Định danh nấm phytophthora spp bằng các kỹ thuật sinh học phân tử

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC * * * * * * * NGUYỄN HUỲNH HOÀNG MINH ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp. BẰNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC * * * * * ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp. BẰNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH:CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN NGUYỄN HUỲNH HOÀNG MINH KS. TRỊNH THỊ PHƢƠNG VY KHÓA: 2002 - 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY * * * * * IDENTIFYING Phytophthora spp. BY MOLECULAR TECHNOLOGIES GRADUATION OF THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor: Student: PhD. LE DINH DON NGUYEN HUYNH HOANG MINH Bs. TRINH THI PHUONG VY TERM: 2002 - 2006 HCMC, 8/2006 iv LỜI CẢM ƠN - Em xin chân thành gửi lời cảm ơn của mình đến cán bộ giáo viên Trường Đại Học Nông Lâm, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài này. - Em rất biết ơn sự hướng dẫn của thầy Tiến sĩ Lê Đình Đôn, Kỹ sư Trịnh Thị Phương Vy, Kỹ sư Nguyễn Văn Lẫm đã tận tình hướng dẫn em trong suốt thời gian thợc hiện đề tài. - Cảm ơn thầy cô, anh chị giảng viên Phòng Công Nghệ Sinh Học – Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài. - Xin gửi lời cảm ơn đến các bạn thực tập đề tài tại Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, đặc biệt là các bạn nhóm Bảo Vệ Thực Vật trong thời gian qua đã tận tình giúp đỡ. - Cảm ơn tập thể lớp Công nghệ sinh học khóa 28 đã cùng tôi chia sẽ những kỉ niệm buồn vui trong suốt thời gian bốn năm học vừa qua. Tp. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2006 Sinh viên Nguyễn Huỳnh Hoàng Minh v TÓM TẮT Nguyễn Huỳnh Hoàng Minh, Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. “ ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp. BẰNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ”. Giáo viên hướng dẫn: TS. Lê Đình Đôn KS. Trịnh Thị Phương Vy Nấm Phytophthora được xem là một trong những tác nhân nguy hiểm hàng đầu cho nền kinh tế nông nghiệp nước ta hiện nay. Dựa trên một số kết quả đạt được từ những nghiên cứu trước đây về hình thái và sinh thái của giống nấm này, chúng tôi đã đề nghị qui trình định danh giống nấm này trên cơ sở cấu trúc di truyền của chúng. Mục đích của đề tài bao gồm việc sử dụng kỹ thuật PCR, kỹ thuật giải trình tự nhằm khuếch đại và xác định vùng trình tự đặc trưng ITS1- 5,8S- ITS2. Kết quả của đề tài tạo cơ sở cho những nghiên cứu điều tra và kiểm soát mầm bệnh Phytophthora ở nước ta. Sau khi thực hiện toàn bộ qui trình, chúng tôi thu được một số kết quả sau: - Sản phẩm khuếch đại trong vùng ITS1- 5,8S- ITS2 của hai mẫu nấm trên tiêu Bà Rịa và sầu riêng Đồng Nai là 900 bp. Trong khi sản phẩm khuếch đại của hai mẫu nấm trên địa lan cho band 800 bp hoặc 900 bp hoặc cả hai band trên. - Kết quả giải trình tự hai mẫu nấm trên địa lan cho thấy trình tự của toàn vùng ITS1- 5,8S- ITS2 khoảng 800 bp. Trong đó vùng ITS1 khoảng 225 bp; vùng 5,8S là 160 bp và vùng ITS2 là 420 bp. vi MỤC LỤC .......o0o....... Trang Lời cảm ơn ............................................................................................................ iv Tóm tắt ................................................................................................................... v Mục lục ................................................................................................................. vi Danh mục các hình .............................................................................................. ix Danh mục các bảng................................................................................................ x Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................... xi 1. Giới thiệu ........................................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề ........................................................................................................ 2 1.2 Mục đích – yêu cầu của đề tài ......................................................................... 2 1.2.1 Mục đích của đề tài ....................................................................................... 2 1.2.2 Yêu cầu của đề tài ......................................................................................... 2 1.2.3 Giới hạn của đề tài ........................................................................................ 2 1.2.4 Đối tượng của đề tài ..................................................................................... 2 2. Tổng quan .......................................................................................................... 3 2.1 Giới thiệu về giống Phytophthora ................................................................... 3 2.1.1 Cây tiến hoá của Phytophthora .................................................................... 4 2.1.2 Chu kì sống của Phytophthora ..................................................................... 4 2.1.3 Phân lập Phytophthora từ các bôl phận nhiễm bệnh của cây ....................... 5 2.1.4 Một số môi trường phân lập Phytophthora từ mô bệnh ............................... 6 2.1.5 Đặc điểm hình thái của giống Phytophthora ................................................ 6 2.1.6 Phân biệt nấm Pythium và nấm Phytophthora ............................................. 7 2.2 Một số bệnh Phytophthora được nghiên cứu tại Việt Nam ............................ 7 2.2.1 Cà chua và khoai tây ..................................................................................... 8 2.2.2 Khoai sọ ........................................................................................................ 8 2.2.3 Dứa ............................................................................................................... 8 2.2.4 Họ cam chanh ............................................................................................... 8 2.2.5 Sầu riêng ...................................................................................................... 