Điều tra và nghiên cứu bảo tồn nguồn Gen các giống hoa Cúc và hoa Lan cắt cành hiện đang sản xuất tại Đà Lạt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO Trường Đại học Đà Lạt -----------o0o------------ ĐIỀU TRA VÀ NGHIÊN CỨU BẢO TỒN NGUỒN GEN CÁC GIỐNG HOA CÚC VÀ HOA LAN CẮT CÀNH HIỆN ĐANG SẢN XUẤT TẠI ĐÀ LẠT ĐỀ TÀI CẤP TRƯỜNG TRỌNG ĐIỂM MÃ SỐ: B2005-29-41-TĐ Cơ quan quản lý: Bộ Giáo dục và Đào tạo Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Đà Lạt Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Văn Kết BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO Trường Đại học Đà Lạt -----------o0o------------ ĐIỀU TRA VÀ NGHIÊN CỨU BẢO TỒN NGUỒN GEN CÁC GIỐNG HOA CÚC VÀ HOA LAN CẮT CÀNH HIỆN ĐANG SẢN XUẤT TẠI ĐÀ LẠT ĐỀ TÀI CẤP TRƯỜNG TRỌNG ĐIỂM MÃ SỐ: B2005-29-41-TD Cơ quan quản lý: Bộ Giáo dục và Đào tạo Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Đà Lạt Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Văn Kết NHÓM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI Cán bộ tham gia thực hiện đề tài: 1. TS. Nguyễn Văn Kết 2. Th.S. Cao Thị Làn 3. Th.S. Nguyễn Thành Sum 4. NCV. Đỗ Phương Mai 5. NCV. Trương Thị Lan Anh Các đề tài sinh viên đã báo cáo 1. Khảo sát hiệu quả ức chế virus của ribazole trên năm giống cúc nuôi cấy in vitro. Đinh Thị Hạnh. Sinh viên Nông học khóa 27 2. Tác động của ribazole lên sự sinh trưởng của cúc (Farm traéng, Farm tím, Nöõ hoaøng tím, Thoï ñoû, Thoï vaøng chanh) in vitro. Nguyễn Thị Thắm. Sinh viên Tại chức Sinh học khóa 13 3. Tác động của ribazole lên sự sinh trưởng của cúc (Chrysanthemum sp.) in vitro. Phạm Thị Hằng Hương. Sinh viên Sinh học khóa 27 4. Phục tráng giống hoa cúc (Farm hồng, Pingpong vàng, Nút vàng, Nút tìm, Tia muỗng vàng) bằng ribazole. Cao Viết Tuấn. Sinh viên Nông Học Khóa 27 5. Khảo sát ảnh hưởng của biện pháp bổ trợ ribazole trong việc làm sạch virus lên sự sinh trưởng và phát triển của ba giống địa lan (Đỏ Bà Mai, Tím hột, Vàng Ba Râu) tại Đà Lạt. Vũ Thị Phương Thanh. Sinh viên Nông học khóa 27 6. Khảo sát về tình hình sản xuất các giống cúc tại Đà Lạt hiện nay. Nguyễn Thị Như Quỳnh. Sinh viên Nông học khóa 28. 1 TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Tóm tắt Qua điều tra thực tế các loại cúc và lan cắt cành tại Thành phố Đà Lạt cho thấy hiện nay có khoảng 38 giống lan đang trồng với mục đích cắt cành, trong đó có khoảng 14 giống có giá trị và được nhiều người tiêu dùng ưa chuộng. Các giống cúc cắt cành nhập vào Đà Lạt có trên 72 giống, tuy nhiên nhiều giống đã bị lãng quên, chỉ còn lại khoảng 54 giống còn có thể phục hồi. Nhằm bảo tồn các giống hoa này, chúng tôi đã tiến hành các biện pháp kiểm tra hiện trạng lây nhiễm các loại virus, và đã phục tráng thành công 14 giống địa lan, 54 giống cúc in vitro. Abstrast Lam Dong Province of Vietnam has an exceptional diversity of cutting flower of Cymbidium and Chrysanthemum with approximately 38 and 72 varieties respectively. Plant tissue culture and micropropagation techniques play an important role in conservation programme and management of botanical collection. Chrysanthemum and Cymbidium plants collected from farmers were identified the highest virus infection rate among of these species. The results obtained by observation samples of 54 varieties Chrysanthemum and 14 varieties Cymbidium. Using meristem culture and treated with Virazol in vitro suggest that the possibility could be obtained virus free plants through cultures. 2 Mở đầu 1. Tính cấp thiết của đề tài Việc du nhập ngày càng nhiều các giống hoa cắt cành là một xu hương cần thiết đề đáp ứng nhu cầu thưởng thức hoa của người dân cũng như để xuất khNu. Tuy nhiên song song với việc chạy đua thay đổi về giống trên thị trường sản xuất hiện nay thì đồng thời cũng có rất nhiều giống dần dần bị lãng quên, không phải vì các giống hoa này không đảm bảo chất lượng mà là do thị hiếu của người tiêu dùng. Việc nghiên cứu các biện pháp công nghệ trong lĩnh vực nhân giống các loài hoa cắt cành có giá trị kinh tế của địa phương nhằm mục đích bảo tồn nguồn gen trong tập đoàn hoa cắt cành là một biện pháp cần thiết cho xu hướng phát triển đa dạng về hoa cắt cành trong tương lai và tránh lãng phí một số lớn các giống hoa mà bản thân đất nước chúng ta hiện nay chưa thể lai tạo được. 2. Mục tiêu đề tài Đề tài thực hiện nhằm những mục đích sau: - Điều tra tình hình sản xuất hoa cắt cành hiện có tại Đà lạt. - Sưu tập và bảo tồn các nguồn gen quí về hoa cúc, hoa lan cắt cành, v.v...có giá trị tại tình Lâm Đồng bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro. - Nghiên cứu các điều kiện môi trường sinh trưởng thích hợp của các giống cây con bảo tồn trong điều kiện in vitro. - Nghiên cứu các điều kiện môi trường giá thể sinh trưởng thích hợp của các giống cây con vườn ươm. - Tạo môi trường thực tập và nghiên cứu cho giáo viên và sinh viên. 3. Phạm vi và giới hạn của đề tài Đề tài chỉ thực hiện nghiên cứu bảo tồn các giống cúc và các giống hoa lan cắt cành hiện còn tồn tại và đang sản xuất tại Thành phố Đà Lạt. 3 CÁC TỪ VIẾT TẮT BAP 6-benzyl-aminopurine dSm-1 deciSiemen per meter – Đơn vị biểu thị độ dẫn điện của dung dịch EC Độ dẫn điện (Electrical conductivity) IAA Indol-3-acetic acid IBA Indolbutyride acid KC Knudson (1946) Kin Kinetin (6-furfuryl-aminopurine) LM Lindemann(1970) MS Murashige and Skoog (1962) NAA
