Định loại sán lá gan lớn bằng kỹ thuật Rapd-Pcr

0 ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC WX Đề tài: ĐỊNH LOẠI SÁN LÁ GAN LỚN BẰNG KỸ THUẬT RAPD-PCR Sinh viên thực hiện: Giáo viên hướng dẫn: Lê Thanh Vương TS Nguyễn Ngọc Hải T.p Hồ Chí Minh, tháng 10 n 1 I. Đặt vấn đề Sán lá gan lớn là một trong những ký sinh trùng nguy hiểm nhất đối với người và gia súc (cừu, bị, dê và động vật nhai lại khác, lợn thỏ, hải ly, chĩ, mèo và kangaroo.Hai lồi thường ký sinh ở người và gia súc là F. hepatica và F. gigantica thuộc giống Fasciola. Hai lồi này giống nhau ở nhiều đặc điểm hình thái, sinh thái, sinh học nên việc định loại chúng trên cơ sở phân biệt hình thái rất dễ nhầm lẫn. Bệnh nhân khi phát hiện nhiễm sán lá gan lớn vẫn khơng thể kết luận tác nhân gây bệnh là F. hepatica hay F. gigantica. Điều này cĩ thể gây hậu quả nghiêm trọng, nhất là đối với F. gigantica chưa thích nghi hồn tồn với đời sống ký sinh ở người và một số động vật khác, nên tỉ lệ sán phát triển đến trưởng thành rất thấp. Hơn nữa, thời gian sán phát triển đến trưởng thành cũng khá dài và là thời kỳ gây bệnh tích nặng cho chủ. Vì vậy phương pháp chẩn đốn bệnh sán lá gan lớn qua tìm trứng sán là khơng thích hợp. Phương pháp chẩn đốn bệnh sán lá gan lớn trên cơ sở miễn dịch là rất thích hợp. Vấn đề quan trọng hàng đầu là phải xác định chính xác lồi gây bệnh để cĩ các chẩn đốn miễn dịch đặc hiệu và tạo cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo để phịng trị sán lá gan lớn cho cả người và gia súc. Phương pháp RAPD-PCR dựa trên cơ sở phản ứng PCR với mồi ngẫu nhiên (kích thước khoảng 10 nucleotide) giúp định loại sán lá gan dựa vào sự đa hình các đoạn DNA được nhân bản. II. Tổng quan tài liệu 1. Giới thiệu sán lá gan lớn Sán lá gan lớn hình chiếc lá, cĩ kích thước 30 x 10-12mm ở trâu bị. Sán ký sinh trong đường mật trâu bị, nhưng trong nhiều trường hợp, chúng cĩ thể ký sinh lạc chỗ như trong cơ bắp, dưới da... Trong cơ thể ký chủ như người và ngựa, sán lá cĩ thể được tìm thấy trong phổi, dưới da hay nơi khác. 2 Hình: Sán lá gan lớn 3 2. Sự phát triển và vịng đời của sán lá gan lớn Sán trưởng thành đẻ trứng theo phân ra ngồi. Trứng sán lá gan lớn cĩ kích thước 140 x 80 mm. Trứng xuống nước, trứng sán lá gan lớn nở ra ấu trùng lơng và ký sinh trong ốc, phát triển thành ấu trùng đuơi, rời khỏi ốc và bám vào các thực vật thủy sinh để tạo nang trùng bơi tự do trong nước. Người hoặc trâu bị ăn phải thực vật thủy sinh hoặc uống nước lã cĩ ấu trùng sẽ bị nhiễm sán lá gan lớn. Hình: Sơ đồ phát triển và vịng đời của sán lá gan Ấu trùng sán lá gan lớn chết ở nhiệt độ 60-700C nhưng nếu chúng ta ăn rau sống, hoặc ăn lẩu tái, trần tái chưa đủ nhiệt độ 40-50 độ C thì ấu trùng sán lá gan vẫn sống được. 3. Đặc điểm bệnh sán lá gan lớn Khi người