9 vii 2.2.6 Mận ............................................................................................................... 9 2.2.7 Cao su ......................................................................................................... 10 2.3 Các kỹ thuật phát hiện và định danh Phytophthora ...................................... 11 2.3.1 Kỹ thuật quan sát hình thái trên môi trường nuôi cấy ................................ 11 2.3.2 So sánh sự tương xứng giữa sinh sản và sinh dưỡng ................................. 12 2.3.3 Kỹ thuật protein profile .............................................................................. 12 2.3.4 Isozyme ....................................................................................................... 13 2.3.5 Huyết thanh học và kit chuẩn đoán ............................................................ 13 2.3.6 Kỹ thuật RFLP ( Restriction Fragment Length Polymorphism ) ............... 14 2.3.7 Kỹ thuật probe acid nucleic, DNA fingerprinting ..................................... 14 2.3.8 Sự lai DNA-DNA ....................................................................................... 15 2.3.9 Kỹ thuật PCR và RAPD ............................................................................. 15 2.4 Một số công trình nghiên cứu định danh nấm Phytophthora ........................ 15 2.4.1 Một số công trình nghiên cứu ngoài nước .................................................. 15 2.4.2 Công trình nghiên cứu trong nước.............................................................. 17 2.5 Một số lưu ý trước khi thực hiện thí nghiệm ................................................. 18 2.5.1 Sơ lược về trình tự ITS ............................................................................... 18 2.5.2 Danh mục các loài Phytophthora được tìm thấy ở Việt Nam .................... 19 3. Vật Liệu và phương pháp ................................................................................ 21 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài .......................................................... 21 3.1.1 Thời gian thực hiện ..................................................................................... 21 3.1.2 Địa điểm thực hiện ..................................................................................... 21 3.2 Vật liệu và hoá chất ....................................................................................... 21 3.2.1 Tăng sinh và nhân sinh khối ...................................................................... 21 3.2.2 Ly trích DNA .............................................................................................. 22 3.2.3 Điện di ........................................................................................................ 22 3.2.4 Kỹ thuật PCR .............................................................................................. 23 3.3 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 23 3.3.1 Tăng sinh và nhân sinh khối ....................................................................... 23 3.3.2 Ly trích DNA .............................................................................................. 24 3.3.3 Kỹ thuật PCR .............................................................................................. 26 3.3.4 Kỹ thuật giải trình tự .................................................................................. 28 viii 3.3.5 Xử lý kết quả giải trình tự .......................................................................... 29 4. Kết quả và thảo luận ........................................................................................ 30 4.1 Quá trình tăng sinh và nhân sinh khối ........................................................... 30 4.2 Quá trình ly trích .......................................................................................... 30 4.3 Quá trình PCR ............................................................................................... 31 4.4 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR .................................................................. 35 4.5 Xử lý kết quả giải trình tự ............................................................................. 36 5. Kết luận và đề nghị .......................................................................................... 44 6. Tài liệu tham khảo ........................................................................................... 45 7. Phụ lục ............................................................................................................. 47 ix Danh sách các hình Hình 2.1. Chu kì sống của Phytophthora .............................................................. 4 Hình 2.2. Một số bệnh do Phytophthora gây ra trên một số cây trồng ............... 10 Hình 2.3. Vùng trình tự ITS trong DNA ribosome ............................................. 18 Hình 4.1. Sản phẩm của qui trình 1 ..................................................................... 31 Hình 4.2. Sản phẩm của qui trình ly trích 2 ........................................................ 31 Hình 4.3. Thang nồng độ DNA chuẩn ................................................................. 32 Hình 4.4. Kết qủa phản ứng PCR ........................................................................ 33 Hình 4.5. Sản phẩm PCR lần thứ hai ................................................................... 34 Hình 4.6. Mẫu tinh sạch dùng cho phản ứng giải trình tự ................................... 36 Hình 4.7. Cây phát sinh loài của hai mẫu địa lan ................................................ 40 x Danh sách các bảng Bảng 2.1. Cây tiến hoá của nấm Phytophthora…………………………………..4 Bảng 2.2. Danh mục các loài nấm Phytophthora được tìm thấy ở Việt Nam ..... 19 Bảng 3.1. Thành phần cho phản ứng PCR thể tích 25 l ..................................... 26 Bảng 3.2.Thành phần cho phản ứng PCR thể tích 50 l ...................................... 27 Bảng 3.3.Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR ........................................................... 