-naphthalene acetic acid NCV Nghiên cứu viên PLB Protocorm like body TDZ Thidiazuron (N-phenyl-N,-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea) VW Vacin and Went (1949) 2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid. LSD 0.5: Sai khác tối thiểu có ý nghĩa ở P = 0.5 CV% Hệ số sai dị FrW: Trọng lượng tươi NTL: Đường Nguyên Tử Lực – Đà Lạt 4 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Sơ lược về cấy mô trong công tác nhân giống cây trồng 1.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật trong nuôi cấy mô Nuôi cấy mô thực vật (hay còn gọi là nuôi cấy thực vật in vitro) là quá trình nhân giống vô tính thực vật trong ống nghiệm. Nuôi cấy mô thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các kỹ thuật nuôi cấy các bộ phận khác nhau (tế bào, mô, cơ quan) thực vật trong môi trường nhân tạo dưới điều kiện vô trùng (15, 22, 29).. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên cơ sở lý luận khoa học về tính toàn năng và khả năng phân hóa, phản phân hóa của tế bào thực vật. Cuối thế kỷ 19, nhà bác học người Đức Haberlangt (1902) là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào. Theo ông, mỗi tế bào của bất kỳ cơ thể sinh vật nào đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cả sinh vật đó, vì vậy khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh (15, 22). Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ hai trong lịch sử nuôi cấy mô thực vật, khi White, người Mỹ, nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua (Lycopersicum esculentum) với một môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose và nước chiết nấm men. Sau đó White chứng minh rằng có thể thay thế nước chiết nấm men bằng hỗn hợp ba loại vitamin nhóm B: Thiamin (B1), Pyridoxin (B6) và Nicotinic axit. Từ đó việc nuôi cấy đầu rễ đã được tiến hành trên nhiều loại cây khác nhau. Năm 1958, tính toàn năng của tế bào đã được khẳng định bằng công trình nghiên cứu của Stewart và cs. (1958) trên mô rễ cây cà rốt. Các tác giả này đã nuôi cấy mô rễ cà rốt trên môi trường đặc có nước dừa và đã thu nhận được khối mô sẹo gồm các tế bào nhu mô. Khi chuyển mô sẹo này sang môi trường lỏng có cùng thành phần và nuôi lắc thì nhận được huyền phù gồm các tế bào riêng lẽ và các nhóm tế bào. Tiếp tục nuôi cấy trên môi trường lỏng, không cấy chuyển thì thấy hình thành rễ. Đến những năm 60, khi đồng thời Stewart (1963), Wetherell và Halperin (1963) cùng thông báo rằng tế bào cà rốt tự do khi nuôi cấy trên môi trường thạch đã tạo thành hàng ngàn phôi, các phôi này phát triển qua các giai đoạn giống như quá trình tạo phôi bình thường ở cà rốt, lúc này tính toàn năng của tế bào càng được khẳng định. Từ những khám phá trên, hàng loạt các báo cáo về tính toàn năng của tế bào đã được thông báo, hầu như tất cả các cơ quan đều có thể phát triển phôi. Phôi soma đã được ghi nhận ở nhiều giống như Atrapoda, Begonia, Citrus, Coffea, Cymbidium, Hordeum, Kalanchoe, Nicotiana, Panax, Ranumculus, Solanum, Oryza... Ngày nay bằng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã nhân giống và phục tráng hàng loạt các cây trồng có giá trị như khoai tây, lan, thuốc lá, dứa, các cây lương thực, cây ăn quả.... Việc nhân giống này đã trở thành công nghệ và đã được áp dụng ở nhiều nước trên thế giới (10, 11, 15. 22, 30). 5 1.2 Công nghệ sinh học thực vật trong nhân giống cây trồng Công nghệ sinh học thực vật hình thành do áp lực tự nhiên của xã hội theo hai khuynh hướng: áp lực gia tăng năng suất và áp lực giảm năng suất mùa màng. Trước những xu hướng đó, đòi hỏi ngày càng phải đưa nhanh kỹ thuật mới vào công tác lựa chọn, nhân giống cây trồng. Sự phát triển của công nghệ sinh học thực vật theo thời gian có thể được tóm tắt như sau: từ những năm 1920 bắt đầu là lai chéo, năm 1960 là kỹ thuật gây đột biến, năm 1970 là sự phát triển kỹ thuật cấy mô, đến năm 1980 là kỹ thuật dung hợp tế bào trần và từ những năm 1990 đến nay là sự phát triển của kỹ thuật gen (10, 12, 15. 22, 30). Nhờ sự kết hợp giữa nuôi cấy mô thực vật và công nghệ gen, người ta đã tạo ra được những thuộc tính mới cho cây trồng một cách có định hướng và hiệu quả. Nhờ thuộc tính totipotent của thực vật, người ta có thể hoàn toàn tái tạo nên một loạt các cây mới hoàn chỉnh từ một tế bào mang đặc tính mới chỉ trong một thời gian ngắn. Nhờ sự kết hợp này đã giúp cho công nghệ sinh học thực vật nói chung và nuôi cấy mô nói riêng có những bước tiến mang lại hiệu quả kinh tế rất lớn. Có thể nói một cách khái quát những ưu điểm của công nghệ này là: - Chọn lọc nhanh những tính trạng mong muốn, nuôi cấy mô là con đường nhanh nhất giúp chọn lọc và biểu hiện tính trạng. - Nuôi cấy mô tạo nguồn nguyên liệu thực vật tuyệt vời cho quá trình chuyển gen ở thực vật. - Nuôi cấy mô kết hợp với kỹ thuật dung hợp tế bào trần và đột biến có thể tạo ra các dòng lai khác loài. - Giúp nhân giống vô tính với tốc độ và số lượng lớn. - Giúp tạo được cây sạch bệnh. - Thực vật nuôi cấy mô là nguồn nguyên liệu tốt để sản xuất các chất quý hiếm, đặc biệt là các dược chất. - Các cây mô là đối tượng tốt và hiệu quả của những nghiên cứu về sinh lý, sinh hóa, di truyền, bệnh lý, sinh học phân tử. - Các cây mô giúp trao đổi quốc tế nguồn giống thực vật rất dễ dàng. - Các cây mô có thể cung cấp quanh năm. 1.3 Vai trò của chất điều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy mô Chất điều tiết sinh trưởng hay còn gọi là chất kích thích sinh trưởng thực vật là các yếu tố hóa học cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật. Chất điều tiết sinh trưởng thực vật có thể là những chất tự nhiên được sản sinh với một hàm lượng rất nhỏ trong một bộ phận nào đó của cá thể thực vật hoặc là những chất được tổng hợp nhân tạo. Những chất điều tiết sinh trưởng này được vận chuyển đến các bộ phận khác của cơ thể gây nên những tác động điều tiết của cây. 6 Vai trò điều hòa của chất điều tiết sinh trưởng thực vật là khởi động cho sự hình thành các phản ứng cá biệt hay các quá trình sinh lý nhất định hoặc trì hoãn quá trình đó. Các chất điều tiết sinh trưởng thực vật gồm hai nhóm chính là auxin và cytokinin, ngoài ra gibberelin và ethylen cũng có vai trò quan trọng đối với sinh trưởng, phát triển và trao đổi chất ở thực vật. 1.3.1 Các auxin Chất auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là indol axetic axit (IAA). IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào, điều khiển sự hình thành rễ. Ngoài IAA, còn có những dẫn xuất khác là naphtyl axetic axit (NAA) và 2,4 – diclophenoxyl axetic axit (2,4-D). Các chất này cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phân chia mô và trong quá trình tạo rễ (10, 12, 40, 41). NAA, IBA, 2,4-D là những auxin tổng hợp, có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên IAA. Chúng có vai trò quan trọng đối với phân chia tế bào và tạo rễ. Đối với rễ, về cơ bản auxin ức chế sự phát triển của rễ, chỉ ở nồng độ cực thấp (10-9 -10-12g/ml) thì mới có tác dụng kích thích sinh trưởng của rễ, vượt qua ngưỡng này (10-8mg/l) thì lại thể hiện tác dụng ức chế. IAA kích thích sự ra rễ và kìm hãm sự phát triển callus. Ngược lại, 2,4-D kích thích sự hình thành callus và kìm hãm sự hình thành rễ trong môi trường nuôi cấy. Mặc dù cùng nhóm chất auxin nhưng hai chất này lại có tính chất đối kháng.. NAA được Went và Thimann (1937) tìm ra. Chất này có tác dụng làm tăng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzim và ảnh hưởng mạnh đến trao đổi chất của nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong môi trường nuôi cấy (10, 12, 40, 41). 