Điều chế kháng huyết thanh thỏ và khảo sát đáp ứng miễn dịch của cá rô phi đỏ đối với vi khuẩn streptococcus sp

1 I. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Theo đề án phát triển nuôi cá rô phi giai đoạn 2003 – 2010 của Bộ Thủy sản, mục tiêu đến năm 2010 nhằm tăng diện tích nuôi lên 10.000 ha, 1 triệu m3 lồng, sản lượng 200.000 tấn với giá trị xuất khẩu đạt 150 triệu USD. Trong chương trình phát triển nuôi trồng thủy sản thời kỳ 1999 – 2010, Bộ Thủy sản đã xếp cá rô phi vào vị trí hàng đầu trong các loài thủy hải sản nuôi (Trích bởi Nguyễn Thị Ngọc Bích, 2005). Trên thế giới, hiện nay cá rô phi nuôi xếp vị trí thứ ba về sản lượng, đạt 1.374.239 tấn vào năm 2002, có giá trị 1.706.538.200 USD (năm 2000) (http:// ag.arizona.edu/azaqua/ista/market/htm), dự đoán trong vài năm tới sản lượng cá rô phi nuôi sẽ đạt vị trí hàng đầu. Những thành quả đạt được và mục tiêu phấn đấu của nghề nuôi cá rô phi rất hứa hẹn nhưng cũng đặt ra nhiều vấn đề cần được giải quyết thỏa đáng. Một trong số những vấn đề đó là bệnh trên cá nuôi. Song song với sự mở rộng quy mô và áp dụng nhiều mô hình nuôi tiên tiến để nâng cao năng suất là sự gia tăng về bệnh. Bệnh là một trong những nguyên nhân chính kìm hãm sự phát triển nghề nuôi thủy sản hiện nay. Từ khi bắt đầu nghề nuôi thủy sản thâm canh, việc kiểm soát bệnh dựa chủ yếu vào các biện pháp hóa trị liệu. Tuy nhiên các biện pháp này bộc lộ nhiều nhược điểm. Điều này dẫn đến các áp lực từ phía người tiêu dùng, các tổ chức chính phủ và môi trường về nhu cầu được hưởng thụ các sản phẩm nuôi trồng an toàn về mặt vệ sinh thực phẩm và môi trường bảo đảm sản xuất bền vững. Trước các thực tế đó, việc dùng vaccine để kiểm soát bệnh là một sự lựa chọn đúng đắn. Nghiên cứu vaccine dùng trong thủy sản là sự kế thừa hợp lí nghiên cứu vaccine dùng trong chăn nuôi và chăm sóc sức khỏe con người. Bệnh do vi khuẩn Streptococcus sp. được báo cáo đầu tiên tại Nhật Bản vào năm 1958 trên loài cá hồi nuôi (Hoshina và ctv., 1958; trích bởi Yanong và Floyd, 2001) . Bệnh có tỉ lệ chết cao, có thể lên tới 100% trong vòng vài ngày phát bệnh. Hiện nay, bệnh do vi khuẩn Streptococcus sp. đã được phát hiện trên nhiều đối tượng nuôi và tại nhiều nơi trên khắp thế giới: Viễn Đông, Hoa Kỳ, Nam Phi, Trung Mỹ, Nhật, Israel, ... 2 Hiện nay trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng đáp ứng miễn dịch của cá đối với vi khuẩn Streptococcus sp. cũng như vaccine phòng bệnh trên. Một số công trình đó như: Alkhlaghi và ctv.(1996) nghiên cứu cách cấp vaccine dạng FKC có thêm chất bổ trợ; Eldar và ctv.(1997) nghiên cứu về thời gian tạo đáp ứng miễn dịch sau khi cấp vaccine ở cá hồi đạt tới 4 tháng; Eldar và ctv. (1995), Bercovier và ctv. (1997) nghiên cứu hiệu lực của vaccine phòng Streptococcus difficile; Bunch và Bejerano (1997) nghiên cứu các ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên sự nhạy cảm của cá rô phi lai do Streptococcus sp.; các công trình nghiên cứu của nhóm các nhà khoa học tại phòng thí nghiệm nghiên cứu sức khỏe động vật thủy, Bộ nông nghiệp Hoa Kỳ ( Aquatic Animal Health Research Laboratary, ARS, USDA) gồm: Shoemaker C.A., Klesius P. H., Evans J. J.. Họ đã lấy bằng sáng chế về vaccine phòng bệnh do Streptococcus iniae tại Hoa Kỳ. Tuy nhiên ở nước ta các công trình nghiên cứu về bệnh trên cá rô phi chưa nhiều, chỉ có vài công trình nghiên cứu chủ yếu tập trung vào ký sinh trùng như công trình nghiên cứu của Bùi Quang Tề và ctv. (1999; trích bởi Võ Văn Tuấn, 2005), và hầu như chưa có hoặc có rất ít công trình có tầm cỡ nghiên cứu về tác nhân vi khuẩn gây bệnh trên cá rô phi cũng như các công trình nghiên cứu về vacine và các chế phẩm miễn dịch phòng bệnh cho cá. Vì vậy để đáp ứng nhu cầu thực tiễn trong việc nuôi và phòng trị bệnh hữu hiệu , được sự phân công của Bộ môn Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nông lâm Tp. Hồ Chí Minh, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “ Điều chế kháng huyết thanh thỏ và khảo sát đáp ứng miễn dịch của cá rô phi đỏ đối với vi khuẩn Streptococcus sp. ”. 1.2. Mục tiêu: Xác định mức độ tạo đáp ứng miễn dịch của thỏ khi tiêm FKC của vi khuẩn Streptococcus sp. nhằm điều chế kháng huyết thanh thỏ kháng Streptococcus sp. dùng cho mục đích chẩn đoán. Xác định ảnh hưởng của mật độ nuôi lên đáp ứng miễn dịch và tỷ lệ cảm nhiễm của cá rô phi đỏ đối với vi khuẩn Streptococcus sp. . Xác định thời gian tạo đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá đối với vi khuẩn Streptococcus sp.. 3 II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Một số đặc điểm sinh học của cá rô phi 2.1.1. Nguồn gốc Cá rô phi có nguồn gốc từ Châu Phi. Năm 1924, cá rô phi được nuôi đầu tiên ở Kenya và sau đó nuôi rộng rãi nhiều nước ở Châu Phi và trên thế giới, nhiều nhất là những nước nhiệt đới và cận nhiệt đới. Chỉ vài chục năm gần đây, việc nuôi cá rô phi mới thực sự phát triển mạnh và trở thành một ngành nuôi có qui mô công nghiệp, cho sản lượng thương phẩm lớn và đạt hiệu quả kinh tế cao. Rô phi đỏ (Oreochromis sp.) được lai tạo từ cá bố có dạng đột biến lặn màu đỏ của loài O. mossambicus, còn mẹ thì cũng cùng giống Oreochromis nhưng có thể thuộc loài khác. Tất cả chúng đều có tên tiếng Anh chung là Red Tilapia. Rô phi đỏ được phân lập lần đầu tiên ở Đài Loan trong những năm 70 của thế kỷ trước từ thế hệ lai giữa con màu đỏ O. mossambicus với con màu đen hoang dại của rô phi sông Nile O. niloticus (Mai Chi, 2002). Cá rô phi đỏ được nhập vào nước ta từ Thái Lan năm 1985. 2.1.2. Phân loại Lớp : Osteichthyes Lớp phụ : Actynopterigii Bộ : Perciformes Bộ phụ : Perciidae Họ : Cichlidae Giống : Tilapia, Sarotherodon và Oreochromis. Việc phân loại cá rô phi dựa vào tập tính sinh sản của các loài được nhiều nhà khoa học công nhận. Ở giống Oreochromis, cá đực làm tổ và cá cái ấp trứng trong miệng. Ở giống Sarotherodon thì cả con đực và con cái đều ấp trứng ở trong miệng. Ở giống Tilapia thì cần giá thể khi đẻ trứng, cá đực và cá cái cùng tham gia bảo vệ tổ (Võ Văn Tuấn, 2005). 