27 Bảng 4.1. Các nguồn nấm trên ngân hàng gen được dùng để so sánh ............... 37 Bảng 4.2. So sánh trình tự nucleotide vùng ITS của hai mẫu DL1, DL2 ........... 38 Bảng 4.3. Kết quả so sánh từng vùng trên đoạn ITS1- 5,8S- ITS2 ..................... 40 Bảng 4.4. Trình tự vùng gen (ITS1-5.8S-ITS2) của mẫu Phytophthora địa lan 42 xi DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT bp: base pair Kbp Kilobase pair DNA: Deoxyribonucleic acid dNTP: 3’- Deoxyribonucleoside- 5’- triphosphate dGTP: deoxyguanosine triphosphate dCTP: deoxycytidine triphosphate dATP: deoxyadenosine triphosphate dTTP: deoxythymidine triphosphate ETDA: Ethylenediamine tetraacetic acid PCR: Polymerase Chain Reaction RFLP: Restriction fragment length polymorphism RAPD: Random Amplified Polymorphism DNA RNA: Ribonucleic acid rDNA: ribosome Deoxynucleotide acid SDS: Sodium dodecyl sulfate TAE: Tris Acetate EDTA Taq: Thermus aquaticus UV: Ultraviolet (light) w/v: Weight for volume 1 Phần 1. GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề: Nấm Phytophthora được xem là một tác nhân gây bệnh nguy hiểm cho cây do sức tàn phá mãnh liệt của nó. Nó gây ra những căn bệnh như: bệnh thối rễ, thối lỡ cổ rễ, loét thân, tàn lụi lá, thối trái và đặc biệt nguy hiểm là bệnh mốc sương trên khoai tây. Việc phân lập và định danh nấm Phytophthora để tìm ra các phương cách phòng trừ hữu hiệu là một nhu cầu cấp thiết. Hiện nay, người ta chỉ định danh được khoảng 60 loài Phytophthora chính thức được phân bố trên nhiều ký chủ ở nhiều vùng khí hậu khác nhau trên thế giới. Các loài Phytophthora này đặc biệt phát triển mạnh ở các nước có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới trong đó có Việt Nam. Những nghiên cứu về Phytophthora ở Việt Nam chỉ nhằm mục đích phát hiện sự lây lan và phát triển bệnh. Mặt khác, do đặc tính của các loài Phytophthora gần giống nhau và rất biến đổi cho nên các kỹ thuật định danh trước đây (chẳng hạn như kỹ thuật quan sát hình thái) không thể định danh được một số loài. Ngày nay, dựa trên những tiến bộ khoa học kỹ thuật mà đặc biệt là những tiến bộ về các kỹ thuật sinh học phân tử ta có thể giải quyết những khó khăn trên. Các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại với các kỹ thuật như: kỹ thuật PCR, kỹ thuật sử dụng enzyme cắt, kỹ thuật đọc trình tự,…. tác động lên cấu trúc phân tử DNA của các loài nấm từ đó cho phép việc định danh chúng một cách chính xác hơn. Với sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học và được sự hướng dẫn của Tiến Sĩ Lê Đình Đôn, Kỹ Sư Trịnh Thị Phương Vy ( Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật- Khoa Nông Học). Chúng tôi đã thực hiện đề tài ” ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp. BẰNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ” nhằm hoàn thiện qui trình định danh nấm Phytophthora bằng các kỹ thuật sinh học phân tử. 2 1.2. Mục đích – yêu cầu của đề tài 1.2.1 Mục đích của đề tài Định danh nấm Phytophthora.bằng các kỹ thuật sinh học phân tử. Cụ thể là sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi ITS4 và ITS5 để khuếch đại vùng ITS1 và ITS2 trong ribosomal DNA của nấm Phytophthora. Sau đó dùng kỹ thuật đọc trình tự để định danh các mẫu nấm trên. 1.2.2 Yêu cầu của đề tài - Tăng sinh, nhân sinh khối các mẫu nấm Phytophthora trên nhiều loại cây trồng ở một số vùng khác nhau. - Phát hiện đoạn gen ITS1- 5,8S- ITS2 bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi ITS4 và ITS5. - Sử dụng kỹ thuật đọc trình tự để định danh các mẫu nấm đã phân lập ở trên. 1.2.3 Giới hạn của đề tài Đề tài chỉ thực hiện được trên các mẫu nấm phân lập được ở một số cây trồng thuộc vùng Đông Nam Bộ. Do đó, đề tài chỉ định danh được ở một mức độ giới hạn các loài nấm Phytophthora ở Việt Nam. 1.2.4 Đối tƣợng của đề tài Các mẫu nấm được lấy từ nhiều loại cây khác nhau như: Tiêu, Sầu Riêng, các loại Lan tại các tỉnh như: Đồng Nai, Bà Rịa Vũng Tàu. 3 Phần 2. TỔNG QUAN 2.1. Giới thiệu về giống Phytophthora Tên của giống nấm bệnh Phytophthora có nguồn gốc từ tiếng Hi Lạp (Phyto có nghĩa là thực vật; phthora có nghĩa là vật phá hoại ). P.infestans còn được biết như loài nấm gây nên nạn mất mùa khoai tây ở Ailen. Nó đã phá hoại trên diện rộng những vụ mùa chính của khoai tây trong suốt hai năm 1845 và 1846. Căn bệnh này đã gây nên tác hại nghiêm trọng về kinh tế và xã hội cho đất nước này, đó là nạn đói và sự ra đi của hai triệu cư dân. Sau đó vài thập kỷ nó lại gây nên một cuộc tranh cải lớn về bệnh tàn lụi muộn, Anton de Bary cũng như Rev. Miles Joseph Berkeley trước đó đã khẳng định: giống nấm này có thể là nguyên nhân chính gây nên bệnh tàn lụi muộn. Và cho đến năm 1876 nó có tên là Phytophthora infestans (Bary). Bệnh Phytophthora đã được nghiên cứu sâu ở châu Âu. Tuy nhiên đây lại là bệnh khá phổ biến ở vùng nhiệt đới ẩm và gây nhiều bệnh nguy hiểm làm mất mùa ở nhiều loại cây ăn quả quan trọng ở những vùng này: như bệnh thối rễ, thối lỡ cổ rễ, loét thân, tàn lụi lá và thối trái. Có thể nói Phytophthora là một nhóm lớn thuộc lớp Oomycetes, có mặt khắp mọi nơi trên thế giới và có hơn 1.000 cây kí chủ, một vài loài của Phytophthora đã trở thành dịch hại (Gregory, 1983). Trong khi P. cinnamomi được tìm thấy ở vùng nhiệt đới thì P. palmivora, P. parasitica và P. citrophthora là đặc trưng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới; P.infestans, P.syringae và P.fragariae xuất hiện phổ biến ở vùng ôn đới. 4 Hình 2.1. Chu kì sống của Phytophthora (SI-AMMOUR, 2002) 2.1.1. Cây tiến hóa của Phytophthora (Andre’ Drenth, 2001) Bảng 2.1. Cây tiến hoá của nấm Phytophthora Ngành Lớp Bộ Họ Giống Chromista Oomycetes Lagenidiales Leptomitales Saprolegniales Saprolegniaceae Achlya Saprolegnia Peronosporales Pythiaceae Pythium Phytophthora Peronosporaceae Bremia Peronospora Albuginaceae Albugo 2.1.2. Chu kì sống của phytophthora 5 Khi Phytophthora được nuôi cấy trong môi trường thích hợp, khuẩn ty (Mycelium) của nó phát triển rất nhanh. Dưới điều kiện ẩm ướt chúng tạo ra những bào tử vô tính được gọi là túi bào tử (Sporangia) hoặc túi bào tử động (Zoosporangia). Túi bào tử này nảy mầm trong môi trường nước hoặc khi nhiệt độ môi trường