Định lượng photpho vào và ra dưới ảnh hưởng của thủy triều tại một khu rừng ngập mặn bị gãy đổ do bão ở huyện Cần Giờ

Phần 2:Vật liệu và phương pháp nghiên cứu CBHD Tieán só Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 43 2.1 NGUYEÂN VAÄT LIEÄU 2.1.1 Nguyeân lieäu vaø hoùa chaát * Nguyeân lieäu Saccharomyces cerevisiae cuûa coâng ty men thöïc phaåm Mauri La Ngaø, Ñoàng Nai - Ñoä aåm ( %): < = 6.0 - Tyû leä men soáng (%): >= 95 - Soá teá baøo naám men ( tyû/g): >= 25-30 - Khaû naêng chòu coàn: 10-16% - Nhieät ñoä baûo quaûn: 20 – 28oC - Maøu: naâu vaøng nhaït, chæ coù teá baøo naám men, khoâng coù phuï gia khaùc - Muøi: ñaëc tröng cuûa naám men * Chaát ding döôõng cho naám men (NH4)2PO4 ; (NH2)2CO thöông maïi cuûa Trung Quoác hoaëc Merck (Ñöùc) * Hoùa chaát - Ethanol 99% ( Trung Quoác) - NaCl tinh khiết 99% (Merck) - Chaát chuaån IMP, GMP (Sigma-Aldrich) - Coät saéc kyù ( pha tónh) C-18 (Merck) - Formaldehyde solution (Merck) - NaOH raén (Merck) - K2SO4 (Trung Quoác) - MgO (Trung Quoác) - HCl 0.1N (Trung Quoác) - Chæ thò Phenolphthalein (Trung Quoác) - Acetonitril (Merck) Phần 2:Vật liệu và phương pháp nghiên cứu CBHD Tieán só Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 44 - Acid phosphoric 0.05% (Merck) - Dung dòch CCl3COOH 5 -10% (Merck) - Dung dòch NaOH 1N (Merck) - Dung dòch ñeäm ly giaûi L6 goàm: Guanidine thiocyanate (Fluka) 120g Tris, HCl 0.1M pH 6.4 100ml EDTA 0.2M pH 8.0 22ml Triton X-100 2.6ml - Ethanol 80% (Trung Quoác) * Enzyme Enzyme do haõng Amano Enzyme Inc. 2-7, 1-Chome, Nishiki, Naka-ku, Nagoya 460- 8630 Japan cung caáp bao goàm 4 loaïi: 1. Enzyme YL-ZL “ Amano” - Phaân loaïi: protease trung tính - Maøu: naâu ñoû nhaït - Traïng thaùi: loûng - Hoaït tính: lôùn hôn 350 units/ml - Tyû troïng (g/ml): 1,20 - Saûn xuaát töø: Bacillus subtilis - Quaù trình saûn xuaát: baèng caùch leân men vi khuaån Bacillus subtilis - Baûo quaûn: nôi khoâ thoaùng 2. Enzyme Umamizyme - Phaân loaïi: laø enzyme protease keát hôïp aminopeptidase - Maøu: naâu nhaït - Traïng thaùi: boät - Hoaït tính: lôùn hôn 70 units/g Phần 2:Vật liệu và phương pháp nghiên cứu CBHD Tieán só Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 45 - Tyû troïng (g/ml): 1.25 - Saûn xuaát töø: Aspergillus oryzae - Quaù trình saûn xuaát: töø quaù trình leân men gioáng Aspergillus oryzae choïn loïc - Baûo quaûn: nôi khoâ maùt 3. Enzyme RP-1G - Phaân loaïi: laø enzyme phosphodiesterase - Maøu: traéng naâu - Traïng thaùi: boät mòn - Hoaït tính: lôùn hôn 7000 units/g - Tyû troïng (g/ml): 1,26 - Saûn xuaát töø: Penicilium citrinum - Quaù trình saûn xuaát: baèng caùch leân men Penicilium citrinum - Baûo quaûn: nôi khoâ thoaùng vaø döôùi 250C 4. Enzyme Deamizyme - 50 000G - Phaân loaïi: laø enzyme 5’-Adenylic Deaminase - Maøu: naâu nhaït - Traïng thaùi: boät mòn - Hoaït tính: nhoû hôn 50 000 units/mg - Tyû troïng (g/ml): 1, 26 - Saûn xuaát töø: Aspergillus melleus - Quaù trình saûn xuaát: baèng quaù trình leân men naám moác Aspergillus melleus - Baûo quaûn: nôi khoâ maùt 2.1.2 