2.1.3. Môi trƣờng sống Các loài cá rô phi phát triển tốt ở nhiệt độ 20 – 310C, ngưỡng nhiệt độ thấp gây chết cá là 10 – 110C, chết nóng ở 420C (Theo Nguyễn Văn Tư, 2003). Môi trường 4 sống có pH thích hợp từ 6,5 – 8,5, tuy nhiên cá có thể sống ở pH = 4 và pH = 11 nhưng sinh trưởng không tốt. Rô phi sống được ở cả môi trường nước ngọt lẫn nước mặn với độ muối lên đến 32‰ và trong môi trường có nồng độ oxy hòa tan thấp (Trích bởi Võ Văn Tuấn, 2005). 2.1.4. Đặc điểm sống và tập tính dinh dƣỡng Trứng cá rô phi thụ tinh được ấp trong miệng cá mẹ (ở giống Oreochromis) ở 28 0C sẽ nở sau 4 ngày. Cá bột sau khi nở 3 – 5 ngày tuổi thì có thể bơi lội tự do ở bên ngoài. Khi có dấu hiệu nguy hiểm thì cá mẹ tìm cách báo động cho cá con biết để bơi vào miệng mẹ (Mai Đình Yên và ctv., 1982; trích bởi Võ Văn Tuấn, 2005). Giai đoạn này cá ăn phiêu sinh động (Zooplankton) nhỏ như là Moina, Daphnia, Cyclops. Cá 20 ngày tuổi trở lên chọn thức ăn giống như cá trưởng thành. Cá trưởng thành ăn thực vật hoặc ăn tạp mà thành phần thức ăn gồm thực vật thủy sinh và mùn bã hữu cơ (Bowen, 1982; trích bởi Võ Văn Tuấn, 2005). 2.1.5. Đặc điểm sinh sản  Mùa vụ sinh sản Rô phi đẻ quanh năm (trừ những ngày quá lạnh hoặc quá nóng), đẻ nhiều nhất từ tháng 5 đến tháng 10. Mỗi năm đẻ từ 5 – 11 lứa, mỗi lứa đẻ 100 – 3400 trứng. Trong một buồng trứng thường có 5 lứa trứng.  Tuổi thành thục Cá rô phi thành thục sinh dục rất sớm, bắt đầu sinh sản sau khi nở 3 – 4 tháng. Cỡ cá thành thục nhỏ nhất khoảng 40g. Thời gian tái thành thục khoảng 1 – 2 tháng.  Phân biệt đực cái ở cá rô phi Khi đến tuổi phát dục thì ở mép các vây đuôi, vây lưng và vây bụng ở cá đực có màu sắc rực rỡ từ hồng đến xanh đen, trong khi đó thì cá cái không có sự thay đổi về màu sắc mà bụng của nó phát triển rất nhanh. Ngoài ra ta có thể phân biệt được cá rô phi đực cái ngay khi chúng còn nhỏ, cỡ 6 – 7 cm, bằng cách nhìn vào vùng lỗ huyệt. Cách phân biệt này càng chính xác khi cá gần thành thục sinh dục. + Cá đực có 2 lỗ: phía trước là lỗ hậu môn, phía sau là rãnh huyệt (còn gọi là huyệt niệu sinh dục). + Cá cái có 3 lỗ: lỗ hậu môn, lỗ niệu và lỗ sinh dục. 5  Tập tính sinh sản Tùy theo loài mà cá rô phi có tập tính sinh sản khác nhau. Đối với loài cá rô phi đen và vằn khi sinh sản, cá đực làm tổ bằng cách đào hố trên đáy ao và chiến đấu chống lại cá đực khác, cá cái thành thục đi đến nơi làm tổ mà ở đó các cá đực đang phô diễn một cách tích cực. Việc bắt cặp và đẻ xảy ra nhanh. Con cái nhanh chóng nhặt trứng vào miệng ngay khi trứng được thụ tinh bởi con đực và tìm nơi trú ẩn. Thời gian ấp khoảng 10 ngày, sau đó cá mẹ tiếp tục chăm sóc khoảng 1 – 4 ngày thì cá con có thể tự đi kiếm ăn. Con cái sau thời kì ấp trứng và chăm sóc cá con sẽ ăn tích cực và hồi phục, thường kéo dài 2 – 4 tuần, trước khi no sẳn sàng đẻ trở lại. Hình 2.1. Cá rô phi đỏ (điêu hồng) 2.2. Tình hình nuôi cá rô phi trên thế giới và ở Việt Nam 2.2.1. Trên thế giới Hiện nay có trên 85 quốc gia nuôi cá rô phi trên khắp các châu lục trên thế giới. Trung Quốc là nước dẫn đầu thế giới về sản lượng cá rô phi nuôi, đạt 315.000 tấn, chiếm 48% sản luợng chung của thế giới. Nhìn chung cá rô phi được đánh bắt tự nhiên ngày càng khan hiếm nên lượng cá bán trên thị trường hiện nay chủ yếu là cá nuôi. Năm 2000, sản lượng cá rô phi nuôi đạt 754.000 tấn (Theo FAO, 2001.). Về quy mô châu lục, các quốc gia ở châu Á là nơi nuôi nhiều cá rô phi nhất, cung ứng 62% sản lượng toàn thế giới, đạt 620.100 tấn, kế đến là các quốc gia thuộc châu Đại Dương, đạt 280.050 tấn, châu Phi: 114.000 tấn, châu Mỹ: 84.450 tấn . Về thị trường cá rô phi: hiện nay thị trường về cá rô phi rất lớn đã góp phần đẩy nhanh tốc độ phát triển nghề nuôi này. Thị trường có nhu cầu lớn về dạng con còn 6 sống, nguyên con tươi, đông lạnh hoặc xông khói. Mỹ là thị trường cá rô phi lớn nhất thế giới, chiếm 88%. Năm 1993, Mỹ chỉ nhập có 14.528 tấn thì đến năm 2000 đã là 61.762 tấn. Năm 2001, cá rô phi nhập khẩu vào Mỹ tăng 39% về khối lượng, trong đó Việt Nam tham gia được gần 60 tấn (Báo Khoa học phổ thông và Nhà văn hóa khoa học, 2002; trích www.ctu.edu.vn/colleges/uquaculture/aquafishdata/index.htm). Bảng 2.1: Sản lƣợng và giá thành cá rô phi của một số nƣớc sản xuất trên thế giới năm 2000 (Theo Fitzsimmons, 2002, trích www.ctu.edu.vn/colleges/uquaculture/aquafishdata/index.htm) Quốc gia Sản lượng (Tấn) Giá thành (USD/kg) Quốc gia Sản lượng (Tấn) Giá thành (USD/kg) Trung Quốc Mexico Philippines Đài Loan Indonesia Thái Lan 150.000 102.000 95.000 90.000 50.000 40.000 1,0 1,3 1,1 1,5 1,2 1,3 Brazil Cuba Colombia Ecuador Costa Rica 45.000 39.000 23.000 15.000 10.000 1,1 1,1 1,3 1,1 1,2 Bảng 2.2.: Sản lƣợng và giá trị xuất khẩu cá rô phi sang Mỹ của một số quốc gia (Theo NASSA, 2002; trích bởi www.ctu.edu.vn/colleges/uquaculture/aquafishdata/index.htm) Quốc gia Sản lượng (kg) Giá trị (USD) Quốc gia Sản lượng (kg) Giá trị (USD) Trung Quốc Costa Rica Ecuador Honduras Indonesia 13.589.832 3.108.922 5.159.163 1.437.708 2.217.74 19.711.012 16.485.179 32.719.948 8.634.514 10.916.541 Jamaica Panama Đài Loan Thái Lan Việt Nam 119.111 352.553 29.808.742 259.596 59.897 766.096 2.110.785 34.459.643 941.509 206.274 7 2.2.2. Ở Việt Nam Sau một thời gian dài bị lãng quên, năm 1994 nhờ tiếp nhận một số dòng cá rô phi vằn có phẩm chất tốt và áp dụng nhiều công nghệ tiến bộ đã làm thức dậy nghề nuôi cá rô phi ở nước ta. Một số cơ sở tại miền Nam đã mạnh dạn đầu tư nuôi cá rô phi theo phương pháp công nghiệp. Năm 1996, sản lượng cá rô phi nuôi ở nước ta ước tính đạt 15.000 tấn (Nguyễn Công Dân và ctv., 1997; trích bởi Trần Văn Vỹ, 1999) 2.2.3. Các tiến bộ kĩ thuật trong nghề nuôi cá rô phi Hiện nay trong nghề nuôi cá rô phi nhiều kĩ thuật mới đã được áp dụng để khắc phục nhược điểm về mùi bùn, cá chậm lớn do mang trứng, tỉ lệ phi lê thấp với mục đích cuối cùng là thu được sản phẩm từ cá sau cùng có giá trị thương mại cao, được thị trường chấp nhận (Báo Khoa học phổ thông và Nhà văn hóa khoa học, 2002; trích website: www.ctu.edu.vn/colleges/uquaculture/aquafishdata/index.htm). Các loại hình nuôi cá rô phi hiện nay khá phong phú. Ngoài phương thức nuôi ao, hầm còn có phương thức nuôi bè trên sông, kênh, rạch, ao, hồ, nuôi trên dòng nước chảy, kênh mương dẫn nước, trong bể chứa, nuôi trong ruộng