giảm. Chúng phóng thích ra những bào tử động (Zoospores) với hệ lông roi không đều nhau (Heterokont flagella). Những bào tử động sau khi được phóng thích sẽ bơi lội hàng giờ liền và cuối cùng ngừng bơi lội để cuộn tròn hay kết kén. Sau một thời gian chúng hình thành vách tế bào. Ở giai đoạn này, bào tử được gọi là kén hay nang (Cyst). Bào tử vách dày (Chlamydospore) ở dạng hình cầu hay oval, là một cấu trúc nghỉ vô tính. Cấu trúc hữu tính bao gồm túi giao tử đực (Antheridium - bộ phận sinh sản đực) và túi noãn ( Oogonium - bộ phận sinh sản cái). Quá trình giảm phân hình thành nên túi giao tử đực và túi noãn. Đây chỉ là giai đoạn đơn bội trong vòng đời của Phytophthora. Giai đoạn lưỡng bội đóng vai trò quyết định trong suốt chu kì sống của chúng. Các vòi thụ tinh từ túi giao tử đực sẽ thoát vị đưa nhân của giao tử đực vào noãn. Hợp tử sau khi được thụ tinh sẽ nảy mầm ở điều kiện thích hợp tùy thuộc vào sự kết hợp của trứng với một hay nhiều ống giao tử đực. Giống Phytophthora bao gồm một số loài nấm dị tản (Heterothallic)(có hai kiểu lai A1và A2) chẳng hạn như P.infestans. Số còn lại là những loài nấm đồng tản (Homothallic) bao gồm cả P. sojae hoặc P. porri. 2.1.3. Phân lập Phytophthora từ các bộ phận nhiễm bệnh của cây Các loài Phytophthora chỉ tấn công trên các bộ phận khỏe mạnh của cây bao gồm cả rễ. Do đó, mầm bệnh có thể hiện diện khi không có dấu hiệu rõ ràng. Các loài Phytophthora khó phân lập từ các mô hoại tử bởi vì các mô này thường che giấu nhiều mầm bệnh thứ cấp. Sự phân lập thành công các loài Phytophthora từ mô bệnh bao gồm sự lựa chọn cẩn thận các mô bị lây nhiễm mới nhất. Cho nên, muốn thu được mẫu tốt nhất từ những bộ phận này ta nên lấy mẫu từ mép của một vết thương đang phát triển nhanh. Mẫu mô lá hay thân lý tưởng được chọn cho việc phân lập nên chứa cả phần bệnh và phần mô khỏe. Mô thu được sau đó được xử lý vô trùng bề mặt rồi chuyển sang môi trường chọn lọc thích hợp (A. Drenth và B. Sendall, 2004). 6 2.1.4. Một số môi trƣờng phân lập Phytophthora từ mô bệnh - Môi trường 3-P dùng để phân lập mô mới nhiễm bệnh . - Môi trường 3-P + 10 mg/ml pimaricin dùng để phân lập trên mô cây già hay đất. - Môi trường Hymexazol-25 và Hymexazol-50 hạn chế sự phát triển của Pythium đồng thời cũng hạn chế sự phát triển của một số loài Phytophthora. - Môi trường P10VP phân lập Phytophthora từ đất và mô bị bệnh. - Môi trường P10ARP và P5ARP là những môi trường dùng để phân lập hầu hết các loài Phytophthora. 2.1.5. Đặc điểm hình thái của giống Phytophthora Ta có thể xác định một số loài Phytophthora thông qua một số đặc điểm hình thái sau (A. Drenth và B. Sendall, 2004): - Túi bào tử Hình thái túi bào tử (hình dạng, kích thước, chiều dài, chiều rộng,…), hệ gai của túi, tính rụng sớm của chúng. Chiều dài của cuống trên túi bào tử. Sự tăng sinh của túi bào tử. Nhánh của cuống túi bào tử mà trên đó túi bào tử sinh ra. Một số loài Phytophthora tạo ra bào tử ngay trên môi trường Agar, trong khi nhiều loài khác cần dược nuôi cấy trong nước, dung dịch muối khoáng và dịch trích từ đất pha loãng trước khi chúng tạo ra bào tử. Điều quan trọng hơn là sự tạo ra bào tử trên Phytophthora phụ thuộc vào điều kiện ánh sáng. - Chlamydospore và sự trương phồng sợi nấm: Chlamydospore là một bào tử vách dày có chức năng như một bào tử nghỉ. Chúng có thể chỉ là một đốt (nằm giữa sợi nấm) hoặc ở tận cùng (nằm ở cuối sợi nấm). Hình thái của chlamydospore không khác biệt nhiều giữa các loài. Tuy nhiên sự hiện diện (trên P. palmivora) hay sự vắng mặt (trên P. hevae) của chlamydospore có thể xác định ở mức độ loài. - Cấu trúc sinh sản hữu tính: Khoảng một nửa các loài Phytophthora ở dạng đồng tản (homothallic) chúng sẽ sản xuất bộ phận sinh sản đực, bộ phận sinh sản cái và bào tử động trên cùng một môi trường. Phần còn lại là dạng dị tản (heterothallic) với hai kiểu lai A1 và A2. Dạng dị tản tạo ra túi giao tử (túi giao tử đực và túi noãn) chỉ khi có sự hiện diện của một dòng 7 phân lập mọc đối trên cùng môi trường.Việc xác định loài nấm thuộc nhóm đồng tản hay dị tản phụ thuộc vào túi bào tử đực của chúng là amphigynuos (túi giao tử đực nằm quanh thân túi noãn) hay paragynuos (túi giao tử đực nằm tiếp theo túi noãn). 2.1.6. Phân biệt nấm Pythium và nấm Phytophthora Khi phân lập các loài nấm Phytophthora, một trong những vi sinh vật mà chúng ta thường đối mặt là Pythium. Phytophthora và Pythium đều thuộc họ Pythiaceae và chúng có mối quan hệ di truyền rất gần nhau. Sự khác nhau giữa hai giống này bao gồm sự khác nhau về cách tạo ra bào tử động: Ở Phytophthora bào tử động được sản xuất bên trong túi bào tử. Ở Pythium, bào tử động phát triển bên trong nang được sản xuất bởi túi bào tử. Đây là đặc điểm quan trọng nhất dùng để phân biệt Phytophthora và Pythium. Các đặc điểm khác chỉ từ đặc điểm này mà ra. 2.2. Một số bệnh Phytophthora đƣợc nghiên cứu ở Việt Nam Những thông tin chính quan tâm đến sự hiện diện, sự phân bố của bệnh Phytophthora ở việt Nam được điều tra và kiểm soát bởi Viện Bảo Vệ Thực Vật Quốc Gia ở Hà Nội. Từ những kết quả điều tra và những nghiên cứu ngoài đồng, 13 loài Phytophthora đã được tìm thấy ở Việt Nam. Sau đây là những thông tin về bệnh Phytophthora trên một số cây trồng chính tại Việt Nam theo ghi nhận của Thanh, Ngo, Viên và Andre’ Drenth năm 2004. 