1.3.2 Cytokinin Cytokinin là chất điều tiết sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia tế bào. Các cytokinin thường gặp là 6-benzyl aminopurin (BAP), Kinetin. Kinetin được Shoog phát hiện ngẫu nhiên trong khi chiết xuất axit nucleic. Kinetin là dẫn xuất của base nitơ adenin. BAP là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn kinetin. Kinetin và BAP cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế sự hóa già của tế bào. Ngoài ra các chất này có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp ADN, tổng hợp protein và tăng cường hoạt động của một số enzim (10, 40, 41). Benjamin và cs. (1987) đã cho rằng nồng độ BA cao (1-5ppm) kích thích sự phát triển của chồi đỉnh và đầu rễ của cây Atropa belladona. Lat và cs. (1988) cho rằng khi sử dụng kinetin để nhân nhanh cây Picrohiza kurroa phải dùng nồng độ từ 1- 5mg/l. Những nghiên cứu của Miller và Skoog (1963) đã cho thấy không phải các chất điều tiết sinh trưởng ngoại sinh tác dụng độc lập với các chất điều tiết sinh 7 trưởng nội sinh. Tác động phối hợp của auxin và cytokinin có tác dụng quyết định đến sự phát triển và phát sinh hình thái của tế bào và mô. Tỷ lệ auxin/cytokinin cao thích hợp cho sự hình thành rễ, tỷ lệ này thấp sẽ kích thích quá trình phát sinh chồi, nếu tỷ lệ này cân bằng thì thuận lợi cho sự phát triển mô sẹo. Barna và Wakhlu (1998) chỉ ra rằng tốc độ tái sinh chồi của cây Plantago ovata tăng cao khi trên môi trường sử dụng KIN 4-6 µM phối hợp với NAA 0,05µM. Das (1958) và Nitsch (1968) khẳng định rằng chỉ khi tác động đồng thời của auxin và cytokinin thì mới kích thích mạnh mẽ sự tổng hợp ADN, dẫn đến quá trình mitos và cảm ứng cho sự phân chia tế bào. Skoog và Miller (1957) đã khẳng định vai trò của cytokinin trong quá trình phân chia tế bào, cụ thể là cytokinin điều khiển quá trình chuyển pha mitos và giữ cho quá trình này diễn ra một cách bình thường (10, 12, 40, 41). 1.3.3 Các nhóm chất khác Ngoài những nhóm chất điều tiết sinh trưởng kể trên, trong nuôi cấy in vitro còn sử dụng một số nhóm chất khác như Abscicis acid, ethylen, các amino acid... Abscisis acid sử dụng ở nồng độ cao là chất ức chế sinh trưởng và trạng thái nghỉ bắt buộc. Ethylen được sinh ra trong quá trình nuôi cấy thực vật. Ethylen có thể kìm hãm sự sinh trưởng tế bào và đNy nhanh sự lão hóa trong quá trình nuôi cấy mô. Silver nitrat có thể được sử dụng để ngăn chặn ethylen hình thành trong quá trình nuôi cấy mô (40, 41). Amino acid có thể nâng cao sự tăng trưởng của tế bào và sự tái sinh cây. L. Glutamine có thể được xem như là nguồn nitơ. Enzim hydrolyzed protein N-Z amin Type A như casein hydrolyzate có thể được sử dụng hiệu quả đến 2g/l. Thêm vào đó malate, citrate, pyruvate và acid vô cơ tương tự có thể có hiệu quả trong môi trường nuôi cấy protoplast và có thể làm giảm bớt độc hại của muối amonium (Gamborg & Shyluk, 1970; Gamborg, 1986). Ngoài ra, các chất chiết của cây như coconut milk của cây quả hạch xanh có thể rất hiệu quả trong việc cung cấp phức hợp chất dinh dưỡng vô cơ không xác định và các nhân tố sinh trưởng. 1.4 Kỹ thuật vi nhân giống (micropropagation) Trong 5 thập kỷ qua đã có nhiều báo cáo về kỹ thuật vi nhân giống (Arditi và Krikorian, 1996; Chakrabarty và cs., 2001; Rasai và cs., 1995; Rout và cs., 2000). Vi nhân giống là sự nhân giống vô tính với số lượng của cây trồng thông qua nuôi cấy mô in vitro. Kỹ thuật nuôi cấy này đã được ứng dụng rộng rãi trong việc nhân giống các loài cây cảnh và những loài khác trên toàn thế giới (Chu 1992; Huetteman và Preece 1993; Mantell và cs., 1985; Prerik, 1987). Một trong những dạng thú vị và quan trọng của kỹ thuật nuôi cấy mô in vitro là khả năng tái sinh và sinh sản của cây từ nuôi cấy tế bào và mô. Dạng đơn giản nhất của tái sinh cây in vitro là kích thích sự phát triển của chồi. Kỹ thuật này tận dụng sự phát triển cá thể cho sự phát triển chồi bằng đỉnh sinh trưởng hoặc chồi bên. Trạng thái ngủ của những chồi này bị phá hũy và sự phát triển của các chồi non được kích 8 thích bằng tổ hợp các chất điều tiết sinh trưởng (thường sử dụng cytokinin) để tái sinh ra chồi con. Các chồi con này sau đó được tách ra cho phát triển rễ để tái sinh cây con. Sự tái sinh cây từ nuôi cấy mô có thể được thực hiện bằng cách nuôi cấy từ đỉnh sinh trưởng, từ callus và từ tế bào, hoặc chồi nách vì chồi nách là tiền thân của đỉnh sinh trưởng. Ngược lại, sự tái sinh bất định diễn ra tại những vị trí khác như là các đốt thân, từ lá mầm, vùng kéo dài ra của rễ. Sự tái sinh chồi bất định thường phụ thuộc vào sự có mặt của gen cấu trúc. Nhưng sự tái sinh cây từ callus và từ tế bào thường không có mặt của gen cấu trúc. Sự phát sinh cơ quan là sự hình thành các cơ quan riêng biệt như chồi hoặc rễ. Sự tái sinh phôi soma là sự hình thành cấu trúc lưỡng cực chứa cả chồi và rễ. Hầu hết các cây trồng có thể tái sinh cây theo cách phát sinh cơ quan hoặc phôi soma nhưng rất ít loài có thể được cả hai cách. Một số loài có thể tái sinh một cách dễ dàng từ nuôi cấy mô và tế bào trong khi một số loài chỉ có thể tái sinh bằng quá trình bất định. Sự tái sinh cây từ chồi nách hoặc chồi đỉnh được ứng dụng rộng rãi trong vi nhân giống do có sự biến dị ít nhất. Ngược lại sự phát sinh chồi bất định và sự tái sinh cây từ callus bởi sự phát sinh cơ quan hoặc bởi phôi soma có biến dị cao như tốc độ tái sinh của nó. 1.4.1 Các bước thực hiện trong kỹ thuật vi nhân giống Trong kỹ thuật vi nhân giống có 4 giai đoạn đặc trưng (Murashige 1974, George và cs. 1984). Giai đoạn 1: Lựa chọn mẫu cấy và nuôi cấy khởi đầu. Giai đoạn 2: Nhân nhanh chồi con hoặc chồi mầm từ mẫu ban đầu. Sự tái sinh chồi bất định là kỹ thuật nhân nhanh được sử dụng thường xuyên nhất trong vi nhân giống (Chu 1992). Môi trường nuôi cấy và điều kiện sinh trưởng trong giai đoạn này được cung cấp tối ưu để tỉ lệ nhân nhanh chồi đạt tối đa. Giai đoạn 3 : là giai đoạn tái sinh rễ từ chồi con để tái sinh cây con. Giai đoạn này cần môi trường đặc trưng hoặc không, điều này phụ thuộc vào kiểu gen của loài. Giai đoạn 4: hoàn chỉnh cây con cho thích nghi trên điều kiện trồng trên hỗn hợp đất trong nhà kính để sau đó chuyển ra đồng ruộng. 