lúa và nuôi bè cả trên mặt biển như ở Philippines (Báo Khoa học phổ thông và Nhà văn hóa khoa học, 2002; trích www.ctu.edu.vn/colleges/uquaculture/aquafishdata/index.htm). Một tiến bộ nữa trong nghề nuôi cá rô phi là việc thực hiện các chương trình cải thiện giống, tạo giống mới với mục đích hoặc là cải thiện tốc độ sinh trưởng của cá, hoặc là tạo cho cá có màu sắc hợp thị hiếu như cá rô phi đỏ - điêu hồng (Mai Chi, 2002). Hiện nay trên thế giới giống cá rô phi được nuôi nhiều nhất là cá rô phi sông Nile (Oreochromis niloticus) và cá rô phi vằn (O. mossambicus). Cá rô phi sông Nile chiếm tỉ lệ nuôi cao nhất và tăng từ 33% (66.000 tấn) vào năm 1984 lên 72% (474.000 tấn) vào năm 1995. Nó được nuôi nhiều nhất ở Đài Loan (tỉ lệ 39% ), Philipines (16%), Mexico (13% ), Mỹ (5,8% ) với nhiều dạng cá lai nuôi như: O. niloticus, O.aureus, O. mossambicus, O. hornorum và cá rô phi đỏ. Hiện nay nhiều nước đang tuyển chọn cá rô phi dạng đỏ, như cá rô phi đỏ của Singapore chọn từ O. mossambicus Mutante (Pruginin và ctv.,1988), của Florida là cá lai F1 giữa O. mossambicus Albina X O. urolepis hornorum (Sipe, 1985), của Tailandesa chọn từ O.niloticus Roja, của Manzala chọn từ cặp lai O. aureus Roja X O. niloticus (Egipcia) Roja (Mc Andrew và ctv., 1988; Tave, 1991), giống Yumbo No 1 lai giữa dạng Florida đỏ và O. niloticus (Castillo, 1990); giống Yumbo No 2 lai giữa Red Tilapia USA và Red Tilapia Israel,... 8 Hoặc sản xuất giống cá rô phi đơn tính bằng cách cho cá con ăn thức ăn có tỉ lệ đạm cao, phối trộn với methlytestosterone sẽ cho tỉ lệ đực rất cao (Báo Khoa học phổ thông và nhà văn hóa khoa học, 2002; trích www.ctu.edu.vn/colleges/aquaculture/aquafishdata/index.htm ). 2.3. Tình hình dịch bệnh ở cá rô phi Cùng với sự gia tăng mật độ trong hệ thống nuôi là sự gia tăng về bệnh. Trong thời gian gần đây, người nuôi luôn phải đương đầu với vấn đề bệnh trên động vật thủy sản. Bệnh trên cá rô phi xảy ra khắp nơi, trong đó một số đã phát triển thành những trận dịch. Đài Loan là nước từng đã hứng chịu rất nhiều trận dịch trên cá rô phi. Chien (1991; trích bởi Nguyễn Tri Cơ, 2004) đã mô tả bệnh trong một hệ thống nuôi cá rô phi vằn do Saprolegnia sp. gây ra. Trận dịch năm 1992 đã làm chết rất nhiều cá rô phi trong những ao nuôi nước ngọt ở miền Đông và Nam Đài Loan, sau đó lan rộng ra các đảo trong khu vực ở cả nước lợ và nước mặn (Huang và ctv., 1998). Tại Israel, một tác nhân gây bệnh rất giống nấm Branchiomyces đã làm chết 85% cá rô phi đỏ và cá rô phi lai. Tại một đầm nuôi cá rô phi nước lợ ở Hưng Yên thuộc tỉnh Quảng Ninh đã xảy một trận dịch vào cuối năm 1997, nguyên nhân do đĩa Piscicola sp. và đã làm chết khoảng 20 – 25 tấn cá (Bùi Quang Tề, 2001; trích bởi Võ Văn Tuấn, 2005). 2.4. Tình hình nghiên cứu bệnh trên cá rô phi 2.4.1. Trên thế giới Hiện nay trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu về bệnh trên cá rô phi do các tác nhân vi khuẩn như: Miyazaki và ctv. (1984; trích bởi Nguyễn Tri Cơ, 2004) nghiên cứu mô học cá bị nhiễm Pseudomonas fluorescens và Streptococcus sp., Chang và Plumb (1996; trích bởi Nguyễn Tri Cơ, 2004) nghiên cứu mô học cá rô phi vằn nhiễm Streptococcus sp. và ảnh hưởng của độ mặn lên quá trình nhiễm Streptococcus sp. của cá rô phi vằn, Bunch và Bejerano (1997; trích bởi Nguyễn Tri Cơ, 2004) nghiên cứu ảnh hưởng của những yếu tố môi trường lên sự nhạy cảm của cá rô phi lai đối với bệnh do Streptococcus sp., Huang và ctv. (1996; trích bởi Nguyễn Tri Cơ, 2004) nghiên cứu dịch tể học và khả năng sinh bệnh của Staphylococcus epidermidis trên cá rô phi nuôi ở Đài Loan và các tác giả này kết luận rằng S. epidermidis là một tác nhân gây bệnh ở cá rô phi,... 9 2.4.2. Tại Việt Nam Hiện nay ở Việt Nam các công trình nghiên cứu về bệnh cá rô phi chưa nhiều, chỉ có vài công trình nghiên cứu chủ yếu tập trung vào kí sinh trùng và hầu như chưa có hoặc có rất ít công trình có tầm cỡ nghiên cứu về tác nhân virus hay vi khuẩn gây bệnh trên cá rô phi. Những công trình nghiên cứu ở Việt Nam như: nghiên cứu về kí sinh trùng trên một số dòng cá rô phi vằn ở Bắc Ninh và Quảng Ninh (Bùi Quang Tề và ctv., 1999; trích bởi Nguyễn Tri Cơ, 2004) hay nghiên cứu về kí sinh trùng ở những giai đoạn khác nhau trên ba dòng cá rô phi nuôi (O. niloticus) như dòng Thái, dòng Việt và dòng GIFT (Genetical Improved Farm Tilapia) tại miền Bắc Việt Nam (Bùi Quang Tề và Vũ Thị Lụa, 1999; trích bởi Nguyễn Tri Cơ, 2004). 2.5. Một số thông tin về liên cầu khuẩn Streptococcus iniae gây bệnh trên cá rô phi 2.5.1. Đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa Streptococcus iniae là một loài vi khuẩn thuộc giống Streptococcus. Streptococcus gồm vài loài được xác định là tác nhân gây bệnh trên nhiều kí chủ. Phần lớn các loài trong giống này vẫn chưa được xác định đầy đủ. Các đặc điểm dùng để định danh Streptococcus sp. thông thường trên loài hữu nhũ không được áp dụng nhiều khi xác định tác nhân gây bệnh trên cá. Một số loài vi khuẩn thuộc giống Streptococcus gây bệnh trên cá đã được xác định, bao gồm: Streptococcus difficile phát hiện ở Israel, S. milerri (Austin và Austin, 1999), S. parauberis phân lập từ loài cá bơn nuôi ở miền Bắc Tây Ban Nha (Austin và Austin, 1999), S. iniae được phát hiện trên nhiều loài và cả ở thú hữu nhủ (Austin và Austin, 1999; trích bởi Yanong và Floyd, 2001). Ngoài ra còn một số loài vi khuẩn có mối quan hệ họ hàng rất gần gũi với Streptococcus và gây ra các triệu chứng bệnh tương tự như: Lactococcus garvieae (Austin và Austin, 1999), L. piscium và Vagococcus salmoninarum (Yanong và Floyd, 2001). Tất cả chúng gây ra hội chứng bệnh có tên là bệnh do liên cầu khuẩn (streptococcosis). Bệnh streptococcosis được Hoshina và ctv. báo cáo đầu tiên vào năm 1958 ở Nhật Bản trên loài cá hồi nuôi. Streptococcus iniae cùng với vi khuẩn Lactococcus garvieae là những tác nhân gây bệnh chủ yếu của bệnh streptococcosis ở cá, theo ước tính nó là nguyên nhân gây ra 50% số cái chết trong tháng đầu của vụ nuôi và tới 80% số cá nuôi bị tổn thất khi kết thúc vụ nuôi, đặc biệt nghiêm trọng nếu bệnh xảy ra trong những tháng mùa lạnh . 