Thieát bò vaø duïng cuï * Thieát bò Phần 2:Vật liệu và phương pháp nghiên cứu CBHD Tieán só Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 46 - Maùy HPLC detector RF 10A XL vaø UV-Vis SPD 20A Shimazdu - Boä caát đạm Kjeldahl baùn töï ñoäng VAPODEST 30 Gerhardt - Maùy ño maät ñoä quang hoïc Spectro UV-Vis Auto USA - Maùy ño pH EUTECH pH510 USA - Beå röûa sieâu aâm ELMASONIC S100H USA - Caân saáy aåm SARTORIUS MA150 Germany - Caân phaân tích 3 soá leû OHAUS ADVENTURER AR3130 USA - Caân phaân tích 4 soá leû SARTORIUS CP 224S Germany - Tuû saáy ECOCELL 111 lít Germany - Tuû aám oån nhieät INCUCELL 111 lít vaø 55 lít Germany - Tuû laïnh HITACHI JAPAN * Duïng cuï - Nhieät keá thuûy ngaân 0 – 160oC - Bình huùt aåm - Bình ñònh möùc 50ml, 100ml, 500ml, 1000ml - Beáp ñun - Oáng phaù maãu Velp 250 ml - Erlen 50ml, 100ml, 250ml - Oáng ñong 30ml, 50ml, 100ml - Becher 50ml, 100ml, 250ml, 500ml - Que thöû caûm quan muøi, muoãng thöû caûm quan vò - Oáng nghieäm - Pipette Vaø caùc duïng cuï cô baûn khaùc trong phoøng thí nghieäm Phần 2:Vật liệu và phương pháp nghiên cứu CBHD Tieán só Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 47 2.2 PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU 2.2.1 Sô ñoà nghieân cöùu Phần 2:Vật liệu và phương pháp nghiên cứu CBHD Tieán só Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 48 2.2.2 Qui trình thöïc hieän thí nghieäm saûn xuaát dòch chieát xuaát naám men 2.2.3 Xaùc ñònh chaát löôïng naám men Chaát löôïng naám men ñöôïc ñaùnh giaù döïa treân caùc yeâu caàu: * Ñaùnh giaù caûm quan theo tieâu chuaån TCVN 5104:90 Maøu saéc: naám men phaûi coù maøu kem ñeán vaøng nhaït Traïng thaùi: nguyeân veïn daïng khoái, khoâng vuïn naùt Muøi: muøi ñaëc tröng cuûa naám men Naám men baùnh mì Röûa vôùi nöôùc voâ khuaån taùch caën Khaûo saùt töï phaân baèng NaCl + ethanol Khaûo saùt caùc ñieàu kieän söû duïng boå sung boán loaïi enzyme thöông maïi: YL-NL, Umamizyme, RP- 1G vaø Deamiazyme 50000G Ly taâm taùch caën khoâng tan Kieåm tra ñaùnh giaù muøi, vò Baùn thaønh phaåm dòch chieát xuaát naám men Phần 2:Vật liệu và phương pháp nghiên cứu CBHD Tieán só Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 49 * Kieåm tra tính chaát hoùa lyù Ñoä aåm theo: saáy ñeán khoái löôïng khoâng ñoåi hoaëc duøng caân saáy aåm Haøm löôïng protein: theo phöông phaùp Kejldahl 2.2.4 Xaùc ñònh haøm löôïng protein cuûa caùc enzyme Caùc loaïi enzyme ñöôïc xaùc ñònh haøm löôïng protein theo phöông phaùp kjeldahl. Caùc böôùc thöïc hieän ñöôïc trình baøy cuï theå ôû muïc 2.2.5.2 2.2.5 Phöông phaùp xaùc ñònh caùc chæ tieâu trong quaù trình thí nghieäm 2.2.5.1 Phöông phaùp xaùc ñònh khoái löôïng chaát khoâ Nguyeân taéc Trong thaønh phaàn caáu taïo cuûa teá baøo, moâ, cô quan, nöôùc toàn taïi döôùi daïng töï do vaø lieân keát vôùi moät tæ leä lôùn hôn so vôùi moät soá hôïp chaát höõu cô khaùc. Vì theá, ñeå xaùc ñònh chính xaùc haøm löôïng protein, saccharid, lipid…trong maãu nguyeân lieäu thì phaûi xaùc ñònh haøm löôïng cuûa chuùng coù trong nguyeân lieäu