1.4.2 Các nhân tố trong môi trường nuôi cấy invitro Mức độ thành công của bất kỳ một kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào hoặc nuôi cấy cơ quan đều liên quan đến nhiều nhân tố. Nhân tố quan trọng là lựa chọn thành phần dinh dưỡng và chất điều tiết sinh trưởng. Trong hai đến ba thập kỷ qua đã có nhiều báo cáo về thành phần của các môi trường cơ bản (Sheet và Shillito, 1997; Perik 1987; Torres, 1989). Môi trường nuôi cấy Có hơn 50 công thức môi trường khác nhau được sử dụng cho nuôi cấy in vitro nhiều loại cây khác nhau (Gamborg và cộng sự, 1976; Huang và Murashige, 1977). Trong đó môi trường MS được sử dụng phổ biến nhất, có cải biên bằng sự thay đổi thành phần các vi lượng (Chand và cs., 1977; Jha và Sen, 1985; Rout và cs., 1999; Saxena và cs., 1988). 9 Môi trường dinh dưỡng bao gồm các loại muối vô cơ, nguồn cacbon, vitamin và chất điều tiết sinh trưởng. Một số thành phần khác có thể được bổ sung thêm như nitơ vô cơ, acid vô cơ và chất chiết cây trồng (Gamborg, 1986). Các muối khoáng được sử dụng như là thành phần của môi trường nuôi cấy mô tế bào. Hầu hết các môi trường chứa ít nhất 30mM nitơ vô cơ và kali vô cơ. Muối amonium có thể được sử sụng từ 2-20mM. Ảnh hưởng của muối amonium có thể thay đổi từ ức chế đến hiệu quả. Nồng độ Ca, SO4, photphat và muối Mg từ 1-3 mM là thích hợp. Ngoài ra trong môi trường cũng cần bổ sung thêm một số khoáng vi lượng. Môi trường MS (1962) hoặc Linsmainer và Skoog (1965) (LS) được sử dụng rộng rãi, đặc biệt là trong quá trình tái sinh cây. Môi trường B5 (Gamborg và cs., 1968), N6 (Chu, 1978), Nisch và Nitsch (1969) (NN) và các dẫn xuất từ các môi trường này có thể được sử dụng rộng hơn cho nhiều loại cây. Theo Huang và cs., Indra D. Bhatt và Uppeandra Dhar (2000), cây dâu tây phát triển thích hợp trên môi trường MS. 1.4.2.2 Các chất điều tiết sinh trưởng. Liều lượng chất điều tiết sinh trưởng lên môi trường nuôi cấy quyết định rất lớn đến sự thành công của nuôi cấy mô thực vật. Mor và Zieslin (1987), Rout và cs. (2000) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng và mối tương tác giữa chúng lên vi nhân giống của nhiều loại cây khác nhau, trong đó đã có báo cáo rất rõõ về ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên sự nhân nhanh chồi của nhiều loại cây khác nhau. Cytokinin là chất điều tiết sinh trưởng thích hợp cho việc nhân nhanh chồi. Theo Indra D. Bhatt và Uppeandra Dhar khi sử dụng BA, Kinetin, 2-ip trên môi trường MS, tốc độ nhân nhanh tốt nhất khi bổ sung BA. Theo kết quả nghiên cứu của Kang và cs. (1994), BA là chất điều tiết sinh trưởng thích hợp nhất cho sự nhân nhanh chồi từ mẫu lá của cây dâu Fragaria x ananassa. Loại dâu này sẽ cho số lượng chồi cao, hiệu quả nhất trên môi trường MS có bổ sung 4,0 µM BA kết hợp với 0,1 µM NAA. Tác động kết hợp giữa BA và auxin sẽ làm tăng số lượng chồi (Uppadhaya và Chandra, 1983). Hu và Wang (1983) cho rằng nồng độ cytokinin cao sẽ làm giảm số lượng chồi sinh sản, nhưng khi sử dụng nồng độ BA cao sẽ cho chất lượng chồi không tốt, chồi hình thành dạng hoa thị hoặc những nốt nhỏ ở cuối gốc. Trong nuôi cấy rễ in vitro, sự có mặt của cytokinin trên môi trường thường hạn chế khả năng ra rễ. Cây sẽ hình thành rễ trong môi trường có bổ sung auxin hoặc không cần bổ sung thêm auxin phụ thuộc vào kiểu gen của cây trồng (Rout và cs., 2000). 1.4.2.3 Nguồn cacbon và những cơ chất khác Nguồn cacbon được sử dụng trong môi trường thường từ 2-3 % đường saccaro hoặc glucose (nhưng rất ít). Những nguồn cacbon khác có thể là lactose, maltose, galactose nhưng rất ít sử dụng. Nguồn cacbon này đóng vai trò trong sự phát triển tế bào. Hầu hết các cây trồng có thể tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển nhưng với những vitamin đặc trưng như vitamin B1), vitamin B3, vitamin B6 và myo- inositol cần được bổ sung vào môi trường trong nuôi cấy in vitro để nâng cao sự sinh trưởng và sự phân hóa (Gamborg và cs., 1968). 10 Agar được sử dụng rộng rãi trên các môi trường đặc và bán đặc, nhưng một vài egllin agent khác có thể sử dụng như gelatin, agrose, aglinate và gebrite. Than hoạt tính được bổ sung vào môi trường ở các giai đoạn khác nhau của quá trình nuôi cấy in vitro. Than hoạt tính không phải là chất điều tiết sinh trưởng, nó đóng vai trò như là chất hút Nm của môi trường. Than hoạt tính có khả năng hấp thụ một số chất không có lợi cho sự phát triển của cây như các chất được sản sinh ra trong quá trình khử trùng môi trường nuôi cấy hoặc một số chất do cây trồng tiết ra. Đôi lúc than hoạt tính cũng đóng vai trò như chất điều tiết sinh trưởng (Ebert và cs., 1993; Eymar và cs., 2000; George và Sherrington, 1984). Bổ sung thêm than hoạt tính vào môi trường có thể có lợi cho việc hình thành rễ của cây do than hoạt tính có tác dụng hạn chế mức độ chiếu sáng hoặc than hoạt tính có khả năng hấp thụ các chất ức chế sự ra rễ có trong môi trường nuôi cấy. (Dumas và cs.,1995; George và Sherrington, 1984). 