10 S. iniae được phân lập đầu tiên trên loài cá heo vùng sông Amazone vào thập niên 70 của thế kỷ trước. Tuy nhiên nó chỉ được coi là tác nhân gây bệnh sau một vụ bộc phát trên cá rô phi lai vào năm 1994 (Yanong và Floyd, 2001). S. iniae có thể gây bệnh trên cả cá lẫn thú, kể cả con người (Austin và Austin, 1999; Weistein và ctv., 1997). S. iniae có dạng hình cầu, có thể đứng riêng lẻ, thành từng cặp hoặc tạo thành chuỗi dài. Vi khuẩn S. iniae bắt màu Gram dương . Đặc điểm này của nó khá hữu ích cho công tác phân lập vì thông thường các tác nhân vi khuẩn gây bệnh trên cá thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm. Vi khuẩn S. iniae phát triển tốt trên các môi trường thạch Tryptic Soyar Agar, Brain Heart Infusion, Muller – Hinton và thạch máu cừu. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp từ 25 – 28oC. Sau 48h nuôi cấy, vi khuẩn tạo thành khuẩn lạc nhỏ (0,5 – 0,7mm) màu trắng đục. Một số chủng khuẩn lạc trong suốt có tính nhầy sau 24h nuôi cấy. Trên môi trường thạch máu, khuẩn lạc tạo vòng dung huyết beta nhỏ, trong suốt, rìa không rõ. Vi khuẩn không phát triển ở điều kiện pH 9,6, NaCl 6,5%, nhiệt độ 10 và 45oC (Nguyen và Kanai, 1999). S. iniae thủy phân esculin và tinh bột, không thủy phân gelatin. Vi khuẩn lên men đường glucose, maltose, mannitol, không lên men arabinose, lactose, raffinose và xylose. Về đặc điểm sinh hóa khác, S. iniae cho phản ứng catalase, oxydase, VP, indol và H2S âm tính; MR và DNase dương tính (Nguyen và Kanai, 1999)..... Hình 2.2 : Hình thái vi khuẩn Streptococcus sp. (Nguồn: Nguyễn Thị Ngọc Bích, 2005) 11 2.5.2. Loài cá nuôi cảm nhiễm Rất nhiều báo cáo khoa học đề cập đến bệnh do S. iniae trên cá rô phi (Oreochromis sp.) nuôi công nghiệp tại nhiều quốc gia trên thế giới. Tại Nhật Bản, các loài cá nuôi cảm nhiễm như: cá cam (Seriola quinqueriata), cá bơn (Paralichthys olivaceus), cá hồng (Pargrus major) và các cá nuôi nước ngọt như: ayu (Phecoglosus alivaceus) chịu rất nhiều thiệt hại do S. iniae gây bệnh. Một số loài cá nuôi ở các nước châu Á khác như: cá chẽm (Lates calcarifer), cá mú (Epinephelus sp.), cá hồng (Lutijanus sp.) cũng bị nhiễm S. iniae (Dương Phượng Uyên, 2005). 2.5.3. Triệu chứng và bệnh tích Hầu hết bệnh xâm nhiễm ở cá là do các mầm bệnh cơ hội. Điều đó có nghĩa là chỉ với sự hiện diện của mầm bệnh trong môi trường không thể bộc phát bệnh được, chỉ khi có các yếu tố khác tạo thuận lợi cho mầm bệnh hoặc hệ thống miễn dịch của kí chủ bị suy yếu, khi đó cá sẽ trở nên nhạy cảm với mầm bệnh. Các yếu tố đó gọi chung là stress. Một số yếu tố gây stress như: nhiệt độ nước cao vào mùa hè, mật độ nuôi cao, do vận chuyển, do đánh bắt, chất lượng nước nuôi kém với nồng độ nitrite và amonia cao. Tuy nhiên, theo Ferguson và ctv. (1994; trích bởi Yanong và Floyd, 2001), vi khuẩn Streptococcus không phải là mầm bệnh cơ hội thật sự. Bệnh thường xảy ra với tỉ lệ cá chết rất cao, hơn 50% trong thời gian từ 3 – 7 ngày (Yanong và Floyd, 2001) . Tỉ lệ cá chết cao và tập trung vào các tháng cuối mùa hè và đầu mùa thu. Đây là khoảng thời gian có nhiệt độ nước cao nhất trong năm. Tại các thời điểm khác trong năm cá chỉ chết rải rác, ngoại trừ vào những tháng mùa đông lúc nhiệt độ nước xuống thấp, cho nên ở các nước ôn đới vào mùa này rất hiếm gặp cá chết vì bệnh trên. Về độ tuổi cá nhiễm bệnh, hầu hết các báo cáo đều đề cập bệnh xảy ra trong giai đoạn nuôi thương phẩm (Dương Phượng Uyên, 2005). Cá bệnh có triệu chứng chung khá điển hình trên nhiều loài. Cá bơi lờ đờ hay mất định hướng gần mặt nước. Bên ngoài quan sát thấy cá bị trướng bụng do tích tụ dịch viêm xoang bụng, xuất huyết điểm, có đốm đỏ ở vùng quanh miệng và hậu môn xuất hiện nặng ở vây lưng và ngực, xuất huyết, viêm có mủ, lồi một hoặc cả hai mắt. Bên trong nội quan gan, lách, thận nhạt màu và sưng to. S. iniae còn nhiễm ở não làm cá bơi bất thường. Tuy nhiên, một vài trường hợp cá bệnh nhưng không có biểu hiện triệu chứng rõ ràng cho đến khi chết (Yanong và Floyd, 2001). 12 Perrera và ctv. (1998) nghiên cứu bệnh tích vi thể học của cá rô phi lai (O. niloticus X O. aureus) nhiễm S. iniae, kết quả cho thấy sự xâm nhập của vi khuẩn vào tế bào ở mắt, màng não gây viêm hạt màng não. Các ổ viêm có rất nhiều vi khuẩn trong nhu mô thận là bệnh tích thường quan sát được. Vi khuẩn phát triển quanh mao tĩnh mạch và tạo bệnh tích viêm hạt ở nhu mô gan. Nhu mô lách cũng nhiễm khuẩn rất nặng. Một số trường hợp có thể quan sát được viêm bao tim và cơ tim. Trong máu, vi khuẩn phát triển tự do trong huyết tương hoặc bị thực bào bởi đại thực bào (Trích bởi Dương Phượng Uyên, 2005). 2.5.4. Huyết thanh học Pier và ctv. (1978) điều chế kháng huyết thanh thỏ kháng S. iniae. Kháng huyết thanh thỏ này không cho phản ứng ngưng kết với bất kỳ loài vi khuẩn thuộc giống Streptococcus nào khác. Các chủng S. iniae phân lập tại Nhật Bản có hai dạng khuẩn lạc khác nhau sau 24h ủ trên các môi trường thạch thích hợp. Một loại khuẩn lạc có tính nhầy, trong và một dạng không nhầy, đục. Khuẩn lạc nhầy có thể chuyển thành khuẩn lạc không nhầy khi kéo dài thời gian ủ nhưng không xảy ra trường hợp ngược lại. Kháng huyết thanh thỏ điều chế từ tế bào vi khuẩn của chủng khuẩn lạc nhầy sẽ cho phản ứng ngưng kết với cả hai khuẩn lạc nhầy và không nhầy. Tuy nhiên, kháng huyết thanh thỏ điều chế từ tế bào vi khuẩn của chủng khuẩn lạc không nhầy sẽ chỉ cho phản ứng ngưng kết với dạng khuẩn lạc đó. Vi khuẩn tạo khuẩn lạc nhầy có độc lực mạnh hơn vi khuẩn tạo khuẩn lạc không nhầy. 2.5.5. Dịch tễ học  Nguồn vi khuẩn lây nhiễm S. iniae hiện diện trong môi trường nước ngọt và nước biển, có thể được phân lập quanh năm. Tuy nhiên, vào mùa đông vi khuẩn hiện diện ở mật độ rất thấp và chỉ có thể phân lập khi sử dụng môi trường canh tăng sinh chọn lọc. Tương tự, S. iniae cũng được phân lập từ nhớt da, chất bẩn tích tụ trong bể nuôi (Nguyen và ctv., 2002). Cá còn sống sót sau dịch bệnh có khả năng là nguồn thải S. iniae vào nước (Bromage và ctv., 1999; trích bởi Dương Phượng Uyên, 2005).  