khoâ tuyeät ñoái. Do ñoù caàn phaûi xaùc ñònh khoái löôïng chaát khoâ tröôùc khi xaùc ñònh caùc thaønh phaàn khaùc trong maãu. Caùch laøm Xaùc ñònh khoái löôïng voû hoäp khoâ tuyeät ñoái Saáy hoäp ôû nhieät ñoä 1050C trong 3h, ñeå nguoäi trong bình huùt aåm, caân, xaùc ñònh khoái löôïng voû hoäp khoâ tuyeät ñoái. Xaùc ñònh khoái löôïng khoâ tuyeät ñoái cuûa maãu: cho 3g maãu (teá baøo naám men) vaøo hoäp, ñaët trong tuû saáy ôû nhieät ñoä: 500 - 600C trong 30 phuùt. Sau ñoù naâng daàn nhieät ñoä ñeán 1050C vaø saáy trong 6 giôø. Ñeå nguoäi hoäp trong bình huùt aåm, caân. Tieáp tuïc saáy theâm 1 giôø ôû nhieät ñoä 1050C; ñeå nguoäi trong bình huùt aåm, caân. Neáu khoái löôïng hoäp coù chöùa maãu khoâng thay ñoåi, chöùng toû maãu khoâ tuyeät ñoái. Phần 2:Vật liệu và phương pháp nghiên cứu CBHD Tieán só Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 50 2.2.5.2 Xaùc ñònh Nitô toång soá theo Kjeldahl * Chuaån bò maãu Laáy 1ml hoaëc1g maãu naám men cho vaøo oáng phaù maãu. Cho 2 ñeán 3g xuùc taùc vaø 10 – 15 ml H2SO4 ñaäm ñaëc. Ñaët maãu vaøo giaù phaù maãu, vaän haønh chöông trình phaù maãu ñaõ ñöôïc caøi ñaët saün trong maùy phaù maãu. Maãu phaù ñeán khi quan saùt thaáy trong suoát laø ñöôïc. * Tieán haønh thöû Caát ñaïm Laàn löôït cho oáng maãu ñaõ phaù xong, theâm NaOH vaø MgO roài ñaët vaøo maùy caát ñaïm baùn töï ñoäng. Chuaån bò saün caùc erlen chöùa 20 ml H2SO4 0.1N vôùi 3 gioït chaát chæ thò hoãn hôïp Tashiro. Ñeå vaøo vò trí haáp thu trong maùy caát ñaïm. Vaän haønh chöông trình caát ñaïm vôùi nguyeân taéc phaûn öùng nhö sau: (NH4)2SO4 + 2NaOH ---------> Na2SO4 + 2NH3 +H2O 2NH3 + H2O +H2SO4 ---------> (NH4)2SO4 + H2O 2NaOH + H2SO4 ---------> Na2SO4 + H2O Sau ñoù chuaån ñoä löôïng acid dö trong bình erlen baèng NaOH 0.1N cho ñeán khi maát maøu chæ thò hay dung dòch chuyeån sang maøu xanh ngoïc. Tieán haønh song song caùc böôùc treân vôùi moät maãu traéng. * Tính keát quaû Haøm löôïng nitô toaøn phaàn tính baèng g/l theo coâng thöùc Ñaïm N toaøn phaàn (g/l) = ( V0 – V1) x N NaOH x 14 V Maãu Phần 2:Vật liệu và phương pháp nghiên cứu CBHD Tieán só Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 51 V0 : theå tích NaOH tieâu toán khi chuaån maãu traéng (ml) V1 : theå tích NaOH tieâu toán khi chuaån maãu thöû (ml) 14 : ñöông löôïng gram nitô Vmaãu : theå tích maãu nguyeân ñaõ laáy ñeå voâ cô hoùa (ml) Neáu muoán tính ra löôïng Protein, ta nhaân vôùi heä soá 6.25 roài qui ñoåi ra % 2.2.5.3 Xaùc ñònh haøm löôïng acid glutamic baèng phöông phaùp saéc kyù HPLC theo AOAC 2006 (994.12) * Ñònh nghóa Saéc kyù laø kyõ thuaät taùch rieâng caùc hôïp chaát, ñaõ ñöôïc Tswett (1903) laàn ñaàu tieân söû duïng ñeå taùch caùc chaát maøu trong caây coû. Töø ngöõ “chromatography” xuaát xöù töø chöõ “chroma” trong tieáng La Tinh coù nghóa laø chaát maøu. Ngaøy nay, saéc kyù ñöôïc söû duïng ñeå taùch taát caû moïi hôïp chaát duø coù maøu hay khoâng, duø troïng löôïng phaân töû nhoû hay lôùn. * Nguyeân taéc Saéc kyù laø moät phöông phaùp vaät lyù ñeå taùch moät hoãn