1.4.2.4 Nhân nhanh chồi Đây là giai đoạn cốt lõi quyết định đến sự thành công trong nuôi cấy in vitro. Có 3 cách thường được sử dụng trong vi nhân giống : thông qua callus, sự hình thành chồi bất định và chồi nách (Bhojwani và cs., 1996). Trong trường thông qua nuôi cấy chối nách, tốc độ nhân nhanh phụ thuộc vào nồng độ cytokinin thích hợp trên môi trường và sự cấy chuyển trong quá trình tái sinh cây. Trên cây dâu tây Fragaria x ananasa, tốc độ nhân nhanh chồi đạt kết quả tốt nhất khi bổ sung vào môi trường MS các chất điều tiết sinh trưởng BA (4,0 µM) và NAA (0,1 µM) sau 60 ngày nuôi cấy. Nhưng khi bổ sung vào môi trường nồng độ BA cao hơn 4,0 µM cùng với 0,1 µM NAA sẽ làm cho chồi sinh trưởng không tốt và chất lượng chồi xấu, do đó tốc độ nhân nhanh cũng giảm. 1.4.2.5 Sự hình thành rễ Sự hình thành rễ của nhiều loài cây có thể không cần bổ sung thêm chất điều tiết sinh trưởng (Saxena và cs., 1998). Rễ của nhiều loài cây có thể được hình thành dễ dàng khi nồng độ các muối khoáng giảm đi một nữa hoặc giảm hơn, và nồng độ đường giảm từ 2 hoặc 3% đến 0.5%. (Webb và Street, 1977). Theo Indra D. Bhatt và Uppeandra Dhar khi nghiên cứu ảnh hưởng của auxin (IBA, NAA) lên sự hình thành rễ của loài Fragaria x ananasa, cây ra rễ tốt nhất khi sử dụng NAA với liều lượng thấp (0.1mg/l). Rễ của một số loài cây có thể được hình thành dễ dàng hơn khi bổ sung thêm than hoạt tính vào môi trường, đôi khi có bổ sung thêm auxin. Than hoạt tính làm nâng cao sự phát triển của rễ khi rễ đầu tiên vừa được hình thành (Marthur và cs., 1999). Sự phát triển của rễ tốt hơn khi trong môi trường có chất hút các chất ức chế ra rễ hoặc làm giảm mức độ chiếu sáng bằng cách bổ sung than hoạt tính (Druart và cs., 1993; George và Sherrington, 1984). Sự phát triển sung mãn của hệ rễ của cây con trong nuôi cấy in vitro là điều kiện thiết yếu cho sự phát triển tốt của cây con trong điều kiện nhà kính và trên đồng ruộng. 11 2. Sơ lược về lịch sử nghiên cứu họ lan (Orchidaceae) và chi địa lan (Cymbidium sw.) 2.1 Khái quát chung Lan được biết đến đầu tiên ở phương Đông vào 551-479 trước công nguyên bởi Khổng Tử. Cây lan được biết đến đầu tiên ở Trung Quốc là Kiến Lan (tìm ra ở Phúc kiến) là Cymbidium enrifolium. Theo Phrastus được xem là ông tổ của thực vật học và cũng có thể nói là cha đẻ của ngành học về lan. Orchis được ông dùng để chỉ những cây lan tìm thấy ở vùng Địa Trung Hải. Thế kỷ thứ nhất sau công nguyên, Dioscorides dùng Orchis để mô tả 2 loài địa lan trong quyển sách về dược liệu của ông và được Linnaeus ghi lại trong sách “Các Loài Cây Cỏ” (Species Plantarum) vào 1753, rồi John Lindley sử dụng đầu tiên để đặt tên cho họ lan là Orchidaceae từ năm 1836 và tồn tại cho đến nay. Ở Việt Nam sự nghiên cứu về lan chưa rõ rệt lắm nhưng có lẽ người đầu tiên tìm hiểu và nuôi trồng lan là vua Trần Anh Tông, kế đến là Joanis Loureiro, là nhà truyền giáo người Bồ Đào Nha (1789) trong cuốn “ Thực Vật Chứng Nam Bộ ” (Flora Cochinchinesis) các cây lan trong cuộc hành trình đến nam phần Việt Nam và đã được Bentham và Hoocker ghi lại trong “ Các Giống Cây Cỏ” (Genera Plantarum)(1862 – 1883). F. Gagnepain và A. Guillaumin mô tả 101 giống gồm 636 loài lan cho cả 3 nước Đông Dương trong bộ “ Thực Vật Chí Đông Dương ” do Hlecomte chủ biên. Đáng kể nhất là quyển II bộ sách “ Cây Cỏ Miền Nam Việt Nam” của giáo sư Phạm Hoàng Hộ với 289 loài lan được mô tả và vẻ hình. Mới dây giáo sư đã bổ sung thêm 364 loài lan trong quyển III tập 2 của bộ sách “Cây Cỏ Miền Nam Việt Nam” xuất bản 1993. Trong đó chi Cymbidium.sw có 15 loài: C.aloifolium (Lindl.).sw, C.atropurpureum (Lindl.) Rolfe., C.banaense Gagn, C. bicolor lindl, C.dayanum Reich.b.f, C.devonianum Paxt., C.enrifolium (Lindl.).sw, C.erythrostylum Rolfe, C.filay sonianum Lindl., C.inrigne Rolfe, C.lancifolinum Hookf, C.lowianum Reich.b.f, C.schroederi Rolfe., C.sinense (Jacks)Willd., C.macroshizon Lindl.. Theo Trần Hợp trong cuốn “Phong Lan Việt Nam” tập 1 và 2 xuất bản 1988- 1990 thì họ lan Việt Nam có khoảng 368 loài, trong đó chi Cymbidium có khoảng 10 loài sau: C.aloifolium (Lindl.).sw, C.dayanum Hookf, C. devonianum Paxt., C.enrifolium (Lindl.).sw, C.evrardii Guillaum, C.grandiflorum Griff, C.inrigne Rolfe, C.lancifolinum Hookf, C.parishii Reich.b., C.poilanei Gagnep. Theo Võ Văn Chi và Dương Đức Tiến trong cuốn “Phân Loại Học Thực Vật – Thực Vật Bậc Cao” xuất bản 1978 thì họ lan ở Việt Nam có 91 chi 463 loài, trong đó chi Cymbidium có khoảng 12 loài sau: 12 C.aloifolium Swartz., C.cyperifolium Wallex Lindl, C.dayanum Reich.b.f, C. devonianum Paxt., C.ebarneum Reich.b.f, C.enrifolium Swartz., C.erythrostylum Lindl., C.giganteum Wall., C.inringne Reich.b.f., C.lancifolinum Hookf, C.polanei Gagn., C.munronianum kinget plant. 2.2 Một vài nét về địa lan Đà Lạt. Hiện nay, nhu cầu hoa tươi nói chung và hoa lan nói riêng trên thế giới và trong nước đang ngày càng tăng. Trong năm 2000 kim ngạch xuất khNu hoa lan cắt cành và giống cây lan trên thế giới đạt 150 triệu USD, trong đó chỉ riêng hoa lan cắt cành đã chiếm 128 triệu USD. Do đó việc trồng lan đã trở thành một hướng phát triển kinh tế của nhiều nước trên thế giới và đang phát triển mạnh mẽ ở khu vực Đông Nam Á. Thái Lan trở thành một nước xuất khNu hoa cắt cành và cây giống lan nhiều nhất trên thế giới. từ 1990 đến 1995 số lượng lan cắt cành xuất khNu ở Thái Lan tăng 1.7 lần, từ 15.6 triệu cành lên 26.5 triệu cành. Chính phủ Malaysia đã thấy hiệu quả kinh tế lớn của việc trồng lan nên đã giao 300 ha đất cho hiệp hội hoa lan Malaysia, với mục đích quy hoạch vùng này thành trung tâm sản xuất hoa xuất khNu. Trong những năm gần đây Nhà nước ta cũng định hướng phát triển việc trồng lan không chỉ phụ vụ cho xuất khNu mà còn phục vụ cho ngành du lịch. Các cấp lãnh đạo nhà nước từ Trung ương đến địa phương đã bắt đầu thấy được tầm quan trọng của ngành xuất khNu hoa lan nên đã có những chủ trương khuyến khích phát triển. Năm 1978, ngành xuất khNu thành phố Đà Lạt đã xuất khNu lô đầu tiên sang các nước Châu âu với 3000 cành lan., cho đến nay thì số lượng này đã tăng lên đáng kể. Hiện nay việc trồng lan đem lại hiệu quả kinh tế cao, đây là một mặt hàng thu nhiều ngoại tệ, nhưng bản thân nó lại chẳng yêu cầu phải có vốn đầu tư quá cao. Điều kiện tự nhiên của Đà Lạt phù hợp với việc trồng nhiều loài hoa, đặc bệt là hoa lan. Trong đó địa lan Đà lạt vốn nổi tiếng từ lâu về sự phong phú và vẻ đẹp độc đáo mà chỉ có địa lan ở Đà Lạt mới có được. Những năm gần đây, ngành trồng lan Đà Lạt đã có những biến chuyển đáng kể. Diện tích trồng hoa thay thế cho trồng rau ngày càng tăng. Hiện nay Đà Lạt có 400 ha trồng hoa với 300 triệu cành hoa xuất khNu hàng năm. Hướng phát triển đến năm 2010 tăng diện tích trồng lên 450 – 500 ha trong đó ưu tiên phát triển trồng lan. Thêm vào đó, với sự trợ giúp của công nghệ nuôi cấy mô, việc nhân giống và tạo ra những giống mới do lai tạo cũng dễ dàng hơn, từ đó mà thời gian trồng lan được rút