Đƣờng lây nhiễm Cá có thể được gây nhiễm bằng cách tiêm, ngâm, cho ăn thụ động bằng thức ăn chứa vi khuẩn (Nguyen và ctv., 2000), nuôi chung cá khỏe và cá bệnh 13 (Perera và ctv., 1997) hay bằng cách khá đặc biệt qua niêm mạc mũi (Evans và ctv., 2000). Zlotkin và ctv. (1998) báo cáo khả năng lây truyền S. iniae từ cá mang khuẩn trong tự nhiên vào cá nuôi (Trích bởi Dương Phượng Uyên, 2005).  Sinh bệnh học Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể cá qua các vết trầy xước ở da và vây. Tại đây, vi khuẩn gia tăng số lượng và bị thực bào bởi các đại thực bào. Đại thực bào mang vi khuẩn theo máu trở về thận và lách. Vi khuẩn không bị tiêu diệt bởi đại thực bào gia tăng số lượng tại hai cơ quan trên và khi vượt qua sức chống chịu của cơ thể cá sẽ tiếp tục nhiễm vào máu, sau đó được di chuyển đến khắp nơi trong cơ thể gây nhiễm khuẩn toàn thân (Nguyen và ctv., 2001). 2.5.6. Phòng trị bệnh  Phòng bệnh Các biện pháp như giảm mật độ nuôi, tránh cho ăn dư thừa, vệ sinh bể nuôi cần được thực hiện thường xuyên. Tránh đến mức tối đa chuyển đàn, chia đàn, phân cỡ cá trong thời gian dịch bệnh thường xảy ra.  Trị bệnh Kháng sinh diệt khuẩn phổ rộng hay diệt khuẩn Gram dương với tác dụng toàn thân có hiệu quả điều trị tốt. Erythromycin và một số kháng sinh khác như doxycycline, kitasamycin, alkyl-trimethyl-ammonium-calcium-oxytetracycline, josamycin, oleandomycin và lincomycin cũng thường được sử dụng trị bệnh do liên cầu khuẩn ở Nhật Bản (Kitao và Aoki, 1979).  Vaccine Rất nhiều nghiên cứu về vaccine phòng bệnh do S. iniae đã được công bố ở nhiều nơi, như: công trình của Bercovier và ctv. (1997) nghiên cứu về vaccine phòng bệnh gây ra do Streptococci và các vi khuẩn có quan hệ họ hàng khác trên cá hồi và cá rô phi, Alkhlaghi và ctv. (1996), Eldar và ctv. (1997), nhiều chương trình nghiên cứu của nhóm nhà nghiên cứu tại Phòng thí nghiệm nghiên cứu sức khỏe động vật thủy, Trung tâm nghiên cứu Nông nghiệp thuộc Bộ Nông nghiệp Hoa kỳ (Aquatic Aniamal Health Research Laboratory, ARS, USDA) gồm: Shoemaker C. A. , Klesius P. H. , Evans J. J. về vaccine phòng bệnh trên ở cá hồi và cá rô phi,... Tuy nhiên, vaccine được thương mại còn rất hạn chế, chỉ có một vài sản phẩm như: sản phẩm 14 Aquavac TM Garvetti TM dạng cung qua thức ăn và ngâm của hãng Schering – Plough Aquaculture, ... 2.6. Khái quát về hệ thống đáp ứng miễn dịch của thú. Cột mốc đầu tiên trong miễn dịch học chỉ cách đây hơn một thế kỷ với nghiên cứu của Pasteur trên bệnh tụ huyết trùng ở gia cầm. Cùng với sự phát hiện đó, các nghiên cứu tiếp theo đã dần làm sáng tỏ giả thuyết của Pasteur lúc đó cũng như làm sáng tỏ hệ thống đáp ứng miễn dịch trên nhiều loài động vật. Hệ thống miễn dịch ở thú chia làm 2 nhóm: miễn dịch tự nhiên (miễn dịch không đặc hiệu) và miễn dịch thu được (miễn dịch đặc hiệu). 2.6.1. Miễn dịch tự nhiên ở thú Miễn dịch tự nhiên được quy định bởi đặc tính của giống, loài sinh vật. Loại miễn dịch này đã có sẵn khi cơ thể được sinh ra và nó được di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác. Những yếu tố cấu thành miễn dịch tự nhiên gồm:  Sự đề kháng ở biểu mô Những yếu tố đề kháng ở biểu mô Những yếu tố cơ học: các tế bào biểu mô ở đường hô hấp tiết dịch nhày, hệ thống nhung mao ở đường hô hấp, nước mắt ở tuyến lệ, nước tiểu có tác dụng thải vi sinh vật ra ngoài. Những yếu tố sinh học: surfactans (do tế bào thực bào ở phổi sản xuất) ngăn ngừa sự dính bám và thải loại vi sinh vật; lactoferrin có ở sữa mẹ, nước mắt, nước bọt, mồ hôi, chất nhầy niêm mạc mũi, phế quản, cổ tử cung, mật và tinh dịch ngăn chặn sự phân chia tế bào vi sinh vật; lysozyme do bạch cầu hạt tiết, có tác dụng làm vỡ peptidoglycan trong cấu phần vách tế bào vi khuẩn; tallow là các acid béo tự do do tuyến mồ hôi tiết, có vai trò diệt nấm; acid có trong dạ dày, âm đạo ngăn chặn sự sinh trưởng của vi khuẩn. Những quá trình tế bào ở biểu mô Có khá nhiều loại tế bào cùng tham gia vào sức đề kháng ở biểu mô : lớp nhung mao của biểu mô đường hô hấp sản xuất chất nhầy tạo phản xạ ho, đẩy chất lạ ra ngoài; đại thực bào ở phế nang tiêu diệt tất cả vi khuẩn thông thường (trừ vi khuẩn lao) Những yếu tố đề kháng bên trong Hiện diện trong máu và các mô, phân biệt thành quá trình dịch thể và tế bào. 15 Những yếu tố dịch thể: lysozyme có trong dịch khớp và dịch não tủy; transferrin có cấu trúc tương tự như lactoferrin có tác dụng ngưng trùng; bổ thể là hệ thống gồm 9 loại enzyme có mặt thường xuyên trong huyết thanh, có vai trò trong sự phản vệ, opsonin hóa, sự ly giải, ngăn ngừa và loại bỏ sự hình thành phức hợp kháng nguyên và kháng thể quá lớn trong cơ thể, kích hoạt sự trưởng thành của lympho bào B và sự thực bào; C – reactive protein xuất hiện trong giai đoạn đầu của quá trình nhiễm khuẩn, kích thích dòng thác bổ thể theo con đường cổ điển; interferon (IFN) do tế bào đơn nhân, các loại đại thực bào và tế bào lympho tiết ra, có vai trò trong sự miễn dịch với virus và kí sinh trùng.  Những quá trình tế bào Sự thực bào Các tế bào làm nhiệm vụ thực bào gồm bạch cầu đa nhân trung tính (tiểu thực bào) và bạch cầu đơn nhân lớn (đại thực bào). Những tế bào này tiền thân ở tủy xương, nhưng khi đã được biệt hóa thì phóng thích vào máu để làm nhiệm vụ thực bào. Quá trình thực bào gồm các giai đoạn sau: hóa hướng động là sự kích động và lôi kéo các các bạch cầu đa nhân trung tính và đại thực bào rời dòng máu đến nơi nhiễm trùng nhờ một yếu tố hóa học tiết ra từ hệ thống bổ thể; nhận diện dựa vào khả năng nhận biết cấu trúc kháng nguyên của vật xâm nhập khác kháng nguyên của cơ thể; ăn vào và đào thải, đưa các phân tử kháng nguyên và các vật chất lạ khỏi dòng máu. Tính gây độc tế bào Những tế bào có hoạt tính gây độc tế bào là lympho hạt lớn, bạch cầu đơn nhân. Quá trình gây độc tế bào cũng trải qua tế bào nhận diện, sau đó là giai đoạn tiết ngoại bào là các hạt vào trong tế bào đích, các hạt này sẽ kết hợp với các tiểu thể sống của tế bào đích và làm tế bào bị chết. Về phương diện chức năng, người ta phân biệt 2 loại tế bào: tế bào lympho hạt lớn gọi là tế bào diệt K (killer cell) và tế bào diệt tự nhiên NK (natural killer cell). Tính gây độc không đặc hiệu đóng một vai trò rất quan trọng trong sức đề kháng của cơ thể, có vai trò trong việc nhận diện sớm và giúp loại bỏ những tế bào bướu, phản ứng loại bỏ mảnh ghép ... Sự sản xuất các hợp