hôïp goàm nhieàu loaïi hôïp chaát ra rieâng thaønh töøng loaïi ñôn chaát, döïa vaøo tính aùi löïc khaùc nhau cuûa nhöõng loaïi hôïp chaát ñoù ñoái vôùi moät heä thoáng. Heä thoáng goàm hai pha: moät pha ñoäng vaø moät pha tónh. Moät hoãn hôïp goàm nhieàu loaïi hôïp chaát khaùc nhau khi ñöôïc ñaët vaøo moät heä thoáng goàm coù 2 pha, moãi loaïi hôïp chaát seõ coù aùi löïc rieâng cuûa noù ñoái vôùi hai pha, vì theá seõ coù töông taùc maïnh hoaëc yeáu khaùc nhau ñoái vôùi pha tónh. Heä quaû laø moãi loaïi hôïp chaát seõ di chuyeån ngang qua pha tónh vôùi moät vaän toác khaùc nhau, nhôø vaäy, kyõ thuaät saéc kyù coù theå taùch rieâng caùc loaïi hôïp chaát. Phần 2:Vật liệu và phương pháp nghiên cứu CBHD Tieán só Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 52 * Chuaån bò maãu Huùt 1ml dòch chieát xuaát naám men cho vaøo bình ñònh möùc 25ml theâm nöôùc caát 2 laàn ñeán vaïch, laéc ñeàu, sau ñoù loïc maãu baèng giaáy loïc PTFE 0.45μm ñeå loaïi taïp chaát khoâng hoøa tan. Ñaët maãu vaøo maùy saéc kyù. * Tieán haønh ño Ño baèng maùy saéc kyù HPLC Pha tónh : coät RP18 ( 4 μm) Pha ñoäng : 30% Acetonitril vaø 70% ACN trong dung dòch ñeäm sodium acetate pH 4,2 Vaän toác doøng : 1,5ml/phuùt Detection : Fluorescence 260 -310 nm Nhieät ñoä : 350C Theå tích huùt: 10 μm 2.2.5.4 Xaùc ñònh haøm löôïng acid Nucleic baèng caùch ño maät ñoä quang * Nguyeân taéc [5] Ngöôøi ta coù theå tính noàng ñoä caùc phaân töû vaät chaát trong moâi tröôøng loûng döïa vaøo möùc haáp thuï aùnh saùng cuûa chuùng. Söï haáp thuï aùnh saùng naøy tuaân theo ñònh luaät Beer-Lambert IgIo/I = εdc Trong ñoù: Io laø cöôøng ñoä tia tôùi Ig laø cöôøng ñoä tia loù d laø beà daøy cuûa moâi tröôøng loûng maø aùnh saùng truyeàn qua, trong thöïc teá d=1cm ( beà daøy cuûa cuvette quang phoå) c laø noàng ñoä chaát trong moâi tröôøng loûng Phần 2:Vật liệu và phương pháp nghiên cứu CBHD Tieán só Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 53 ε laø heä soá taét ( extinction coefficient) ñaëc tröng cho töøng loaïi phaân töû vaät chaát, phuï thuoäc vaøo böôùc soùng aùnh saùng vaø nhieät ñoä. Ñaïi löôïng A, ñöôïc goïi laø maät ñoä quang hoïc, ñöôïc tính theo coâng thöùc: A = IgIo/I = εdc Moãi loaïi phaân töû coù moät ñænh haáp thuï ( töùc laø nôi chuùng haáp thuï aùnh saùng maïnh nhaát) ôû moät ñoä daøi soùng nhaát ñònh tuøy thuoäc vaøo caáu truùc cuûa chuùng. Ví duï ñænh haáp thuï cuûa caùc nucleic acid laø 260nm trong vuøng töû ngoaïi. Söï haáp thuï naøy laø do töông taùc giöõa caùc photon vôùi caùc electron cuûa voøng purin vaø pirimidine. Söï haáp thuï ôû ñaây ñöôïc tính baèng ñôn vò OD ( optical density). Moät ñôn vò OD töông öùng vôùi 50μg/ml DNA sôïi ñoâi 40 μg/ml DNA sôïi ñôn hay RNA 20 μg/ml oligonucleotide sôïi ñôn Töø giaù trò OD ño ñöôïc, ngöôøi ta coù theå suy ra ñöôïc noàng ñoä nucleic acid cuûa dung dòch. Beân caïnh ñoù, ngöôøi ta coøn tính tæ leä OD260/OD280 ñeå öôùc tính ñoä tinh saïch cuûa dung dòch acid nucleic. Neáu tæ leä naøy naèm trong khoaûng 1,8 ñeán 2 thì dung dòch nucleic