2.2.1. Cà chua và khoai tây Bệnh tàn lụi lá là bệnh chính trên nhóm cây trồng này. Được nghiên cứu ở vùng đồng bằng sông Hồng trong những năm 1960. Tác nhân gây bệnh là Phytophthora infestans và bệnh xuất hiện hàng năm từ tháng 12 đến tháng 3 khi điều kiện khí hậu lạnh và ẩm; gây mất mùa 30 – 70%, trong trường hợp xấu bệnh gây mất mùa toàn bộ (Vũ, 1973). Điều đáng lưu ý là phạm vi ảnh hưởng của bệnh cao hơn mức trung bình ở những vùng đất sét. Bệnh dược khống chế bằng phun 1% Bordeaux. Ngoài ra thuốc diệt nấm Maneb và Zineb 0,2 – 0,3% a.i. cũng được xem là có hiệu quả phòng chống P. infestans cao. 2.2.2. Khoai sọ Bệnh tàn lụi lá gây ra bởi P. colocasiae được xem là bệnh chính trên khoai sọ ở Bắc Việt Nam. Bệnh được báo cáo đầu tiên bởi Roger (1951). Nhiệt độ ấm (24 – 30 0C) và ẩm độ cao là yêu cầu cho bệnh lan rộng. Bệnh xuất hiện hằng năm, bắt đầu 8 vào giữa tháng 4, tháng 5 và cao điểm ở tháng 7, tháng 8 khi nhiệt độ ổn định ở 27 – 29 0C, lượng mưa trung bình trong tháng ở mức 201 – 308 mm. 2.2.3. Dứa Bệnh thối nõn dứa là một trong những bệnh chính gây mất năng suất dứa. Bệnh được tìm thấy ở tất cả các vùng trồng dứa trên khắp đất nước gồm Thừa Thiên Huế, Nghệ An, Hà Tây, Bắc Giang, Thanh Hóa và Ninh Bình. Giống dứa cayenne mẫn cảm với bệnh hơn các giống dứa khác. Một điều thú vị là ở những vùng có pH đất thấp (3,5 – 4,2) như Tiền Giang và Tp. Hồ Chí Minh, bệnh thối nõn dứa không được tìm thấy. Tuy nhiên, điều này không rõ là do pH thấp hoặc là do một yếu tố khác. Tác nhân gây bệnh là P. cinnamomi và P. nicotianae, điều này được chứng minh bởi các thí nghiệm trong nhà kính được kiểm soát tại Viện BVTV quốc gia ở Hà Nội năm 2001 (Ngô và cộng sự, 2001). 2.2.4. Cây cam quýt Phytophthora citrophthora được báo cáo đầu tiên trên cam ở đồng bằng sông Cửu Long trong những năm 1950 và không được theo dõi mãi đến những năm 1970, khi bệnh có mặt ở tất cả các vùng trồng cam quýt, như vùng Thanh Trà ở Thừa Thiên Huế, Ninh Bình ở Tiền Giang. P. citrophthora tấn công thân và quả, với các biểu hiện triệu chứng, làm chảy nhựa và thối quả. Sự phát triển nhanh trong mùa mưa, nguy hiểm nhất là vào tháng 7 và tháng 8. Vào tháng 3 năm 2002, tỷ lệ mắc bệnh trên cam ở Cao Phong – Hòa Bình là 10% nhưng sau đó đã tăng lên 20 – 30% vào tháng 8. Quýt bị ảnh hưởng nhiều hơn, với nhiều vườn đã bị mất năng suất và chết cây. Những mẫu lấy từ mô cây cam quýt bị loét thân ở tỉnh Tiền Giang được nhận biết là P. nicotianae (A. Drenth, thông tin chưa công bố). 2.2.5. Sầu riêng Sầu riêng (Durio zibethinus Murr) là một trong những cây ăn trái được ưa thích nhất ở miền Nam Việt Nam và diện tích trồng sầu riêng ngày càng được mở rộng do trồng chúng có hiệu quả kinh tế hơn các cây trồng khác. P. palmivora là tác nhân gây bệnh ở sầu riêng, bao gồm thối rễ, loét thân, thối trái và rụng lá. Nó được tìm thấy trong tất cả các vùng trồng sầu riêng ở những vùng cả miền Nam và miền Trung Việt Nam. Trong năm 2001, bệnh đã ảnh hưởng đến cả các vùng thấp trồng sầu riêng và đặc biệt nghiêm trọng ở tỉnh Quảng Nam. Trong 9 3075 cây trồng ở xã Quế Trung, có 2138 cây bị chết do P. palmivora, gây thiệt hại kinh tế 15 tỉ đồng VND (1,5 triệu USD). Những nơi khác, bệnh đã được tìm thấy phổ biến nhất ở Cái Bè, Tiền Giang, với 24,6% cây bị nhiễm bệnh. Tỷ lệ mắc bệnh có liên quan với tuổi cây, những cây hơn 10 tuổi là mẫn cảm với bệnh nhất. 2.2.6. Mận Trong những năm gần đây bệnh đốm đen trên mận (Prunus salicilas) đã làm giảm lượng thu hoạch một cách đáng kể ở tỉnh Bắc Hà và Mộc Châu. Phytophthora cactorum được nhận biết là tác nhân gây bệnh. Ở Bắc Hà vào tháng 3 năm 1996, bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng trên 300ha mận làm mất mùa 20%. Suốt những năm 1997 và 1998, bệnh lan rộng ít hơn nhưng mức độ tàn phá thì mãnh liệt hơn, với những vướn bị đốm đen thì mất mùa trên 50%. Triệu chứng bệnh trên mận là những điểm úng nước màu trắng xám trên trái non, phát triển thành những đốm đen trũng với rìa mép màu nâu. Trong vài trường hợp bệnh nặng, toàn bộ trái bị khô quắt lại và rụng khỏi cây. Những đốm trũng được bao phủ bởi những sợi nấm trắng trong điều kiện ẩm ướt, P. cactorum được phân lập từ những đốm đen trong điều kiện này. Nhiệt độ mát (nhiệt độ ngày 14 – 180C), chênh lệch nhiệt độ ngày đêm cao, ẩm ướt và có sương mù được xem là điều kiện lý tưởng cho P. catorum lây nhiễm. Do vật bệnh tăng nhanh vào tháng 3 và đầu tháng 4, chậm dần khi nhiệt độ tăng dần lên gần cuối tháng. Và cây mận chưa trưởng thành mẫn cảm với bệnh đốm đen hơn cây mận đã trưởng thành. Vào tháng 3 năm 1998, ở tỷ lệ bệnh trên cây mận hai năm tuổi là 10% trong khi trên cây mận bốn năm tuổi là 2,1%. 2.2.7. Cao su Trong những năm 1960, bắt đầu có những nghiên cứu quan tâm đến bệnh trên cao su ở Việt Nam. 19 bệnh ảnh hưởng đến cao su ở Việt Nam, rụng lá, sọc đen và loét thân gây ra bởi các loài Phytophthora. P. palmivora được phân lập từ khoảng 70% cây cao su bị bệnh sọc đen, trong khi P. botryosa được tìm thấy trên 75 – 80% từ lá và trái của những cây cao su bị rụng lá. Cả hai loài P. palmivora và P. botryosa được biết là tác nhân gây bệnh trên cao su ở tất cả các vùng trồng trên đất nước. 10 2.3. Phát hiện và định danh Phytophthora Hiện nay để phát hiện Phytophthora, người ta dựa trên nhiều kỹ thuật khác nhau 2.3.1. Kỹ thuật quan sát những đặc điểm về hình thái của Phytophthora trên môi trƣờng nuôi cấy Đây được xem là kỹ thuật định danh cơ bản bởi vì nó xuất hiện sớm và được sử dụng rộng rãi trong quá trình phân lập, định danh các loài nấm cũng như vi khuẩn gây bệnh. Những đặc điểm hình thái làm cơ sở để nhận biết nấm Phytophthora bao gồm: hình dạng túi bào tử, chóp đầu và tính rụng; hình thái túi bào tử; sự hiện diện của bào tử vách dày và sợi nấm trương phồng; sự tiếp xúc giữa túi đực và túi noãn và tổ chức hữu tính là cùng tản hay khác tản Hình 2.2. Một số bệnh do Phytophthora gây ra trên một số cây trồng; (1) Loét thân cây ca cao do P.palmivora; (2) Thối rễ tiêu do P.capsici; (3) Tổn thƣơng thân cà chua do P.infestans; (4) Thối nõn dứa do P.nicotianae 11 Môi trường thông thường dùng cho quá trình nhận biết Phytophthora: V-8 juice, cà rốt agar, lima bean agar. Khi ủ ở nhiệt độ thích hợp, mẫu nấm nuôi cấy sẽ có những biểu hiện hình thái đặc trưng cho loài. Đặc điểm sợi nấm, hình dạng tản nấm hoặc khả năng hình thành bộ phận vô tính như túi bào tử, bào tử vách dày (chlamydospore) trên bề mặt môi trường nuôi cấy là đặc điểm quan trọng để phát hiện Phytophthora. Với kỹ thuật trên ta có thể phát hiện một số loài Phytophthora chẳng hạn: loài P. capsici với dạng tản nấm đồng nhất, túi bào tử hình thành nhiều nhưng không có sự hiện diện của bào tử vách dày (chlamydospore). Trong khi P. parasitica với dạng nấm xòe ra, túi bào tử và bào tử vách dày (chlamydospore) hình thành phong phú trên môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, kỹ thuật này đòi hỏi nhiều thời gian, công sức. Nó không phải là giải pháp tốt cho những kiểm tra thường lệ trên một số lượng