Chương 2. Vai trò của protein với VSV 27 Có trong thịt và nội tạng cá, điển hình là enzym cathepsin D. Hệ enzym này dễ bị ức chế bởi nồng độ muối khoảng 15% nên thường nó chỉ tồn tại một thời gian ngắn ở đầu thời kỳ của quá trình thủy phân. Loại men này đóng vai trò thứ yếu trong quá trình sản xuất nước mắm. 2.3.1.4. Vi sinh vật trong sản xuất nước mắm Nguồn gốc: có từ nguyên liệu, dụng cụ, thiết bị, môi trường (không khí, nước). Khi vi sinh vật xâm nhập vào chượp có các ảnh hưởng sau: - Tham gia vào quá trình thủy phân protein nhưng rất yếu vì bị ức chế bởi nồng độ muối cao. - Tham gia tích cực vào việc hình thành hương vị của nước mắm, chủ yếu là các vi sinh vật kỵ khí có khả năng sinh hương. 2.3.1.5. Phương pháp chế biến nước mắm bằng vi sinh vật Nguyên lý Sử dụng hệ enzym protease trong nấm mốc Aspergilus oryzea để thủy phân protein thịt cá thành các acid amin ở điều kiện nhiệt độ và môi trường thích hợp. Phương pháp Vi sinh vật học thực phẩm Chương 2. Vai trò của protein với VSV 28 Hình 2.2. Sơ đồ sản xuất nước mắm - Xử lý: cá phải rửa sạch bùn, đất, tạp chất, cá to phải cắt nhỏ. - Thủy phân: + Mốc: yêu cầu tốc độ sinh trưởng và phát triển nhanh, hình thái khuẩn ty to và mập, tốt nhất là sau 2 ngày ở nhiệt độ và độ ẩm thích hợp. + Tỉ lệ giữa mốc và cá từ 3-4% tính theo chế phẩm mốc thô và cá xay nhỏ trộn với mốc. + Nước cho vào 5-10% để vừa đủ ngấm mốc, giúp men hoạt động tốt, nhiệt độ thủy phân 37-41oC, thời gian 10-15 ngày chượp sẽ chín. + Muối: sử dụng muối có tinh thể nhỏ, màu sáng, độ trắng cao, không vón cục, không bị chát, lượng muối cho vào 4-6% so với khối lượng cá - Lọc: nước lọc và nước rửa bã bằng 30% so với khối lượng cá. Sau đó Vi sinh vật học thực phẩm Chương 2. Vai trò của protein với VSV 29 + Đun sôi:nhỏ lửa có tàc dụng khử mùi, vi sinh vật, chất bẩn. + Thêm muối vào để đạt đến độ mặn nước chấm. + Kéo rút dịch này qua bả chưởp tốt. * Nhược điểm: - Nước mắm không có hương vị vì thời gian sản xuất ngắn. - Nước mắm bị chua do tinh bột lên men lactic hoặc do sinh ra acid dễ bay hơi khi cá bị ươn. - Đắng do xác vi sinh vật còn tồn tại hoặc do chất lượng của muối kém, có nhiều ion Ca2+, Mg2+. 2.3.2. Trong sản xuất thực phẩm cho người Khi môi trường thiếu cacbon và thừa nitơ, vi sinh vật sẽ khử amin của acid amin và sử dụng acid hữu cơ làm nguồn cacbon, do đó có amôniac bay ra. Nhờ protease của vi sinh vật mà protein của cá, đậu tương… được phân giải tạo ra các acid amin, dùng nước muối chiết chứa các acid amin này ta được các loại nước mắm, nước chấm…sử dụng trong đời sống hàng ngày. Sản xuất tương dựa vào 2 enzim chủ yếu của nấm mốc và vi khuẩn nhiễm tự nhiên hoặc cấy chủ động vào các nguyên liệu: amylase phân giải tinh bột (trong xôi hoặc ngô) thành glucose và proteasephân giải protein (trong đậu tương) thành các acid amin. 2.3.3. Cung cấp chất dinh dưỡng cho cây trồng Nhờ các hoạt tính phân giải của vi sinh vật mà xác các động vật và thực vật trong đất được chuyển thành chất dinh dưỡng cho cây trồng. Do đó, chính vi sinh vật Vi sinh vật học thực phẩm Chương 2. Vai trò của protein với VSV 30 tạo nên độ phì nhiêu của đất. Đây cũng là cơ sở khoa học của việc chế biến rác thải thành phân bón. 2.3.4. Phân giải các chất độc Muốn tăng năng suất cây trồng, người ta phải sử dụng các chất trừ sâu, diệt cỏ, diệt nấm. Đây là các chất do con người tổng hợp ra và thường độc đối với người và động vật. Rất may, nhiều vi khuẩn và nấm có khả năng phân giải các hoá chất độc nói trên còn tồn đọng trong đất. 2.3.5. Trong bột giặt sinh học Để tẩy sạch các vết bẩn (bột, thịt, mỡ, dầu, cellulose…) trên quần áo, khăn bàn, chăn màn… người ta thêm vào bột giặt một số enzyme vi sinh vật như amylase, protease, lipase, cellulase… 2.3.6. Cải thiện công nghiệp thuộc da Để tẩy sạch lông ở bộ da động vật, trước đây người ta phải sử dụng các hoá chất vừa kém hiệu quả, vừa gây ô nhiễm môi trường. Việc sử dụng các enzymeprotease và lipase từ vi sinh vật thay cho hoá chất không những làm tăng chất lượng của da mà còn tránh được các ảnh hưởng xấu đến môi trường sống. 2.4. Tác hại của quá trình phân giải protein ở vi sinh vật Hoạt tính phân giải của vi sinh vật cũng gây nên những tổn thất to lớn cho con người. Ví dụ như: - Gây hư hỏng thực phẩm: các loại đồ ăn, thức uống giàu tinh bột và protein dễ bị ôi, thiu do bị vi khuẩn và nấm mốc phân giải. Vi sinh vật học thực phẩm Chương 2. Vai trò của protein với VSV 31 - Làm giảm chất lượng của các loại lương thực, đồ dùng và hàng hoá. Hàng năm, các loại lương thực hoa màu (gạo, đậu, ngô, khoai, sắn) bị hư hỏng sau thu hoạch do vi sinh vật gây ra là rất lớn. Nhiều đồ dùng và hàng hoá bằng nguyên liệu thực vật (quần áo, chăn, màn, chiếu, các hàng mây, tre, sách vở, tranh ảnh…) rất dễ bị mốc và làm giảm phẩm chất. Vi sinh vật có khả năng phân giải các chất phức tạp ở bên trong và bên ngoài tế bào nhờ các enzym xúc tác: protease (phân giải protein), cellulase (phân giải cellulose), lipase (phân giải lipide)… Người ta đã lợi dụng các quá trình phân giải của vi sinh vật để phục vụ cho đời sống (nếu có lợi) hoặc tìm cách kìm hãm chúng (nếu có hại). 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài Liệu Tiếng Việt [1]. Nguyễn Lân Dũng (chủ biên) - Nguyễn Đình Quyến - Phạm Văn Ty, Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, 2010 [2]. Trần Quốc Huy, Vi sinh vật học thực phẩm, Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM (Lưu hành nội bộ), 2011 [3]. Đàm Sao Mai (chủ biên) và cộng sự, Hóa Sinh Thực Phẩm, NXB ĐHQG TP.HCM, 2011