bị nhiễm ấu trùng sán lá gan vào bộ phận tiêu hĩa, ấu trùng đĩ sẽ theo máu di hành đến gan và cư trú ở đĩ. Nhưng đối với một số trường hợp, ấu trùng theo đường máu cư trú ở các cơ quan khác như phổi, dưới da thì chúng vẫn phát triển được thành sán lá gan. Sán lá gan lớn hấp thu chất dinh dưỡng của người qua máu. Đối với người, việc chẩn đốn bệnh sán lá 4 gan lớn bằng phương pháp tìm trứng trong phân là khĩ vì chúng thường cư trú ở các thùy gan. Tuy nhiên, 2-10% bệnh nhân cĩ thể tìm thấy dấu vết sán lá gan qua phân. Cịn đối với trâu bị sán lá gan cư trú trong ống mật. Do vậy, phương pháp tìm trứng trong phân rất dễ dàng. Động vật nhai lại (trâu, bị, cừu...) bị nhiễm sán lá gan là mãn tính. Khi bị nhiễm, chúng ít khi cĩ triệu chứng sốt mà biểu hiện chủ yếu là sút cân, gầy yếu. Thơng thường, động vật mắc bệnh này ở giai đoạn di hành của ấu trùng sán lá gan lớn thường kéo theo các vi khuẩn hiếm khí dẫn đến nguy cơ tử vong cao. Do các lồi động vật trên thường ăn cỏ ngồi đồng, uống nước ao hồ nên tỷ lệ mắc sán lá gan rất cao. Theo con số điều tra của Viện Thú y Quốc gia qua nhiều năm bằng phương pháp tìm trứng trong phân, trên các vùng núi cao, tỷ lệ động vật ăn cỏ bị nhiễm sán lá gan chiếm từ 40- 90%. Số liệu này cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh sán lá gan lớn ở động vật ăn cỏ rất cao. Bệnh sán gan lớn gây tổn thất kinh tế nghiêm trọng do làm tổn thương gan và giảm năng suất thịt, sữa. 4. Phịng tránh bệnh sán lá gan lớn Đối với người, để phịng tránh bệnh sán lá gan lớn, cần rửa sạch các loại rau thủy sinh (rau trồng trong nước), ăn chín, uống sơi. Đối với trâu, bị, dê... hàng năm cần phải cho tẩy giun sán. Cần xử lý phân của của những lồi động vật này trước khi sử dụng làm phân bĩn lĩt bằng cách mang ủ trước khi bĩn trực tiếp cho đồng ruộng và rau màu nhằm hạn chế ấu trùng Fasciola gigantica phát triển và bám vào rau màu. 5. Giới thiệu kỹ thuật PCR PCR (Polymerase chain reaction) là phản ứng nhân bản trình tự DNA quan tâm trong test tube (Nguyễn Thái Thủy, 2004). 5 Phản ứng PCR được thực hiện trong máy luân nhiệt, lập lại khoảng 30 – 50 chu kỳ. Phản ứng PCR gồm ba chu kỳ như hình 5 với các thành phần phản ứng như sau: • Taq polymerase • dNTP • Primer • DNA mẫu • Buffer Kết quả phản ứng được đọc qua bảng điện di được nhuộm với Ethidium bromide. ADN đích 1 Biến tính (94o C) 2 Bắt cặp (55-65o C) 3 Kéo dài (72o C) 1 2 3 4 n Hình 5: Các giai đoạn của phản ứng PCR 6. Giới thiệu kỹ thuật điện di trên gel agarose Sự di chuyển của các phân tử mang điện trong điện trường gọi là điện di. Điện di hay điện di trên gel (electrophoresis hay gel electrophoresis) áp dụng trong sinh học phân tử là một kĩ thuật để phân tích các phân tử DNA, RNA hay protein dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng điện tích (isoelectric point). Kĩ thuật này sử dụng một dung dịch đệm (buffer) để dẫn diện và tạo điện trường đều, một bản gel (thường là agarose hay polyacrylamide) đĩng vai trị là thể nền để phân tách các phân tử, và các chất nhuộm khác nhau (ethidium bromide, bạc, xanh Coomassie) để phát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khi điện di. 6 DNA hay RNA thường tích điện âm. Trong điện di trên gel, mẫu được cho vào các giếng ở gần cực âm và DNA hay RNA sẽ di chuyển về phía cực dương. sự di chuyển tỉ lệ nghịch với kích thước phân tử, phân tử càng nhỏ di chuyển càng nhanh. Điện di trên gel là phương pháp hữu dụng trong các phân tích sinh hố học. Hình: gel Agarose: cấu tạo mạng lưới cấu trúc ba chiều, cầu nối hydrogen giữa các thành phần. Là polysaccharide tự nhiên được phân lập từ tảo biển, cĩ kích thước lỗ gel lớn thích hợp cho phân tách các phân tử cĩ kích thước lớn và điện di dựa trên độ tích điện. Dùng để phân tách các protein > 500 kDa và các DNA cĩ kích thước lớn hơn 2000 bp. 7 Hình: Một số thiết bị điện di 7. Kỹ thuật RAPD-PCR Các kỹ thuật phân tử như PCR và các biến thể của nĩ được sử dụng cho việc chẩn đốn bệnh ký sinh và nhận dạng các ký sinh trùng, phát triển kháng nguyên đặc hiệu cho các xét nghiệm huyết thanh học và nghiên cứu các phản ứng miễn dịch ở người bệnh. RAPD là viết tắt của Random Amplification of Polymorphic DNA. Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những pimer ngắn khoảng 10 cặp nucleotide đã biết trước trình tự khuếch đại DNA một ngẫu nhiên. Nguyên tắc: khi hai cá thể hồn tồn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng RAPD-PCR ở điều kiện như nhau sẽ tạo ra số lượng các đoạn DNA bằng nhau và chiều dài các đoạn tương ứng bằng nhau. Khi cĩ đột biến làm thêm hoặc mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên thì sản phẩm khuếch đại sẽ khác nhau về số lượng đoạn DNA và chiều dài khác nhau của các đoạn giữa các cá thể. Do đĩ kỹ thuật RAPD cĩ thể phát hiện đột biến. Kỹ thuật này giúp nhận diện những chỉ thị phân tử trội. Quy trình thực hiện RAPD-PCR - Ly trích DNA - Lựa chọn mồi - Tối ưu hố mồi và thực hiện phản ứng PCR - Chọn các primer khuếch đại ổn định nhất - Điện di trên gel agarose - So sánh kết quả giữa các mẫu PCR thơng thường: 8 Hình: Phản ứng PCR đã biết trình tự đoạn gene cần khuếch đại Tuy nhiên, trong RAPD phân tích, trình tự mục tiêu (sẽ được khuếch đại) là chưa biết. Mồi được thiết kế với một trình tự tùy ý, kích thước 10 nucleotide. Sau đĩ thực hiện một phản ứng PCR và chạy điện di trên gel agarose để đọc kết quả nếu cĩ các phân đoạn DNA được khuếch đại trong sự hiện diện của mồi tùy ý. Trong hình này mơ tả một phản ứng RAPD, một đoạn lớn của DNA được sử dụng làm mẫu trong một phản ứng PCR cĩ chứa nhiều bản sao của một