mẫu lớn (Drenth và Irwin, 2001). Mục đích định danh muốn thực sự đạt hiệu quả cao, ta phải kết hợp đồng thời kỹ thuật quan sát hình thái với các kỹ thuật hiện đại về sinh hoá hay sinh học phân tử. Chúng tôi xin giới thiệu một số kỹ thuật phổ biến nhằm phát hiện và định danh một số giống nấm gây bệnh thường gặp (James C. Correll. Genetic, Biochemical, and Molecular Techniques for the Identification and Detection of Soilborne Plant-Pathogenic Fungi) 2.3.2. So sánh sự tƣơng đồng về sinh sản và sinh dƣỡng Kỹ thuật so sánh tính tương đồng về sinh sản thường được sử dụng để xác định và mô tả mật độ lai của loài, đặc tính sinh học giữa các loài, bên trong loài. Kỹ thuật so sánh tính tương đồng về sinh dưỡng thường được sử dụng để xác định các tiểu quần thể clone hoặc các cá thể trong một loài. Hai kỹ thuật này khác nhau không nhiều về di truyền và cơ chế. Giới hạn của kiểm tra tính tương quan sinh sản bao gồm những điều sau: khó khăn phải đối mặt trong việc tái sinh những điều kiện lai thích hợp trong môi trường thuần khiết; tất cả những chủng kiểm tra thích hợp trong những quần thể lai khác nhau của các loài định sẵn có thể không có giá trị; một số cá thể trong quần thể nấm có thể không có bộ phận sinh sản, và do đó không thể tái sản xuất với bất kì những chủng kiểm tra đã biết. 12 So sánh về sinh dưỡng, hay thể dị hạch (heterokaryon) giúp ta hiểu thêm về mối liên hệ di truyền của những chủng nấm trong một loài. Kỹ thuật này đơn giản dựa vào khả năng nối nhau của sợi nấm của hai chủng khác nhau, nó rất giống với sự đánh giá những đặc điểm di truyền khác. Kỹ thuật này được sử dụng như một kỹ thuật xác định sự đa dạng di truyền trong các loài nấm, đột biến dinh dưỡng – sinh trưỡng, đột biến nitrate- nonutilizing (nit ). 2.3.3. Kỹ thuật protein profile Điện di protein hòa tan trong ứng dụng ở cấp độ loài và dưới loài. Kỹ thuật này bao gồm ly trích protein tổng số từ sợi nấm và bào tử đính., phân tách trên gel polyacrylamide bằng điện di, nhuộm màu để kiểm tra sản phẩm protein phân tách. Kỹ thuật này được áp dụng trên nhiều giống nấm bệnh có nguồn gốc từ đất (soilborne). 2.3.4. Isozymes Trong phân tách Isozyme, nhiều enzyme có thể không kiểm tra được trong các mẫu đã định. Các enzyme cắt này được xác định có thể ở dạng đơn hình trong khi có rất ít sự khác nhau giữa các loài, dưới loài hoặc chúng có độ đa hình rất cao. Các enzyme sau khi điện di trên tinh bột, gel polyacrylamide, hoặc màng cellulose acetate cơ chất enzyme được cho vào cùng với thuốc nhuộm chlorogenic. Phản ứng giữa enzyme với cơ chất và với thuốc nhuộm, phức tạp của phản ứng màu phản ánh sự hiện diện của enzyme. Sự khác nhau nhỏ giữa trong cấu hình acid amino có thể thay đổi trong cấu trúc hay vật mang của protein. Sự xác định và tính biến động của những enzyme này phụ thuộc nhiều yếu tố khác nhaubao gồm những điều kiện trên sinh vật như tốc độ tăng trưởng, độ pH, dòng điện, hệ thống đệm, tuổi, độ đậm của dung dịch nhuộm,và chuẩn bị mẫu. Gel cellulose acetate thường được sử dụng do nó hạn chế thấp nhất thời gian chuẩn bị so với điện di bằng gel polyacrylamide và tinh bột 2.3.5. Huyết thanh học và kit chẩn đoán Việc ứng dụng kháng thể trong việc kiểm tra và phát hiện nấm gây bệnh có nguồn gốc từ đất đã ra đời 5 - 10 năm trước. Nhiều phương pháp thường được sử dụng để sản xuất ra huyết thanh miễn dịch các loại bệnh cây do nấm gây ra mà không cần phải hiểu biết về mặt di truyền của nguyên liệu nấm bệnh (vách tế bào, bào tử, các protein hòa tan,…) đã tạo ra huyết thanh miễn dịch đa dòng đặc biệt. Vấn đề gặp phải 13 với kháng thể sử dụng là sự thiếu tính chuyên biệt và đặc hiệu trong hầu hết chất nền là mô cây hay đất. Kháng thể đơn dòng được chấp nhận như một dụng cụ chẩn đoán và phát hiện ở mức độ loài và dưới loài. Kháng thể đơn dòng có thể ở cấp độ giống, loài, hay các chủng đặc biệt. Các kit chẩn đoán thường kiểm tra và phát hiện các mầm bệnh từ đất dựa vào kỹ thuật kháng thể đơn dòng hay đa dòng. Những kit này có thể chứng minh rằng sự cần thiết của các chẩn đoán nhanh và chính xác. Những phát hiện nhanh thường cần thiết khi điều đó cần được cung cấp lời giải thích cho việc sử dụng các loại thuốc diệt nấm. Các kit chuẩn đoán thông thường nhằm cung cấp hai mục đích: chẩn đoán và nghiên cứu. Câu hỏi được đặt ra là các kit này có hiệu quả như thế nào khi quản lí bệnh. 2.3.6. Phân tích đa dạng độ dài các đoạn đoạn đƣợc phân cắt (RFLP) Phân tích RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) được dùng để xác định mối quan hệ phân loài của nấm. Phản ứng RFLP bao gồm nhiều bước sau: ly trích và tinh sạch DNA từ cơ quan hay genome; sử dụng enzyme cắt để phân cắt các đoạn DNA; điện di phân tích các đoạn DNA trên gel agarose; thu hình các đoạn DNA bằng cách nhuộm với ethidium bromide hoặc chuyển các đoạn DNA sang màng nitrocellulose hay màng nylon (kỹ thuật Southern blot) và đánh dấu với các probe có đánh dấu hay không đánh dấu phóng xạ lai với các các đoạn DNA. Blot sau khi lai được chuyển qua phim rửa hay giấy nhạy cảm với hóa chất. Sự khác nhau về kích cở các đoạn đa dạng là sự đa dạng di truyền (sự mất đoạn cắt, lặp lại đoạn, hay thêm đoạn DNA). Giá cả để thực hiện phản ứng RFLP cao nhưng giá cả sẽ giảm, và ứng dụng của phản ứng này tăng khi thay thế các probe đánh dấu phóng xạ thành các probe không đánh dấu. Phân tách RFLP thường dùng để nghiên cứu đa dạng di truyền trên DNA ribosome (rDNA) và DNA ti thể ở mức độ loài hay dưới loài . 2.3.7. Kỹ thuật dùng probe acid nucleic, DNA fingerprinting và Molecular karyotyping Sử dụng DNA như probe phân tử để xác định các loài nấm bệnh. Một đoạn DNA giới hạn được clone dòng và được dùng để xác định ở cấp độ loài nấm P.parasitica ( Goodwin và cộng sự, 1989). Hiệu quả của các probe acid nucleic khi 14 xác định các loài nấm phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau bao gồm cả mức độ đa dạng di truyền hiện diện trong các loài đã biết. Một ứng dụng khác của các probe acid nuceic gần đây là việc sử dụng các probe DNA minisatellite trong kỹ thuật DNA fingerprinting (Jeffreys và cộng sự, 1985). Các probe rất nhỏ được sử dụng trên nhiều sinh vật để xác định cá thể và theo dỏi phả hệ, chúng chỉ hiện diện để xác định độ đa dạng di truyền trên nấm. Minisatellite probe, probe oligonucleotide có thể được ứng dụng cho cấp độ loài, dưới loài và cả những dòng clone.