acid ñöôïc xem laø saïch. * Caùc böôùc thöïc hieän Taùch chieát vaø xaùc ñònh acid nucleic cuûa naám men vaø dòch töï phaân giai ñoaïn ñaàu. Goàm 3 böôùc: Böôùc 1: Phaù vôõ maøng teá baøo vaø maøng nhaân Vortex 10g maãu dòch chieát naám men vôùi chaát laøm bieán tính protein maïnh guanidium thiocyanate trong dung dòch L6. Hoãn hôïp naøy seõ phaù vôõ hoaøn toaøn maøng teá baøo vaø maøng nhaân, phoùng thích acid nucleic ra moâi tröôøng, ñoàng thôøi phaân huûy caùc protein coøn lieân keát vôùi ADN hoaëc ARN Phần 2:Vật liệu và phương pháp nghiên cứu CBHD Tieán só Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 54 Böôùc 2: Loaïi boû protein vaø caùc thaønh phaàn khoâng mong muoán trong maãu Theâm 20ml dung dòch phenol: chloroform tæ leä 1:1vaø 9ml isoamylalcohol ñeå giaûm boït. Vortex thaät kyõ trong 20-30 phuùt. Ly taâm 5000v/p trong 10 phuùt. Protein bò bieán tính seõ khoâng hoøa tan trong pha nöôùc, sau khi ly taâm seõ keát tuûa thaønh moät lôùp naèm giöõa pha nöôùc vaø pha phenol:chloroform. Pha nöôùc coù chöùa acid nucleic seõ ñöôïc thu laáy vaø chuyeån vaøo moät oáng nghieäm saïch khaùc. Ño maät ñoä quang hoïc ôû böôùc soùng 260nm ñeå xaùc ñònh haøm löôïng acid nucleic hoaëc tuûa acid nucleic ñeå baûo quaûn. Böôùc 3: Laøm keát tuûa acid nucleic ( neáu caàn) Muïc ñích cuûa vieäc keát tuûa laø thu nhaän acid nucleic döôùi daïng coâ ñaëc, ñeå baûo veä chuùng khoûi söï phaân huûy cuûa caùc enzyme vaø coù theå hoøa tan chuùng laïi trong dung dòch theo noàng ñoä mong muoán. Tuûa maãu trong isopropanol vôùi tæ leä isopropanol:maãu laø 1:1 Ly taâm 7000v/p trong 10-15 phuùt thu nhaän phaàn tuûa laø acid nucleic. Sau ñoù röûa tuûa trong etanol 70% ñeå loaïi boû veát isopropanol coøn dính trong maãu. Acid nucleic coù theå baûo quaûn ñöôïc 1 naêm döôùi daïng tuûa trong dung dòch ethanol. 2.2.5.5 Xaùc ñònh haøm löôïng Inosine Monophosphate vaø Guanosine Monophosphate baèng phöông phaùp saéc kyù loûng hieäu naêng cao (HPLC) * Chuaån bò maãu Huùt 1ml dòch chieát xuaát naám men cho vaøo bình ñònh möùc 100ml, laéc ñeàu. Sau ñoù loïc maãu ñeå loaïi taïp chaát khoâng hoøa tan. Ñaët maãu vaøo maùy saéc kyù. * Tieán haønh ño Vaän haønh chöông trình treân maùy saéc kyù HPLC, ñaàu doø UV-Vis vôùi caùc thoâng soá kyõ thuaät sau: Böôùc soùng λ = 248nm Phần 2:Vật liệu và phương pháp nghiên cứu CBHD Tieán só Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 55 Pha tónh : coät C18 khoâng phaân cöïc Pha ñoäng : hoãn hôïp dung moâi khoâng phaân cöïc acetonitril / nöôùc caát 2 laàn vôùi tæ leä 5 / 95 vaø dung dòch ñeäm acid phosphoric 0.05% 2.2.5.6 Xaùc ñònh ñoä pH Ñaët ñieän cöïc vaøo dung dòch maãu thöû vaø hieäu chænh heä thoáng ñaët nhieät ñoä cuûa pH meter cho phuø hôïp vôùi nhieät ñoä cuûa dung dòch maãu. Neáu pH meter khoâng coù heä thoáng hieäu chænh nhieät ñoä thì phaûi duy trì nhieät ñoä dung dòch maãu trong khoaûng 20oC ñeán 220C. Khuaáy maãu baèng maùy khuaáy töø, ño giaù trò pH theo ñuùng höôùng daãn keøm theo maùy. Ñoïc giaù trò pH chính xaùc khi giaù trò