mồi ngẫu nhiên duy nhất. Hình: phản ứng RAPD-PCR Trong ví dụ này, cĩ 2 sản phẩm: 9 • Một sản phẩm được tạo bởi PCR khuếch đại trình tự DNA nằm ở giữa cặp mồi 2 và 5. • B là sản phẩm được tạo ra bởi PCR khuếch đại trình tự DNA nằm ở giữa cặp mồi 3 và 6. • Khơng cĩ sản phẩm PCR là sản phẩm của cặp mồi ở vị trí 1 và 4 vì hai mồi này quá xa nhau. • Khơng cĩ sản phẩm PCR được tạo ra bởi các mồi tại các vị trí 4 và 2 hoặc các vị trí 5 và 3 bởi vì các cặp primer khơng được định hướng thích hợp. Tìm sự khác nhau giữa các bộ gene sử dụng kỹ thuật RAPD Nếu các mẫu DNA (gen) được thu nhận từ các nguồn khác nhau, cĩ thể sẽ cĩ sự khác biệt trong trình tự DNA của hai mẫu. Giả sử cĩ một sự thay đổi trong trình tự mồi bắt cặp ở vị trí số 2: Trong hình này, mồi khơng thể bắt cặp ở vị trí số 2, vì thế khơng tạo ra sản phẩm, chỉ cĩ sản phẩm B được tạo ra. Khi chạy điện di sản phẩm 2 phản ứng RAPD ở trên, trên gel agarose, kết quả như sau: 10 Sự khác biệt số band khi điện di sản phẩm RAPD cho phép phân biệt được hai cá thể khác nhau, các giống khác nhau. III. Vật liệu và phương pháp 1. Phân lập ký sinh trùng Sán lá gan lớn Fasciola hepatica đã thu được từ gan của bị và cừu, được rửa nhiều lần với phosphate-buffered saline (PBS) pH 7,4 và sau đĩ ủ trong hệ đệm tương tự ở 37 ° C trong 3 giờ để loại bỏ hết vật chất của ký chủ. Sau đĩ các ký sinh trùng được rửa sạch với PBS nhiều lần. 2. Chiết tách DNA Việc khai thác của DNA được thực hiện theo các bước được mơ tả trước đĩ bởi KAPLAN et al., MC Manus và Bowles; Vargas et al.. Phương pháp đã được chỉnh sửa như sau: Các mẫu ký sinh trùng được đồng nhất trong một dung dịch phân giải (8% triton 100X, 0,25 M Sucroza, 50 mm EDTA, pH 7,4). Dung dịch đồng nhất được ly tâm 10000 vịng/ phút trong 10 phút, ở 4°C. DNA bộ gen được tách ra bởi SDS-proteinase K, enzym này sẽ phá vỡ các polypeptide thành các đơn vị nhỏ hơn, sau đĩ dễ dàng tách bởi phenol chloroform. DNA phục hồi được hịa tan trong 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,6 (Tris-EDTA đệm) và RNA được loại bỏ bằng cách ủ với RNAse ở 37 ° C trong 1h, sau đĩ kết tủa lần thứ hai bởi phenol cloroform và ethanol. Dịch huyền phù được bảo quản ở -20°C. 3. Lựa chọn mồi Để tối ưu hĩa các điều kiện PCR, ba mồi (5'-TCG TCG CATT -3 '(OSA09), 5'-AGC AGC AGGC -3' (OSA 10) và 5'-GGG TAA CGCC -3 11 '(OSA 11 )) đã được lựa chọn ngẫu nhiên để khuyếch đại DNA của Fasciola hepatica cĩ nguồn gốc ở bị và cừu. 4. Tối ưu hĩa Sự cần thiết tối ưu hĩa các điều kiện là để việc khuếch đại cĩ thể thu nhận đầy đủ và tái bản nhiều band mẫu cho DNA bộ gen của mỗi ký sinh trùng (5ng). Nồng độ DNA được xác định nhờ ultraviolet absorbance spectrophotometry tại bước sĩng 260nm. Lượng bức xạ tia tử ngoại hấp thu bởi dung dịch DNA tỷ lệ thuận với lượng DNA