ngắn lại. Hiện nay sản lượng hoa lan cắt cành đặc biệt là địa lan vẫn chưa đủ cung cấp cho nhu cầu rộng lớn của thị trường. Trong khi đó dịch bệnh thối giả hành, và một số bệnh do virus hoành hành đã làm giảm một lượng lớn số chậu địa lan có ở Đà Lạt. Do vậy ngành trồng lan trong đó Cymbidium là chủ đạo sẽ còn tiếp tục phát triển. Từ một vài dẫn liệu nêu trên, ta có thể mạnh dạn kết luận việc nuôi trồng Cymbidium ở Đà Lạt có một ưu thế tuyệt vời. Và đây là một tiềm năng to lớn mà nếu chúng ra biết cách tác động sẽ đem lại lợi nhuận cao. Họ lan là họ có số lượng loài lớn thứ 2 với khoảng 20000 - 25000 loài. Trong đó Cymbidium được mệnh danh là nữ hoàng của các loài hoa, Cymbidium có những 13 đặc điểm nổi bật cả về giá trị thNm mĩ lẫn giá trị khoa học. Vẻ tao nhã, hài hòa của chúng từ lâu đã hiện diện trong văn học nghệ thuật và gắn liền với đời sống văn hóa của con người Phương Đông. 2.3 Hình thái bên ngoài của địa lan. Về hình thái bên ngoài địa lan là những cây thân thảo, đa niên, đẻ nhánh hàng năm tạo thành những bụi nhỏ. Thân ngầm của địa lan (căn hành) thường ngắn nối những củ với nhau, … các củ lan thực chất là những cành ngắn của căn hành. Củ già, khi bị tách khỏi căn hành cũ có thể phát sinh đoạn căn hành mới, từ đó mọc lên những cây con, do đó người ta xếp Cymbidium vào nhóm lan đa thân. Củ lan (giả hành) thường có dạng con quay hay dạng hột xoài. Đường kính của giả hành từ 1cm đến 15cm. Giả hành được bao bọc bởi các bẹ lá xếp xít nhau, do đó giả hành của địa lan không rõ ràng như một số loài lan khác như denrobium, catleya. Rễ của một số loài địa lan bì sinh hay phụ sinh thường mọc bám trên vỏ cây, mặt đất. Một số loài khác có rễ ăn sâu trong bọng cây, trong đất mùn (địa sinh hay thực sinh). Những rễ mới thường chỉ mọc ở cây con, còn cây mẹ ít khi hình thành rễ mới mà chỉ thấy những rễ phụ phân nhánh từ rễ củ. Lá địa lan thường có hai dạng, dạng vảy đính theo một đoạn căn hành và dạng thực đính trên giả hành. Lá ở dạng thực đính trên giả hành thường có cuống lá, giữa bẹ lá và cuống lá có một phần phân cách, khi phiến lá rụng vẫn còn đoạn bẹ ôm lấy giả hành, một số loài không có cuống lá. Tùy theo từng loài mà hình dáng của phiến lá, gân lá rất khác nhau, gân dọc nổi rõ hay gân chìm trong thịt lá. Một số loài ít chịu rợp có phiến lá màu vàng xanh, còn lại thường là màu xanh đậm. Bản lá và độ dày của lá thay đổi tùy theo từng loài, các loài sống ở trảng trống có lá hẹp và dày hơn các loài ưa bóng rợp. Lá có dạng dải, dạng mũi mác hay dạng phiến. Đầu lá thường là nhọn, hay chia thành hai thùy. Kích thước của lá biến động từ 0.5 cm – 6cm, chiều dài thay đổi từ 10 cm – 150 cm. Chồi hoa thường xuất hiện bên dưới của giả hành từ các nách lá, tách các bẹ già đâm ra ngoài. Chồi hoa thường xuất hiện cùng với chồi thân mọc đâm ra hai phía hình đuôi cá, nhưng chồi hoa căng tròn hơn, trong khi đó chồi thân thì hơi dẹt. Các lá đầu tiên ở chồi thân mọc đâm ra hai phía hình đuôi cá, còn các lá bao ở chồi hoa thì luôn ôm chặt quanh phát hoa. Cành hoa không phân nhánh, có thể dựng đứng hay buông thõng. Cành hoa có thể mang từ vài hoa đến vài chục búp hoa xếp luân phiên theo hình xoắn ốc. Búp hoa khi đã đủ lớn bắt đầu dang xa khỏi cành hoa, xoay nửa vòng tròn để đưa cánh môi xuống dưới, sau đó búp hoa bắt đầu bung cánh. Hoa Cymbidium thoạt nhìn có 6 cánh với 5 cánh gần giống nhau và 1 cánh môi. Thực ra 3 cánh bên ngoài chính là 3 lá đài, có màu sắc giống 2 cánh hoa ở trong. Cánh hoa cuối cùng biến đổi thành cánh môi có màu sắc sặc sỡ hơn. Hoa Cymbidium là hoa lưỡng tính, đặc biệt nhị đực và nhụy cái cùng gắn chung trên một trục hợp nhụy (trụ nhị - nhụy). Trên trục hợp nhụy, thì nhị nằm ở trên cùng mang hai khối phấn màu vàng, có gót dính như keo. Khối phấn được đậy bởi một nắp màu trắng ngà, nắp này dễ mở rời và cách biệt với nuốm nhụy bởi một các mỏ nổi lên. Do hoa có cấu trúc đặc biệt như vậy nên Cymbidium trong tự nhiên quá 14 trình thụ phấn chỉ xảy ra được nhờ côn trùng. Tận cùng phía bên trong hoa có dĩa mật và đôi khi còn có tuyến tiết mùi thơm. Sau khi thụ phấn xong, bầu hoa xoay dần về vị trí cũ, bầu phình lên và tạo thành quả. Quả của lan thuộc dạng quả nang có ba góc, bên trong quả chứa hàng trăm ngàn hạt. Hạt lan có kích thước rất nhỏ trông như bụi phấn, màu vàng lụa. Khi chín, quả mở theo 3 đường góc và phát tán hạt theo gió, hạt rơi vào nơi có điều kiện thích hợp như Nm độ, ánh sáng,… thì hạt sẽ nảy mầm thành cây con. Trong tự nhiên tỷ lệ hạt lan nảy mầm là rất thấp, do đó khi chưa có công nghệ nuôi cấy mô thì việc trồng và nhân giống lan cần thời gian lâu và gặp nhiều khó khăn. 2.4 Phân loại địa lan. Trong hệ thống phân loại họ lan là một họ lớn thứ hai với 20.000- 25.000 loài chỉ sau họ cúc (A.L. Takhtajan). Loài địa lan thuộc Ngành: Magnoliophyta- Angiospermae Lớp: Liliopsida- monocotyledemes Bộ: Orchidales Họ: Orchidaceae Chi: Cymbidium. Theo các tác giả Võ Văn Chi và một số tác giả khác thì trong tự nhiên có chi Cymbidium có khoảng hơn 50 loài, và ở Việt Nam có 15 loài trong đó chỉ riêng Đà Lạt có tới 12 loài. - Cymbidium aloifolium Swartz (Hay Cymbidium aimulans Rolfe; Cymbidum Pubesecens Lindl). - Cymbidium cyperifolium. - Cymbidium dayanum Reichb.F - Cymbidium devoniaum Paxt - Cymbidium eburneum Reichb - Cymbidium ensifolium Swartz (hay Cymbidium sudaicum Schltr) - Cymbidium erythrostylum Lindl (hay Cymbidium longifolium Don; Cymbidium Limodorum Angustiflorum Ham) - Cymbidium gagiteum Wall (hay Cymbidium gradnifolium Griff; Cymbidium hookerianum. R) - Cymbidum insigne Rolfe - Cymbidium Lancifolium Hook. F (hay Cymbidium gibsonii Paxt; Cymbidium javancum Hook. F.) - Cymbidium polanei Gagn. - Cymbidium munronianum King et Plan. 15 Ở Đà Lạt ngoài 12 loài trên còn có nhiều biến chủng khác, nhưng hiện nay vẫn chưa xác định rõ loài, thứ. Từ lâu đồng bào dân tộc ở Đà Lạt đã dùng từ Tòong Plăng có nghĩa là “lan sả” để gọi những loài lan này. Nhưng cho tới khi người Pháp và người Kinh đến Đà Lạt thì phong trào trồng lan và phát triển lan ở Đà Lạt mới bắt đầu phổ biến và ngày càng phát triển. Cuối những năm 50 của thế kỷ này, một số giống lan lai đã di nhập vào Đà Lạt để thoả mãn về nhu cầu giống mới và thị hiếu