khoâng thay ñoåi. 2.2.5.7 Phöông phaùp röûa sinh khoái teá baøo naám men Naám men baùnh mì daïng men töôi cuûa nhaø cung caáp Mauri La Ngaø sau khi ñöôïc ñaùnh giaù chaát löôïng caûm quan vaø tính chaát hoùa lyù ñaït yeâu caàu, ñöôïc huyeàn phuø vôùi nöôùc voâ khuaån vôùi tæ leä naám men:nöôùc laø 1:3 (w/w). Ñeå laéng trong 90 phuùt, gaïn boû phaàn nöôùc vaø taïp chaát noåi. Tieáp tuïc röûa laàn thöù 2 vôùi nöôùc voâ khuaån, gaïn bôùt phaàn nöôùc beân treân, sau ñoù ly taâm 2000v/phuùt trong 15 phuùt ñeå thu nhaän laïi sinh khoái naám men. 2.3 PHÖÔNG PHAÙP TIEÁN HAØNH CAÙC THÍ NGHIEÄM 2.3.1 Thuûy phaân teá baøo naám men boå sung enzyme * Nguyeân taéc chung Huyeàn phuø teá baøo naám men trong nöôùc voâ khuaån, boå sung enzyme ôû noàng ñoä khaûo saùt, uû ôû caùc nhieät ñoä, pH vaø thôøi gian khaùc nhau ñeå thu ñöôïc hoãn hôïp coù haøm löôïng caùc chaát sinh hoùa hoïc cao nhaát. 2.3.1.1 Thuûy phaân teá baøo naám men baèng NaCl vaø ethanol Nguyeân taéc Phần 2:Vật liệu và phương pháp nghiên cứu CBHD Tieán só Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 56 NaCl vaø ethanol hoaït hoùa quaù trình töï phaân ôû naám men, laøm ngaén laïi quaù trình thuûy phaân giuùp cho söï töï phaân xaûy ra nhanh hôn. Chuùng ñöôïc theâm vaøo nhö laø caùc taùc nhaân khôûi ñoäng (trigger-agent), sau ñoù nhöõng enzyme khaùc nhau voán coù trong teá baøo naám men giuùp cho quaù trình töï phaân tieáp tuïc xaûy ra. * Tieán haønh thí nghieäm Hoãn hôïp goàm 50g naám men + 5% NaCl, troän ñeàu vaø huyeàn phuø trong 60ml ethanol vôùi noàng ñoä töông öùng 1%, 2%, 3% vaø 4%. Hoãn hôïp treân ñöôïc laøm noùng taïi 400C trong 72h. Khuaáy ñeàu vaø ñeå nguoäi ôû nhieät ñoä phoøng. Ly taâm 4000v/10 phuùt. Xaùc ñònh haøm löôïng protein vaø acid nucleic taïo thaønh. 2.3.1.2 Thuûy phaân teá baøo naám men baèng enzyme Döïa theo khuyeán caùo haøm löôïng söû duïng cuûa nhaø saûn xuaát, chuùng toâi tieán haønh thí nghieäm theâm caùc noàng ñoä thöïc teá söû duïng ñeå choïn loïc löôïng duøng coù hieäu quaû toái öu. * Thuûy phaân teá baøo naám men boå sung enzyme YL-NL Enzyme YL-NL thuûy phaân lieân keát peptide trong ñoù nhoùm - NH-CH-R ñöôïc bao boïc bôûi caùc goác acid amin kî nöôùc laø alanine, valanine, isoleucine, norleucine, leucine, hoaëc phenylalanine. Toác ñoä thuûy phaân cuûa enzyme gia taêng maïnh khi caùc goác alanine, serine, threonine hoaëc histidine chöùa nhoùm – COOH taïo neân lieân keát peptide. Enzyme naøy cuõng thuûy phaân lieân keát chöùa nhoùm – COOH cuûa proline. Nhieät ñoä toái öu ñeå enzyme naøy hoaït ñoäng laø 50oC ñeán 57oC, pH toái öu 6.5 – 7.5 . Thôøi gian thuûy phaân enzyme YL-NL laø khoaûng 16h. Phần 2:Vật liệu và phương pháp nghiên cứu CBHD Tieán só Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 57 Tieán haønh Cho 50ml dung dòch enzyme 0,7%, 1% vaø 1,2% ñöôïc cho vaøo 50g naám men töôi. Laéc ñeàu hoãn hôïp, laøm noùng taïi 50oC. Sau caùc moác thôøi gian töø khi cho enzyme vaøo 12h, 14h, 16h khuaáy ñeàu maãu, laáy moät löôïng ñeå nguoäi ôû nhieät ñoä phoøng. Maãu ñöôïc