chất hoạt mạch 16 Gồm các chất như: histamin, leucotrienes... sinh ra gián tiếp trong quá trình hoạt hóa hệ thống bổ thể và hệ thống đông máu, có tác động gây co mạch máu trung tâm và giãn mạch máu ngoại biên. 2.6.2. Miễn dịch thu đƣợc ở thú Miễn dịch thu được hay còn gọi là miễn dịch đặc hiệu là loại miễn dịch mà cơ thể tiếp thu được trong quá trình sống  Đáp ứng miễn dịch thể dịch ở thú Với sự tham gia quan trọng của kháng thể. Các kháng thể được các tế bào lympho sản xuất và đã được tạo ra trước khi có kháng nguyên xâm nhập. Các kháng thể được các kháng nguyên chọn lựa cho mình (Theo thuyết lựa chọn của Jener – Burnet, trích bởi Lê Văn Hùng, 2002). Mỗi một tế bào lympho của một nhóm được biệt hóa trong tủy xương và đã được chương trình hóa để sản xuất một và chỉ một kháng thể, nó đặt kháng thể này trên bề mặt ở lớp ngoài của nó để tác động như một receptor. Các tế bào lympho nhận tín hiệu khi tiếp xúc với kháng nguyên sẽ tăng sinh mãnh liệt để tạo ra một dòng tương bào sản xuất kháng thể thuộc loại mà tế bào lympho bố mẹ đã được chương trình hóa. Kết quả cuối cùng là cơ thể tạo lượng kháng thể đặc hiệu rất cao chống lại sự xâm nhập của kháng nguyên. Kháng thể còn được gọi là globulin miễn dịch (immunoglobulin = Ig), có bản chất protein. Ở người và động vật có vú tồn tại 5 lớp Ig: IgA, IgG, IgM, IgD và IgE có chức năng được thể hiện qua bảng 2.3. Các Ig đều là protein hình cầu, có hai chuỗi polypeptide nặng kí hiệu là chuỗi H (heavy chain) và hai chuỗi nhẹ kí hiệu là L (light chain). Sự khác biệt chủ yếu giữa hai lớp Ig với nhau là ở chuỗi nặng. Các chuỗi H hoặc L trên cùng một phân tử kháng thể bao giờ cũng giống nhau hoàn toàn từng đôi một (Lê Văn Hùng, 2002).  Miễn dịch qua trung gian tế bào Là kết quả của sự hoạt hóa các lympho T và đại thực bào bởi kháng nguyên. Khi đưa một lượng nhỏ kháng nguyên đặc hiệu vào cơ thể, thì tại nơi đưa vào sẽ xảy ra phản ứng viêm. Phản ứng viêm do sự tương tác giữa lympho T mẫn cảm với kháng nguyên đặc hiệu gọi là sự quá mẫn muộn (delayed hypersensivity). Người ta coi quá mẫn muộn là một biểu hiện của đáp ứng miễn dịch tế bào. 17 Khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể sẽ kích thích sự hoạt động biệt hóa của dòng tế bào lympho T, các quần thể sau khi được biệt hóa sẽ tăng sinh nhanh chóng và tạo ra một số lượng lớn sẵn sàng làm nhiệm vụ tấn công kháng nguyên. Bảng 2.3 : Chức năng sinh học của 5 lớp Ig (Nguồn : Đặng Đức Trạch và ctv., 1987; trích bởi Hoàng Hải Hóa, 2001) Lớp kháng thể Hoạt động hữu ích Hoạt động gây tổn thương. IgG Trung hòa độc tố Ngưng kết Opsonin hóa Tan vi khuẩn (kết hợp với bổ thể) Phức hợp kháng nguyên – kháng thể đọng lại trong cơ thể gây tổn thương. IgM Trung hòa độc tố Ngưng kết Tan vi khuẩn (phối hợp với bổ thể) Thụ thể trên bề mặt lympho bào B dành cho kháng nguyên Như trên IgA Trung hòa độc tố Ngưng kết Opsonin hóa Như trên IgD Thụ thể trên bề mặt lympho bào B dành cho kháng nguyên Như trên IgE Làm thay đổi tính thẩm thấu của thành mao mạch Gây phản vệ quá mẫn tức khắc và toàn thân ngay tại chỗ Những tế bào lympho tham gia vào đáp ứng miễn dịch tế bào thuộc về hai tiểu quần thể lympho T sau: Tiểu quần thể lympho T gây quá mẫn muộn (TDTH = delayed type hypersensivity T lymphocyte) : có chức năng sản xuất các yếu tố hòa tan gọi là lymphokin, tác động đến các loại bạch cầu khác, đặc biệt là đại thực bào. Chúng có vai 18 trò rõ rệt trong đáp ứng miễn dịch tế bào chống lại các vi sinh vật kí sinh bên trong tế bào, trong hiện tượng mẫn cảm do tiếp xúc, phản ứng thải bỏ mảnh ghép. Tiểu quần thể lympho T gây độc (TC = cytotoxic T lymphocyte) có khả năng tiêu diệt tế bào đích, những tế bào đã bị vi sinh vật gây bệnh đột nhập vào bên trong tế bào chất hoặc nhân. Các quần thể tế bào khác như: tế bào T cảm ứng TI (inducer T lymphocyte), tế bào T hỗ trợ TH, tế bào T ức chế TS (T cell suppressor)... có vai trò điều hòa đáp ứng miễn dịch hoặc điều hòa mối quan hệ phức tạp giữa các tế bào cùng tham gia đáp ứng miễn dịch. Lymphokin: hiện nay phát hiện được hơn 90 loại lymphokin ở thú. Chúng có bản chất là protein do tế bào lympho tiết ra với các chức năng khác nhau, mà một trong những chức năng đó là kích thích khả năng thực bào của các đại thực bào đơn nhân và bạch cầu trung tính (Lê Văn Hùng, 2002). 2.7. Khái quát về hệ thống miễn dịch của cá Lớp cá là lớp động vật có xương sống nguyên thủy nhất, được coi là gạch nối quan trọng giữa các loài động vật không xương sống và các loài động vật có xương sống bậc cao hơn (Stoskopf S.K., 1993). Ở cá tồn tại cơ chế thực bào với các tế bào thực bào đơn nhân và tế bào hạt của động vật không xương sống, chúng cũng là các sinh vật đầu tiên thể hiện được hai cơ chế miễn dịch thể dịch và miễn dịch qua trung gian tế bào như ở các loài hữu nhũ (Stoskopf S.K., 1993). Ngoại trừ một số loài cá sống ở nhiệt độ thấp không phát triển hệ thống đáp ứng miễn dịch (Fox, 2005). Cũng như tất cả các cơ thể sống khác, cá có đặc tính quan trọng là nhận biết và dung nạp những cái của bản thân, đồng thời nhận biết và thải bỏ những cái không phải của bản thân, xa lạ với cơ thể (Đỗ Ngọc Liên, 1999). Dưới một phức hệ phức tạp tương tác giữa các tế bào được biết đến là hệ thống miễn dịch, chúng nhận biết tác nhân gây bệnh và các chất lạ rồi khởi động một loạt các phản ứng khác nhau nhằm loại bỏ chúng ra khỏi cơ thể. Đó còn được gọi là sự đáp ứng miễn dịch. Những đáp ứng miễn dịch nói chung được chia thành 2 lớp lớn: các đáp ứng miễn dịch tự nhiên (không đặc hiệu) và các đáp ứng miễn dịch thu được (miễn dịch đặc hiệu). 