của một số người chơi lan giàu có. Trong quá trình nuôi trồng lan lai, giới chơi lan đã tích luỹ dần những kinh nghiệm trong việc xác định các yếu tố giá thể, giàn che, cách tưới nước bón phân,… phù hợp với điều kiện khí hậu ở Đà Lạt. Những cây lai đó đã phát triển tốt và cho ra hoa đều đặn hàng năm. Từ đó phương pháp trồng “lan ngoại” đã được hình thành và được phổ biến nhưng cũng chỉ dừng lại trong phạm vi hẹp của những người trồng lan tiêu khiển. Trong mấy năm gần nay, phong trào trồng lan của người dân Đà Lạt đang có chiều hướng phát triển mạnh các loài địa lan, đặc biệt là các loài lan nhập nội như: Tím Hột, Miretta xanh, Xanh Chiểu, Trắng bệt, Trắng Bệt, Hồng Bệt, Miss Kim, Đỏ Bà Mai, Vàng Ba Râu, Miretta xanh,… … Vì các giống lan này cho hoa rất đẹp, màu sắc sặc sỡ, hương thơm và đặc biệt là lâu tàn nên đã làm thu hút các nhà vườn, các nghệ nhân chơi hoa, họ đã chú ý nuôi trồng và nhân giống ngày càng nhiều. 2.5 Virus hại thực vật Virus thực vật được phát hiện vào cuối thế kỉ 19 và đến đầu thế kỉ 20 có rất nhiều virus gây bệnh cho thực vật lần lượt được phát hiện như virus khảm thuốc lá dưa chuột, virus thoái hóa khoai tây, virus hại cà chua,…Virus thực vật gây nhiều thiệt hại như làm giảm chất lượng nông sản, giảm năng suất và có khi là mất 100% năng suất. Trên thế giới hàng năm bệnh virus gây thiệt hại khoảng 70 tỉ USD (Nguyễn Văn Tỵ, 2002). Tại nước ta, nhiều bệnh virus được truyền từ năm này qua năm khác gây thiệt hại một vài phần trăm cho đến 80- 90% năng suất cây trồng, đặc biệt virus gây thoái hóa nghiêm trọng các cây trồng nhân giống vô tính. Hiện nay, các cây đang trồng cũng như cây mô ở Đà Lạt đều không hoàn toàn sạch bệnh, và virus là nguyên nhân gây bệnh nghiêm trọng nhất cản trở sự phát triển của sản xuất trồng trọt hiện đại. Việc nghiên cứu và phòng bệnh virus giúp giảm thiệt hại do bệnh virus gây ra là rất cần thiết, đặc biệt là những nước có nền kinh tế dựa vào nông nghiệp là chính như nước ta. Ivanopski là người đầu tiên khám phá ra thế giới virus khi nghiên cứu bệnh trên cây thuốc lá vào năm 1892. Virus được phát hiện đầu tiên đó gây những vết khảm trên lá cây thuốc lá là Tobaco Mosaic Virus và đây cũng chính là loài virus có phổ cây chủ lớn nhất hiện nay. Cho đến nay, với sự phát triển của sinh học và sự trợ giúp của trang thiết bị, phương tiện hiện đại, con người đã phát hiện được trên 4 ngàn loại virus, trong đó có hơn 100 loại là virus hại thực vật và có tới hơn 25 loài virus gây hại trên cây lan. Như vậy, virus thực vật là những vi sinh vật có kích thước vô cùng nhỏ bé và có những đặc điểm sau đây (PGS.TS Vũ Triệu Mẫn và PGS.TS Lê Lương Tề, 2002). 16 Virus là những nucleoprotein rất nhỏ bé do đó phải quan sát chúng trên kính hiển vi điện tử. Virus có cấu tạo rất đơn giản: có hai phần chính là lõi axit nucleic và vỏ protein. Thông thường virus thực vật có vật chất di truyền là ARN, một số ít còn lại có vật chất di truyền là ADN. Virus là vi sinh vật kí sinh ở mức độ tế bào. Virus thực vật có thể nhiễm bệnh cho một hay nhiều loài cây, và mỗi loại cây có thể nhiễm một hay nhiều loài virus. Virus thực vật cũng như virus động vật, sau khi xâm nhiễm vào tế bào cây chủ chúng bắt đầu tác động đến sự trao đổi chất của tế bào, virus sử dụng vật chất của tế bào để tạo thành vô số virus con mới. Do vậy cơ thể thực vật bị kiệt quệ dần dần, thoái hóa và suy tàn có khi bị chết. Khoảng thời gian từ lúc virus bắt đầu xâm nhiễm đến khi cây thoái hóa và chết phụ thuộc vào đặc điểm gây bệnh của các loài khác nhau và phụ thuộc vào từng loài cây cũng như sức chống chịu của từng cây. 2.5.1 Thành phần cấu tạo Thông thường mỗi virus được tạo từ hai thành phần chính là protein và axit nucleic, một số virus đặc biệt còn có cả polyanin, lipit, hoặc một số men đặc hiệu. Dựa vào những hiểu biết về đặc điểm cấu tọa của virus mà các nhà khoa học đã tìm ra những chất hóa học có tác dụng làm giảm sự nhân lên của virus trong tế bào cây chủ. Protein của virus thực vật có tác dụng bảo vệ, bám giữ và có vai trò quan trọng trong việc virus truyền bệnh qua môi giới. Protein của virus thực vật cũng được tạo thành từ nhiều axit như alanin, acginin, glixin, triptophan, valin,…Các virus (ARN hay ADN) sẽ quyết định bản chất protein của chúng. Ở bên ngoài tế bào cây chủ có những điểm đặc biệt hay những thụ thể để virus nhận biết mà bám vào, từ đó mới bơm nucleic vào tế bào. Do đó từ kết quả phân tích vỏ protein của virus và biết được trình tự nhận biết đó thì sẽ tổng hợp được những chất hóa học có cấu tạo giống các thụ thể để giảm tốc độ lan truyền virus trong cây chủ. Axit nucleic của virus giữ vai trò chủ yếu quyết định tính di truyền, khả năng truyền nhiễm và gây bệnh. Phần lớn các virus thực vật có vật chất di truyền là ARN, một số ít là ADN. Cả ARN và ADN đều là những đại phân tử chứa hàng trăm ngàn các đơn vị nhỏ được gọi là các nucleotit. Mỗi nucleotit được cấu tạo từ một gốc photphat, bazơ nitơ và đường 5 carbon. Có 2 nhóm bazơ nitơ là purin và pirimidin với 5 loại là uracil, adenin, guanin, xitozin và timin. Dựa trên cấu tạo của các nucleotit mà con người đã tổng hợp nên những dẫn xuất của chúng hoặc những hóa chất mà về mặt hóa học tương tự các nucleotit này. Các hóa chất này sẽ cạnh tranh với các nucleotit để tham gia tạo thành các axit nucleic, và do đó làm sai khác trật tự nucleotit và làm giảm tốc độ tái sản xuất của virus. 