xaùc ñònh haøm löôïng ñaïm toång soá vaø acid nucleic. * Thuûy phaân teá baøo naám men baèng enzyme RP-1G Enzyme RP-1G coù baûn chaát laø 5’phosphodiesterase, thuûy phaân RNA cuûa teá baøo naám men thaønh caùc 5’Nucleotide, trong ñoù coù GMP. Enzyme naøy coù theå hoaït ñoäng trong khoaûng pH 4 - 7, tuy nhieân hoaït ñoäng ôû pH toái öu laø 5 vaø nhieät ñoä toái öu laø 700C. Tieán haønh Caân 50g naám men baùnh mì theâm vaøo 50ml RP-1G noàng ñoä 0.1%, 0.08% vaø 0.07%, khuaáy ñeàu hoãn hôïp, ñieàu chænh pH leân khoaûng 6-7. Sau ñoù uû hoãn hôïp trong tuû aám ôû nhieät ñoä 65oC – 70oC. Ñaùnh giaù caûm quan muøi sau moãi 8h ñeán 16h, hoãn hôïp sau thuûy phaân ñöôïc ñem xaùc ñònh haøm löôïng GMP taïo thaønh. * Thuûy phaân teá baøo naám men baèng enzyme Deamizyme 50000G Enzyme naøy coù hoaït tính 5’-Adenylic Deaminase maïnh, chuyeån hoùa 5’- Adenylic acid (AMP) thaønh 5’Inosinic acid (IMP). Tieán haønh Cho 50ml Deaminase 50000G 0.07%; 0.1% cho vaøo 50g naám men baùnh mì, khuaáy ñeàu, uû ôû 50oC – 55oC. Hoãn hôïp sau thuûy phaân ñöôïc ñaùnh giaù caûm quan muøi vaø xaùc ñònh tính chaát lyù hoùa sau moãi 12h ñeán 24h. Hoãn hôïp ñöôïc ñem xaùc ñònh haøm löôïng IMP. * Thuûy phaân teá baøo naám men baèng enzyme Umamizyme Umamizyme laø moät enzyme thuûy phaân protein, khaùc vôùi proteinase toång hôïp khaùc, Umamizyme coù hoaït tính peptidase maïnh, beân caïnh ñoù hoaït tính Phần 2:Vật liệu và phương pháp nghiên cứu CBHD Tieán só Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 58 proteinase cuõng cao. Söï keát hôïp naøy giuùp noù thuûy phaân ñöôïc nhieàu loaïi protein ôû noàng ñoä cao vaø coù theå taïo saûn phaåm cuoái cuøng laø glutamic acid. Noù hoaït ñoäng toát nhaát ôû 50oC vaø pH 7 - 8. Tieán haønh 50g naám men ñöôïc huyeàn phuø trong 50 ml Umamizyme 0,9% ; 1% vaø 1,1%. Hoãn hôïp treân ñöôïc laøm noùng taïi 50oC trong 6h, 8h, 10h. Khuaáy ñeàu, ñeå trôû veà nhieät ñoä phoøng. Hoãn hôïp ñöôïc ñaùnh giaù caûm quan vaø xaùc ñònh haøm löôïng acid glutamic. 2.3.2 Khaûo saùt caùc ñaëc ñieåm söû duïng enzyme 2.3.2.1 Aûnh höôûng cuûa chæ soá pH dòch thuûy phaân Huyeàn phuø 50g naám men vaøo dung dòch enzyme vôùi noàng ñoä toái öu khaûo saùt ôû caùc thí nghieäm tröôùc, ñieàu chænh pH baèng NaOH 0.1N ñeán khi pH hoãn hôïp ñaït möùc caàn khaûo saùt töông öùng vôùi töøng loaïi enzyme. Hoãn hôïp ñöôïc ñem uû töông öùng vôùi nhieät ñoä hoaït ñoäng toát nhaát cuûa enzyme trong thôøi gian 16h. Sau ñoù khuaáy ñeàu, ñeå nguoäi ôû nhieät ñoä phoøng. Hoãn hôïp ñöôïc ñaùnh giaù saûn phaåm taïo thaønh sau thuûy phaân ôû töøng ñoä pH töông öùng. 2.3.2.2 Nhieät ñoä thuûy phaân Caân 50g naám men huyeàn phuø laàn löôït trong dung dòch enzyme YL-NL, Umamizyme, Deamizyme 50000G, RP 1G. Hoãn hôïp treân ñöôïc uû noùng taïi caùc möùc nhieät ñoä khaûo saùt phuø hôïp vôùi töøng loaïi enzyme. Sau ñoù khuaáy ñeàu vaø ñeå nguoäi ôû nhieät ñoä phoøng. Xaùc ñònh caùc chaát taïo thaønh ñeå choïn loïc nhieät ñoä toái öu cho töøng loaïi enzyme. 