( Rodriguez, 1989). 2.3.8. Sự lai DNA-DNA Sự lai DNA-DNA (DNA-DNA hydridization) được ứng dụng ở một mức độ giới hạn trong quá trình phân loại nấm bệnh trên. Qui trình thực hiện gồm: tách DNA của dòng phân lập; trộn với DNA từ chủng khác hay loài khác nhằm mục đích cho chúng sáp nhập lại; mức độ sáp nhập của chúng phụ thuộc vào sự tương đồng hay giống nhau giữa các phân tử DNA khác nhau. Kỹ thuật này không được sử dụng rộng rãi bởi vì giá cả của bộ dụng cụ thực hiện thí nghiệm cao, tuy nhiên tỉ lệ tương đồng giữa các loài thường rất đáng kể. 2.3.9. Kỹ thuật PCR và RAPD Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật nhân đoạn DNA dựa vào các base trình tự. Kỹ thuật này thường dùng để xác đinh mối quan hệ phát sinh loài giữa các loài và là kỹ thuật ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu sinh học (Amheim và cộng sự, 1990; White và cộng sự, 1990). PCR bao gồm enzyme khuếch đại một trình tự DNA đặc hiệu. Vùng thường được sử dụng để khuếch đại là vùng lập lại không mã hóa ITS ( Internal Transcribed Spacer) trong RNA ribosome, vùng này có giá trị thay đổi giữa các loài nấm và do đó có thể xác định mối quan hệ giữa các loài (Bruns và cộng sự, 1992). Kỹ thuật này rất có giá trị bởi tính tiến hóa ở mức độ cao của các loài và các chủng có thể được so sánh. PCR rất có giá trị trong việc xác định ở mức độ loài và chủng. Nó phù hợp để xác đinh các nhóm, các chủng đặc biệt. Gần đây, kỹ thuật khuếch đại các đoạn đa hình RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) được phát triển (William và cộng sự, 1990). RAPD nhằm sử dụng những cặp mồi khoảng 10 base để nhận ra nhiều đoạn DNA khác nhau trên toàn DNA sinh vật (đoạn lớn nhất có kích thước khoảng 1kb). Sự xuất hiện, vắng mặt và sự khác nhau về các band DNA cho phép xác định sự đa dạng giữa chúng. 15 2.4. Một số công trình nghiên cứu định danh nấm Phytophthora 2.4.1. Một số công trình nghiên cứu ngoài nƣớc: Sử dụng cặp mồi ITS để khuếch đại vùng ITS trên nấm Phytopthora. Sản phẩm PCR đem đi phân tích mối quan hệ di truyền với hơn 35 loài bằng ba enzyme cắt AluI, TaqI, MspI hoặc được giải trình tự để so sánh với 17 loài nấm Phytophthora khác bằng cách dùng phần mềm so sánh trình tự PHYLIP [7]. P. palmivora được phân lập từ cây cacao và cây dừa. P. capsici được phân lập từ ca cao, tiêu đen và tiêu chuông đã được chọn lọc từ nhiều địa phương khác nhau của Ấn Độ. Tác giả sử dụng cập mồi ITS1, ITS2 để khuếch đại vùng ITS của gen rDNA bằng kỹ thuật PCR và phân tích AFLP. Dòng phân lập của P. capsici (P575) từ cacao ở Mehico cũng bao gồm trong sự so sánh đa dạng di truyền ở trên. Phân tích AFLP của P. palmivora phân lập từ cây ca cao và cây dừa cũng giống như các mẫu khác. Nhưng các phân tích AFLP của loài P. capsici cho thấy sự khác nhau một cách hiển nhiên với loài P. palmivora. Do đó, vùng ITS được dùng như marker phân loại để xác định giống Phytophthora và AFLP được dùng cho việc ước định những thay đổi đặc biệt bên trong [14]. Sử dụng kết hợp 2 phương pháp: quan sát hình thái và sinh học phân tử. Phương pháp sinh học phân tử dùng cho những nghiên cứu chi tiết, sử dụng PCR- RFLP phân tích đoạn gen ITS1-5,8S-ITS2 trên vùng ITS thuộc DNA ribosome của 180 dòng phân lập. Phân tích trình tự trên ITS2 cho 50 dòng phân lập được dùng cho điều tra mối quan hệ giữa sự thay đổi di truyền và sự phát sinh loài giữa các loài phân lập. Dòng phân lập được chia làm 12 nhóm dựa theo kiểu phát triển của chúng trên môi trường CMA (Corn Meal Agar). Phân cắt bằng 3 enzyme cắt nhằm tìm ra sự phát sinh loài trong vùng ITS2 [11]. Nghiên cứu trình tự lặp lại ITS (internal transcribed spacer) của gen rDNA và đa dạng độ dài các đoạn khuếch đại (AFLP) DNA tổng của loài mới (mầm bệnh Phytophthora trên cây dương đỏ ở Châu Âu). Kỹ thuật lai (heteroploid-interspecific hydrid) trên P.cambivora, một số loài khác và một loài chưa rõ giống như P. fragariae. Phương pháp này đánh dấu tính biến đổi di truyền đang tăng, sự thay đổi hình thái một cách khác thường, sự tái tổ hợp trên vùng ITS [15]. Kỹ thuật PCR dùng để xác định Phytophthora capsici trên cây tiêu. Ba mồi PCR ( CAPFW, CAPRV1 và CAPRV2) được thiết kế đặc biệt dựa trên trình tự của 16 Hình 2.3. Vùng trình tự ITS trong DNA ribosome (A.Drenth và J.A.G Irwin,2001) vùng ITS của chúng. Cặp mồi CAPFW/CAPRV1 khuếch đại sản phẩm 452bp trong khi cặp mồi CAPFW/CAPRV2 khuếch đại đoạn 595bp. Cặp mồi CAPFW/CAPRV2 trong PCR dùng để phát hiện đoạn gel của P.capsici trong cây được chủng bệnh. Kết quả xuất hiện sau 8 giờ chủng bệnh trên mẫu gốc bị ảnh hưởng trong khi cây vẫn chưa thấy sự biểu hiện bệnh của cây [8]. 2.4.2. Nghiên cứu trong nƣớc Sử dụng hai kỹ thuật mô tả hình thái và PCR định danh được một số loài nấm như Phytophthora capsici gây bệnh trên hồ tiêu ở Bà Rịa Vũng Tàu, Phytophthora parasitica gây bệnh trên sầu riêng Đồng Nai, Phytophthora palmivora gây bệnh trên sầu riêng và lan Dendrobium ở Đắc Lắc và Tp. HCM [1]. 2.5. Sơ lƣợc về trình tự ITS và danh mục các loài Phytophthora ở Việt Nam 2.6.1. Sơ lƣợc về trình tự ITS (Internal Transcribed Spacer) Sự lựa chọn trình tự DNA dùng cho việc phát hiện đặc biệt giống Phytophthora và các loài thuộc giống này giữ vai trò quan trọng trong quá trình tìm ra những trình tự có tính ổn định cao. Các trình tự đó phải thể hiện sự khác biệt đặc biệt sao cho ta có thể phân biệt được dòng phân lập ở cấp độ loài hay giống của chúng. Gen mã hóa vùng ribosomal RNA trên sinh vật Eukaryote đảm bảo được chất lượng này. Chúng là một phần thiết yếu của sự sống tế bào và các vùng biểu hiện mà vùng này có sự khác biệt về sự thay đổi trình tự giữa các loài. Mặt khác, độ nhạy của các kiểm tra chẩn đoán tăng khi gen mục tiêu tồn tại ở một số lượng lớn trong genome. Trong hầu hết các sinh vật Eukaryote gen ribosomal RNA (rDNA) gồm một họ đa gen, trong đó các bản sao được sắp xếp lặp lại liên tiếp nhau. Mỗi đoạn lặp lại gồm một đơn vị phiên mã 17 đơn bao gồm một cấu trúc