2.7.1. Đáp ứng miễn dịch tự nhiên ở cá Là các đáp ứng miễn dịch nhờ vào các hàng rào cơ học và sinh học một cách không đặc hiệu. 19 Các tế bào tham gia vào đáp ứng miễn dịch tự nhiên Đây là các tế bào quan trọng nhất trong đáp ứng miễn dịch ở cá (Fox, 2005). Bạch cầu đơn nhân chỉ có số lượng giới hạn trong vòng tuần hoàn máu ngoại vi, trong khi đại thực bào có nhiều trong các mô. Chúng tham gia vào sự thực bào và sản sinh ra các yếu tố tương tự cytokine như: interleukin-1 (IL – 1), yếu tố hoại tử khối u (TNF – tumor necrosis factor) kích hoạt các đáp ứng tiếp theo (Fox, 2005) Neutrophil: là các tế bào thứ cấp xuất hiện trong giai đoạn sớm của sự viêm (Manning, 1994; trích bởi Stoskopf S.K., 1993.), nó sản sinh cytokine để lôi kéo các tế bào có chức năng miễn dịch khác tới vùng đã bị nhiễm (Fox, 2005) . Tế bào giết tự nhiên ( Natural killer cell) có các thể nhận (receptor) gắn bám vào tế bào đích và li giải nó. Các tế bào này quan trọng trong sự đáp ứng miễn dịch với mầm bệnh virus và kí sinh trùng (Fox, 2005). Ngoài ra còn có một số tế bào tham gia vào sự thực bào khác như: bạch cầu có hạt ưa acid (Mainwaring và Rowley, 1985), tiểu cầu (Ferguson, 1976; Lester và Budd, 1979), tế bào lớp lót nội mô của xoang máu, tế bào hình trụ ở mang cá (Chilmonczyk và Monge, 1980), tế bào nội mô ở dạ dày (Woodhead, 1981) và các đại thực bào trong tâm nhĩ (Ferguson, 1975) (Trích bởi Stoskopf S. K., 1993). Sự thực bào Sự thực bào là cơ chế phòng vệ nguyên thủy nhất (Fox, 2005), khởi nguyên của nó là một chức năng phục vụ cho nhu cầu dinh dưỡng ở động vật cấp thấp, nó đã tiến hóa độc lập thành chức năng phòng vệ ở động vật có xương sống (Stoskopf S.K., 1993). Cơ chế của sự thực bào bao gồm: nhận biết tác nhân ngoại nhiễm, gắn bám vào tác nhân ngoại nhiễm, hút nuốt và tiêu hóa. Cơ chế của việc nhận biết và gắn bám với tác nhân ngoại nhiễm không được hiểu biết rõ. Ở cá xương, thận và lách là hai cơ quan chính bắt giữ kháng nguyên cho tế bào thực bào hoạt động chức năng. Có hai loại tế bào thực bào: Bạch cầu đơn nhân và đại thực bào. Bạch cầu có hạt. Da và lớp nhớt của cá Không như lớp da của động vật có xương sống bậc cao, da cá được cấu tạo bởi các tế bào sống không được keratin hoá (Robert và Bullock, 1980; trích bởi Stoskopf S. K., 1993). Da cá cũng mau lành hơn nếu có thương tổn . Sự tồn tại của lớp chất nhớt 20 phía mặt ngoài da cá là một điều đặc biệt mà các lớp động vật khác không có được. Nó ức chế sự phát triển của các vi sinh vật. Người ta tìm thấy trong chất nhớt của da các chất: lysozyme, bổ thể, kháng thể tự nhiên, bacteridosin (Diconza, 1970; Fletcher và White, 1973; Ourth, 1980; trích bởi Stoskopf S. K., 1993). Các kháng thể tự nhiên trong lớp nhớt này đặc hiệu với các epitope có chứa thành phần carbohydrate của vách tế bào kháng nguyên. Trong lớp nhớt còn phát hiện có cả kháng thể đặc hiệu. Các phân tử hòa tan trong đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu Gồm một số chất sau: lectines, lytic enzyme, transferrin/lactoferrin, ceruloplasmin, protein C – raeactive, interferon (IFN) đảm nhận các chức năng bổ trợ cho các đáp ứng miễn dịch của cơ thể. Bổ thể Bổ thể là một kháng thể không đặc hiệu có trong huyết thanh tươi của các loài động vật, có tác dụng làm tan vi khuẩn đã được kháng thể cảm ứng. (Nguyễn Vĩnh Phước, 1979; trích bởi Hoàng Hải Hóa, 2001.) Trong huyết thanh cá tồn tại khoảng hơn 20 loại bổ thể khác nhau, chúng hoạt động qua hai cơ chế: hoặc tương tác với kháng thể đặc hiệu, hoặc hoạt động một cách không đặc hiệu với các phân tử ở bề mặt vật kí sinh (Sakai, 1992; trích bởi Fox, 2005.). 2.7.2. Đáp ứng miễn dịch thu đƣợc ở cá ( miễn dịch đặc hiệu) Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu có tính đặc hiệu cao đối với tác nhân gây bệnh . Sự đáp ứng này càng hoàn thiện sau mỗi lần tiếp xúc với tác nhân gây bệnh. Hệ thống miễn dịch đặc hiệu có thể ghi nhớ lại tác nhân gây bệnh và ngăn cản tác động gây bệnh của chúng ở lần tiếp xúc lặp lại tiếp theo (Đỗ Ngọc Liên, 1999). Sự đáp ứng miễn dịch đặc hiệu bao gồm: Miễn dịch thể dịch: Với vai trò tham gia quan trọng của các tế bào lympho B. Ở cá, do thiếu tủy sống, sự trưởng thành và tăng sinh của các tế bào lympho B diễn ra ở lách và phần trước của thận (Đỗ Ngọc Liên, 1999). Cá chỉ tổng hợp được một lớp Ig (immunoglobulin) tương đương với IgM ở thú. IgM ở cá xương có dạng tetreametric, ở cá sụn có dạng pentametric, trong khi ở cá mập và cá đuối có dạng monometric (Ambrosius và ctv., 1982; trích bởi Stoskopf S. K., 1993). IgM là dạng Ig chủ yếu được tạo ra trong các đáp ứng miễn dịch thì đầu ở 21 thú. Ở cá không có kháng thể IgG. IgM có vai trò hoạt hóa bổ thể, có vai trò trong sự opsonin hóa, trung hòa virus và sự ngưng kết (Tizard, 1987; trích bởi Stoskopf S.K., 1993). Ở lớp nhớt của cá cũng có sự có mặt của các kháng thể loại IgM và Ig tương tự như IgA ở thú (St-Louis-Cornier và ctv., 1984; Lobb, 1987; trích bởi Stoskopf, 1993). Miễn dịch qua trung gian tế bào: Các lympho bào T sinh ra từ tuyến ức của cá giúp cho sự đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào . Sau các đáp ứng của đại thực bào, các lympho bào T – helper sẽ được kích hoạt, trưởng thành thành các tế bào effector. Nó nhận diện được kháng nguyên và gắn bám vào kháng nguyên thông qua các thể nhận trên bề mặt của các đại thực bào, từ đó kích thích đại thực bào sản sinh các loại cytokine. Cytokine tác động gián tiếp gây ra một loạt các phản ứng nhờ các quần thể tế bào khác. 2.8. Giới thiệu về chất bổ trợ 2.8.1. Nguyên lý tác dụng của chất bổ trợ Cơ chế tác động của chất bổ trợ dùng trong vaccine được giải thích như sau: Chất bổ trợ có tác dụng gây viêm, kích thích quá trình thực bào, giúp quá trình đáp ứng miễn dịch xảy ra mạnh hơn. Các chất bổ trợ hấp thu kháng nguyên và thải kháng nguyên từ từ ra từ chỗ tiêm. Chất bổ trợ còn có tác dụng lên tế bào lympho T hỗ trợ (TH). 2.8.2. Các loại chất bổ trợ thông dụng Các nhà khoa học đã tìm ra hàng trăm chất có tác dụng như chất bổ trợ cho vaccine. Tuy nhiên đa số trong các chất này, ngoài tính làm tăng khả năng miễn dịch và kéo dài thời gian miễn dịch cho vaccine, chúng lại có độc tính tương đối cao, vì thế không được sử dụng rộng rãi mà chỉ có ý nghĩa trong nghiên cứu và trong phòng thí nghiệm. Để chọn chất bổ trợ ta nên cân nhắc giữa độ an toàn và tính kích thích miễn dịch sao cho phù hợp. Hiện nay các chất bổ trợ được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất vaccine gồm các nhóm:  Nhóm chất vô cơ Nhôm hydroxit (Al(OH)3) – keo phèn 22 Nhôm phosphat (AlPO4) Nhôm kali sulfat (AlK(SO4)2.12H2O) – phèn chua  Nhóm chất hữu cơ Gồm những chất chủ yếu như protamin, mỡ động vật, dầu thực vật, dầu khoáng. Qua nhiều thực nghiệm cho thấy: một chất bổ trợ được chọn dùng để chế vaccine, ngoài hoạt tính kích thích sinh miễn dịch không đặc hiệu mạnh mẽ còn phải có tính an toàn cao, nghĩa là không gây phản ứng phụ sau khi tiêm (Nguyễn Mạnh Thắng, 2003). 