2.3.2.3 Thôøi gian thuûy phaân Cho 50g naám men vaøo dung dòch enzyme trong caùc ñieàu kieän pH vaø nhieät ñoä toái öu ñaõ khaûo saùt ôû caùc thí nghieäm tröôùc, uû hoãn hôïp trong khoaûng thôøi gian tieäm caän treân vaø döôùi cuûa thôøi gian ñöôïc khuyeán caùo söû duïng. Ñaùnh giaù Phần 2:Vật liệu và phương pháp nghiên cứu CBHD Tieán só Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 59 chaát löôïng saûn phaåm sau thuûy phaân ñeå choïn loïc khoaûng thôøi gian uû toái öu nhaát cho töøng loaïi enzyme. 2.3.2.4 Khaûo saùt phöông phaùp cho enzyme vaøo Ñeå toái öu phöông phaùp söû duïng enzyme, chuùng toâi thöïc hieän khaûo saùt löôïng enzyme cho vaøo baèng hai caùch: cho hoaøn toaøn vaøo khi baét ñaàu quaù trình vaø cho laøm 2 giai ñoaïn trong quaù trình thuûy phaân ( 1/3 löôïng enzyme ñöôïc vaøo ngay töø ñaàu vaø 2/3 coøn laïi cho vaøo giöõa thôøi gian). 2.4 Khaûo saùt ñieàu kieän vaø hieäu quaû söû duïng keát hôïp boán loaïi enzyme Döïa vaøo keát quaû ñieàu kieän toái öu söû duïng töøng loaïi enzyme, chuùng toâi boá trí thí nghieäm thuûy phaân naám men coù boå sung keát hôïp 4 loaïi enzyme thöông phaåm vaø ñaùnh giaù, phaân tích hieäu quaû cuûa quaù trình. So saùnh hieäu quaû söû duïng keát hôïp vôùi caùch söû duïng rieâng leû töøng loaïi enzyme. 2.5 Ñaùnh giaù thöïc phaåm baèng phöông phaùp caûm quan theo TCVN 5104-90 Xaùc ñònh khaû naêng phaân bieät giôùi haïn veà vò cuûa maãu theo phöông phaùp so saùnh caëp ñoâi 2.5.1 Noäi dung Phaân bieät söï khaùc nhau veà noàng ñoä caùc chaát taïo vò vaø taïo muøi baèng caùch so saùnh caëp ñoâi 2.5.2 Chuaån bò thöû Dung dòch thöû ñöôïc chuaån bò töø dòch naám men ñaõ thuûy phaân coù söû duïng enzyme vaø khoâng söû duïng enzyme. Duøng pipette hay oáng ñong laáy moät löôïng dung dòch thöû theo baûng döôùi vaø cho vaøo bình ñònh möùc dung tích 1000 ml, theâm nöôùc caát voâ khoaùng vaøo cho ñeán vaïch. Dung dòch caûm quan ñöôïc mang ñaùnh giaù ngay hoaëc ñöôïc baûo quaûn trong bình thuûy tinh kín khoâng quaù 3 ngaøy. Chuaån bò maãu thöû caûm quan theo baûng sau: Phần 2:Vật liệu và phương pháp nghiên cứu CBHD Tieán só Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 60 Dòch coù boå sung enzyme (A) Dòch khoâng boå sung enzyme (B) Loaïi vò Vaø muøi Chaát taïo vò Taïo muøi Theå tích dòch goác Noàng ñoä chaát taïo vò Theå tích dòch goác Noàng ñoä chaát taïo vò Vò Ngoït Muøi thôm (ñaëc tröng cuûa GMP vaø IMP) Dòch thuûy phaân naám men baùnh mì 50 ml 100 ppt 50 ml 100 ppt 2.5.3 Tieán haønh thöû Cho 30 ml dung dòch A, B ñaõ chuaån bò vaøo 12 bình thuûy tinh gioáng nhau chia theo 6 maãu dung dòch A vaø 6 maãu dung dòch B. Maõ hoùa caùc bình vaø gheùp chuùng laïi vôùi nhau theo töøng caëp ñoâi. Ñaët treân moãi baøn caûm quan 6 caëp maãu theo trình töï tuøy yù. Moãi chuyeân vieân caûm quan seõ ñaùnh giaù muøi, vò cuûa 6 caëp maãu. Trong moãi caëp, ngöôøi caûm quan caàn xaùc ñònh ñöôïc maãu coù noàng ñoä vò cao hôn. Ghi keát quaû vaøo phieáu. 2.6 Phöông phaùp qui hoaïch thöïc nghieäm Döõ lieäu khoa hoïc ñöôïc tính trung bình coäng vaø phaân tích baèng chöông trình MS-EXCELL.