trong mẫu. Sự hấp thu tia tử ngoại cũng được sử dụng để kiểm tra độ tinh sạch của DNA mẫu. Phản ứng này được thực hiện trong một thể tích 50 μL chứa 10X dung dịch đệm (500 mM KCI, 200 mM Tris-HCl pH 8,4), 2,0 mM MgCI, 20,4 μm dNTPs (Promega, Hoa Kỳ). Mỗi ống phản ứng cĩ 2 đơn vị của Taq polymerase. DNA được khuếch đại trong 75 chu kỳ với một bước biến tính ở 94oC trong 5 giây, mồi bắt cặp lúc 36 ° C trong 30 giây, và bước kéo dài ở 720C trong 10 giây. 5. Điện di sản phẩm PCR Điện di trên gel agarose 1,4% agarose gel được nhuộm màu với bromua ethidium trước khi quan sát và chụp ảnh. Nĩ được sử dụng như là chỉ thị trọng lượng phân tử một cái thang 100 pb. IV. Kết quả Kết quả của nghiên cứu này cho thấy rằng mồi khác nhau cho các đoạn DNA khác nhau (Bảng I). Những doạn khác nhau này đặc trưng cho lồi F. hepatica cĩ nguồn gốc từ bị và cừu. Các kích thước của các đoạn DNA của F.hepatica từ bị và cừu được khuếch đại bằng mồi OSA-09 tương ứng khoảng 700 bp và bp 150 (Hình 1). 12 Sử dụng OSA-10 mồi, chỉ cĩ doạn DNA (150 bp) từ F. hepatica trên cừu đã được phát hiện, trong khi khơng cĩ đoạn khuếch đại của F. hepatica trên bị (Hình 2). 13 Cuối cùng, sau khi khuếch đại của mồi OSA-11, 2 đoạn ADN khoảng 200 và 400 bp đã thu được chỉ từ F. hepatica trên bị và khơng cĩ band DNA của F. hepatica trên cừu được phát hiện (hình 3). V. Thảo luận Việc xác định các lồi gần gũi dựa trên đặc điểm hình thái cĩ thể khĩ khăn. Điều này đặc biệt là trường hợp cho các lồi động vật thân mềm như sán lá ký sinh. Tuy nhiên, tiến bộ gần đây trong sinh học phân tử, đặc biệt là khuếch đại vùng ADN đặc trưng thơng qua phản ứng PCR cĩ thể cho phép để phân biệt các cĩ lồi quan hệ gần gũi bằng cách so sánh DNA của chúng. DNA prode cũng như PCR primer dựa trên khu vực biến động của chuỗi DNA ribosome đã được phát triển để phát hiện và định loại các lồi Fasciola. Kỹ thuật RAPD-PCR cho phép khuếch đại của khu vực ngắn của bộ gen của một sinh vật mà khơng cĩ thơng tin về trình tự trước, nên rất thuận tiện trên các đối tượng mà bộ gen chưa được biết rõ. Kỹ thuật này cĩ một tiềm năng lớn trong phân biệt giống, phân biệt cá thể và lập bản đồ di truyền. Trong nghiên cứu này, 3 mồi ngẫu nhiên đã cho các đoạn DNA cĩ kích thước khác nhau theo nguồn gốc các lồi trên ký chủ khác nhau. Phân biệt những đoạn đặc trưng cho F. hepatica cĩ nguồn gốc từ bị và cừu. Với primer OSA-09, một đoạn dài 150 bp DNA được thu được từ 14 F. hepatica trên cừu, trong khi một đoạn DNA độ dài 700 bp đã được xác định từ F. hepatica trên bị. Các kết quả này tương đồng với báo cáo trước đĩ. Từ đĩ kết luận rằng RAPD-PCR kỹ thuật cĩ thể chứg minh về mối quan hệ di truyền giữa Fasciola hepatica cĩ nguồn gốc và cừu và cũng để xác định cụ thể các lồi giun sán ký sinh. VI. Tài liệu tham khảo