2.9. Một số nét về vaccine phòng bệnh cho cá 2.9.1. Nguyên tắc ứng dụng vaccine Nguyên tắc của việc ứng dụng vaccine là dựa vào hai đặc tính cơ bản của đáp ứng miễn dịch đặc hiệu. Đó là tính đặc hiệu và sự ghi nhớ miễn dịch. Các tế bào ghi nhớ cho phép hệ thống miễn dịch phát triển sự đáp ứng mạnh hơn khi có lần tiếp xúc lặp lại với kháng nguyên. Sự đáp ứng thứ cấp này đồng thời nhanh hơn và có hiệu quả hơn sự đáp ứng ban đầu. Nguyên tắc của vaccine là sử dụng các vi sinh vật (vi khuẩn, virus) hoặc độc tố của chúng đã được cải biến (làm yếu, gây chết) làm cho chúng trở nên một tác nhân không gây bệnh nhưng không làm mất tính kháng nguyên của chúng (Nguyễn Đình Bảng và Nguyễn Thị Kim Hương, 2003). Miễn dịch học cá có lịch sử ngắn hơn nhiều so với miễn dịch học người và thú. Báo cáo đầu tiên về vaccine trên cá là nghiên cứu về vaccine phòng bệnh furunculosis của Duff vào năm 1942 (Souter, 1983), đến nay đã có nhiều công trình nghiêu cứu về vaccine cho cá. Đặc biệt từ khi nhiều nhược điểm của các biện pháp phòng trị bệnh theo con đường hoá trị liệu bộc lộ nhiều nhược điểm, gây tác hại đến người tiêu dùng và môi trường, việc nghiên cứu và sử dụng vaccine phòng bệnh cho cá càng thêm sự khích lệ. Nhưng để đạt được một loại vaccine hiệu quả cả về mặt kinh tế và môi trường thật là khó (Aasjord và Slinde, 1994). Kể từ năm 1976 cho đến năm 1993, trong vòng gần 20 năm chỉ có 3 loại vaccine cho cá được thương mại hoá, đó là: vaccine phòng bệnh enteric – redmouth, vaccine phòng bệnh furunculosis, vaccine phòng bệnh do vibrio (Souter, 1983). 2.9.2 Các dạng vaccine dùng cho cá Vaccine chết (killed vaccine) là dạng vi sinh vật đã được bất hoạt thông qua các phương pháp xử lí hoá – lí. Hầu hết các vacine được thương mại hiện nay để phòng 23 các bệnh trên động vật thuỷ sản đều dựa vào phương pháp xử lí bằng formalin (Austin, 1984; trích bởi Stoskopf S. K., 1993). Ngoài ra còn sử dụng một số hoá chất như: chloroform và phenol, hoặc các tác nhân vật lí như: sodium hydroxide, sodiumdodecyl sulfate, nhiệt độ để giết chết vi sinh vật (Stoskopf S. K., 1993). Vaccine nhược độc (attenuated vaccine): dùng các vi sinh vật đã được làm yếu, bằng cách: xử lí vi sinh vật với hoá chất ở nồng độ cận ngưỡng chết, xử lí nhiệt độ thấp. Phương pháp thông thường là nuôi cấy chúng ở môi trường không thích hợp hoặc với nhiệt độ không thuận lợi cho sự sinh trưởng. Tuy nhiên vaccine dạng này vẫn chưa được thương mại hóa vì những e ngại là vi sinh vật dùng chế vaccine có thể trở nên có độc lực mạnh hơn . Hiện nay ngoài hai dạng vaccine phổ biến trên, các nhà nghiên cứu đang hướng đến sản xuất vaccine tiểu đơn vị (subunit vaccine) và các loại peptide tổng hợp dùng làm vaccine phòng bệnh cho cá. 2.9.3. Các phƣơng pháp chủng vaccine cho cá Việc chủng vaccine trên cá có nhiều sự lựa chọn hơn so với trên thú và con người. Hiện nay hầu hết các loại vaccine sử dụng cho động vật có xương sống là ở dạng tiêm (injection) , có thể tiêm dưới da, tiêm cơ hay tiêm xoang bụng (Souter, 1983; Stoskopf S. K., 1993). Ở cá, sự tiêm xoang bụng (intraperitoneal = i.p.) cho hiệu giá kháng thể cao hơn với nhiều loài vi khuẩn và virus (Austin, 1984; Wolf, 1988), nhưng nếu tiêm chủng với số lượng cá lớn sẽ không khả thi. Các đường chủng khác như chủng qua đường miệng thông qua thức ăn hoặc qua đường hậu môn. Tuy nhiên phương pháp này không hiệu quả bởi vì vaccine bị phá hủy ở đường tiêu hóa của cá (Austin và Austin, 1987). Vì vậy, việc cấp qua lỗ hậu môn sẽ tránh được tác động phân hủy vaccine ở đường ruột cá nhưng tốn nhiều công nên chẳng ưu việt hơn phương pháp cấp bằng đường tiêm vào xoang bụng. Để chủng vacine với số lượng cá lớn, phương pháp ngâm và tắm là thích hợp nhất. Các phương pháp này thích hợp với cá nhỏ, nhưng cũng không nên chọn cá quá nhỏ vì sẽ tạo đáp ứng miễn dịch kém do hệ thống miễn dịch chưa trưởng thành (Tatner và Horne, 1984; Manning và Mugal, 1985, trích bởi Aasjord và Slinde, 1994). 2.10. Giới thiệu về phản ứng ngƣng kết dùng trong chẩn đoán miễn dịch học 2.10.1. Định nghĩa kháng nguyên và kháng thể 24 Kháng nguyên (Antigen) Kháng nguyên là những dị chất đối với cơ thể, có đặc tính khi vào cơ thể sẽ kích thích sinh ra những chất phản ứng đặc hiệu, đối lập với chúng, gọi là kháng thể. Kháng thể sinh ra sẽ phản ứng một cách đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng (Nguyễn Vĩnh Phước, 1979). Kháng thể (Antibody) Kháng thể là các protein của huyết thanh được gọi tên chung là globulin miễn dịch (immunoglobulin), được sinh ra trong huyết thanh khi một kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể, cơ thể phản ứng bằng cách sản sinh ra kháng thể để chống lại kháng nguyên. Tính chất đặc hiệu của kháng thể là kết hợp một cách đặc hiệu với kháng nguyên đã sinh ra nó (Đặng Đức Trạch và ctv., 1987; trích bởi Hoàng Hải Hóa, 2001). 2.10.2 Phản ứng ngƣng kết Là sự dính các vi khuẩn vào nhau thành đám nhờ có kháng thể tương ứng và khi có mặt dung dịch nước muối sinh lí (chất điện phân) (Vương Thị Việt Hoa và ctv., 1999). Đối với các kháng nguyên hữu hình như xác vi khuẩn, khi gặp kháng thể đặc hiệu, các vi khuẩn sẽ kết lại với nhau thành đám lớn, mắt thường có thể quan sát được. Đó là hiện tượng ngưng kết trực tiếp. Khi cơ thể được miễn dịch, trong huyết thanh có chứa nhiều kháng thể đặc hiệu. Khi cho kháng nguyên hữu hình (tế bào vi khuẩn đã chết) trộn với kháng thể đặc hiệu tương ứng, các vi khuẩn phân tán rời xa nhau trong hỗn dịch, sẽ kết lại với nhau qua cầu nối kháng thể đặc hiệu. Do mỗi cầu nối với các kháng nguyên dưới hình thức mạng lưới nhiều chiều, tạo nên những đám ngưng kết biểu hiện bằng những đám ngưng kết lổn nhổn như những hạt cát hoặc những cụm bông lơ lửng. Trong thực tế, phản ứng ngưng kết xảy ra được còn phụ thuộc nhiều điều kiện khác nhau. (Lê Văn Hùng, 2002). Kháng thể gây ngưng kết gọi là kháng thể ngưng kết, còn kháng nguyên kích thích sinh ra kháng thể ngưng kết gọi là kháng nguyên ngưng kết. Phản ứ