2.5.2 Về cách gọi tên: tên virus thường được đặt theo qui tắc sau Tên virus = Tên cây chủ + Đặc điểm bệnh + Virus 17 Ví dụ : Tobaco Mosaic Virus: đây là virus gây hại trên cây thuốc lá, đặc điểm bệnh là gây khảm lá. Odontoglossum Ringspott Virus: virus này gây hại trên cây lan thuộc chi Odontoglossum, lá cây bị bệnh có các vết bệnh hình đốm vòng. Virus là một loại kí sinh phân tử không có cấu tạo tế bào, nhưng cũng không sinh sản bằng cách phân đôi như vi khuNn, virus sinh sản bằng cách kí sinh vài tế bào sống và “ bắt ” tế bào cung cấp vật chất cần thiết cho virus tổng hợp thành protein và vật chất di truyền của virus, sau đó các thành phần này lắp ráp với nhau tạo thành virus con. Phương thức sinh sản này người ta gọi là sinh sản tái tạo (multiplication). Như vậy sự sinh sản của virus hoàn toàn dựa vào vật chất của tế bào, làm cho tế bào kiệt quệ và dẫn đến chết. Virus thực vật muốn kí sinh và gây bệnh cho cây chủ thì virus phải bám được vào thành tế bào và xâm nhiễm vào trong tế bào. Bản thân virus không chủ động di chuyển và xâm nhập vào bên trong tế bào được. Sự xâm nhiễm của virus thực vật vào cây chủ có thể thông qua các vectơ truyền bệnh như côn trùng, bét nhện,… hoặc qua các vết thương cơ giới do con người gây ra trong quá trình cắt tỉa cây trồng. Sau khi xâm nhập được vào bên trong tế bào, sự lây lan của virus từ tế bào này sang tế bào khác có thể qua cầu nguyên sinh giữa các tế bào, hoặc qua dòng vận chuyển vật chất. Người ta cũng phát hiện ra rằng trên tế bào có một số điểm nhận biết đặc biệt mà virus có khả năng bám vào để từ đó xâm nhập vào tế bào, gọi là các thụ thể. Sau khi xâm nhiễm vào tế bào cây chủ, virus sẽ giải phóng vật chất di truyền (RNA, DNA) quá trình này gọi là sự lột áo (uncoating). Tiếp đó là quá trình tái tạo vật chất di truyền và biểu đạt gen. Đối với virus có vật chất di truyền là ARN (ARN virus), quá trình tái tạo ARN gồm tái tạo ARN của virus và mARN protein của virus. “ARN virus ” lợi dụng ribosom của cây chủ phiên dịch ra là enzym ARN- phụ thuộc ARN (ARN- dependent ARN polymerasa, RdRp). Dưới tác dụng của RdRp tế bào sẽ tổng hợp ra hàng loạt ARN con của virus và ARN tổ gen của virus, lúc này ARN tổ gen sẽ tiến hành phiên dịch ra protein vỏ áo. Cuối cùng “ARN con” và “protein vỏ áo” lắp vào nhau tạo thể virus con hoàn chỉnh. Vô số virus con được tạo thành sản sinh ra enzym phân giải màng tế báo ký chủ để phóng thích virus con ra ngoài, từ đó tiếp tục xâm nhiễm sang các tế bào bên cạnh. Đối với virus có vật chất di truyền là ADN, sự tái tạo lại vật chất di truyền có thể xảy ra theo con đường sau: đầu tiên là từ DNA sẽ phiên mã ra RNA , sau đó xảy ra quá trình phiên mã ngược từ RNA qua DNA và quá trình tổng hợp protein từ RNA. Cuối cùng là protein và DNA sẽ kết hợp với nhau để tạo thành virus mới hoàn chỉnh. Như vậy virus sử dụng vật chất của tế bào để sinh sản. Do đó virus cũng gây ra những biến đổi về sinh lí và hình thái bên ngoài của cây bị bệnh. 2.5.3 Virus gây biến đổi về sinh lí cây chủ. Virus thực vật kí sinh bên trong tế bào và sử dụng vật chất của tế bào cây để xây dựng cơ thể virus mới do đó gây ra những tác động lên quá trình tổng hợp và trao đổi chất của tế bào cây chủ. Virus có thể kìm hãm sự tổng hợp, trao đổi chất này trong khi đó lại kích thích sự tổng hợp và trao đổi chất khác. 18 Virus tác động lên quá trình hoạt động của hệ thống men trong tế bào để kìm hãm enzym phản ứng tạo nên một số chất này hay kích thích tạo ra nhiều chất có lợi cho virus. Trong cây bị bệnh virus, hoạt động một số men oxi hóa được tăng cường như oxidaza (Woods, 1899), peroxidaza (Kokin, 1937), tirodinaza, xitocromoxidaza (Martin, 1954), polyfenoloxida (Van Kammen và Drouwer, 1964), ngược lại thì hoạt động của một số men khác bị kìm hãm như catalaza (Vager, 1955). Virus gây bệnh cho cây cũng tác động lên quá trình hô hấp của cây. Những thay đổi này không ổn định (có thể cao hay thấp) tùy thuộc vào giai đoạn sinh trưởng của cây, điều kiện thời tiết hay tình trạng sinh lí của cây trồng. Bệnh virus thường làm giảm số lượng diệp lục trong lục lạp, do vậy làm giảm hiệu quả quang hợp của cây. Cùng với sự giảm số lượng diệp lục thì các sắc tố như antoxianit, carotinoit sẽ tăng lên, làm cho lá cây nhiễm bệnh virus chuyển màu từ màu xanh sang màu vàng hay nâu đỏ. Bên cạnh đó, virus thực vật còn làm thay đổi tốc độ trao đổi gluxit trong cây. Ban đầu cây bị bệnh ở bộ phận hoa, lá cây sẽ tích lũy các chất đường ở vị trí nhiễm bệnh. Nhưng về sau hàm lượng đường ở các lá bị bệnh sẽ thấp hơn so với các lá khỏe. Nguyên nhân là do virus ban đầu làm cản trở quá trình vận chuyển ở các bộ phận bị bệnh đến các bộ phận khác dẫn đến việc tích lũy đường ở các bộ phận này. Sau đó, virus sử dụng vật chất của tế bào, thúc đNy quá trình hô hấp nên hàm lượng đường ở bộ phận bị bệnh sẽ thấp hơn các bộ phận khác trong cây. 2.5.4 Virus gây biến đổi về hình thái. Thông thường cây chủ chỉ có biểu hiện bệnh ra bên ngoài khi mà đã bị nhiễm bệnh khá nặng. Một số triệu chứng về hình thái do virus gây ra: - Triệu chứng khảm lá: Là triệu chứng rất phổ biến của nhiều bệnh virus mới hại thực vật. Lá cây loang lổ chỗ xanh đậm, chỗ xanh nhạt, chỗ biến vàng (Mosaic - khảm lá). Khảm lá thường xảy ra ở các bệnh như: Virus khảm thuốc lá, khảm ớt, dưa chuột, khảm lá đậu, khảm lá táo tây. - Đốm chết hình nhẫn: Thương gặp là khảm và tạo ra đốm chết loại hình nhẫn (đốm vòng) như bệnh đốm hình nhẫn ở cây đu đủ, cây mận, cây thuốc lá, cây hoa cNm chướng. - Triệu chứng hại gân lá: Là hiện tượng bệnh phá hoại ở gân lá dẫn đến gân sáng, gân chết, gân biến dạng… như virus Y hại cây thuốc lá tạo gân sáng, virus Y hại một số giống khoai tây (tạo gân biến dạng). - Khảm lá, lùn cây: Là hiện tượng khảm lá kèm theo cây lùn như Maize mosaic dwarf virus hay khảm sóc lá (Maize strerk trip mosaic virus) ở ngô, lúa, và các cây đơn tử diệp. - Xoăn, cuốn lá: Biến dạng lá như xoăn lá cà chua, cuốn lá khoai tây, xoăn lá cây ớt, hồ tiêu. - Biến màu và biến vàng: Là những triệu chứng gây biến vàng (ở lúa), gây hoá xanh (ở cam, chanh). 19 - Lùn bụi, tàn lụi: Là hiện tượng khá phổ biến như lùn bụi ở cây lạc, cây chuối rụt, cây cam bị bệnh tritera virus. Vết chết ở thân cây, vết lõm thân như hiện tượng sưng cành táo, vết lõm thân cây cam, chanh. - Biến dạng củ, quả: Như ở táo, mận, nho bị nhiễm virus, quả cà chua bị đốm héo, củ khoai tây ở cây bị bệnh vàng lùn. Các triệu chứng bệnh trên còn phụ thuộc vào giống cây kí chủ, điều kiện môi trường và chủng loại virus gây bệnh mà có sự biến đổi. Cùng một loại virus mà ở ba nhóm chủng khác nhau có thể thể hiện thành nhiều nhóm triệu chứng khác nhau. Bên cạnh đó các triệu chứng bệnh này không mang tính đặc thù, ví dụ như virus bệnh đốm vòng thì vết bệnh cũng tương tự như bệnh đốm do một số loài nấm gây nên. Do đó bệnh virus không chỉ khó phát hiện khi mới chớm bị, mà khi bị nặng và có biểu hiện bệnh ra bên ngoài thì cũng rất dễ nhầm với bệnh do bệnh sinh lí, bệnh nấm, hay một số tác nhân khác gây ra. Tóm lại virus