tiểu đơn vị nhỏ 5,8S và một cấu trúc tiểu đơn vị lớn (chia làm hai phần ) là ITS1, ITS2 (A. Drenth và J.A.G. Irwin, 2001) Primer ITS4 và ITS5 là các Universal primer được White và cộng sự (1990) thiết kế để khuếch đại đoạn gen nằm trong vùng ITS. Đoạn gen của giống Phytophthora có kích thước 900bp. Vùng ITS cũng có một số ứng dụng như: tính toán các đột biến điểm trong quá trình hình thành loài, đo lường sự giống nhau bên trong trình tự DNA, dùng các phần mềm chuyên dụng tạo ra cây tiến hóa loài không chỉ bao gồm các loài giống nhau mà còn phân biệt sự khác nhau giữa các loài; mô tả vùng ITS bằng các enzyme cắt chuyên dụng như: TaqI, AluI, MspI. 2.6.2. Danh mục các loài Phytophthora đƣợc tìm thấy ở Việt Nam Bảng 2.2. Danh mục các loài nấm Phytophthora đƣợc tìm thấy ở Việt Nam (A. Drenth và I. Guest, 2004) Tên loài Kí chủ Bệnh Năm Tài liệu tham khảo P.botryosa Cao su Rụng lá 1961 Đặng Vũ Thị Thanh Vệt đen và Hà Minh Trung (1999) P.cactorum Mận Thối trái 1996 Đặng Vũ Thị Thanh và Hà Minh Trung (1999) P.capsici Tiêu đen Thối rễ 1998 NguyễnViết Trọng (2002) P.cinnamomi Dứa Thối nõn 2001 Đặng Vũ Thị Thanh và cộng sự (2004) P.citrophthora Họ cam chanh Thối trái Roger (1951) Loét thân P.colocasiae Khoai mỡ Tàn lụi lá 1951 Roger (1951) P. infestans Khoai tây Tàn lụi lá 1951 Roger (1951) Cà chua Tàn lụi lá Cà trứng Tàn lụi lá P.nicotianae Dứa Thối nõn 2001 Đặng Vũ Thị Thanh và cộng sự (2004) Thuốc lá Thân đen 1967 NIPP (1975) Họ cam chanh Loét thân 2002 Đặng Vũ Thị Thanh và cộng sự (2004) P.palmivora Sầu riêng Tàn lụi lá 2000 Đặng Vũ Thị Thanh 18 và cộng sự (2004) Dừa Loét thân 2002 Đặng Vũ Thị Thanh và cộng sự (2004) Cacao Thối trái 2002 Đặng Vũ Thị Thanh và cộng sự (2004) Caosu Tàn lụi lá 1965 Đặng Vũ Thị Thanh Vệt đen và Hà Minh Trung (1999) Rụng lá P.durian Sầu riêng Loét 2002 Đặng Vũ Thị Thanh và cộng sự (2004) Phytophthora sp Cao su Loét thân 1965 Đặng Vũ Thị Thanh và Hà Minh Trung (1999) Phytophthora sp Ziziphus Thối trái 1997 Đặng Vũ Thị Thanh và Hà Minh Trung (1999) Phytophthora sp Nhãn Thối trái 1995 Đặng Vũ Thị Thanh Tàn lụi lá và Hà Minh Trung (1999) 19 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 3.1.1 Thời gian Đề tài được thực hiện từ ngày 06/02/2006 cho đến ngày 15/08/2006 3.1.2 Địa điểm thực hiện: - Quá trình tăng sinh, nhân sinh khối được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Bệnh Cây – Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật – Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. - Quá trình chiết tách DNA và phản ứng PCR được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học Thực Vật – Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh – Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 3.2 Vật liệu và hóa chất: Chúng tôi tiến hành tăng sinh nhân sinh khối 2 mẫu nấm Phytophthora phân lập trên sầu riêng Đồng Nai, tiêu Bà Rịa và 2 mẫu nấm Phytophthora trên địa lan Đà Lạt của kỹ sư Trịnh Thị Phương Vy. Các mẫu nấm này đã được định danh bằng kỹ thuật quan sát hình thái. 3.2.1 Phục hồi và nhân sinh khối a. Vật liệu và hóa chất Đường Glucose Agar Khoai tây Cồn 70% và Cồn 96% Cà rốt CaCO3 3.2.2 Ly trích DNA a. Vật liệu và dụng cụ:  Máy vortex  Máy ủ nhiệt độ 600C  Máy li tâm Siqma  Ống nghiệm(eppendorf) 1,5 ml 20  Pipetman và đầu tip các loại ( hãng Nichikyo Le) b. Hóa chất: ( Merk)  Lysis buffer( 50 mM Tris HCl; 50mM EDTA; 3% SDS; 1% -mercaptoethanol) pH 8,0.  Nitơ lỏng  Hỗn hợp Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol (25: 24: 1).  Isopropanol.  Ethanol 70%.  Dung dịch TE ( 10mM Tris HCl; 1mM EDTA; pH 8,0). 3.2.3 Kỹ thuật điện di a. Vật liệu và hóa chất  Dung dịch TAE( Tris HCl; Na2EDTA 0,5 M; Glacial acetic acid).  Agarose.  Thuốc nhuộm gel Ethidium bromide 1%. 3.2.4 Kỹ thuật PCR a. Vật liệu  Mẫu nấm ly trích. b. Hóa chất ( Biorad)  dNTPs(dATP; dTTP; dGTP; dCTP), MgCl2, 10X PCR buffer.  Taq DNA polymerase( BioRad).  Ethidium bromide; dung dịch đệm TAE 0,5%. 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1 Tăng sinh và nhân sinh khối Mẫu nấm đã thu thập trên nhiều mẫu khác nhau được tăng sinh trên môi trường PGA. Thành phần trong 1lít môi trường tăng sinh PGA ( Potato – Glucose Agar) - Khoai tây 200gram - Glucose 20gram - Agar 15gram - Nước cất vừa đủ 1000ml Môi trường PGA được hấp tiệt trùng ở 1210C/ 1 atm / 20 phút, được đổ ra đĩa petri. 21 Tiến hành cấy các dòng nấm Phytophthora từ các mẫu khác nhau vào các đĩa môi trường PGA. Sau đó, các đĩa môi trường này được ủ ở nhiệt độ 250C – 280C. Sau khoảng 3 – 4 ngày, khi tản nấm đã hình thành và có đường kính khá lớn ( 4 – 5 mm) ta tiến hành cấy mẫu nấm vào môi trường nhân sinh khối lỏng ( môi trường cà rốt ). Thành phần có trong 1l môi trường cà rốt - Cà rốt 600gram - CaCO3 15gram - Nước cất vừa đủ 1000ml Cách thực hiện: Cà rốt gọt vỏ, rửa sạch, bào mỏng xay nhuyễn cùng với 700 ml nước cất; hấp tiệt trùng 1000C / 20 phút. Để nguội lọc qua rây và 4 lớp vải lọc, lấy dịch trong. Thêm 15gram CaCO3 vào dung dịch khuấy đều, sau đó lắng 20 phút. Gạn lấy dịch lỏng, bỏ CaCO3. Chia đều dung dịch vào bình tam giác hay chai nước biển với thể tích khoảng 100 ml/chai. Hấp tiệt trùng 1210C/ 1atm / 20 phút. Cách cấy nấm sang môi trường nhân sinh khối - Sử dụng đĩa petri mang các khuẩn lạc nấm có đường kính 4 – 5 mm. - Cắt nhỏ ( băm nhuyễn ) rìa mép tản nấm. - Cấy mẫu nấm đã được băm nhuyễn sang bình chứa môi trường cà rốt. Sau khi cấy, những bình nhân sinh khối phải được ủ tối từ 7 đến 10 ngày trong điều kiện nhiệt độ phòng, tĩnh lặng. Quá trình thu sinh khối: mẫu nấm sau khi nhân sinh khối sẽ được lọc qua vải lọc và làm cho khô kiệt bằng giấy thấm. Bảo quản mẫu ở -700C. 3.3.2 Ly trích DNA Mẫu nấm trước khi chiết tách DNA phải qua quá trình nghiền mẫu trong Nitơ lỏng và được cho vào các eppendorf. Qui trình ly trích DNA tổng số: dựa trên qui trình ly trích được của Lee và Taylor (1990) có cải tiến thêm một số bước. Các hóa chất cần pha để thực hiện qui trình ly trích - Lysis buffer(50mM Tris-HCl; 50mM EDTA; 3% SDS; 1% -mercaptoethanol). - Hỗn hợp Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1). - TE(10mM Tris-HCl; 1mM EDTA; pH 8,0). Có hai qui trình ly trí